JPH0746103B2

JPH0746103B2 - 血清中のチオール基の直接測定方法及びそれに用いる試薬

Info

Publication number: JPH0746103B2
Application number: JP31747987A
Authority: JP
Inventors: 三知夫浜; 満直田中
Original assignee: 株式会社ヤトロン
Priority date: 1987-12-17
Filing date: 1987-12-17
Publication date: 1995-05-17
Anticipated expiration: 2010-05-17
Also published as: JPH01161151A

Description

【発明の詳細な説明】＜産業上の利用分野＞この発明は、血清中のチオール基、特に血清中のメルカ
プトアルブミンを主体とするチオール基をクロマトグラ
フィー等でメルカプトアルブミン成分を分画することな
く直接測定（定量）する方法、及びこれに用いる試薬に
関するものである。

＜従来の技術＞血清中のアルブミン量と疾患との関係は、特に栄養障害
時の有効な指標とされるので、アルブミン量はこれと親
和性を有する色素を使用して、色素結合法という簡便法
によって日常的に測定されている。

他方、アルブミン分子に存在するチオール基について
は、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、各種肝疾患等によ
り、これがシステインやグルタチオン等と結合し、その
結果Ｓ−Ｓ（混合ジスルフィド）結合したアルブミンが
増大することが報告されている。従ってチオール基を持
つメルカプトアルブミン（以下HMAという）と疾患によ
り増えるノンメルカプトアルブミン（以下HNAという）
の含有率を測定することは、臨床検査の分野において有
用なことである。

さて、血清中には種々の干渉物質が存在するので、従来
血清中のチオール基（特に血清中のHMAを主体とするチ
オール基）を単に試薬を添加するだけで直接測定するこ
とはできななった。

すなわち、血清中のチオール基の測定は、その中に含ま
れているアルブミンを予じめカラムクロマトグラフィー
等により分画して共存する干渉物質を除去した後、これ
に5,5′−ジチオビスコニトロベンゾイックアシッド（D
TNB）を添加してアルブミンのチオール基により呈色さ
せ、その吸光度を測定することにより行なわれていたの
である。

＜発明が解決しようとする問題点＞しかしながら、前記したカラムクロマトグラフィー等に
より分画する操作は煩雑で時間がかかり過ぎるので、血
清中のチオール基の直接測定方法の開発が望まれてい
た。

発明者等は、前記DTNBを使用して、血清中のチオール基
を直接測定する方法について、カラムクロマトグラフィ
ー法と比較検討したところ、DTNBの呈色を阻害するの
は、血清中の低分子物質（セファデックスＧ−25脱塩用
カラムの低分子分画）である事実を突きとめたが、いず
れにしても従来血清中のチオール基の測定試薬として使
用されていたDTNBは、チオール基の直接測定試薬として
は不適当であることが判明した（第１図参照）。

そこで発明者等は、DTNBとは異なった機構（反応）によ
り呈色する試薬を鋭意検討した結果、血清中のチオール
基の直接測定試薬（呈色試薬）としては、4,4′−ビス
ジメチルアミノベンズヒドロール（以下BDABという）が
最適であること、また血清中の総チオール基量はHMAで
大部分を占められているという事実を知り本発明を完成
した。

＜問題を解決するための手段＞すなわちこの発明は、血清に、4,4′−ビスジメチルアミノベンズヒドロー
ル、及び蛋白変性剤を添加して生ずる呈色の程度を比較
測定することを特徴とする血清中のチオール基の直接測
定方法、及び 4,4′−ビスジメチルアミノベンズヒドロール（BDA
B）及び蛋白変性剤を含有することを特徴とする血清中
のチオール基の直接測定方法に用いる試薬、を提供し、血清中から予じめアルブミンの分画しなくて
もチオール基を直接測定することができるようにするこ
とを目的として開発したものである。

本発明においては、血清に4,4′−ビスジメチルアミノ
ベンズヒドロールと蛋白変性剤を添加するものである
が、他の物質を添加しないという趣旨ではない。分析
上、通常必要とする他の物質を添加することはもちろん
である。

本発明に使用するBDABは、従来のDTNBとは次に記載する
ようにチオール基に対する特性が異なっている。

すなわち、従来のDTNB法によるチオール−ジスルフィド
交換反応が親電子置換反応であるのに対し、本発明にお
けるBDAB法は、以下に示すようにカチオンに対するチオ
ール基の求核反応の結果生ずる呈色（吸光度変化）をモ
ニターする点にある。

従って、血清等の体液中に共存する低分子干渉物質の影
響を受けないので、カラムクロマトグラフィー等による
前処理を必要とせず、直接測定が可能となるのである。

本発明に係る血清中のチオール基の直接測定方法及びそ
れに用いる試薬には、蛋白変性剤を必要とする。蛋白変
性剤としては、塩酸グアニジンが最も適している。その
他、ラウリル硫酸、尿素、エタノール、アセトン等も使
用できる。

塩酸グアニジンが測定系に存在すると、１×10⁵という
高い分子吸光係数を得られるため、検体は極めて少量で
よい。

また、分光光度計で測定する際の吸収極大が612nmと長
波長側にあるので共存物質の影響を全く受けないことが
有利である。

なお、本願に係る血清中のチオール基の直接測定方法及
びそれに用いる試薬は、測定対象が血清ばかりではな
く、他の体液にも応用可能である。

＜実施例１＞試薬:6M−塩酸グアニジン、14μＭ−DBABを拭む50mM−
酢酸緩衝液（ph5.0）操作：検体50μに、前記試薬2mlを添加して十分撹拌
後、室温で20分間放置し、波長612nmで吸光度を測定す
る。同時にHMAの希釈列を検体と同様に操作して、その
濃度と得られた吸光度から検量線を作成し、血清中の総
チオール基物質量を求めた。得られた検量線を第２図
（Ａ）に示す。

また、6M−塩酸グアニジンに代えて0.17M−ラウリル硫
酸ナトリウムを使用したときの検量線を第２図（Ｂ）に
示す。

次に、健常者及び各疾患者（リウマチ、痛風、糖尿病、
癌）の血清を用いて、本発明に係る血清中のチオール基
の直接測定方法を実施した。また、比較としてHPLC（高
速液体カラムクロマトグラフィー，旭化成（株）製ア
サヒパックES−502のIEC,移動相として0.4M 硫酸ナト
リウム,0.05M Ｎ−メチルピペラジン,1％シアン化メ
チル（pH4.8））で血清を分離し、HMA及びHNAを測定し
た。またHMA/（HMA＋HNA）を求めた。その結果を第３図
及び第４図に示す。

第３図及び第４図によれば、従来のHPLC法による疾患の
検定法よりも、本願発明の方法による疾患の検定方法の
方が有意性が高いこと、すなわち健常者及び各疾患者の
差が明らかである。

本発明に係る血清中のチオール基の直接測定方法及びそ
れに用いる試薬について、試薬の濃度、測定条件等を補
足すると次の通りである。

（１）前記した試薬は塩酸グアニジンにおいては２〜６
モル、DBABにおいては、４〜20μＭの範囲で使用可能で
ある。

（２）DBABの緩衝液の至適pHは5.0である。

（３）試薬を添加して10分後には、吸光度がほぼ安定す
る。

＜発明の効果＞以上のように、この発明に係る血清中のチオール基の直
接測定方法及びそれに用いる試薬によれば、血清中のHM
Aを主とするチオール基含有量を、HPLC等により分画す
ることなく直接測定することがな可能となるので、日常
の検査に迅速、簡便かつ高精度の測定法として十分利用
できる。

また、これを用いた疾患の検定は、従来のHPLC法による
HMAとHNAの含有比率による検定よりも有意性が高いとい
う効果を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、DTNBを使用する、血清中のHMAの直接測定結
果と、血清中の低分子物質（セファデックスＧ−25脱塩
用カラムの低分子分画）を除去したときの測定結果を示
す。第２図（Ａ）、（Ｂ）は、本願発明によるHMAの検量線
（各々順に、6M−塩酸グアニジン、及び0.17M−ラウリ
ル硫酸ナトリウムを使用）示す。第３図は、HPLC法によるHMA/（HMA＋HNA）を示す。第４図は、本願発明の血清中のチオール基の直接測定方
法による総SH基濃度を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】血清に、4,4′−ビスジメチルアミノベン
ズヒドロール、及び蛋白変性剤を添加して生ずる呈色の
程度を比較測定することを特徴とする血清中のチオール
基の直接測定方法。
【請求項２】蛋白変性剤が塩酸グアニジンである特許請
求の範囲第１項記載の血清中のチオール基の直接測定方
法。
【請求項３】4,4′−ビスジメチルアミノベンズヒドロ
ール及び蛋白変性剤を含有することを特徴とする血清中
のチオール基の直接測定方法に用いる試薬。
【請求項４】蛋白変性剤が塩酸グアニジンである特許請
求の範囲第３項記載の血清中のチオール基の直接測定方
法に用いる試薬。