JPH04330097A

JPH04330097A - キメラ繊維芽細胞成長因子

Info

Publication number: JPH04330097A
Application number: JP3331568A
Authority: JP
Inventors: Andrew P Seddon; アンドリユー・ピー・セツドン; Peter Bohlen; ピーター・ボーレン; Yakov Gluzman; ヤコブ・グルツマン
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1990-11-23
Filing date: 1991-11-21
Publication date: 1992-11-18
Anticipated expiration: 2016-09-04
Also published as: KR920009848A; PT99565A; CA2055963C; AU646514B2; KR100205078B1; IL99984A; DE69119869D1; IL99984A0; DE69119869T2; US5371206A; JP3205578B2; CA2055963A1; ZA919260B; EP0486862A1; IE74956B1; IE914068A1; US5302702A; PT99565B; AU8806291A; GR3020237T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【本発明の背景】本発明は新規のキメラの塩基性繊維芽
細胞成長因子並びに該成長因子（ｂＦＧＦ）を増殖生産
する方法に関する。

【０００２】ポリペプチド成長因子は細胞の増殖および
分化を行うホルモンに似たモジュレータである。成長因
子は成長、再生および傷の修復を含む種々の生理学的な
過程を調節する作用をもっている。

【０００３】これらの成長因子の研究の過程において、
種々の組織、例えば脳、脳下垂体、視床下部からの抽出
物が培養された細胞の有糸分裂を刺激する能力に関し、
多数の成長因子が同定されてきた。これらの抽出物中の
活性因子には多数の簡略化された名前が付けられ、これ
らの中には上皮成長因子、血小板誘導成長因子、神経成
長因子、造血成長因子および繊維芽細胞成長因子が含ま
れる。

【０００４】繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は１９７４
年ゴスポダロヴィッツ（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ）
により、繊維芽細胞および内皮細胞に対するマイトジェ
ンである牛の脳または脳下垂体の組織から誘導されるも
のとして初めて発表された［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ
）誌２４９巻１２３〜１２７頁］。後に脳から得られる
主なマイトジェンは脳下垂体から分離されたものとは異
なることが報告された。これらの２種の成長因子はそれ
ぞれ酸性および塩基性のＦＧＦと名付けられた。何故な
らば両者は全く同じではないが同様な生物活性を有し、
等電位点が個となっているからである。酸性および塩基
性の繊維芽細胞成長因子［最近ダヴリュー・エイチ・バ
ージェス（Ｗ．Ｈ．Ｂｕｒｇｅｓｓ）およびティー・マ
シアグ（Ｔ．Ｍａｃｉａｇ）によりアニュアル・レヴィ
ユー・オヴ・バイオケミストリー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．）誌５８巻５７５〜６０６頁（１９８９
年）総説が書かれている］はヘパリン結合成長因子の１
種の通常の構成員であり、内皮細胞、平滑筋細胞、副腎
皮質細胞、前立腺細胞、網膜上皮細胞、オリゴデンドロ
サイト、アストロサイト、クリンドサイト、筋芽細胞、
骨芽細胞を含む大部分の中胚葉細胞および脳外胚葉から
誘導される細胞の一般的な増殖能力に影響を及ぼす［デ
ィー・ゴスポダロヴィッツ等、Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ　
　Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎ．４８巻１０９〜１３０頁（１９７
８年）、および上記バージェス並びにマシアグの論文５
８４頁］。人のメラノサイトは塩基性の繊維芽細胞成長
因子の突然変異を誘起するような影響に対し応答するが
、酸性のＦＧＦは応答しない。しかしながら、大部分の
型の鳥類および哺乳類の細胞は両方のポリペプチドに応
答する（上記バージェス等の論文）。

【０００５】繊維芽細胞成長因子は細胞の成長を刺激す
る突然変異的な応答を誘起することの他に、多数の型の
細胞を刺激し突然変異的でない応答を行和せることがで
きる。これらの活性には傷を負った区域への細胞の移動
の促進（走化性）、新しい血管の生成（アンギオジェネ
シス）、神経再生の調節（ニューロトロピズム）、およ
び特定の細胞蛋白質の表現、細胞外マトリックスの生産
および治癒過程において重要な細胞の生存に対する刺激
または抑制が含まれる（上記バージェス並びにマシアグ
の論文５８４〜５８８頁）。

【０００６】これらの性質は、細胞の成長促進作用と共
に、繊維芽細胞成長因子を治療の目的に使用して、傷の
治癒の促進、および血栓症、動脈硬化等の予防および治
療を行う基礎となる。従って繊維芽細胞成長因子は外傷
を受けた組織の治癒を促進し［ジェー・エム・ダヴィド
ソン等、ジャーナル・オヴ・セル・バイオロジー誌１０
０巻１２１９〜１２２７頁（１９８５年）］、心臓の病
気および手術の際の心筋の損傷を最小限度に抑制し（フ
ランコの米国特許第４，２９６，１００号および第４，
３７８，３４７号）、ニューロンの生存と軸索突起の延
長を増加させる［ピー・ウォリック等、米国プロシーデ
ィング・オヴ・ナチュラル・アカデミー・オヴ・サイエ
ンス誌８３巻３０１２〜３０１６頁（１９８６年）］こ
とが示唆されて来た。

【０００７】従来から人の酸性の、並びに人および牛の
塩基性の繊維芽細胞成長因子をコード化した相補的なＤ
ＮＡクローンが分離され配列が得られており、この相補
的なＤＮＡから得られた予測されるアミノ酸配列は蛋白
質の配列分析法により決定された構造と一致している（
上記バージェスおよびマシアグの総説の５８０〜５８１
頁にまとめられている）。これらのデータから酸性の繊
維芽細胞成長因子（以後ａＦＧＦと略記する）は１５５
個のアミノ酸をもっていることが予測される（上記文献
参照）。塩基性の繊維芽細胞成長因子（以後ｂＦＧＦと
略記する）に対する遺伝子も１５５残基の蛋白質をコー
ドしている。ａＦＧＦおよびｂＦＧＦの両方に対しＮ−
末端の切断された形が存在し、これは全部の生物活性を
含んでおり、最初に分離され配列化されたｂＦＧＦの１
４６個のアミノ酸を含むもの［エフ・エッシュ等、米国
プロシーディング・オヴ・ナチュラル・アカデミー・オ
ヴ・サイエンス誌８２巻６５０７〜６５１１頁（１９８
５年）および１３１個のアミノ酸を含むものとがある。構造を解析した結果ａＦＧＦとｂＦＧＦとの間に５５％
の一致が見られた（上記バージェスおよびマシアグの総
説の５８１頁）。

【０００８】塩基性の繊維芽細胞成長因子は哺乳類の組
織から抽出することができるが、これにはヘパリン結合
アフィニティークロマトグラフを使用したとしても数段
階を必要とし（ゴスポダロヴィッツ等の米国特許第４，
７８５，０７９号および第４，９０２，７８２号）、プ
ロテアーゼ阻害剤なしで抽出を行うと一般に１４６個の
アミノ酸をもつ種が得られる（同特許第９欄２９〜３２
行）。牛および人の塩基性繊維芽細胞成長因子ｃＤＮＡ
は大腸菌［エム・イワネ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｎ．誌１４６巻４７０〜４７
７頁（１９８７年）、およびシー・エイチ・スクァイヤ
ーズ等、ジャーナル・オヴ・バイオロジカル・ケミスト
リー誌２６３巻１６２９７〜１６３０２頁（１９８８年
）］、およびエス・セルヴィシアエ（Ｓ．ｃｅｒｖｉｃ
ｉａｅ）［ピー・ジェー・バー等、ジャーナル・オヴ・
バイオロジカル・ケミストリー誌２６３巻１６４７１〜
１６４７８頁（１９８８年）］中で表現されている。しかし生成物の報告された収率は低く（エッシュ等のヨ
ーロッパ特許明細書第２２８，４４９号１８頁参照）、
組み替えられた成長因子は蛋白質中で遊離のチオール基
により促進されるチオール−ジスルフィド交換を行う傾
向が強く、その結果ジスルフィドがスクランブルされた
種が生じる（上記イワネの論文参照）。

【０００９】多数の塩基性繊維芽細胞成長因子の同族体
が示唆されている。ｂＦＧＦの変種でアミノまたはカル
ボキシル末端アミノ基が除去されたもの、アミノ酸が付
加されたもの、システインがセリンのような中性のアミ
ノ酸で置き換えられたもの、またはアスパルチン酸、ア
ルギニン、グリシン、セリンまたはバリンが他の酸で置
き換えられたものは安定性が増加していることが示唆さ
れている（セノ等のヨーロッパ特許明細書第２８１，８
２２号４頁１〜３行、および６頁２９行〜７頁１９行）
。この変種は付加された部分、除去された部分および置
き換えられた部分を２または３個有し、システインがセ
リンに置き換えられたものが最も好適である（７頁１８
〜２３行）。アラカワおよびフォックス（ヨーロッパ特
許明細書第３２０，１４８号）は天然のｂＦＧＦに存在
するシステインの少なくとも１個、好ましくは２個を他
のアミノ酸残基で置き換えると、安定性の高い同族体が
得られることを示唆している（１３頁２２〜２３行）。実施例にはセリンが示されている（５頁２６行および１
３頁２５行）が、アラニン、アスパルチン酸およびアス
パラギンも示唆されている（５頁２６行および１３頁２
２行）。同様に余分な結合を生じるシステインをセリン
で置き換え、酸化し易いシステイン、メチオニンおよび
トリプトファンをアラニン、ヴァリン、ロイシンまたは
イソロイシンで置き換えた組み換えａＦＧＦは、生物活
性が増加または改善された成長因子を与えることが示唆
されている（トーマス・ジュニアーおよびラインメイヤ
ーのヨーロッパ特許明細書第３１９，０５２号１７頁８
〜２０行）。

【００１０】カルボキシル末端から７〜４６のアミノ酸
が除去され、随時アミノ酸が置き換えられているｂＦＧ
Ｆ変種は、安定性が改善されると同時に活性を保持して
いることがセノ等のヨーロッパ特許明細書第３２６，９
０７号に記載されている（２頁５０行〜３頁４行）。フ
ィッヅ等（ヨーロッパ特許明細書第２９８７２３号）は
１２８〜１３８の残基を含むヘパリン結合領域の塩基性
または正に帯電した残基を、中性または負に帯電したア
ミノ酸で置き換えると、ヘパリン結合能力が減少し力が
強くなったＦＧＦが生じることを示唆している（５頁４
５行および５頁５４行〜６頁１６行）。バーゴンゾニ等
は２７〜３２の残基を欠いたＭ１−ｂＦＧＦ；５４〜５
８の残基を欠いたＭ２−ｂＦＧＦ；７０〜７５の残基を
欠いたＭ３−ｂＦＧＦ；７８〜８３の残基を欠いたＭ４
−ｂＦＧＦ；１１０〜１２０の残基を欠いたＭ５−ｂＦ
ＧＦ；１２８の位置のリジンおよび１２９の位置のアル
ギニンがグルタミン残基で置き換えられているＭ５ａ−
ｂＦＧＦ；および位置１１９および１２８のリジンおよ
び位置１１８および１２９のアルギニンがグルタミン残
基で置き換えられているＭ６ｂ−ｂＦＧＦの６種の同族
体を示唆している（ヨーロッパ特許明細書第３６３，６
７５号、６欄４８行〜７欄１３行）。

【００１１】しかし現在でも上記の治療に使用する目的
で新規の安定で活性をもった形の繊維芽細胞成長因子の
探索が尚続けられている。

【００１２】

【本発明の概要】本発明は生のｂＦＧＦの３の位置のア
ラニン残基および５の位置のセリン残基がグルタミン酸
で置き換えられた新規の全長に亙る（１５５個のアミノ
酸に対しコード化を行う）人の塩基性繊維芽細胞成長因
子の遺伝子および蛋白質に関する。本発明のＧｌｕ３，
５ｈｂＦＧＦはＮ−末端の８個のアミノ酸のところで人
の酸性ＦＧＦと配列が同じであり、従ってキメラＦＧＦ
と考えることができる。更に詳細に述べれば、これらの
成長因子は人のＦＧＦであるが、本発明によって他の哺
乳類のＦＧＦも得られる。

【００１３】ｇｌｕ３，５キメラ繊維芽細胞成長因子は
組織から誘導されたｂＦＧＦの突然変異誘起性をもって
いるが、大腸菌中における表現は生の配列のものよりも
著しく大きい。従って本発明によれば新規の生物活性を
もったＦＧＦおよびそれを高収率で製造する方法が提供
される。

【００１４】ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦの新規変種に関し
ても同じ発見がなされた。例えばシステイン７８および
システイン９６をチオールジスルフィドの交換（ジスル
フィドのスクランブリング）を除去するアミノ酸、例え
ばセリンで置き換えると成長因子の安定化された種類が
得られる。従って本発明はｈｂＦＧＦ（１〜１５５）を
変性して大腸菌中に表現される成長因子の収率を著しく
増加させるばかりでなく、精製を容易にし安定性を増加
させることができる。

【００１５】従って本発明によれば新規の生物学的に活
性をもった繊維芽細胞成長因子並びにこれを工業的規模
で製造する方法が提供される。好適具体化例においては
、本発明のＤＮＡでコードされた新規ＦＧＦをプラスミ
ドまたはベクターの中に挿入し、これを必要に応じ便利
に且つ効率的に保存、貯蔵または輸送することができる
。次にプラスミドまたはベクターを用いて微生物、例え
ば大腸菌に対し形質変換またはトランスフェクションを
行い、必要に応じこれを用いて本発明の新規ＦＧＦをコ
ード化するゲノム材料を保存、貯蔵および輸送すること
ができる。これらの成長因子を表現する条件下において
これらの微生物の培養すると、高収率でポリペプチドが
生産される。

【００１６】上記のように外傷を負った区域に放出され
た該成長因子は通常の治癒過程を促進するから、本発明
の新規繊維芽細胞成長因子は火傷、外科的な切除および
他の傷の治療、床ずれ等を含む皮膚の潰瘍の治療、心臓
血管系の異常、および心臓傷害後傷付いた組織の血管再
生を行うことにより血流を再び流す場合の処置、骨の修
復の促進、筋肉骨格傷害の治療、および神経萎縮症およ
び他の病気の治療などに使用する用途をもっている。

【００１７】

【本発明の詳細な記述】本発明は約１５５個のアミノ酸
をもつ新規塩基性繊維芽細胞成長因子を高収率で製造す
る方法がおよび安定化する方法に関する。本明細書には
人の成長因子についての組み換え例が提供されているが
、本発明のＦＧＦは他の哺乳類にも適用することができ
る。本発明の新規組み換えＦＧＦは全長に亙る人の塩基
性繊維芽細胞成長因子のアラニン３およびセリン５をグ
ルタミン酸で置き換えることによりつくられる。ｇｌｕ
３，５ｈｂＦＧＦはＮ−末端の８個のアミノ酸の所で配
列が人のａＦＧＦと同じであり、従ってｈａＦＧＦおよ
びｈｂＦＧＦのキメラ同族体と考えることができる。こ
の変種は生の配列をもったｂＦＧＦに比べ大腸菌中で表
現される蛋白質の収率を著しく増加させる。

【００１８】組み換えられた生のｂＦＧＦおよびｇｌｕ
３，５ｈｂＦＧＦは両方ともヘパリン−および逆相高速
液体クロマトグラフ上において微小不均一性を示す。ど
のような理論にも拘束されることを望まないが、この微
小不均一性はチオール−ジスルフィド交換（ジスルフィ
ドのスクランブル）によると思われる。何故ならば微小
不均一性はクロマトグラフにかける前に還元剤で成長因
子を処理すれば除去できるからである。成長因子の安定
化された種類の生成およびジスルフィドがスクランブル
された形の除去は部位指向突然変異によりシステイン７
８およびシステイン９６をセリンで置き換えることによ
り達成される。

【００１９】本明細書においては、蛋白質が試験管内お
よび生体内における試験でＦＧＦ活性を示し（上記のバ
ージェスおよびマシアグの総説の５８４〜５８６頁参照
）、ヘパリンと結合し、１．５〜１．７モルのＮａＣｌ
濃度でヘパリン・セファロースから流出し、人または牛
の塩基性ＦＧＦまたはそれらの合成されたまたは生のペ
プチドを用いてつくられた抗体と免疫的に反応するか、
または牛の血清アルブミンと共役なｂＦＧＦの配列をも
つ合成同族体になるならば、塩基性ＦＧＦであると定義
される。また蛋白質が試験管内および生体内における試
験でＦＧＦ活性を示し、ヘパリンと結合し、１．０〜１
．２モルのＮａＣｌ濃度でヘパリン・セファロースから
流出し、人または牛のａＦＧＦまたはそれらの合成され
たまたは生のペプチドを用いてつくられた抗体と免疫的
に反応するならば、酸性ＦＧＦであると定義される。キ
メラの繊維芽細胞成長因子は両方の型の配列を共有して
いる。任意の哺乳類、特に人の繊維芽細胞成長因子が本
発明の範囲内に含まれる。

【００２０】本発明のキメラの繊維芽細胞成長因子は約
１５５個のアミノ酸をもったｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦお
よびｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦを含み
、また約１５４個のアミノ酸をもった切断型（例えばＮ
−末端メチオニンをもたないもの、実施例６（ｂ）参照
）を含んでいる。本発明はまた７８および９６の位置の
システインを他のアミノ酸、例えばアラニン、グリシン
、アルギニン、トリプトファン、リジン、アスパルチン
酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチ
ジン、イソロイシン、ロイシン、ヴァリン、フェニルア
ラニン、チロシン、メチオニン、セリン、スレオニンま
たはプロリンで置き換えたｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ同族
体を含んでいる。さらに本発明のＦＧＦ誘導体は特定な
種ではなく、例えば牛のＦＧＦの相補的複製およびｈｂ
ＦＧＦと配列相同性をもつ他の種類のものが含まれる。

【００２１】本発明の新規繊維芽細胞成長因子は構成ア
ミノ酸から、或いはアミノ酸またはペプチドとポリペプ
チドから、当業界の専門家に公知の化学的または生化学
的方法、例えば短い繊維芽細胞のＮ−末端に順次アミノ
酸を付加してゆく方法でポリペプチドを組み立てること
により製造することができる。別法として本発明の新規
繊維芽細胞成長因子はキメラＦＧＦをコード化するＤＮ
Ａをつくり、このＤＮＡをベクターに挿入し、宿主細胞
中でベクターを表現させ、このようにしてつくられた組
み換えＦＧＦを分離する方法である。

【００２２】本発明のＦＧＦをコード化するＤＮＡはヌ
クレオチドを除去するか、ヌクレオチドを付加するか、
或いは標準の方法を用いて点変異を行うことにより人ま
たは牛の塩基性繊維芽細胞成長因子の遺伝子を変化させ
てつくられる。その例は実施例１に示されている。遺伝
子コードは重複しているために、本発明のＦＧＦをコー
ドしているＤＮＡをつくるために種々のコドンの変化の
組み合わせを選ぶことができ、キメラＦＧＦをコード化
するＤＮＡを生じるどのようなヌクレオチドの除去、付
加または点変異も本発明の範囲に含まれる。ある種の生
物中でポリペプチドを表現するには或る種のコドンがよ
り効率的であるから、本発明のＦＧＦをコードしている
ＤＮＡを得るために繊維芽細胞遺伝子をどのように変化
させるかを選ぶには、組み換えベクターの宿主として作
用する種類の生物の中で最も効率の良い表現を与えるも
のを選ぶことが好ましい。

【００２３】変化させてキメラＤＮＡをつくり得る繊維
芽細胞成長因子のＤＮＡ原料は天然のもの、組み換えた
もの、或いは合成したものであることができる。即ちＤ
ＮＡ原料は組織または組織培養物から分離するか、通常
の方法でオリゴヌクレオチドからつくるか、市販品を使
用するか、或いは繊維芽細胞からのｂＦＧＦに対してコ
ーディングを行うＲＮＡを分離し、このＲＮＡを用いて
単一鎖のｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として使用して
対応する二重鎖のＤＮＡをつくることができる。

【００２４】本発明の例には実施例２および３でつくら
れるようなキメラ繊維芽細胞ポリペプチド配列を定義す
るクローニングされた相補的なＤＮＡが含まれる。また
ＤＮＡ配列の同族体またはそれと密接に関連した相補的
なＤＮＡ、即ち、特に厳密な条件下においてハイブリッ
ド化によりキメラの繊維芽細胞ｃＤＮＡになるＤＮＡ配
列、およびそれに対応したＲＮＡが含まれる。本発明に
含まれるＤＮＡは、キメラＦＧＦをコードしている配列
の他に、ベクターを構成する配列に依存して、遺伝子の
表現を容易にする余分な配列を含んでいる。

【００２５】本発明のキメラ成長因子をコード化するＤ
ＮＡまたはそれに対応するＲＮＡを、次にベクター、例
えばｐＢＲ、ｐＵＣ、ｐＵＢ、またはｐＥＴ系列のプラ
スミドに挿入し、この組み換えられたベクターを用いて
宿主微生物の形質変換を行う。宿主生物はバクテリア［
例えば大腸菌またはビー・スブテリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）］、イースト［例えばエス・セヴリシアエ（Ｓ
．Ｃｅｖｒｉｃｉａｅ）］または哺乳類（例えばマウス
の繊維芽細胞）であることができる。従ってまた本発明
によれば、標準的な方法でつくられたキメラ成長因子を
記述するＲＮＡおよびＤＮＡの配列を導入した新規の生
物学的に機能をもったウイルスの円形プラスミドが提供
される。外因性のベクターで運ばれるＤＮＡまたはＲＮ
Ａの配列の大規模な表現を容易にする条件下において、
このようなベクターで安定に形質転換またはトランスフ
ェクションされた微生物を培養し、その培養媒質、細胞
溶解物または細胞膜残渣を分離すると所望の生成物が得
られる。大腸菌中にｈｂＦＧＦの突然変異体を表現させ
た例を実施例４に示す。

【００２６】本発明によれば、ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ
、ｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦおよび位
置７８および９６のシステインがジスルフィドのスクラ
ンブルを除去する他のアミノ酸で置き換えられている他
のｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦに対してコード化を行うＤＮ
Ａであって、選ばれた非哺乳類の宿主による表現に好適
なコドンを含み、内皮酵素を用いて制限する開裂部位が
備えられ、さらに容易に表現できるベクターを容易に構
成できる最初、末端および中間部分のＤＮＡ配列を備え
た有利な特性をもっているＤＮＡの全製造法および／ま
たは部分的製造法が提供される。従って本発明によれば
、１種またはそれ以上のアミノ酸残基に関し本明細書に
詳細に記載された形とは異なり（即ちｈｂＦＧＦに対し
て規定されたすべての残基の中の幾つかが除去された同
族体、および／または１種またはそれ以上の残基が置き
換えられた同族体、および／またはポリペプチドの末端
または中間部分に１種またはそれ以上の残基が付加され
た同族体）、ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦおよびｇｌｕ３，
５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦと同じ生物学的性質を
もったキメラ繊維芽細胞成長因子を微生物中に表現する
ためのコード化を行い得るＤＮＡの製造法（およびｃＤ
ＮＡおよび突然変異体のＤＮＡの部位特異性をもった突
然変異による発現法）が提供される。

【００２７】本発明のＤＮＡ（およびＲＮＡ）配列は一
次構造配座の少なくとも一部を有し、キメラ繊維芽細胞
成長因子の生物学的特性を一つまたはそれ以上もったポ
リペプチド生成物を原核または真核宿主細胞の中に表現
するのに有用なすべての配列に対してコード化を行うこ
とができる。これらの配列には（ａ）本明細書に記載さ
れたｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦおよびｇｌｕ３，５，ｓｅ
ｒ７８，９６ｈｂＦＧＦまたはそれに相補的な鎖をコー
ド化して得られるＤＮＡ配列；（ｂ）ハイブリッド化を
行い（本明細書記載のハイブリッド化条件またはもっと
厳密な条件下において）（ａ）に定義したＤＮＡ配列ま
たはその断片にし得るＤＮＡ配列；および（ｃ）ハイブ
リッド化をして遺伝子のコードが重複していること以外
上記（ａ）および（ｂ）と同じものになるＤＮＡ配列が
含まれる。特にキメラ繊維芽細胞成長因子の対立変種をコード化す
るゲノムＤＮＡ配列、およびキメラ繊維芽細胞成長因子
のＲＮＡ、その断片、および配列化されたＲＮＡまたは
ＤＮＡが非脊椎動物の宿主のメッセンジャーＲＮＡの転
写または複製を容易にするコドンを導入できる同族体の
コード化を行う配列が含まれる。

【００２８】本発明によって微生物的に表現されたポリ
ペプチドの分離および精製は通常の方法で行うことがで
き、これらの方法には例えば図２および３に示されたよ
うな分取クロマトグラフによる分離、および免疫的な分
離法、例えば単クローンおよび／または多クローン抗体
をつくる方法、即ち実施例５に例示された精製法が含ま
れる。

【００２９】上記の説明および下記実施例に詳細に説明
されることを要約すれば、本発明のキメラ繊維芽細胞成
長因子は全長に亙る（１５５個のアミノ酸）人の組み替
えられた塩基性繊維芽細胞成長因子であり、３の位置の
アラニンと５の位置のセリンがグルタミン酸で置き換え
られており、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ表現系を用いて大
腸菌の中に表現されたものである。［ここに用いられた
ｂＦＧＦについての番号はアブラハム等（１９８６年）
によって１５５個のアミノ酸の形に対して付けられたも
のであり、メチオニン・コドンを１の位置としている。］組み替えられた生のｂＦＧＦおよびｇｌｕ３，５ｈｂ
ＦＧＦは両方ともヘパリン−およびＲＰ−ＨＰＬＣ上で
広範な微小不均一性を示し（図２）、これは成長因子を
クロマトグラフにかける前にジチオトレイトールのよう
な還元剤で処理すれば除去することができる（図３）。成長因子の安定化された種をつくり、ジスルフィドがス
クランブルした形のものを除去するには、システイン７
８およびシステイン９６を部位指向突然変異によってセ
リンで置き換えることにより達成される。

【００３０】この表現系におけるｇｌｕ３，５ｈｂＦＧ
Ｆおよびｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦの
収率は両方共、ａＦＧＦ　　ｃＤＮＡと同様に、親のｂ
ＦＧＦ　　ｃＤＮＡよりも１０倍高い（実施例５）。ｇ
ｌｕ３，５ｈｂＦＧＦおよびｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８
，９６ｈｂＦＧＦの配列はＮ−末端の８個のアミノ酸の
ところでｈａＦＧＦと同じである。従ってこれらの誘導
体はキメラである。

【００３１】本発明のポリペプチドは繊維芽細胞成長因
子と同様な生物学的活性を保持している。例えば組み替
えられたｈｂＦＧＦの突然変異誘起性および突然変異に
よって得られる蛋白質を牛の脳から最初に分離されたｂ
ＦＧＦ（１０〜１５５）と比較すると（実施例７）、人
の組み替えられたｂＦＧＦおよびｇｌｕ３，５ｈｂＦＧ
Ｆは内皮細胞の成長の投与量に依存する刺激を示し、こ
れは牛の脳のｂＦＧＦと同一である（図５）。システイ
ン７８および９６をセリンで置き換えてｇｌｕ３，５，
ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦにしても、潜在的な突然変
異誘起性には影響がなく、組織から誘導された牛のｂＦ
ＧＦに対して決定されたものと区別できない投与量−応
答曲線を与える（図６）。

【００３２】本明細書記載のようにｈｂＦＧＦへの変性
を行うと、表現される成長因子の収率が著しく増加し、
その精製が容易になり、ジスルフィドのスクランブルに
よる微小不均一性が除去され、安定性が増大し、同時に
生物活性はすべて保持される。

【００３３】

【実施例】下記実施例により本発明並びに使用されたキ
ャラクタリゼーションの方法を例示する。これらの実施
例は本発明を限定するものではない。特記しない限りす
べての割合は重量により、処理の特定の段階における重
量に基づく値である。

【００３４】実施例　　１表現プラスミドの構成人のｂＦＧＦの１５５個のアミノ酸の形をコード化した
合成遺伝子［ジェー・エー・アブラハム（Ｊ．Ａ．Ａｂ
ｒａｈａｍ）等、イー・エム・ビー・オー・ジャーナル
（ＢＭＢＯ　　Ｊ．）５巻２５２３〜２５２８頁（１９
８６年）］をｐＵＣ１８にクローニングしたものを、英
国オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）のブリティッシ・
バイオテクノロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ　　Ｂｉｏ−ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ）社から購入した。次のようにしてｂ
ＦＧＦ　　ｃＤＮＡのＮ−末端メチオニン・コドンを含
む−２〜３の位置のＮｃｏｌ制限部位の切り離しと、独
特なＮｄｅｌ部位の導入を行った。変えるべきヌクレオ
チドの配列（−１２〜３６）（下記のａ）をＨｉｎｄＩ
ＩＩおよびＢｓｐＭＩＩをもつｐＵＣ　　１８、および
ｐＵＣ１８にクローニングされた内部Ｎｄｅｌ部位を含
む合成フラグメント（下記のｂ）から切り取る。このク
ローニングの結果、元の構成に比べ上手のコード化しな
い区域で４個のヌクレオチドが除去された構成が得られ
る（下記参照）。この除去は下記に述べる表現系を用い
た場合ｂＦＧＦの相対的な蛋白質の収率に影響を及ぼさ
ない。

【００３５】

【化１】

【００３６】元の（ａ）断片および変性された（ｂ）断
片に対し順方向の鎖だけが示されている。下線を引いた
部分のコドンはメチオニン開始コドンの位置を示してい
る。

【００３７】ｂＦＧＦをコード化したこのｃＤＮＡを次
にＮｄｅｌおよびＢａｍＨ１を用いてｐＵＣから切り出
し、ＲＮＡポリメラーゼに対するＴ７プロモーターを含
むｐＥＴ−３ａの誘導体［バクテリオファージＴ７によ
る表現プラスミド、エー・ローゼンバーグ（Ａ．Ｒｏｓ
ｅｎｂｅｒｇ）等によりジーン（ｇｅｎｅ）誌５６巻１
２５〜１３５頁（１９８７年）に定義］である表現ベク
ターｐＴ７Ｋａｎ５のＮｄｅｌおよびＢａｍＨ１部位に
クローニングする。

【００３８】実施例　　２ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦの構成ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦの構成手順はＮｄｅｌ制限部位
の導入に関して上記に述べた手順と同じであるが、塩基
性ＦＧＦ（ｃ）の最初の５−末端アミノ酸をコード化し
た区域は酸性ＦＧＦ（ｄ）のそれをコード化するように
変化させた。

【００３９】

【化２】

【００４０】元の（ａ）断片および変性された（ｂ）断
片に対し順方向だけが示されている。下線を引いた部分
のコドンは３および５の位置でグルタミン酸をコード化
するように変えられている。

【００４１】実施例　　３ｇｌｕ３，５Ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦの構成表現プ
ラスミドｐＴ７　　ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦをオリゴヌ
クレオチドの部位指向突然変異誘発の鋳型として用いた
。２種の突然変異誘発性のオリゴヌクレオチド・プライ
マーを位置７８および９６のシステイン・コドンをセリ
ン・コドンに変えるように設計する。位置９６のセリン
に対するプライマーは順方向の鎖（６０量体、２３８〜
２９７）に対するものであり、これに対し位置７８のセ
リンに対するプライマーは逆方向の鎖（３０量体、２５
１〜２２２）に対するものである。これらの突然変異誘
発性のプライマーの他に、Ｔ７プロモーター（−１２〜
＋１３のヌクレオチド）および末端区域（−７５〜−５
４のヌクレオチド）に対するプライマーを設計した。

【００４２】変性されたＦＧＦ遺伝子の突然変異はポリ
メラーゼによる鎖の反応（ＰＣＲ）を用いて行う。図１
に模式的に示すようにＨｉｎｄＩＩＩ切断プラスミドＤ
ＮＡを含む２種の反応混合物をつくる。（ｉ）Ｔ７の順
方向のプライマーおよびセリン７８の逆方向のプライマ
ーにより期待された３１９塩基対生成物が得られ、（ｉ
ｉ）Ｔ７の順方向のプライマーおよびセリン９６の順方
向プライマーにより期待された２９４塩基対生成物が得
られる。ＰＣＲ混合物はメーカー［米国コネチカット州
ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）パーキン・エルマー・
シータス（Ｐｅｒｋｉｎ　　Ｅｌｍｅｒ　　Ｃｅｔｕｓ
）社］の指示に従って製造した。ＰＣＲはＴａｑｇポリ
メラーゼを用い３０回の増幅サイクルの間それぞれ９２
℃で１分間、５０℃で５秒間、７２℃で１分間行い、生
成物を寒天のゲル電気泳動法で分析した。

【００４３】過剰のプライマーを増幅されたＤＮＡフラ
グメントから連続３回濃縮し、分子量３０，０００のミ
リポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ミクロ濃縮器を用いて透
析を行って分離した。保持液の部分を一緒にし、上記の
方法でＰＣＲを用いて増幅したが、この場合使用したプ
ライマーはＴ７プロモーター（順方向）およびＴ７ター
ミネーター（逆方法）の区域に対応している。図１参照
。５９９塩基対ＰＣＲ生成物を次にＮｄｅｌおよびＢａ
ｍＩＩＩで処理し、寒天のゲル電気透析法により精製し
た。精製された断片をＴ７表現ベクター、即ちｐＥＴ−
３ａの誘導体であるｐＥＴ−３ａ（Ｍ１３）にクローニ
ングした。

【００４４】実施例　　４天然の配列のｈｂＦＧＦおよびｈｂＦＧＦ突然変異体の
表現配列の証明［エフ・サンジャー（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ）等
のプロシーディング・オヴ・ナチュラル・アカデミー・
オヴ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．）誌７４巻５４６３〜５４６７頁（１９７７年）］
を行った後、ｂＦＧＦ突然変異体をコード化した遺伝子
の形質転換を行いコンピテント細胞ＢＬ２１　　ｐＬｙ
ｓＳにする。プラスミドを宿した大腸菌は、３７℃にお
いて硫酸カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）またはプラス
ミドｇｌｕ３．５ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦに対する
アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびクロランフェ
ニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含むリュリア（Ｌｕｒｉ
ａ）ブイヨンの中で６００ｎｍにおいて約０．６吸収単
位になるまで成育した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド（１ミルモル）を加えてｂＦＧＦ合成
を開始させる。２時間の誘導時間後４℃で遠心分離して
細胞を回収した。

【００４５】実施例　　５ｈｂＦＧＦ突然変異体の精製１リットルの培養液から得た細胞ペレットを５０ミルモ
ルのトリス、０．１ミルモルのＥＤＴＡ緩衝剤を含むｐ
Ｈ７．６の液３０ｍｌ中に再懸濁させ、凍結／減圧サイ
クルを迅速に３回行って溶解させる。この溶解物を次い
で５ミルモルのＭｇＣｌ２の存在下においてＤＮａｓｅ
（２０μｇ／ｍｌ）で４℃において２０分間処理し、１
０，０００×ｇにおいて２０分間遠心分離にかけ、細胞
の残渣を除去する。ｂＦＧＦの活性はペレットおよび上
澄液の中に一様に分布していることが見出された。

【００４６】米国のプロシーディング・オヴ・ナチュラ
ル・アカデミー・オヴ・サイエンス誌８１巻６９６３〜
６９６７頁（１９８４年）のディー・ゴスポラドヴィッ
ツの論文記載のヘパリン−セファロース・カラム・クロ
マトグラフにより、０．６〜３．０モルの直線勾配を付
けたＮａＣｌ濃度において流出させてｂＦＧＦの精製を
行う。成長因子を含む部分を一緒にし、ｐＨ７．６のト
リス緩衝液１０ミルモルで希釈して最終ＮａＣｌ濃度を
約０．６モルにした。

【００４７】これを１０ミルモルのｐＨ７．６のトリス
、０．６モルのＮａＣｌと平衡に保った０．７５×７．
５ｃｍのヘパリン−５ＰＷのカラム［米国フィラデルフ
ィア州フィラデルフィアのトーソーハース（ＴｏｓｏＨ
ａａｓ）社］に充填する。結合した材料の流出は２８０
ｎｍで監視し、塩の濃度に直線的な勾配を付け（６０分
で０．６〜３．０モルＮａＣｌ）流速を０．７ｍｌ／分
として流出させた。

【００４８】実施例４記載のＴ７表現系を用い、生の配
列をもったｈｂＦＧＦ（２〜１５５）の収率はバクテリ
ア培養液１リットル当たり約０．８ｍｇであった。生の
配列をもったｈａＦＧＦを用いると６〜８ｍｇ／リット
ルの収率が得られた。同じ系で表現されたｇｌｕ３，５
ｈｂＦＧＦでは精製された成長因子は８〜１０ｍｇ／リ
ットルであった。

【００４９】プラスミドｐＴ７　　ｇｌｕ３．５，ｓｅ
ｒ７８．９６を含む大腸菌を大規模培養（１０リットル
）した場合、細胞ペースト１ｇ当たり約１ｍｇの精製さ
れた成長因子が得られる。キメラｓｅｒ７８，９６変種
の蛋白質収率およびバクテリア抽出物の上澄液とペレッ
ト部分とにおける蛋白質の分布はｇｌｕ３，５ｈｂＦＧ
Ｆと同様であった。

【００５０】実施例　　６ｈｂＦＧＦおよびｈｂＦＧＦ突然変異体のキャラクタリ
ゼーション（ａ）クロマトグラフでの挙動ヘパリン高速液体クロマトグラフで精製したｂＦＧＦを
、０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル勾配（０
〜２８％ＣＨ３ＣＮで１５分間、２８〜６０％で９９分
間、６０〜３０％で１０分間）を用い流速を０．７ｍｌ
／分として逆相高速液体クロマトグラフＲＰ−ＨＰＬＣ
［Ｃ４、米国カリフォルニア州ヘスペリア（Ｈｅｓｐｅ
ｒｉａ）ヴァイダック（Ｖｙｄａｃ）ザ・セパレーショ
ン・グループ（ｔｈｅ　　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　　Ｇ
ｒｏｕｐ）］により分析する。結合した材料の流出は２
１０ｎｍで監視する。

【００５１】生の配列をもったｈｂＦＧＦ（２〜１５５
）を含む粗製細胞均質化物のヘパリン・セファロース・
クロマトグラフの流出グラフでは２個の主要な蛋白質の
ピークがあり、その両方とも突然変異誘起活性をもち、
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電
気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によればＭｒが１７，０
００の主要蛋白質種を含んでいた。ヘパリン・セファロ
ースの段階で得られたこの二つのピークの各々からの材
料をＣ４逆相高速液体クロマトグラフ（ＲＰ−ＨＰＬＣ
）にかけ、次いで分割された成分のＮ−末端分析を行っ
た結果、少なくとも３種の異なったｂＦＧＦの形である
と同定された。

【００５２】この見掛け上の微小不均一性を解析する最
初の手段として、クロマトグラフ的に異なった種の発生
ぬ対するチオール−ジスルフィド交換（ジスルフィドの
スクランブル）の寄与を還元剤で処理することにより得
た。ヘパリン・セファロースで精製したｂＦＧＦの蛋白
質をジチオトレイトール（２ミリモル）で１０分間３７
℃で培養した後ＲＰ−ＨＰＬＣで分析すると、前にｂＦ
ＧＦ主として同定されたピークが示され、クロマトグラ
フは実質的に単一のピークから成っている。

【００５３】ヘパリン・セファロースの段階からのＦＧ
Ｆを含む２個の蛋白質ピークを高分解能ＴＳＫヘパリン
高速液体クロマトグラフにかけると、１．６〜２．３モ
ルのＮａＣｌの範囲で流出する４個の主要な蛋白質成分
が現れる（図２）。このピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
析すると、Ｐ−Ｉ、Ｐ−ＩＩＩおよびＰ−ＩＶは一つの
蛋白質バンドに含まれてＭｒが１７，０００で移動し、
これはｈｂＦＧＦ（２〜１５５）と一致するが、Ｐ−Ｉ
ＩはＭｒが約２０，０００となり、Ｎ−末端分析法によ
り不純物であることが判る。ヘパリン・セファロース・
クロマトグラフで一緒に貯蔵しておいた材料の部分をジ
チオトレイトール（５ミリモル）で１０分間室温におい
て処理した後ヘパリン高速液体クロマトグラフにかける
と、Ｐ−Ｉの量が増え、Ｐ−ＩＩＩの量が減少し、Ｐ−
ＩＶは消失する。この処理によりＭｒ２２，０００を含
むＰ−ＩＩの位置と強度は影響を受けない（図３）。

【００５４】ジチオトレイトールを存在させまたは存在
させない場合のヘパリンおよびＲＰ−ＨＰＬＣ上でのｇ
ｌｕ３，５ｈｂＦＧＦのクロマトグラフ的挙動は、生の
配列をもったｈｂＦＧＦと同様である。システインをセ
リンに変える突然変異によってこの同族体の精製が非常
に容易になる。何故ならばこの変異体はヘパリンおよび
Ｃ４　　ＲＰ−ＨＰＬＣ上で単一の種として挙動し（図
４）、精製中にジチオトレイトールによる処理を省くこ
とができるからである。

【００５５】（ｂ）配列分析法逆相で精製された蛋白質のＮ−末端配列分析は４７７Ａ
型パルス液相配列解析機［米国カルフォルニア州アプラ
イド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）社］にフェニルチオヒダントイン・アミ
ノ酸オンライン解析機（１２０Ａ型、同社製）を取り付
けて行う。ＨＣｌで気相で加水分解（５．７モルＨＣｌ
／０．１％フェノール；１１０℃で２４時間）した後、
オンラインの１３０Ａ型分離系（同社製）を取り付けた
４２０Ａ型フェニルチオヒダントイン・デリヴァタイザ
ーを用いてアミノ酸の組成を決定する。

【００５６】ヘパリンＨＰＬＣで分離された材料のＮ−
末端配列分析によればｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ（２〜１
５５）に一致した単一の配列が得られ、このことはＮ−
末端メチオニンが完全に除去されていることを示してい
る。

【００５７】（ｃ）分子量分子量の決定は１０〜１５％の勾配を付けた２０％の均
一なポリアクリルアミド・ゲル上においてドデシル硫酸
ナトリウムの存在下で（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）銀染色検出
系［ファストゲル・システム（Ｐｈａｓｔｇｅｌ　　Ｓ
ｙｓｔｅｍ）／ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）／
ＬＫＢ］を用いて行う。

【００５８】ｈｂＦＧＦ（２〜１５５）はＭｒ１７，０
００で移動するが、これはｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦに対
する約１９，０００のＭｒ値に匹敵する。ｈｂＦＧＦお
よびそのキメラに対しアミノ酸配列のデータから計算さ
れた分子量はそれぞれ１７，１２４および１７，２２４
であった。見掛けの分子量の不一致を解決するために、
液体二次イオン質量分析計でｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦの
試料を分析し、分子イオンの質量として１７，３６５を
得た。この値は実験誤差の範囲で配列のデータから予測
された値と一致する。どのような理論にも拘束されたく
ないが、変性条件下においてポリアクリルアミド・ゲル
上におけるｇｌｕ３，５の異常な移動は位置３および５
におけるグルタミル側鎖からの蛋白質−ＳＤＳ相互作用
の干渉によると考えることが最も確からしい。

【００５９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上においてｇｌｕ３，５
．ｓｅｒ７８，９６もＭｒ１９，０００の蛋白質として
移動し、予想されたＭｒ１７，０００の種として移動す
るのではない。この観測はｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦに対
する異常な移動と一致している。

【００６０】実施例　　７生および突然変異体のｈｂＦＧＦ誘導体の生物検定生の
配列をもったｈｂＦＧＦおよびその突然変異体の突然変
異誘起特性は、エッシュ（Ｅｓｃｈ）等の米国プロシー
ディング・オヴ・ナチュラル・アカデミー・オヴ・サイ
エンス誌８２巻６５０７〜６５１１頁（１９８５年）記
載の方法により大動脈弓から誘導された牛の内皮細胞を
用いて決定する。１０％の牛の血清［ハイクロン（Ｈｙ
ｃｌｏｎｅ）、ローガン（Ｌｏｇａｎ）、ＵＴ］を含み
、これにペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプト
マイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびＬ−グルタミン（
２ミリモル）を加えたダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）
の方法で変性したイーグル（Ｅａｇｌｅ）の媒質（ＤＭ
ＥＭ）０．５ｍｌ中において２４個の穴をもった培養板
１枚当たり初期密度０．８×１０４個の細胞を接種する
。接種後２時間して０．５％の牛の血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）を含むＤＭＥＭ中にｂＦＧＦを適当に希釈した（
０．００１〜１００ｎｇ／ｍｌ）試料２０μｌを加えた
。培養器に入れて５日後二重の培養板をトリプシン化し
、クルター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）のカウンターで細胞を数
えて細胞の密度を決定した。

【００６１】別法として、燐酸ｐ−ニトロフェニルを基
質として用い細胞を溶解した後に酸フォスファターゼの
濃度を測定することにより、ｂＦＧＦが存在する場合お
よびしない場合での成長曲線をつくる［ディー・ティー
・コンノリー（Ｄ．Ｔ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）等、アナリ
ティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．）誌１５２巻１３６〜１４０頁（１９８６年）１
３７頁］。１０％の牛の血清、抗生物質およびＬ−グル
タミンを含む０．２５ｍｌのＤＭＥＭ中において穴１個
当たりの細胞の初期密度１０００〜１２００で細胞を接
種する（０．３２ｃｍ２、直径０．６４ｃｍの平らな底
の９６個の穴を備えた板を使用）。接種後０．５％のＢ
ＳＡを含むＤＭＥＭ中に成長因子を適当に希釈した（０
．００１〜１００ｎｇ／ｍｌ）試料１０μｌを加える。

【００６２】４〜５日培養した後、各穴を洗滌し、各穴
に０．１モルの酢酸ナトリウム、０．１％のトリトン（
Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００および１０ミリモルの燐酸ｐ
−ニトロフェニル［シグマ（Ｓｉｇｍａ１０４フォスフ
ォターゼ基質）］を含むｐＨ５．５の緩衝液に加える。板を３７℃で２時間保温し、１Ｎの水酸化ナトリウム１
０μｌを加えて反応を停止させ、ＵＶマックス・カイネ
ティック・マイクロプレート・リーダー（ＵＶ　　ｍａ
ｘ　　ｋｉｎｅｔｉｃ　　ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　　ｒ
ｅａｄｅｒ）［米国カリフォルニア州モレキュラー・デ
ヴァイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　ｄｅｖｉｃｅ）社］
を用いて、細胞を加えないで培養した対照の緩衝液と比
較して４０５ｎｍにおける発色度を決定する。両方の方
法とも区別できない投与量−応答曲線を与える。

【００６３】組み換えｈｂＦＧＦおよび突然変異体の突
然変異誘起性を牛の脳から最初に分離されたｂＦＧＦ（
１０〜１５５）と比較すると、人の組み換えｂＦＧＦお
よびｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦは内皮細胞の成長の投与量
に依存した刺激を示し、これは牛の脳のｂＦＧＦと同じ
であり（図５）、最高刺激の半分の値の投与量（平均有
効投与量ＥＤ５０）として０．３〜１．０ｎｇ／ｍｌ、
最高刺激に対し３〜１０ｎｇ／ｍｌである。システイン
７８および９６をセリンと入れ換えてｇｋｕ３，５，ｓ
ｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦをつくても潜在的な突然変異
誘起性には影響がなく、組織から誘導された牛のｂＦＧ
Ｆに対して決定されたものと区別できない投与量−応答
曲線を与える。

【００６４】上記の説明は当業界の専門家に本発明をい
かにして実施するかを説明する目的のものであり、当業
界の専門家がこれらの説明を読んで明らかになる明白な
変形または変更のすべての詳細を示そうとしたものでは
ないことを了解されたい。しかしこのようなすべての変
形および変更は添付特許請求の範囲に定義されているよ
うに本発明の範囲内に入るものである。

【００６５】ＤＮＡ配列、プラスミドおよび／または本
発明に関連して保存された微生物は米国ニューヨーク州
パール・リヴァー（Ｐｅａｒｌ　　Ｒｉｖｅｒ）のアメ
リカン・サイヤナミド・コンパニー（Ａｍｅｒｉｃａｎ
　　ＣｙａｎａｍｉｄＣｏｍｐａｎｙ）の培養基保存室
に保存されており、適切な手続きにより誰でも入手する
ことができる。さらに下記のものが下記の日付で下記の
ＡＴＣＣ番号が付されて米国メリーランド州ロックヴィ
ル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）２０９５２、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　
　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）
に保存されている。

【００６６】ＢＬ２１　　ｌｙｓＳ／ｐＥＴ　　ｇｌｕ
３，５ｓｅｒ７８，９６、１９９０年１１月１３日、Ａ
ＴＴＣ番号６８４７８ＢＬ２１　　ｌｙｓ−Ｓ／ｐＥＴ　　ｇｌｕ３，５ｈｂ
ＦＧＦ、１９９０年１１月１３日、ＡＴＴＣ番号６８４
７７上記の二つは本明細書記載のｇｌｕ３，５ｓｅｒ７
８，９６ｈｂＦＧＦおよびｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦを含
んでいる。

【００６７】実施例　　８ｍＥｏ−ｐｅｇ化合物による誘導体ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ（２〜１５５）を上記方法でつ
くる。ポリエチレングリコールヨードアセテート（ｍｅ
Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ２−ＣＣＨ２Ｉ；分子量＝２０００およ
び５０００）およびヨードアセトアミド（ＭｅＯ−ＰＥ
Ｇ−ＮＨＣＤＣＨ２Ｉ；分子量＝５０００）を下記方法
でつくる。

【００６８】２ミリモルのＥＤＴＡを含むｐＨ８．６、
トリス０．１モルの緩衝液中でｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ
（５ｍｇ／ｍｌ）をジチオトレイトール（５ミリモル）
で還元し、アルゴン雰囲気下において室温で１時間保温
する。ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｏ２−ＣＣＨ２Ｉ分子量＝２０
００または５０００）ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨＣＯＣＨ２
Ｉ（分子量＝５０００）を加えて最終濃度を２５〜５０
ミリモルにし、次いで反応混合物を燐酸で緩衝した塩水
（ＰＢＳ）に対し４℃で１２時間透析する。

【００６９】実施例　　９誘導体にしたＦＧＦｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ（５ｍｇ／ｍｌ）を１．５モル
のＮａＣｌを含むｐＨ７．４のトリス緩衝液１０ミリモ
ル中においてジチオトレイトール（５ミリモル）で還元
し、アルゴン雰囲気下において室温で０．５〜１時間保
温する。ヨード酢酸（ｐＨ８．５のトリス緩衝液１モル
中に０．４モル）を加えて最終濃度を５０ミリモルにし
、反応混合物を暗所において２時間室温で保温する。次いでこの溶液を０．５モルのＮａＣｌを含む１０ミリ
モルのトリス緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析する。

【００７０】ｂＦＧＦのポリエチレングリコール誘導体
およびカルボキシメチル化されたｂＦＧＦを前記方法で
検定した。

【００７１】実施例１０カルボキシメチル化されたＦＧＦカルボキシメチル化されたｂＦＧＦ：　　非変性条件下
においてｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ（２〜１５５）をヨー
ド酢酸で処理すると、ｂＦＧＦの４個のシステイン残基
の２個にカルボキシメチル化が起こる。変性されたシス
テインの位置は１４Ｃでラベルしたカルボキシメチル化
されたｂＦＧＦのエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ蒸解
物のペプチド・マッピングによりシステイン７８および
９６と同定される。システイン７８および９６を変性し
てもヘパリンに対するｂＦＧＦの親和性には影響がない
。ｇｌｕ３，５ＣＭＣｙｓ７８，９６ｈｂＦＧＦの突然
変異誘起性およびレセプター結合特性はｇｌｕ３，５ｈ
ｂＦＧＦと同じである（図１）が、完全にカルボキシメ
チル化されたｂＦＧＦは活性をもっているようには見え
ない。変性されていないｂＦＧＦとは対照的にｇｌｕ３
，５ｈｂＦＧＦはｐ４における半減期が約５分であるの
に対し、ｇｌｕ３，５ＣＭＣｙｓ７８，９６ｈｂＦＧＦ
では６０分より長い（図２参照）。

【００７２】ｂＦＧＦのポリエチレングリコールエステ
ル：　　ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦのＰＥＧ−２０００お
よび−５０００の誘導体は牛の内皮細胞突然変異誘起試
験では完全に活性があり（図３）、ヘパリンに結合する
。ＰＥＧのエステル誘導体は加水分解してカルボキシメチ
ル化されたｂＦＧＦ、即ち安定化された十分な活性をも
つ同族体になり、これはドデシル硫酸ナトリウム・ポリ
アクリルアミド・ゲル上において１８Ｋｄ蛋白質（ｇｌ
ｕ３，５ＣＭＣｙｓ７８，９６ｈｂＦＧＦ）の出現によ
って監視することができる。

【００７３】ｂＦＧＦのポリエチレングリコールアミド
：　　ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦのＰＥＧ−５０００誘導
体はＰＥＧエステルとは対照的に安定である。これはＢ
ａｌｂＣ３Ｔ３繊維芽細胞突然変異誘起検定において完
全に活性であり、ＦＧＦレセプター結合検定試験におい
ては変性されていないｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦと同程度
に効果的に競合する。

【００７４】参考文献１．アブラハム，ジェー・エー等、イー・エム・ビー・
オー・ジャーナル誌５巻２５２３〜２５２８頁（１９８
６年）．２．アラカワ，ティー（Ａｒａｋａｗａ，Ｔ）およびフ
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９号１２３〜１２７頁（１９７４年）．１４．ゴスポダ
ロヴィッツ，ディー、Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ　　Ｉｎｓ
ｔｉ．Ｍｏｎ．誌４８巻１０９〜１３０頁（１９７８年
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米国）誌８１巻６９６３〜６９６７頁（１９８４年）．１６．ゴスポダロヴィッツ，ディー、米国特許第４，７
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ロシーディング・オヴ・ナチュラル・アカデミー・オヴ
・サイエンス（米国）誌７４巻５４６３〜５４６７頁（
１９７７年）．２１．セノ，エム（Ｓｅｎｏ，Ｍ）等、ヨーロッパ特許
明細書２８１，８２２号（１９８８年）．２２．セノ，
エム等、ヨーロッパ特許明細書３２６，９０７号（１９
８９年）．２３．スクァイヤーズ，シー・エイチ（Ｓｑｕｉｒｅｓ
，Ｃ．Ｈ．）等、ジャーナル・オヴ・バイオロジカル・
ケミストリー誌２６３巻１６２９７〜１６３０２頁（１
９８８年）．２４．トーマス　　ジュニア，ケー・エー（Ｔｏｍａｓ
　　Ｊｎｒ，Ｋ．Ａ．）およびラインメイヤー，ディー
・エル（Ｌｉｎｍｅｙｅｒ，Ｄ．Ｌ．）、ヨーロッパ特
許明細書第３１９，０５２号（１９８９年）．２５．ウ
ォリック，ピー（Ｗａｌｉｃｋｅ，Ｐ．）等、プロシー
ディング・オヴ・ナチュラル・アカデミー・オヴ・サイ
エンス（米国）誌８３巻３０１２〜３０１６頁（１９８
６年）．配列のリスト（１）一般的事項（ｉ）出願人：　　アンドリュー・ピー・セドン（Ａｎ
ｄｒｅｗ　　Ｐ．Ｓｅｄｄｏｎ）、ピーター・ボーレン
（Ｐｅｔｅｒ　　Ｂｏｈｌｅｎ）およびヤコヴ・グルツ
マン（Ｙａｋｏｖ　　Ｇｌｕｚｍａｎ）（ｉｉ）発明の名称：　　キメラ繊維芽細胞成長因子（
ｉｉｉ）配列の数：　　２（ｉｖ）連絡先：（Ａ）宛先人：　　エステル・ジェー・チェヴドス（Ｅ
ｓｔｅｌｌｅ　　Ｊ．Ｔｓｅｖｄｏｓ）博士、アメリカ
ン・サイヤナミド・コンパニー（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　
Ｃｙａｎａｍｉｄ　　Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｂ）町名：　　ウエスト・メイン・ストリート（Ｗｅ
ｓｔ　　Ｍａｉｎ　　Ｓｔｒｅｅｔ）１９３７番地、Ｐ
．Ｏ．ボックス（Ｂｏｘ）６０（Ｃ）市名：　　スタンフォード（Ｓｔａｎｆｏｒｄ）
（Ｄ）州名：　　コネチカット（Ｅ）国名：　　アメリカ合衆国（Ｆ）ＺＩＰ：　　０６９０４−００６０（ｖ）計算機
可読形態：（Ａ）媒体の種類：　　フロッピー・ディスク（Ｂ）計
算機：　　ＩＢＭ　　ＰＣ　　ＡＴ（Ｃ）オペレーティ
ング・システム：　　ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア
ー：　　ＩＢＭのディスプレイライト（Ｄｉｓｐｌａｙ
ｗｒｉｔｅ）４から変換されたＡＳＣＩＩ（ｖｉ）現在の出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日付：（Ｃ）分類：（ｖｉｉ）以前の出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日付：（ｖｉｉｉ）弁理士／代理人の情報（Ａ）氏名：　　チェヴドス，エステル・ジェー、博士
（Ｂ）登録番号：　　３１，１４５（Ｃ）参考文書／明細書番号：　　３１，２１９−０１
（ｉｘ）通信情報：（Ａ）電話番号：　　２０３　　３２１　　２７５６（
Ｂ）ＦＡＸ番号：　　２０３　　３２１　　２９７１（
Ｃ）テレックス番号：　　７１０　　４７０　　４０５
９（２）配列に対する情報：　　識別番号１（ｉ）配列
の特徴：（Ａ）長さ：　　４５６塩基対（Ｂ）型：　　核酸（Ｃ）鎖の種類：　　単一鎖（Ｄ）形状：　　線状（ｉｉ）分子の種類：　　ＤＮＡ（ｉｉｉ）仮説：（ｉｖ）逆方向：（ｖ）断片の種類：（ｖｉ）原出所：（Ａ）生物：（Ｂ）株：（Ｃ）個々の分離物：（Ｄ）成育段階：（Ｅ）ハプロタイプ：（Ｆ）組織の型：（Ｇ）細胞の型：（Ｈ）細胞系：（Ｉ）オルガネラ：（ｖｉｉ）直接の出所（Ａ）ライブラリ：（Ｂ）クローン：（ｖｉｉｉ）ゲノムにおける位置（Ａ）染色体／セグメント（Ｂ）マップの位置（Ｃ）単位（ｉｘ）特徴（Ａ）名前／キー（Ｂ）位置（Ｃ）同定方法（Ｄ）その他の情報（ｘ）出版情報（Ａ）著者（Ｂ）標題（Ｃ）雑誌（Ｄ）巻（Ｅ）号（Ｆ）頁（Ｇ）日付（Ｈ）文書番号（Ｉ）受理の日付（Ｊ）出版の日付（Ｋ）関連事項：（ｘｉ）配列の記述：　　配列識別番号１

【００７５】

【化３】

【００７６】

【化４】

【００７７】（２）配列に対する情報：　　識別番号２
（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：　　４５６塩基対（Ｂ）型：　　核酸（Ｃ）鎖の種類：　　単一鎖（Ｄ）形状：　　線状（ｉｉ）分子の種類：　　ＤＮＡ（ｉｉｉ）仮想：（ｉｖ）逆方向：（ｖ）断片の種類：（ｖｉ）原出所：（Ａ）生物：（Ｂ）株：（Ｃ）個々の分離物：（Ｄ）成育段階：（Ｅ）ハプロタイプ：（Ｆ）組織の型：（Ｇ）細胞の型：（Ｈ）細胞系：（Ｉ）オルガネラ：（ｖｉｉ）直接の出所（Ａ）ライブラリ：（Ｂ）クローン：（ｖｉｉｉ）ゲノムにおける位置（Ａ）染色体／セグメント（Ｂ）マップの位置（Ｃ）単位（ｉｘ）特徴（Ａ）名前／キー（Ｂ）位置（Ｃ）同定方法（Ｄ）その他の情報（ｘ）出版情報（Ａ）著者（Ｂ）標題（Ｃ）雑誌（Ｄ）巻（Ｅ）号（Ｆ）頁（Ｇ）日付（Ｈ）文書番号（Ｉ）受理の日付（Ｊ）出版の日付（Ｋ）関連事項：（ｘｉ）配列の記述：　　配列識別番号２

【００７８】

【化５】

【００７９】

【化６】

【００８０】本発明の主な特徴及び態様は次の通りであ
る。１．（ａ）約１５５個のアミノ酸から成り、位置３のア
ラニンおよび位置５のセリンがグルタミン酸で置き換え
られている塩基性繊維芽細胞成長因子、（ｂ）約１５５
個のアミノ酸から成り、位置３のアラニンおよび位置５
のセリンがグルタミン酸で置き換えられ、位置７８およ
び９６のシステインがジスルフィドのスクランブルを除
去するアミノ酸で置き換えられている塩基性繊維芽細胞
成長因子、および（ｃ）（ａ）および（ｂ）のＮ−末端
メチオニンをもたない切断された形から成る群から選ば
れる塩基性繊維芽細胞成長因子。

【００８１】２．該塩基性繊維芽細胞成長因子が組み換
えられたものである上記第１項記載の塩基性繊維芽細胞
成長因子。

【００８２】３．位置７８および９６のシステインがセ
リン、リジン、アスパルチン酸、グルタミン酸、アスパ
ラギン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイ
シン、ヴァリン、フェニルアラニン、チロシン、メチオ
ニン、スレオニン、プロリン、アラニン、グリシン、ア
ルギニン、またはトリプトファンで置き換えられている
上記第２項記載の組み換えられた塩基性繊維芽細胞成長
因子。

【００８３】４．位置７８および９６のシステインがセ
リンで置き換えられている上記第３項記載の組み換えら
れた塩基性繊維芽細胞成長因子。

【００８４】５．ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦから成る上記
第２項記載の組み換えられた塩基性繊維芽細胞成長因子
。

【００８５】６．ｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６から
成る上記第２項記載の組み換えられた塩基性繊維芽細胞
成長因子。

【００８６】７．上記第２項記載の成長因子をコード化
したＤＮＡ配列から成る生物学的な機能をもった円形プ
ラスミドまたはウィルスＤＮＡベクター。

【００８７】８．ｐＥＴ−３ａ誘導体から成る上記第７
項記載のベクター。

【００８８】９．ＲＮＡポリメラーゼからのＴ７を含む
ｐＴ７　　Ｋａｎ　　５およびｐＥＴ−３ａ（Ｍ１３）
から成る群から選ばれる上記第８項記載のベクター。

【００８９】１０．宿主細胞が該成長因子を表現できる
方法で上記第７項記載のベクターで形質変換またはトラ
ンスフェクションされた原核細胞または真核細胞。

【００９０】１１．大腸菌から成る上記第１０項記載の
細胞。

【００９１】１２．（ａ）約１５５個のアミノ酸から成
り、位置３のアラニンおよび位置５のセリンがグルタミ
ン酸で置き換えられている組み換えられた人の塩基性繊
維芽細胞成長因子をコードしているＤＮＡ配列、（ｂ）
約１５５個のアミノ酸から成り、位置３のアラニンおよ
び位置５のセリンがグルタミン酸で置き換えられ、位置
７８および９６のシステインがジスルフィドのスクラン
ブルを除去するアミノ酸で置き換えられている組み換え
られた人の塩基性繊維芽細胞成長因子をコードしている
ＤＮＡ配列、および（ｃ）厳密な条件下でハイブリッド
形成され（ａ）または（ｂ）記載のＤＮＡになるＤＮＡ
から成る群から選ばれるＤＮＡ配列。

【００９２】１３．上記第１２項記載のＤＮＡ配列から
成る生物学的な機能をもった円形プラスミドまたはウィ
ルスＤＮＡベクター。

【００９３】１４．該ベクターがＲＮＡポリメラーゼに
対するＴ７プロモーターを含むｐＴ７　　Ｋａｎ　　５
およびｐＥＴ−３ａ（ｍ１３）から成る群から選ばれる
ｐＥＴ−３ａである上記第１３項記載のベクター。

【００９４】１５．宿主細胞が該成長因子を表現できる
方法で上記第１２項記載のＤＮＡ配列で形質変換または
トランスフェクションされた原核細胞または真核細胞。

【００９５】１６．大腸菌の細胞が繊維芽細胞成長因子
を表現できる方法で上記第１３項記載のベクターの中に
コード化されたＤＮＡで形質転換された大腸菌。

【００９６】１７．位置３のアラニンおよび位置５のセ
リンがグルタミン酸で置き換えられている１５４個（マ
イナス１個のメチオニン）または１５５個のアミノ酸を
有する組み換えられた人の塩基性繊維芽細胞成長因子。

【００９７】１８．位置３のアラニンおよび位置５のセ
リンがグルタミン酸で置き換えられ、位置７８および９
６のシステインがセリン、リジン、アスパルチン酸、グ
ルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、
イソロイシン、ロイシン、ヴァリン、フェニルアラニン
、チロシン、メチオニン、スレオニン、プロリン、アラ
ニン、グリシン、アルギニン、またはトリプトファンで
置き換えられている組み換えられた人の塩基性繊維芽細
胞成長因子。

【００９８】１９．位置３のアラニンおよび位置５のセ
リンがグルタミン酸で置き換えられ、位置７８および９
６のシステインがセリンで置き換えられている１５４ま
たは１５５個のアミノ酸をもった組み換えられた人の塩
基性繊維芽細胞成長因子。

【００９９】２０．上記第２項記載のＦＧＦをコードし
ている生成され分離されたＤＮＡ配列で形質転換または
トランスフェクションされた宿主細胞を該宿主細胞が成
長因子を表現するのに十分な時間の間培養媒質中で増殖
させ、該培養媒質、該宿主細胞の溶解物および該宿主細
胞の膜残渣から成る群から選ばれる材料から成長因子を
回収する組み換えられた人の繊維芽細胞成長因子を製造
する方法。

【０１００】２１．該宿主細胞が大腸菌である上記第２
０項記載の方法。

【０１０１】２２．該ＦＧＦはｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ
およびｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦから
成る群から選ばれる上記第２１項記載の方法。

【０１０２】２３．宿主細胞がＤＮＡでコード化された
ポリペプチドを表現できる方法で上記第２項記載のＦＧ
Ｆに対しコード化を行うＤＮＡ配列で原核細胞または真
核細胞の形質転換またはトランスフェクションを行う組
み換えられた人の塩基性繊維芽細胞成長因子を表現し得
る原核細胞または真核細胞を製造する方法。

【０１０３】２４．該細胞が大腸菌である上記第２３項
記載の方法。

【０１０４】２５．該ＦＧＦはｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ
およびｇｌｕ３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦから
成る群から選ばれる上記第２４項記載の方法。

【０１０５】２６．４個のシステインの少なくとも２個
は（ＣＨ２ＣＯＯＨ）；［ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）（ＣＨ２）
ｘＣＯ２Ｈ］、（ＣＨ２ＣＯＮＲ３Ｒ４）、（Ｒ５）、
［（ＣＨ２）ｎＳＯ３］、（ＣＨＣＨ２ＣＯＮＲ３ＣＯ
［（ＣＨ２）ｍＮＲ３Ｒ４］、（ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２Ｒ
５）または（ＳＲ６）、但し式中Ｒ３およびＲ４はそれ
ぞれＨ、［（ＣＨ２）ｘＣＯ２Ｈ］、［（ＣＨ（ＣＯ２
Ｈ）（ＣＨ２）ｘＣＯ２Ｈ］、随時ヒドロキシル置換基
を０〜２個有するＣ１〜Ｃ６のアルキルまたはポリエチ
レングリコールであり；Ｒ５はＣ１〜Ｃ６のアルキル、
Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシメチルであり、Ｒ６はＣ１〜Ｃ
６のアルキル、ポリエチレングリコールまたは随時１ま
たは２個のカルボン酸または硫酸基を置換したフェニル
基であり；ｎはお〜４の整数、ｍは２〜４の整数であり
、ｘは１〜３の整数である、から成る群から選ばれる置
換基で修飾されている上記第２項記載の塩基性繊維芽細
胞成長因子。

【０１０６】２７．該塩基性繊維芽細胞成長因子はカル
ボメトキシ化された繊維芽細胞成長因子である上記第２
６項記載の塩基性繊維芽細胞成長因子。

【０１０７】２８．該繊維芽細胞成長因子はｇｌｕ３，
５ｈｂＦＧＦである上記第２７項記載の塩基性繊維芽細
胞成長因子。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はｇｌｕ３，５，Ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦ
ＧＦ　　ｃＤＮＡの構成を示す。実例２でつくられた表
現プラスミドｐＴ７　　ｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦを鋳型
とし使用し、下記のポリメラーゼによる鎖反応混合物を
用いｃｙｓ７８をｓｅｒ７８に、ｃｙｓ９６をｓｅｒ９
６に変異させた。（１）Ｔ７の順方向プライマーおよび
ｓｅｒ７８逆方向プライマー；および（２）Ｔ７逆方向
プライマーおよびｓｅｒ９６順方向プライマー。次に実
施例３記載のＴ７順方向プライマーおよびＴ７逆方向プ
ライマーを用いて（１）および（２）からポリメラーゼ
による鎖の反応を行う。

【図２】図２は天然のｈｂＦＧＦのヘパリンＨＰＬＣを
示す。結合したｈｂＦＧＦ（１５４個のアミノ酸を含む
）を、実施例５記載の方法で０．６〜３．０モルのＮａ
Ｃｌ濃度の直線状の勾配を付け、流速を０．７ｍｌ／分
とし、２８０ｎｍで監視してヘパリン・セファロース・
カラムから流出させた。

【図３】図３は還元された組み換えｈｂＦＧＦのヘパリ
ンＨＰＬＣを示す。実施例６に記載したようにヘパリン
・セファロースからの材料を一緒に集めたものをジチオ
テイトールで還元し、これをヘパリン・セファロース・
カラムから流出させた。

【図４】図４はｇｌｕ３，５，Ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦ
ＧＦの逆相ＨＰＬＣを示す。ヘパリンＨＰＬＣからの試
料（８μｇ）を０．４５×２５ｃｍのヴァイダックＣ４
カラムに入れ、実施例６記載のように０．１％トリフル
オロ酢酸／アセトニトリル溶媒系（０〜２８％のアセト
ニトリルで１５分間、２８〜６０％で９９分間、６０〜
８０％で１０分間）を用い０．７ｍｌ／分で流出させた
。

【図５】図５は天然のｂＦＧＦと組み換えｂＦＧＦとの
生物検定の結果の比較である。実施例７記載のように牛
の脳から分離されたｂＦＧＦの突然変異誘起性を、牛の
大動脈急の血管の内皮細胞の増殖作用に関し、人の組み
換えｂＦＧＦと比較した。牛の脳のｂＦＧＦ（１０〜１
５５）（−▲−）、天然の配列をもった組み換えｈｂＦ
ＧＦ（−●−）およびｇｌｕ３，５ｈｂＦＧＦ（−○−
）を種々の量で存在させ（アミノ酸分析で決定）細胞を
成長させた。４日後に、検査した細胞密度領域に関する
細胞の数と等価な酸フォスフォターゼ活性を４０５ｎｍ
において決定した。

【図６】図６は生のｂＦＧＦとキメラのｂＦＧＦとの生
物検定の結果の比較である。成長因子を種々の量で存在
させ（アミノ酸分析で決定）５日間保持した細胞を用い
牛の脳のｂＦＧＦ（１０〜１５５）（−○−）とｇｌｕ
３，５，ｓｅｒ７８，９６ｈｂＦＧＦ（−●−）との突
然変異誘起活性を比較し、細胞の数を実施例７記載の方
法で決定した。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　（ａ）約１５５個のアミノ酸から成り
、位置３のアラニンおよび位置５のセリンがグルタミン
酸で置き換えられている塩基性繊維芽細胞成長因子、（
ｂ）約１５５個のアミノ酸から成り、位置３のアラニン
および位置５のセリンがグルタミン酸で置き換えられ、
位置７８および９６のシステインがジスルフィドのスク
ランブルを除去するアミノ酸で置き換えられている塩基
性繊維芽細胞成長因子、および（ｃ）（ａ）および（ｂ
）のＮ−末端メチオニンをもたない切断された形から成
る群から選ばれることを特徴とする塩基性繊維芽細胞成
長因子。
【請求項２】　　特許請求の範囲第１項記載の成長因子
をコード化したＤＮＡ配列から成ることを特徴とする生
物学的な機能をもった円形プラスミドまたはウィルスＤ
ＮＡベクター。
【請求項３】　　宿主細胞が該成長因子を表現できる方
法で特許請求の範囲第２項記載のベクターで形質変換ま
たはトランスフェクションされていることを特徴とする
原核細胞または真核細胞。
【請求項４】　　（ａ）約１５５個のアミノ酸から成り
、位置３のアラニンおよび位置５のセリンがグルタミン
酸で置き換えられている組み換えられた人の塩基性繊維
芽細胞成長因子をコードしているＤＮＡ配列、（ｂ）約
１５５個のアミノ酸から成り、位置３のアラニンおよび
位置５のセリンがグルタミン酸で置き換えられ、位置７
８および９６のシステインがジスルフィドのスクランブ
ルを除去するアミノ酸で置き換えられている組み換えら
れた人の塩基性繊維芽細胞成長因子をコードしているＤ
ＮＡ配列、および（ｃ）厳密な条件下でハイブリッド形
成され（ａ）または（ｂ）記載のＤＮＡになるＤＮＡか
ら成る群から選ばれることを特徴とするＤＮＡ配列。
【請求項５】　　特許請求の範囲第４項記載のＤＮＡ配
列から成ることを特徴とする生物学的な機能をもった円
形プラスミドまたはウィルスＤＮＡベクター。
【請求項６】　　宿主細胞が該成長因子を表現できる方
法で特許請求の範囲第４項記載のＤＮＡ配列で形質変換
またはトランスフェクションされていることを特徴とす
る原核細胞または真核細胞。
【請求項７】　　大腸菌の細胞が繊維芽細胞成長因子を
表現できる方法で特許請求の範囲５項記載のベクターの
中にコード化されていることを特徴とするＤＮＡで形質
転換された大腸菌。
【請求項８】　　位置３のアラニンおよび位置５のセリ
ンがグルタミン酸で置き換えられている１５４個（マイ
ナス１個のメチオニン）または１５５個のアミノ酸を有
する組み換えられていることを特徴とする人の塩基性繊
維芽細胞成長因子。
【請求項９】　　位置３のアラニンおよび位置５のセリ
ンがグルタミン酸で置き換えられ、位置７８および９６
のシステインがセリン、リジン、アスパルチン酸、グル
タミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、イ
ソロイシン、ロイシン、ヴァリン、フェニルアラニン、
チロシン、メチオニン、スレオニン、プロリン、アラニ
ン、グリシン、アルギニン、またはトリプトファンで置
き換えられている組み換えられていることを特徴とする
人の塩基性繊維芽細胞成長因子。
【請求項１０】　　位置３のアラニンおよび位置５のセ
リンがグルタミン酸で置き換えられ、位置７８および９
６のシステインがセリンで置き換えられている１５４ま
たは１５５個のアミノ酸をもった組み換えられているこ
とを特徴とする人の塩基性繊維芽細胞成長因子。
【請求項１１】　　特許請求の範囲第１項記載のＦＧＦ
をコードしている生成され分離されたＤＮＡ配列で形質
転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を該宿
主細胞が成長因子を表現するのに十分な時間の間培養媒
質中で増殖させ、該培養媒質、該宿主細胞の溶解物およ
び該宿主細胞の膜残渣から成る群から選ばれる材料から
成長因子を回収することを特徴とする組み換えられた人
の繊維芽細胞成長因子を製造する方法。
【請求項１２】　　宿主細胞がＤＮＡでコード化された
ポリペプチドを表現できる方法で上記第２項記載のＦＧ
Ｆに対しコード化を行うＤＮＡ配列で原核細胞または真
核細胞の形質転換またはトランスフェクションを行うこ
とを特徴とする組み換えられた人の塩基性繊維芽細胞成
長因子を表現し得る原核細胞または真核細胞を製造する
方法。
【請求項１３】　　４個のシステインの少なくとも２個
は（ＣＨ２ＣＯＯＨ）；［ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）（ＣＨ２）
ｘＣＯ２Ｈ］、（ＣＨ２ＣＯＮＲ３Ｒ４）、（Ｒ５）、
［（ＣＨ２）ｎＳＯ３］、（ＣＨＣＨ２ＣＯＮＲ３ＣＯ
［（ＣＨ２）ｍＮＲ３Ｒ４］、（ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２Ｒ
５）または（ＳＲ６）、但し式中Ｒ３およびＲ４はそれ
ぞれＨ、［（ＣＨ２）ｘＣＯ２Ｈ］、［（ＣＨ（ＣＯ２
Ｈ）（ＣＨ２）ｘＣＯ２Ｈ］、随時ヒドロキシル置換基
を０〜２個有するＣ１〜Ｃ６のアルキルまたはポリエチ
レングリコールであり；Ｒ５はＣ１〜Ｃ６のアルキル、
Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシメチルであり、Ｒ６はＣ１〜Ｃ
６のアルキル、ポリエチレングリコールまたは随時１ま
たは２個のカルボン酸または硫酸基を置換したフェニル
基であり；ｎはお〜４の整数、ｍは２〜４の整数であり
、ｘは１〜３の整数である、から成る群から選ばれる置
換基で修飾されていることを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の塩基性繊維芽細胞成長因子。