JPH01165385A - 蛋白質の分泌発現 - Google Patents
蛋白質の分泌発現Info
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- JPH01165385A JPH01165385A JP63234747A JP23474788A JPH01165385A JP H01165385 A JPH01165385 A JP H01165385A JP 63234747 A JP63234747 A JP 63234747A JP 23474788 A JP23474788 A JP 23474788A JP H01165385 A JPH01165385 A JP H01165385A
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- JP
- Japan
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- dna
- protein
- vector
- signal sequence
- hegf
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、組み換えＤＮＡ技術による蛋白質の分泌発椀
に関するものであり、更に具体的には細菌性毒素の改良
シグナル配列をコードしている新規なりＮＡを利用して
複雑な高次構造を有する蛋白質を分泌発現させ、純度の
高い活性型蛋白質を簡単に得る方法に関するものである
。
に関するものであり、更に具体的には細菌性毒素の改良
シグナル配列をコードしている新規なりＮＡを利用して
複雑な高次構造を有する蛋白質を分泌発現させ、純度の
高い活性型蛋白質を簡単に得る方法に関するものである
。
末技術および 日が解決しようとする課ｌ現在１組み換
えＤＮＡ技術によって有用蛋白質を生産する方法は一般
的なものとなっており、その多くは大腸菌〔エシェリヒ
アコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））（以下
、Ｅ、ｃｏｌｉと略記することがある。）を用いてなさ
れている。この方法は、培養時間が短かくてすむ利点が
ある反面、微生物体内で生産された蛋白は宿主のプロテ
アーゼによって分解される恐れがあると共に、目的物を
純粋な形で取得するまでの過程で多大の時間と労力を必
要とするだけでなく、それらの過程において蛋白質の失
活を伴う恐れもあった。
えＤＮＡ技術によって有用蛋白質を生産する方法は一般
的なものとなっており、その多くは大腸菌〔エシェリヒ
アコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））（以下
、Ｅ、ｃｏｌｉと略記することがある。）を用いてなさ
れている。この方法は、培養時間が短かくてすむ利点が
ある反面、微生物体内で生産された蛋白は宿主のプロテ
アーゼによって分解される恐れがあると共に、目的物を
純粋な形で取得するまでの過程で多大の時間と労力を必
要とするだけでなく、それらの過程において蛋白質の失
活を伴う恐れもあった。
この問題点を解決するために蛋白質の膜透過に関与する
シグナル配列を利用して宿主の菌体内で産生された蛋白
質をペリプラズム（細胞質膜および外膜の膜間）あるい
は菌体外へ分泌させ、これらを蓄積させる方法が試みら
れている（例えば特開昭６１−２８０２９２号公報、特
開昭６１−９２５７５号公報参照）、そして、大腸菌に
おける分泌発現としては、アルカリ性ホスファターゼ（
特開昭６１−２８０２９２号）や、アンピシリン耐性因
子のシグナル配列が一般に用いられている。しかしアル
カリ性ホスファターゼやアンピシリン耐性因子は分子内
にジスルフィド結合をほとんど持たないことが特徴的で
ある。一般に大腸菌の分泌性蛋白はジスルフィド結合に
乏しい（Ｐ、Ａ、Ｍａｈｅｒ ａｎｄ Ｓ、Ｊ、Ｓｉｎ
ｇｅｒ ：プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔ
１ 、 Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ 、 ＵＳＡ ） 、 ８
３ 。
シグナル配列を利用して宿主の菌体内で産生された蛋白
質をペリプラズム（細胞質膜および外膜の膜間）あるい
は菌体外へ分泌させ、これらを蓄積させる方法が試みら
れている（例えば特開昭６１−２８０２９２号公報、特
開昭６１−９２５７５号公報参照）、そして、大腸菌に
おける分泌発現としては、アルカリ性ホスファターゼ（
特開昭６１−２８０２９２号）や、アンピシリン耐性因
子のシグナル配列が一般に用いられている。しかしアル
カリ性ホスファターゼやアンピシリン耐性因子は分子内
にジスルフィド結合をほとんど持たないことが特徴的で
ある。一般に大腸菌の分泌性蛋白はジスルフィド結合に
乏しい（Ｐ、Ａ、Ｍａｈｅｒ ａｎｄ Ｓ、Ｊ、Ｓｉｎ
ｇｅｒ ：プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔ
１ 、 Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ 、 ＵＳＡ ） 、 ８
３ 。
９００１ （１９８６））とされており、これらの蛋白
のシグナル配列をジスルフィド結合に富む蛋白質、たと
えばヒト表及細胞増殖因子（ｈＥＧＦ）、ヒト塩基性繊
維芽細胞増殖因子（ｈｂＦａＦ）、ヒト酸性繊維芽細胞
増殖因子（ｈａＦＧＦ）、ヒト・アンギオゲニン。
のシグナル配列をジスルフィド結合に富む蛋白質、たと
えばヒト表及細胞増殖因子（ｈＥＧＦ）、ヒト塩基性繊
維芽細胞増殖因子（ｈｂＦａＦ）、ヒト酸性繊維芽細胞
増殖因子（ｈａＦＧＦ）、ヒト・アンギオゲニン。
ヒト・プロインスリン、ヒト・インスリン様成長因子Ｉ
および■、塩基性ウシ膵臓トリプシンインヒビターなど
の分泌発現に応用することは無理があると考えられる。
および■、塩基性ウシ膵臓トリプシンインヒビターなど
の分泌発現に応用することは無理があると考えられる。
これらのジスルフィド結合に富む蛋白質は発現される過
程において不完全にジスルフィド結合を形成したり、間
違った組合せのジスルフィド結合に至ることによって生
理活性が全くなくなるか、極めて弱くなることが知られ
ている。これらの不活性型を活性型に戻すためには、蛋
白の変性に次ぐ酸化過程を必要とする。かくして複雑な
高次構造を保持した状態で蛋白質を分泌させるためには
、それにふされしいシグナル配列を開発することが望ま
れていた。
程において不完全にジスルフィド結合を形成したり、間
違った組合せのジスルフィド結合に至ることによって生
理活性が全くなくなるか、極めて弱くなることが知られ
ている。これらの不活性型を活性型に戻すためには、蛋
白の変性に次ぐ酸化過程を必要とする。かくして複雑な
高次構造を保持した状態で蛋白質を分泌させるためには
、それにふされしいシグナル配列を開発することが望ま
れていた。
又、特開昭６１−９２５７５号公報には、細菌性分泌シ
グナル配列をコードしているＤＮＡを利用して特定の成
熟真核性蛋白質をペリプラズムあるいは菌体外へ分泌さ
せる方法が記載されている。この方法では具体的には、
シグナル配列をコードするＤＮＡは、細菌性の分泌蛋白
質または細胞膜蛋白質あるいはそれらの突然変異体から
取り出したもの、即ち天然のものを用いており、また分
泌させる真核性蛋白質は補乳類蛋白質、特にヒト成長ホ
ルモンのような成長ホルモンを得ている。
グナル配列をコードしているＤＮＡを利用して特定の成
熟真核性蛋白質をペリプラズムあるいは菌体外へ分泌さ
せる方法が記載されている。この方法では具体的には、
シグナル配列をコードするＤＮＡは、細菌性の分泌蛋白
質または細胞膜蛋白質あるいはそれらの突然変異体から
取り出したもの、即ち天然のものを用いており、また分
泌させる真核性蛋白質は補乳類蛋白質、特にヒト成長ホ
ルモンのような成長ホルモンを得ている。
さらに、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）、２６２，１０
１８９（１９８７）では、毒素原性大腸菌の産生ずる易
熱性エンテロトキシンＢサブユニット蛋白質のシグナル
配列を改変する試みが行なわれており、真核細胞におい
て、改変シグナルペプチドが天然型シグナルペプチドと
は異なる機能を示すことが記載されているが、蛋白質の
分泌社増大については言及されていない。
リー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）、２６２，１０
１８９（１９８７）では、毒素原性大腸菌の産生ずる易
熱性エンテロトキシンＢサブユニット蛋白質のシグナル
配列を改変する試みが行なわれており、真核細胞におい
て、改変シグナルペプチドが天然型シグナルペプチドと
は異なる機能を示すことが記載されているが、蛋白質の
分泌社増大については言及されていない。
Ｗ、題を解決するための手段
本発明者等は蛋白質の１摸透過に関与するシグナル配列
を利用して宿主の菌体内で産生された蛋白質をペリプラ
ズムあるいは菌体外へ分泌させ蓄積させる方法により改
良を加えるべく、先に天然型細菌性分泌シグナル配列に
対応する化学合成りＮＡを用いて蛋白質、殊にｈＥＧＦ
を分泌発現する方法を提案した（特願昭６２−６１２０
７号出願）が、更に研究を重ねた結果、天然型細菌性分
泌シグナル配列の一部を改変したものに対応する化学合
成りＮＡも、所期の目的を達成し得ることを見出し、更
にそのＤＮＡの普遍化を進めて本発明に到達したもので
ある。
を利用して宿主の菌体内で産生された蛋白質をペリプラ
ズムあるいは菌体外へ分泌させ蓄積させる方法により改
良を加えるべく、先に天然型細菌性分泌シグナル配列に
対応する化学合成りＮＡを用いて蛋白質、殊にｈＥＧＦ
を分泌発現する方法を提案した（特願昭６２−６１２０
７号出願）が、更に研究を重ねた結果、天然型細菌性分
泌シグナル配列の一部を改変したものに対応する化学合
成りＮＡも、所期の目的を達成し得ることを見出し、更
にそのＤＮＡの普遍化を進めて本発明に到達したもので
ある。
即ち１本発明は（１）一般式
％式％
〔式中、αはＫＫ、ＫまたはＲを、βは工またはＳを、
γはＮまたはＳを示す〕で表わされる分泌シグナル配列
をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（２）ＤＮＡが
複製可能なベクターに有意義に結合されており、該ベク
ターの５′側から３′側に向って、ＤＮＡの転写を制御
するプロモーター、シャインダルガノ配列、一般式 ％式％ 〔式中、αはＫＫ、ＫまたはＲを、βは■またはＳを、
γはＮまたはＳを示す〕で表わされる分泌シグナル配列
をコードするＤＮＡとその３′末端に直結している蛋白
質をコードするＤＮＡ、および停止コドンを含むターミ
ネータ−領域が、この順次に含有されている上記（１）
記載のＤＮＡ、および（３）ＤＮＡが複製可能なベクタ
ーに有意義に結合されており、該ベクターの５′側から
３′側に向って、Ｉ）ＮＡの転写を制御するプロモータ
ー、シャインダルガノ配列、一般式 ％式％ 〔式中、αはＫＫ、ＫまたはＲを、βは工またはＳを、
γはＮまたはＳを示す〕で表わされる分泌シグナル配列
をコードするＤＮＡとその３′末端に直結している蛋白
質をコードするＤＮＡ、および停止コドンを含むターミ
ネータ−領域が、この順次に含有されているベクターを
用いて宿主細胞を形質転換し、宿主細胞を培養し、次い
で宿主のペリプラズムあるいは菌体外に蛋白質を蓄積さ
せることからなる、当該蛋白質の製造法に関するもので
ある。 本発明によって複雑な高次構造を有する蛋白質
、特にジスルフィド結合を高密度に含有する蛋白質を分
泌発現させ、これによって単純な操作によって純度の高
い活性型蛋白質を得ることが可能となったものである６ 本発明で用いられる一般式 ％式％ （式中、α、β、γについては前記のとおり）で表わさ
れる分泌シグナル配列をコードするＤＮＡは先に述べた
とおり、大腸菌毒素のような毒素のシグナル配列を改変
したものをコードするものに注目した所に端を発してお
り、中でも毒素原性大腸菌の産生ずる易熱性エンテロト
キシンＡサブユニットの改変シグナル配列をコードする
合成りＮＡをその出発点としているので、まずこれらに
ついて説明する。
γはＮまたはＳを示す〕で表わされる分泌シグナル配列
をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（２）ＤＮＡが
複製可能なベクターに有意義に結合されており、該ベク
ターの５′側から３′側に向って、ＤＮＡの転写を制御
するプロモーター、シャインダルガノ配列、一般式 ％式％ 〔式中、αはＫＫ、ＫまたはＲを、βは■またはＳを、
γはＮまたはＳを示す〕で表わされる分泌シグナル配列
をコードするＤＮＡとその３′末端に直結している蛋白
質をコードするＤＮＡ、および停止コドンを含むターミ
ネータ−領域が、この順次に含有されている上記（１）
記載のＤＮＡ、および（３）ＤＮＡが複製可能なベクタ
ーに有意義に結合されており、該ベクターの５′側から
３′側に向って、Ｉ）ＮＡの転写を制御するプロモータ
ー、シャインダルガノ配列、一般式 ％式％ 〔式中、αはＫＫ、ＫまたはＲを、βは工またはＳを、
γはＮまたはＳを示す〕で表わされる分泌シグナル配列
をコードするＤＮＡとその３′末端に直結している蛋白
質をコードするＤＮＡ、および停止コドンを含むターミ
ネータ−領域が、この順次に含有されているベクターを
用いて宿主細胞を形質転換し、宿主細胞を培養し、次い
で宿主のペリプラズムあるいは菌体外に蛋白質を蓄積さ
せることからなる、当該蛋白質の製造法に関するもので
ある。 本発明によって複雑な高次構造を有する蛋白質
、特にジスルフィド結合を高密度に含有する蛋白質を分
泌発現させ、これによって単純な操作によって純度の高
い活性型蛋白質を得ることが可能となったものである６ 本発明で用いられる一般式 ％式％ （式中、α、β、γについては前記のとおり）で表わさ
れる分泌シグナル配列をコードするＤＮＡは先に述べた
とおり、大腸菌毒素のような毒素のシグナル配列を改変
したものをコードするものに注目した所に端を発してお
り、中でも毒素原性大腸菌の産生ずる易熱性エンテロト
キシンＡサブユニットの改変シグナル配列をコードする
合成りＮＡをその出発点としているので、まずこれらに
ついて説明する。
毒素原性大腸菌の産生ずるエンテロトキシンはヒトおよ
び他の動物に下痢などの毒性を発揮するものであり〔竹
田美文、下西康嗣、山本達男、竹田長患、「蛋白質、核
酸、酵素」、■、 ３２４（１９８６））。
び他の動物に下痢などの毒性を発揮するものであり〔竹
田美文、下西康嗣、山本達男、竹田長患、「蛋白質、核
酸、酵素」、■、 ３２４（１９８６））。
耐熱性（ＳＴ）のものと熱に不安定な易熱性（ＬＴ）な
ものに大別され、それぞれにサブタイプが知られている
。
ものに大別され、それぞれにサブタイプが知られている
。
エンテロトキシンの産生は大腸菌のプラスミドによって
支配されており、薬剤耐性因子と同様、プラスミドによ
る有用物質産生にとって好都合である０本発明者等は、
大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性因子
のシグナル配列にｈＥＧＦ遺伝子を接続し、これをトリ
プトファンプロモーターの支配下に大腸菌で分泌発現さ
せた場合よりも、エンテロトキシンのシグナル配列をコ
ードする化学合成りＮＡを用いた場合（前出、特願昭６
２−６１２０７号出願）の方が、更に改良型工ンテロト
キシンＡサブユニットのシグナル配列をコードする化学
合成りＮＡを用いた方がより明らかにｈＥＧＦの分泌量
が改善されることを見出し確認した。
支配されており、薬剤耐性因子と同様、プラスミドによ
る有用物質産生にとって好都合である０本発明者等は、
大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性因子
のシグナル配列にｈＥＧＦ遺伝子を接続し、これをトリ
プトファンプロモーターの支配下に大腸菌で分泌発現さ
せた場合よりも、エンテロトキシンのシグナル配列をコ
ードする化学合成りＮＡを用いた場合（前出、特願昭６
２−６１２０７号出願）の方が、更に改良型工ンテロト
キシンＡサブユニットのシグナル配列をコードする化学
合成りＮＡを用いた方がより明らかにｈＥＧＦの分泌量
が改善されることを見出し確認した。
エンテロトキシンシグナルには上記のように大まかに分
けて耐熱性（ＳＴ）のもの及び易熱性（ＬＴ）のものの
２種があるが、ＳＴの中にはＳ Ｔ Ｉａ。
けて耐熱性（ＳＴ）のもの及び易熱性（ＬＴ）のものの
２種があるが、ＳＴの中にはＳ Ｔ Ｉａ。
ＳＴＩ ｂ、５ＴＩＩ等が、ＬＴにはＬＴｈ、ＬＴｐ（
それぞれＡ、Ｂのサブユニット蛋白が存在する）があり
、本発明で用いられているものは中でもＬＴＡの改変シ
グナルに相当するＤＮＡである。
それぞれＡ、Ｂのサブユニット蛋白が存在する）があり
、本発明で用いられているものは中でもＬＴＡの改変シ
グナルに相当するＤＮＡである。
ＬＴＡシグナル配列は、１８個のアミノ酸から成り、こ
の配列のままでは５ＴＩＩシグナル配列を用いた時と比
較すると、著しく低い蛋白質分泌能を示すにすぎない。
の配列のままでは５ＴＩＩシグナル配列を用いた時と比
較すると、著しく低い蛋白質分泌能を示すにすぎない。
しかしＬＴＡは、シグナル配列としては最も短かいもの
の一つであり、若干の改変によってその分泌能を高める
ことが可能であると考えられた。すでに知られている各
種エンテロトキシンシグナル配列を相互比較することに
よって、ＬＴＡシグナル配列に分泌シグナルとじて有効
な要素を加味するよう検討がなされた。改変シグナルの
有効度は、改変シグナル配列に対応するＤＮＡを化学合
成し、これをｈＥＧＦのＤＮＡに接続し、発現用ベクタ
ーに挿入したのち、大腸菌において分泌発現されるｈＥ
ＧＦを定量することによって達成された。
の一つであり、若干の改変によってその分泌能を高める
ことが可能であると考えられた。すでに知られている各
種エンテロトキシンシグナル配列を相互比較することに
よって、ＬＴＡシグナル配列に分泌シグナルとじて有効
な要素を加味するよう検討がなされた。改変シグナルの
有効度は、改変シグナル配列に対応するＤＮＡを化学合
成し、これをｈＥＧＦのＤＮＡに接続し、発現用ベクタ
ーに挿入したのち、大腸菌において分泌発現されるｈＥ
ＧＦを定量することによって達成された。
各種シグナル配列の効果をテストした結果、次のアミノ
酸配列で示されるものが優れた効果を有することを発見
した。なお、アミノ酸は次のようなアミノ酸の一文字記
号による表記（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会確
認規則）で表わしている。
酸配列で示されるものが優れた効果を有することを発見
した。なお、アミノ酸は次のようなアミノ酸の一文字記
号による表記（ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会確
認規則）で表わしている。
Ａ：アラニン
Ｂ：アスパラギン酸もしくはアスパラギンＣニジスティ
ン Ｄ＝アスパラギン酸 Ｅ：グルタミン酸 Ｆ：フェニルアラニン Ｇニゲリシン Ｈ：ヒスチジン エ：イソロイシン に：リジン Ｌ：ロイシン Ｍ：メチオニン Ｎ：アスパラギン Ｐニブロリン Ｑ：グルタミン Ｒ：アルギニン Ｓ：セリン Ｔ：スレオニン ■：バリン Ｗニトリブトファン Ｙ：チロシン Ｚ：グルタミン酸もしくはグルタミン Ｘ：未知もしくは他のアミノ酸 天然のエンテロトキシンＬＴＡは次の式％式％ 一方、本発明のシグナル配列としては、例えばＭＫＮＩ
ＴＦＩＦＦＩＬＬＡＳＮＡＹＡ。
ン Ｄ＝アスパラギン酸 Ｅ：グルタミン酸 Ｆ：フェニルアラニン Ｇニゲリシン Ｈ：ヒスチジン エ：イソロイシン に：リジン Ｌ：ロイシン Ｍ：メチオニン Ｎ：アスパラギン Ｐニブロリン Ｑ：グルタミン Ｒ：アルギニン Ｓ：セリン Ｔ：スレオニン ■：バリン Ｗニトリブトファン Ｙ：チロシン Ｚ：グルタミン酸もしくはグルタミン Ｘ：未知もしくは他のアミノ酸 天然のエンテロトキシンＬＴＡは次の式％式％ 一方、本発明のシグナル配列としては、例えばＭＫＮＩ
ＴＦＩＦＦＩＬＬＡＳＮＡＹＡ。
ＭＫＮＩＴＦＩＦＦＩＬＬＡＳＳＡＹＡ。
ＭＲＮＩＴＦＩＦＦＩＬＬＡＳＮＡＹＡ。
ＭＫＫＮＩＴＦＩＦＦＩＬＬＡＳＮＡＹＡ。
ＭＫＮＩＴＦＩ ＦＦ５ＬＬＡＳＮＡＹＡ。
ＭＲＮＩＴＦＩＦＦＳＬＬＡＳＮＡＹＡ。
ＭＫＫＮＩＴＦＩＦＦＳＬＬＡＳＮＡＹＡなどが好まし
いものとして挙げられ、とりわけＭＫＮＩＴＦＩ ＦＦ
ＩＬＬＡＳＮＡＹＡ。
いものとして挙げられ、とりわけＭＫＮＩＴＦＩ ＦＦ
ＩＬＬＡＳＮＡＹＡ。
ＭＫＮＩＴＦＩＦＦＩＬＬＡＳＳＡＹＡ。
ＭＫＫＮＩＴＦＩＦＦＩＬＬＡＳＮＡＹＡなどが特に好
ましいものとして挙げられる。
ましいものとして挙げられる。
本発明で分泌発現する蛋白質としては、ヒト表皮細胞増
殖因子（ｈＥＧＦ）、ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（
ｈｂＦＧＦ）、ヒト酸性繊維芽細胞増殖因子（ｈａＦＧ
Ｆ）、ヒト・アンギオゲニン、ヒト・プロインスリン、
ヒト・インスリン様成長因子【および■。
殖因子（ｈＥＧＦ）、ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（
ｈｂＦＧＦ）、ヒト酸性繊維芽細胞増殖因子（ｈａＦＧ
Ｆ）、ヒト・アンギオゲニン、ヒト・プロインスリン、
ヒト・インスリン様成長因子【および■。
塩基性ウシ膵臓トリプシンインヒビターのようなジスル
フィド結合に富む蛋白質が、より効果のあるものとして
挙げられるが、それらの外、どのような蛋白質の分泌発
現にも、無論、有効である。
フィド結合に富む蛋白質が、より効果のあるものとして
挙げられるが、それらの外、どのような蛋白質の分泌発
現にも、無論、有効である。
本発明のＤＮＡは１分泌シグナル配列をコードするＤＮ
Ａそれ自身、あるいはその３′末端に蛋白質をコードす
るＤＮＡが直結したものであることができ、それらは更
に複製可能なベクターに組み込まれていることもでき、
その際、該ベクターの５′側から３′側に向かってＤＮ
Ａの転写を制御するプロモーター、一般式 ％式％ 〔式中、αはＫＫ、ＫまたはＲを、βは工またはＳを、
γはＮまたはＳを示す〕で表わされる分泌シグナル配列
をコードするＤＮＡ、構造遺伝子および停止コドンを含
むターミネータ−領域がこの順序で含有された形のベク
ターを包含するものである。
Ａそれ自身、あるいはその３′末端に蛋白質をコードす
るＤＮＡが直結したものであることができ、それらは更
に複製可能なベクターに組み込まれていることもでき、
その際、該ベクターの５′側から３′側に向かってＤＮ
Ａの転写を制御するプロモーター、一般式 ％式％ 〔式中、αはＫＫ、ＫまたはＲを、βは工またはＳを、
γはＮまたはＳを示す〕で表わされる分泌シグナル配列
をコードするＤＮＡ、構造遺伝子および停止コドンを含
むターミネータ−領域がこの順序で含有された形のベク
ターを包含するものである。
上記ベクターで形質転換する宿主としては、大腸菌ＨＢ
ＩＯＩ、大腸菌ＤＨＩ、大腸菌Ｃ６００、大腸菌Ｍ Ｍ
２９４ 、大腸菌ＲＲＩ等が挙げられる。
ＩＯＩ、大腸菌ＤＨＩ、大腸菌Ｃ６００、大腸菌Ｍ Ｍ
２９４ 、大腸菌ＲＲＩ等が挙げられる。
本発明は、具体的には、プロモーターの制御下に毒素原
性大腸菌のエンテロトキシンの改良型シグナル配列をコ
ードする遺伝子を備えたベクターに、所望の外来蛋白質
をコードする遺伝子を導入して得られる組み換えＤＮＡ
によって宿主を形質転換し、得られた形質転換体を適当
な条件下で培養させることにより、生理活性を発現する
ために必要な高次構造を具えた目的蛋白質を大腸菌の菌
体外あるいはべりプラズムへ効率よく分泌させることか
らなる蛋白質の製造法に関するものである。
性大腸菌のエンテロトキシンの改良型シグナル配列をコ
ードする遺伝子を備えたベクターに、所望の外来蛋白質
をコードする遺伝子を導入して得られる組み換えＤＮＡ
によって宿主を形質転換し、得られた形質転換体を適当
な条件下で培養させることにより、生理活性を発現する
ために必要な高次構造を具えた目的蛋白質を大腸菌の菌
体外あるいはべりプラズムへ効率よく分泌させることか
らなる蛋白質の製造法に関するものである。
以下にエンテロトキシンの一改良型シグナル配列に相当
するアミノ酸をコードする本発明のＤＮＡを用いｈＥＧ
Ｆを分泌発現させた場合を例にとり、詳細な説明を加え
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
するアミノ酸をコードする本発明のＤＮＡを用いｈＥＧ
Ｆを分泌発現させた場合を例にとり、詳細な説明を加え
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下、実施例によって発明の詳細な説明する。
なお、以下の実施例２（２）に記載のプラスミドｐＴＢ
４１３を用いて、大腸菌ＤＨＩ株を、Ｔ、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ ら「モレキュラー・クローニングＪ （Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）、２５０〜２５１頁（１
９８２年） Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒに
記載の方法により、形質転換させて得られた形質転換体
エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
） Ｄ Ｈ１／ ｐ Ｔ Ｂ４１３は、財団法人発、酵
研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ−１４５７６として、また昭
和６２年３月１８日から通商産業省微生物工業技術研究
所（ＦＲＩ）にＦＥＲＭ Ｐ−９２９３として寄託され
ている。
４１３を用いて、大腸菌ＤＨＩ株を、Ｔ、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ ら「モレキュラー・クローニングＪ （Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）、２５０〜２５１頁（１
９８２年） Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒに
記載の方法により、形質転換させて得られた形質転換体
エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
） Ｄ Ｈ１／ ｐ Ｔ Ｂ４１３は、財団法人発、酵
研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ−１４５７６として、また昭
和６２年３月１８日から通商産業省微生物工業技術研究
所（ＦＲＩ）にＦＥＲＭ Ｐ−９２９３として寄託され
ている。
なお、第１図にエンテロトキシンＬＴＡのシグナルペプ
チド、および本発明のシグナルペプチドの具体例のアミ
ノ酸配列を、第２図に第１図の各シグナルペプチドに対
応した化学合成りＮＡ配列を示す。第３図にはエンテロ
トキシンＬＴＡシグナルペプチドおよび本発明のシグナ
ルペプチドを化学合成するための遺伝子断片を示してい
る。第４図にはシグナルペプチド−ｈＥＧＦ連結部のア
ミノ酸および合成遺伝子配列を示し、第５図は本発明で
用いるプラスミドの構築図である。
チド、および本発明のシグナルペプチドの具体例のアミ
ノ酸配列を、第２図に第１図の各シグナルペプチドに対
応した化学合成りＮＡ配列を示す。第３図にはエンテロ
トキシンＬＴＡシグナルペプチドおよび本発明のシグナ
ルペプチドを化学合成するための遺伝子断片を示してい
る。第４図にはシグナルペプチド−ｈＥＧＦ連結部のア
ミノ酸および合成遺伝子配列を示し、第５図は本発明で
用いるプラスミドの構築図である。
実施例
１、ＤＮＡ断片の合成
第３図に示す各ＤＮＡ断片（ＬＵＩ、 ＬＵ２． ＬＵ
３゜Ｍ３３Ｕ３． Ｍ３１０１Ｊ３． Ｍ３１２Ｕ１．
ＬＬＩ、 ＬＬ２． Ｌ１２． Ｍ３３Ｌ２゜Ｍ３１
０Ｌ２． Ｍ３１２Ｌ１）はβ−シアノエチルホスホア
ミダイトを原料とし、アプライドバイオシステム社モデ
ル３８０Ａ−ＤＮＡ自動合成装置を用いて合成した。脱
保護精製は、０．２μｍｏ ｌｅの樹脂に対し濃アンモ
ニア水２ｍＲで５５℃、５時間加熱し、逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略記）で精製後、８
０％酢酸２ ｍ Ｑ、２０分間で５′末端のジメトキシ
トリチル基を除去し、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬ
Ｃで精製した。
３゜Ｍ３３Ｕ３． Ｍ３１０１Ｊ３． Ｍ３１２Ｕ１．
ＬＬＩ、 ＬＬ２． Ｌ１２． Ｍ３３Ｌ２゜Ｍ３１
０Ｌ２． Ｍ３１２Ｌ１）はβ−シアノエチルホスホア
ミダイトを原料とし、アプライドバイオシステム社モデ
ル３８０Ａ−ＤＮＡ自動合成装置を用いて合成した。脱
保護精製は、０．２μｍｏ ｌｅの樹脂に対し濃アンモ
ニア水２ｍＲで５５℃、５時間加熱し、逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略記）で精製後、８
０％酢酸２ ｍ Ｑ、２０分間で５′末端のジメトキシ
トリチル基を除去し、逆相ＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬ
Ｃで精製した。
（１）シグナルを含む断片の調製〔第２図、第３図およ
び第５図（Ａ）参照〕 ＤＮＡ断片ＬＵ２、ＬＵ３、ＬＬＩ、ＬＬ２各７５Ｑ
ｐｍｏ ｎ ｅを６６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，６）
、 ６．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭβ−メルカ
プトエタノール、１ｍＭ アデノシントリフオスフェー
ト（以下ＡＴＰと略す）の溶液１９．５μＱに溶解し、
３．５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）
を加えて全量を２０μＱとし、３７℃で１時間処理し５
′末端をリン酸化した。これらを９０℃で３分間処理後
、反応の終濃度が６６ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７，６
）、６．６ｍ Ｍ塩化マグネシウム、５００μＭＡＴＰ
となる溶液中にＬＵＩ、ＬＬ３各７５０ｐｍ。
び第５図（Ａ）参照〕 ＤＮＡ断片ＬＵ２、ＬＵ３、ＬＬＩ、ＬＬ２各７５Ｑ
ｐｍｏ ｎ ｅを６６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，６）
、 ６．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭβ−メルカ
プトエタノール、１ｍＭ アデノシントリフオスフェー
ト（以下ＡＴＰと略す）の溶液１９．５μＱに溶解し、
３．５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）
を加えて全量を２０μＱとし、３７℃で１時間処理し５
′末端をリン酸化した。これらを９０℃で３分間処理後
、反応の終濃度が６６ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７，６
）、６．６ｍ Ｍ塩化マグネシウム、５００μＭＡＴＰ
となる溶液中にＬＵＩ、ＬＬ３各７５０ｐｍ。
Ｑｅと共に加え、これを９０℃で３分間加熱後、速やか
に氷冷した。更にこれを７５℃から２０℃に２時間かけ
て徐冷した後１５℃で１０分間処理した。これに終濃度
が１０ｍＭとなるようβ−メルカプトエタノールを加え
、更にＴ４−ＤＮＡリガーゼ４００単位にューイングラ
ンド・バイオラボ社）を加えて全量を２００μＱとし、
１５℃で２０時間処理した。
に氷冷した。更にこれを７５℃から２０℃に２時間かけ
て徐冷した後１５℃で１０分間処理した。これに終濃度
が１０ｍＭとなるようβ−メルカプトエタノールを加え
、更にＴ４−ＤＮＡリガーゼ４００単位にューイングラ
ンド・バイオラボ社）を加えて全量を２００μＱとし、
１５℃で２０時間処理した。
反応後１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下Ｐ
ＡＧＥと略記）により６９塩基対（ｂｐ）のＤＮＡをゲ
ル片より回収した〔「ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジーＪ （Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、）
。
ＡＧＥと略記）により６９塩基対（ｂｐ）のＤＮＡをゲ
ル片より回収した〔「ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジーＪ （Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、）
。
υ舌、 １１９ （１９７７））。このＤＮＡを６単位
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）で前記と同
様に処理し、５′末端をリン酸化した。
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）で前記と同
様に処理し、５′末端をリン酸化した。
（２）ｈＥＧＦ断片の調製
（ｈ Ｅ Ｇ Ｆ ／ Ｈｉｎｆ−Ｐｓｔ）Ｃ第５図（
Ｂ））特開昭６２−４０２９０号（特願昭６０−１７６
９７６号）公報実施例７に記載のプラスミドｐ Ｔ ８
．４１３ （４，３ｋ ｂｐ）２００ μｇにスタンダ
ード緩衝液（以下Ｓ 、 ｂｕｆｆｅｒと略す；反応の
終濃度が２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７゜６）、７ｍＭ塩
化マグネシウム、１０ｍＭ β−メルカプトエタノー
ルとなるように調製したもの）と終濃度が５０ｍＭとな
るように塩化ナトリウムを加え、Ｈｉｎｆ Ｉ （宝酒
造） ８０単位とＰｓｔｌ（日本ジーン）１０５単位を
加えて全量を４００μＱとし３７℃で２時間処理した。
Ｂ））特開昭６２−４０２９０号（特願昭６０−１７６
９７６号）公報実施例７に記載のプラスミドｐ Ｔ ８
．４１３ （４，３ｋ ｂｐ）２００ μｇにスタンダ
ード緩衝液（以下Ｓ 、 ｂｕｆｆｅｒと略す；反応の
終濃度が２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７゜６）、７ｍＭ塩
化マグネシウム、１０ｍＭ β−メルカプトエタノー
ルとなるように調製したもの）と終濃度が５０ｍＭとな
るように塩化ナトリウムを加え、Ｈｉｎｆ Ｉ （宝酒
造） ８０単位とＰｓｔｌ（日本ジーン）１０５単位を
加えて全量を４００μＱとし３７℃で２時間処理した。
反応液は５％ＰＡＧＥを行ない１４５ｂｐのｈＥＧＦ断
片をゲルから回収した。
片をゲルから回収した。
（３）ベクター断片の調製
（ｐＴ ＲＰ７７１／ Ｃ１ａ＝Ｐｓｔ）（第５図（Ｃ
）〕プラスミドｐ’ｒ ＲＰ７７１（４，３ｋｂＰ）（
黒用勉ら「ヌクレイツク・アシッド・リサーチＪ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）、１１，３
０７７（１９８３）参照）１０ｐｇに２（２）と同様に
Ｓ 、 ｂｕｆｆｅｒと塩化ナトリウムを加え、Ｃ１ａ
ｌにューイングランド・バイオラボ社）１０単位。
）〕プラスミドｐ’ｒ ＲＰ７７１（４，３ｋｂＰ）（
黒用勉ら「ヌクレイツク・アシッド・リサーチＪ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）、１１，３
０７７（１９８３）参照）１０ｐｇに２（２）と同様に
Ｓ 、 ｂｕｆｆｅｒと塩化ナトリウムを加え、Ｃ１ａ
ｌにューイングランド・バイオラボ社）１０単位。
Ｐｓｔｌ１５単位を加えて全量を１００μＱとし、３７
℃で２時間処理した。反応液は０．７％アガロースゲル
電気泳動（ＡＧＥ）を行ない、 ３．６ｋｂｐの断片を
ゲルから回収した。
℃で２時間処理した。反応液は０．７％アガロースゲル
電気泳動（ＡＧＥ）を行ない、 ３．６ｋｂｐの断片を
ゲルから回収した。
（４）プラスミドｐＬＡＥ４の調製〔第５図（Ｄ）〕シ
グナル断片（２（１）） ０．５ ｐｍｏｌｅ、ｈ Ｅ
Ｇ Ｆ断片（２（２）） ０．５ ｐｍｏｌｅ、ベク
ター断片（２（３） ）０．０５ｐｍｏｌｅ（０，１，
ｔｔ ｇ）を６６ｍＭトリス塩酸、６．６ｍＭ塩化マグ
ネシウム、 ５００ｍ Ｍ Ａ Ｔ Ｐ、１０ｍＭ
β−メルカプトエタノール溶液に入れ、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ４００単位を加え全量２０μＱとし１５℃で２０時
間処理した。
グナル断片（２（１）） ０．５ ｐｍｏｌｅ、ｈ Ｅ
Ｇ Ｆ断片（２（２）） ０．５ ｐｍｏｌｅ、ベク
ター断片（２（３） ）０．０５ｐｍｏｌｅ（０，１，
ｔｔ ｇ）を６６ｍＭトリス塩酸、６．６ｍＭ塩化マグ
ネシウム、 ５００ｍ Ｍ Ａ Ｔ Ｐ、１０ｍＭ
β−メルカプトエタノール溶液に入れ、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ４００単位を加え全量２０μＱとし１５℃で２０時
間処理した。
第３図および第５図（Ａ）参照）
前項２（１）で用いたＤＮＡ断片のうち、ＬＵ３をＭ３
３Ｕ３に、ＬＬ２をＭ３３Ｌ２に変換して前記と同様に
処理し、改変シグナルＭ３−３を含む断片を調製した。
３Ｕ３に、ＬＬ２をＭ３３Ｌ２に変換して前記と同様に
処理し、改変シグナルＭ３−３を含む断片を調製した。
これと、ｈＥＧＦ断片Ｃ２（２））、ベクター断片（２
（３） ）とを、前項２（４）と同様に処理した。
（３） ）とを、前項２（４）と同様に処理した。
４、本発明の改変シグナルを含むｈＥＧＦ／泌−し用プ
ラスミド ｐＭＬＡ３−１０の調製（第２図、第３図お
よび第５図（Ａ）参照） 前項２（１）で用いたＤＮＡ断片のうち、ＬＵ３をＭ３
１０Ｕ３に、ＬＬ２をＭ３１０Ｌ２に変換して前記と同
様に処理し、改変シグナルＭ３−１０を含む断片を調製
した。これと、ｈＥＧＦ断片（２（２） ） 、ベクタ
ー断片（２（３） ）とを、前項２（４）と同様に処理
した。
ラスミド ｐＭＬＡ３−１０の調製（第２図、第３図お
よび第５図（Ａ）参照） 前項２（１）で用いたＤＮＡ断片のうち、ＬＵ３をＭ３
１０Ｕ３に、ＬＬ２をＭ３１０Ｌ２に変換して前記と同
様に処理し、改変シグナルＭ３−１０を含む断片を調製
した。これと、ｈＥＧＦ断片（２（２） ） 、ベクタ
ー断片（２（３） ）とを、前項２（４）と同様に処理
した。
図、第３図および第５図（Ａ）参照）
前項３で用いたＤＮＡ断片のうち、ＬＵＩをＭ３１２Ｕ
１に、ＬＬＩをＭ３１２Ｌ１に変換して前記と同様に処
理し、改変シグナルＭ３−１２を含む断片を調製した。
１に、ＬＬＩをＭ３１２Ｌ１に変換して前記と同様に処
理し、改変シグナルＭ３−１２を含む断片を調製した。
これと、ｈＥＧＦ断片〔２（２））、ベクター断片（２
（３） ：］ とを、前項２（４）と同様に処理した。
（３） ：］ とを、前項２（４）と同様に処理した。
（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら 「モレキュラー・クローニ
ング」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） 、２
５０〜２５１頁（１９８２年）ＣｏｌｄＳｐｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｕｒ） ５ｍＱのり、ブロスに、大腸菌Ｉ（ＢＩＯＩを植菌し、
３７℃で一晩培養した。この２００μＱを２０ｍ Ｑの
り。
ング」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） 、２
５０〜２５１頁（１９８２年）ＣｏｌｄＳｐｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｕｒ） ５ｍＱのり、ブロスに、大腸菌Ｉ（ＢＩＯＩを植菌し、
３７℃で一晩培養した。この２００μＱを２０ｍ Ｑの
り。
ブロスに植え、３７℃でクレットユニットが８０に達す
るまで培養し、１０分間水冷した。培養液を４℃で３０
０Ｏｒｐｍ、５分間で遠心し１分離した菌体を１０ｍＱ
の生理食塩水にｌ＠濁した後、４℃、２４００ ｒｐｍ
５分間遠心した。この菌体を５０ｍＭの塩化カルシウム
溶液１０ｍ Ｑに懸濁し、３０分間氷冷した。遠心分離
した菌体を５０ｍＭ塩化カルシウム溶液２ｍΩに懸濁し
た。このｌ＠濁液各２００μＱに２ （４）、３゜４お
よび５の反応溶液をそれぞれ１０μα加え１時間水冷後
、４２℃で７５秒間処理した。これに０．８ｍｕのり、
ブロスを加えて３７℃で１時間培養後、遠心し、上清０
．８ｍＱを除いた後、菌体を！＠濁させ１００μＱずつ
２枚のり、ブロス寒天プレート（テトラサイクリン６μ
ｇ ／ ｍ Ｑの濃度で含む）にまき、３７℃で一晩培
養した。
るまで培養し、１０分間水冷した。培養液を４℃で３０
０Ｏｒｐｍ、５分間で遠心し１分離した菌体を１０ｍＱ
の生理食塩水にｌ＠濁した後、４℃、２４００ ｒｐｍ
５分間遠心した。この菌体を５０ｍＭの塩化カルシウム
溶液１０ｍ Ｑに懸濁し、３０分間氷冷した。遠心分離
した菌体を５０ｍＭ塩化カルシウム溶液２ｍΩに懸濁し
た。このｌ＠濁液各２００μＱに２ （４）、３゜４お
よび５の反応溶液をそれぞれ１０μα加え１時間水冷後
、４２℃で７５秒間処理した。これに０．８ｍｕのり、
ブロスを加えて３７℃で１時間培養後、遠心し、上清０
．８ｍＱを除いた後、菌体を！＠濁させ１００μＱずつ
２枚のり、ブロス寒天プレート（テトラサイクリン６μ
ｇ ／ ｍ Ｑの濃度で含む）にまき、３７℃で一晩培
養した。
形質転換体のプラスミドＤＮＡをアルカリ法（Ｔ、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら 「モレキュラー・クローニング」（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） 、３６８〜３６
９頁（１９８２年）ＣｏｌｄＳｐｉｎｇ ｔ（ａｒｂｏ
ｕｒ）により調製し、Ｃ１ａＩおよびＰｓｔＩで切断反
応を行なった後、５％ＰＡＧＥにより、正しくシグナル
とｈＥＧＦ遺伝子が挿入された形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ
ＨＢ １０１／ ｐ Ｌ Ａ Ｅ ４ 、 Ｅ。
ｎｉａｔｉｓら 「モレキュラー・クローニング」（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） 、３６８〜３６
９頁（１９８２年）ＣｏｌｄＳｐｉｎｇ ｔ（ａｒｂｏ
ｕｒ）により調製し、Ｃ１ａＩおよびＰｓｔＩで切断反
応を行なった後、５％ＰＡＧＥにより、正しくシグナル
とｈＥＧＦ遺伝子が挿入された形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ
ＨＢ １０１／ ｐ Ｌ Ａ Ｅ ４ 、 Ｅ。
ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ／ｐＭＬＡ３−３． Ｅ、ｃｏｌ
ｉ ＨＢＩＯＩ／ｐＭＬＡ３−１０．Ｅ、ｃｏｌｉ Ｈ
ＢＩＯＩ／ｐＭＬＡ３−１２を選択した。
ｉ ＨＢＩＯＩ／ｐＭＬＡ３−１０．Ｅ、ｃｏｌｉ Ｈ
ＢＩＯＩ／ｐＭＬＡ３−１２を選択した。
７、ｈＥＧＦの 泌発現および 画
テトラサイクリンを１２．５μｇ／ｍＱ濃度で含むＢＨ
ｌブロス（デイフコ社）５ｍＡに、形質転換体Ｅ、ｃｏ
ｌｉ ＨＢＩＯＩ／ ｐ ＬＡＥ ４ 、 Ｅ、ｃｏｌ
ｉ ＨＢＩＯＩ／ｐＭＬＡ３−３．Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢ
ＩＯＩ／ｐＭＬＡ３−１０、Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ
／ｐＭＬＡ３−１２を植菌し、３７℃で一晩培養した。
ｌブロス（デイフコ社）５ｍＡに、形質転換体Ｅ、ｃｏ
ｌｉ ＨＢＩＯＩ／ ｐ ＬＡＥ ４ 、 Ｅ、ｃｏｌ
ｉ ＨＢＩＯＩ／ｐＭＬＡ３−３．Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢ
ＩＯＩ／ｐＭＬＡ３−１０、Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ
／ｐＭＬＡ３−１２を植菌し、３７℃で一晩培養した。
この１ｍＱを、１９ｍ ＱのＭ９培地（１％カザミノ酸
、１％グルコース、６゜５μｇ／ｍＱテトラサイクリン
を含む）に植え継ぎ３７℃、８時間培養した。この培養
液５ｎ＋Ｑを８００゜ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、培
養上清と菌体に分けた。菌体からオスモティック・ショ
ック法（Ｓ。
、１％グルコース、６゜５μｇ／ｍＱテトラサイクリン
を含む）に植え継ぎ３７℃、８時間培養した。この培養
液５ｎ＋Ｑを８００゜ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、培
養上清と菌体に分けた。菌体からオスモティック・ショ
ック法（Ｓ。
Ｊ、Ｃｈａｎら「プロシーデインゲス・オブ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳ Ａ
Ｊ （Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎ
ｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ ５ｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅ
ｒｉｃａ） 、？８、５４０１ （１９８１）参照〕に
よりペリプラズム画分を調製した。
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳ Ａ
Ｊ （Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎ
ｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ ５ｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅ
ｒｉｃａ） 、？８、５４０１ （１９８１）参照〕に
よりペリプラズム画分を調製した。
８、ｈＥＧＦの定量
培養上清画分およびペリプラズム画分をＣＬ８Ｓｅｐ
−Ｐ ａｋ （ウォーターズ社）に吸着させ、水５ＩＩ
Ｑ。
−Ｐ ａｋ （ウォーターズ社）に吸着させ、水５ＩＩ
Ｑ。
２０％アセトニトリル〔０，１％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）を含む〕２ＩＩＩＩｌで洗浄後、５０％アセトニ
トリル〔０，１％ＴＦＡを含む） ２ｍ１２で溶出した
。
ＦＡ）を含む〕２ＩＩＩＩｌで洗浄後、５０％アセトニ
トリル〔０，１％ＴＦＡを含む） ２ｍ１２で溶出した
。
溶媒を留去し、残渣を水に溶解し逆相ＨＰＬＣ（ＴＳＫ
−ＧＥＬ、０ＤＳ−１２０Ｔ；東洋曹達）により分析し
た。溶出はアセトニトリル濃度が２５％から４０％（０
，１％ＴＦＡを含む）の直線勾配を１５分間かけて行な
った。
−ＧＥＬ、０ＤＳ−１２０Ｔ；東洋曹達）により分析し
た。溶出はアセトニトリル濃度が２５％から４０％（０
，１％ＴＦＡを含む）の直線勾配を１５分間かけて行な
った。
定量は、標準のｈＥＧＦ（湧水製薬）と同じ保持時間を
示すピークの大きさを、高さ半値幅法により求め、標準
品との比較により行なった。
示すピークの大きさを、高さ半値幅法により求め、標準
品との比較により行なった。
ｈＥＧＦの分泌発現量
エンテロトキシンＬＴＡの天然型シグナルペプチドを用
いたものに比べ、本発明のシグナルペプチドを用いたも
のは蛋白質の分泌発現の効率が３倍以上と高い。
いたものに比べ、本発明のシグナルペプチドを用いたも
のは蛋白質の分泌発現の効率が３倍以上と高い。
（１）改変シグナルＭ３−３を用いたｈＥＧＦの分泌発
現 テトラサイクリンを１２．５ μｇ／ｍＱ’ＪＭ度で含
むＢＨＩブロス（デイフコ社）５ｍｕに、実施例６で得
た形質転換体Ｅ、Ｃｏ１１ ＨＢ １０１／ ｐ Ｍ
Ｌ Ａ ３−３を植菌し、３７℃で一晩培養した。この
４ｍＱを７６ｍ ｆｌのＭ９培地（１％カザミノ酸、１
％グルコース、６．５ μｇ／ｍＱテトラサイクリンを
含む）に植え継ぎ３７℃、８時間培養した。
現 テトラサイクリンを１２．５ μｇ／ｍＱ’ＪＭ度で含
むＢＨＩブロス（デイフコ社）５ｍｕに、実施例６で得
た形質転換体Ｅ、Ｃｏ１１ ＨＢ １０１／ ｐ Ｍ
Ｌ Ａ ３−３を植菌し、３７℃で一晩培養した。この
４ｍＱを７６ｍ ｆｌのＭ９培地（１％カザミノ酸、１
％グルコース、６．５ μｇ／ｍＱテトラサイクリンを
含む）に植え継ぎ３７℃、８時間培養した。
（２）分泌発現させたｈＥＧＦの精製
上記（１）で得られる培養液８０ｍＱを８００Ｏｒｐｍ
、４℃、５分間遠心して培養上清約８０ｍＱを得た。こ
のうち２０ｍｆｆをＣ１ｇ ５ｅｐ−Ｐａｋ （ウォー
ターズ社）に吸着させ、水１０ｍ！、２０％アセトニト
リル〔０，１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む〕２
ＩｌＩＱで洗浄後、５０％アセトニトリル〔０，１％Ｔ
ＦＡを含む）４ｍＱで溶出した。残りの培養上清につい
ても、同様の処理を行なった。溶出液の溶媒を留去し、
残渣を蒸留水５００μＱに溶解した。これを１００μΩ
ずつ５回に分けて、逆相ＨＰＬＣ（ＴＳＫ−ＧＥＬ、０
ＤＳ−１２０Ｔ ； ドーリ−）を用いてｈＥＧＦを含
むピークを分取した。
、４℃、５分間遠心して培養上清約８０ｍＱを得た。こ
のうち２０ｍｆｆをＣ１ｇ ５ｅｐ−Ｐａｋ （ウォー
ターズ社）に吸着させ、水１０ｍ！、２０％アセトニト
リル〔０，１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む〕２
ＩｌＩＱで洗浄後、５０％アセトニトリル〔０，１％Ｔ
ＦＡを含む）４ｍＱで溶出した。残りの培養上清につい
ても、同様の処理を行なった。溶出液の溶媒を留去し、
残渣を蒸留水５００μＱに溶解した。これを１００μΩ
ずつ５回に分けて、逆相ＨＰＬＣ（ＴＳＫ−ＧＥＬ、０
ＤＳ−１２０Ｔ ； ドーリ−）を用いてｈＥＧＦを含
むピークを分取した。
溶出条件は、アセトニトリル濃度が２５％から４０％（
０，１％ＴＦＡを含む）の１５分間の直線勾配で、１２
．５分から１２．８分の溶出液を分取した。この溶出液
の溶媒を留去し、残渣を１００μＱの蒸留水に溶解し、
同様の条件で再分取を２回行なった。溶出液の溶媒を留
去し、残渣を８０μ悲の蒸留水に溶解した。このうち６
５μＱをイオン交換ＨＰＬＣ（ＴＳＫ−ＧＥＬ、ＤＥＡ
Ｅ−５ＰＷ； ドーリ−）を用いてｈＥＧＦを含むピー
クを分取した。溶出条件は酢酸アンモニウム濃度が、０
．１Ｍから０．３Ｍの１５分間の直線勾配で、１２．７
分から１３．４分の溶出液を分取した。この溶出液の溶
媒を留去し、残渣を１００μΩの蒸留水に溶解し、前述
と同様の条件で逆相ＨＰＬＣを行ない、精製ｈＥＧＦ約
１２μｇを得た。
０，１％ＴＦＡを含む）の１５分間の直線勾配で、１２
．５分から１２．８分の溶出液を分取した。この溶出液
の溶媒を留去し、残渣を１００μＱの蒸留水に溶解し、
同様の条件で再分取を２回行なった。溶出液の溶媒を留
去し、残渣を８０μ悲の蒸留水に溶解した。このうち６
５μＱをイオン交換ＨＰＬＣ（ＴＳＫ−ＧＥＬ、ＤＥＡ
Ｅ−５ＰＷ； ドーリ−）を用いてｈＥＧＦを含むピー
クを分取した。溶出条件は酢酸アンモニウム濃度が、０
．１Ｍから０．３Ｍの１５分間の直線勾配で、１２．７
分から１３．４分の溶出液を分取した。この溶出液の溶
媒を留去し、残渣を１００μΩの蒸留水に溶解し、前述
と同様の条件で逆相ＨＰＬＣを行ない、精製ｈＥＧＦ約
１２μｇを得た。
（３）精＠ｈＥＧＦのＮ末端配列分析
精Ｈｈ Ｅ Ｇ Ｆ ３ ｔｔ ｇ （約４００ ｐ
ｍｏｌｅ）をアプライドバイオシステム社モデル４７
７Ａ気相シークエンサーを用い、Ｎ末端配列分析を行な
った。反応はＮ末端より２サイクル行ない、Ａｓｎ−８
ｅｒのＮ末端配列を同定した。
ｍｏｌｅ）をアプライドバイオシステム社モデル４７
７Ａ気相シークエンサーを用い、Ｎ末端配列分析を行な
った。反応はＮ末端より２サイクル行ない、Ａｓｎ−８
ｅｒのＮ末端配列を同定した。
１０、ｈＥＧＦのアミノ酸分析
実施例９と同様にして得た精製ｈＥＧＦ３０μｇを、４
％チオグリコール酸を含む５．７Ｎ定沸点塩酸２００μ
Ｑに溶解し、容器を封管した。これを１１０℃、２４時
間処理した後、日立Ｍｏｄｅｌ ８３５ Ａｍ１ｎｏ
Ａｃ１ｄ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてアミノ酸分析を行
なった。
％チオグリコール酸を含む５．７Ｎ定沸点塩酸２００μ
Ｑに溶解し、容器を封管した。これを１１０℃、２４時
間処理した後、日立Ｍｏｄｅｌ ８３５ Ａｍ１ｎｏ
Ａｃ１ｄ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてアミノ酸分析を行
なった。
以下に結果を示す。
Ａｓｐ＋Ａｓｎ ６．６３（７）、 Ｓｅｒ ２．８３
（３）、 Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ ５．１２（５）。
（３）、 Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ ５．１２（５）。
Ｐｒｏ １．２７（１）、 Ｇｌｙ ４．１０（４）、
Ａｌａ ２．００（２）、 Ｃｙｓ （６）。
Ａｌａ ２．００（２）、 Ｃｙｓ （６）。
Ｖａｌ ２．６８（３）、 Ｎｅｔ ０．８７（１）、
Ｉｌｅ １．６４（２）、 Ｌｅｕ ４．９１（５）
。
Ｉｌｅ １．６４（２）、 Ｌｅｕ ４．９１（５）
。
Ｔｙｒ ４．９９（５）、 Ｌｙｓ １．７６（２）、
１ｌｉｓ ｔ、９７（２）、 Ａｒｇ ３．２４（３
）。
１ｌｉｓ ｔ、９７（２）、 Ａｒｇ ３．２４（３
）。
Ｔｒｐ １．７６（２）
１１、ｈＥＧＦの生物活性測定
ヒト偏平上皮ガン細胞Ｈ５Ｃ−１細胞に対する増殖阻害
〔バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ） 、ジャーナルオブセルラ
ーバイオロジー（Ｊ、 Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、）、９
３．１（１９８２））を調べたところ、ｈＥＧＦ培養上
清は顕著な生物活性を示した（第１表）。
〔バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ） 、ジャーナルオブセルラ
ーバイオロジー（Ｊ、 Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、）、９
３．１（１９８２））を調べたところ、ｈＥＧＦ培養上
清は顕著な生物活性を示した（第１表）。
また、ＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３−Ａ３１細胞に対する増殖
促進（ローズ（Ｒｏｓｅ）ら、ジャーナルオブセルラー
フィジオロジー（Ｊ、 Ｃａ１１． Ｐｈｙｓｉｏｌ
、）、 ８６゜５９３（１９７５））を調べたところ、
ｈＥＧＦ培養上清は顕著な生物活性を示した（第２表）
。
促進（ローズ（Ｒｏｓｅ）ら、ジャーナルオブセルラー
フィジオロジー（Ｊ、 Ｃａ１１． Ｐｈｙｓｉｏｌ
、）、 ８６゜５９３（１９７５））を調べたところ、
ｈＥＧＦ培養上清は顕著な生物活性を示した（第２表）
。
第１表 Ｈ８Ｃ−１細胞に対する増殖阻害性１）対照
として、実施例２（３）に記載のプラスミドｐＴＲＰ
７７１を用いて実施例６と同様にＥ、 ｃｏｌｉ Ｉｔ
ＢＩＯＩを形質転換して得たＥ、 ｃｏｌｉ ｔ（ＢＩ
ＯＩ／ｐＴＲＰ ７７１を、実施例９（１）と同様に培
養して得た培養上清（ｈ Ｅ Ｇ Ｆを発現していない
培養上清）を用いた。
として、実施例２（３）に記載のプラスミドｐＴＲＰ
７７１を用いて実施例６と同様にＥ、 ｃｏｌｉ Ｉｔ
ＢＩＯＩを形質転換して得たＥ、 ｃｏｌｉ ｔ（ＢＩ
ＯＩ／ｐＴＲＰ ７７１を、実施例９（１）と同様に培
養して得た培養上清（ｈ Ｅ Ｇ Ｆを発現していない
培養上清）を用いた。
第２表 ＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３−Ａ ３１１ｊＪＪＪ
抱に対する増殖促進
抱に対する増殖促進
第１図はエンテロトキシンＬＴＡの天然型シグナルペプ
チドおよび本発明のシグナルペプチドの具体例のアミノ
酸配列を示し、第２図は第１図の各シグナルペプチドに
対応した化学合成りＮＡ配列を示す。 第３図は天然型エンテロトキシンＬＴＡシグナルペプチ
ドおよび本発明のシグナルペプチドを化学合成するため
の遺伝子断片を示している。 第４図はシグナルペプチド−ｈＥＧＦ連結部のアミノ酸
および合成遺伝子配列図である。 第５図は本発明で用いている蛋白質分泌発現用プラスミ
ドの構築図である。
チドおよび本発明のシグナルペプチドの具体例のアミノ
酸配列を示し、第２図は第１図の各シグナルペプチドに
対応した化学合成りＮＡ配列を示す。 第３図は天然型エンテロトキシンＬＴＡシグナルペプチ
ドおよび本発明のシグナルペプチドを化学合成するため
の遺伝子断片を示している。 第４図はシグナルペプチド−ｈＥＧＦ連結部のアミノ酸
および合成遺伝子配列図である。 第５図は本発明で用いている蛋白質分泌発現用プラスミ
ドの構築図である。
Claims (7)
- （１）一般式 ＭαＮＩＴＦＩＦＦβＬＬＡＳγＡＹＡ 〔式中、αはＫＫ、ＫまたはＲを、βはＩまたはＳを、
γはＮまたはＳを示す〕 で表わされる分泌シグナル配列をコードするＤＮＡを含
有するＤＮＡ。 - （２）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡの３′末端
に蛋白質をコードするＤＮＡが直結している請求項１記
載のＤＮＡ。 - （３）シグナル配列が ＭＫＮＩＴＦＩＦＦＩＬＬＡＳＮＡＹＡ、 ＭＫＮＩＴＦＩＦＦＩＬＬＡＳＳＡＹＡ または ＭＫＫＮＩＴＦＩＦＦＩＬＬＡＳＮＡＹＡ のいずれか一つで表わされるものである請求項１または
２記載のＤＮＡ。 - （４）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡが化学的に
合成したＤＮＡである請求項１、２、または３記載のＤ
ＮＡ。 - （５）蛋白質がヒト表皮細胞増殖因子である請求項２、
３または４記載のＤＮＡ。 - （６）ＤＮＡが複製可能なベクターに有意義に結合され
ており、該ベクターの５′側から３′側に向って、ＤＮ
Ａの転写を制御するプロモーター、シャインダルガノ配
列、一般式 ＭαＮＩＴＦＩＦＦβＬＡＳγＡＹＡ 〔式中、αはＫＫ、ＫまたはＲを、βはＩまたはＳを、
γはＮまたはＳを示す〕で表わされる分泌シグナル配列
をコードするＤＮＡとその３′末端に直結している蛋白
質をコードするＤＮＡ、および停止コドンを含むターミ
ネーター領域が、この順次に含有されている請求項１記
載のＤＮＡ。 - （７）ＤＮＡが複製可能なベクターに有意義に結合され
ており、該ベクターの５′側から３′側に向って、ＤＮ
Ａの転写を制御するプロモーター、シャインダルガノ配
列、一般式 ＭαＮＩＴＦＩＦＦβＬＬＡＳγＡＹＡ 〔式中、αはＫＫ、ＫまたはＲを、βはＩまたはＳを、
γはＮまたはＳを示す〕で表わされる分泌シグナル配列
をコードするＤＮＡとその３′末端に直結している蛋白
質をコードするＤＮＡ、および停止コドンを含むターミ
ネーター領域が、この順次に含有されているベクターを
用いて宿主細胞を形質転換し、宿主細胞を培養し、次い
で宿主のペリプラズムあるいは菌体外に蛋白質を蓄積さ
せることからなる、当該蛋白質の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63234747A JP2670104B2 (ja) | 1987-09-24 | 1988-09-21 | 蛋白質の分泌発現 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-237298 | 1987-09-24 | ||
| JP23729887 | 1987-09-24 | ||
| JP63234747A JP2670104B2 (ja) | 1987-09-24 | 1988-09-21 | 蛋白質の分泌発現 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01165385A true JPH01165385A (ja) | 1989-06-29 |
| JP2670104B2 JP2670104B2 (ja) | 1997-10-29 |
Family
ID=26531738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63234747A Expired - Fee Related JP2670104B2 (ja) | 1987-09-24 | 1988-09-21 | 蛋白質の分泌発現 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2670104B2 (ja) |
-
1988
- 1988-09-21 JP JP63234747A patent/JP2670104B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2670104B2 (ja) | 1997-10-29 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |