JPH01165961A - ビリルビン抗原、そのモノクローナル抗体、それらの製造方法およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業−１二の技術分野） この発明は、ビリルビン抗原、そのモノクローナル抗体
、それらの製造方法およびその用途に関し、更に詳細に
は、ビリルビンに特異性を有するモノクローナル抗体、
そのモノクローナル抗体ニ対する抗原、それらの製造方
法およびそのモノクローナル抗体の用途に関するもので
ある。

（従来技術） 生体内で機能を失ったヘモグロビン等のへム蛋白のヘム
は、その鉄分が回収されるために、そのポルフィリン環
か開環されビリベルジンに変換され、次いで還元されて
ビリルビンになる。

生体試料に含まれるビリルビンは、人別して、脂溶性の
ビリルビン（ジアゾ反応間接反応型）である遊離のビリ
ルビンと、水溶性のビリルビン（ジアゾ反応直接反応型
）であるビリルビンの塩もしくはエステル等がある（山
開等：Ｐｒｏｃ、　ＪａｐａｎＡｃａｄ、、　２７．７
］５−７２１．　１９５１　）　。更に、遊離のビリル
ビンにも、異性体の存在が確認されていて、例えば、成
人の胆汁中のビリルビンの約９７％か遊離のビリルビン
の■α型“異性体であり、少Ｈが■βおよび■δ異１１
：体であることか判明している。また、ビリルビンのエ
ステル体にも各種の誘導体が報告されていて、モノグル
クロン酸抱合体等のモノニスデル体、グルクロン酸抱合
体、グルコース抱合体、キシロース抱合体等のシエスデ
ル体等の存在が確認されている。かかるエステル体とし
て存在するビリルビン抱合体としては、例えばクルクロ
ン酸、グルコース、キシロース等のシ抱合体の他に、グ
ルクロン酸等とのモノ抱合体も知られている。

ところで、これまでこれらのビリルビン類を直接的に定
量分析する方法は未だ実用化されてなく、ビリルビン類
をジアゾ化反応によってジアゾ色素に分解して生成し、
そのジアゾ色素を測定する方法が採用されている。しか
しながら、ｔｉ離ビリルビンやその抱合体等は不安定な
物質であるので、ジアゾ化反応時や抽出分離操作中に簡
単に分解したり、変化してしまうことから、このジアゾ
法では本来の遊離ビリルビンやビリルビン抱合体等を定
量分析てきないという欠点がある。更に、このジアゾ法
には、ビリルビン類以外のアゾ色素生成物質や、黄色を
呈するカロチン等のそのほかの生体内物質によって、分
析定量値が大幅に変化するという大きな欠点がある。そ
の上、従来のビリルビン分析法では、直接反応型のビリ
ルビン類と総ビリルビン値を測定しえるにとどまり、ま
た本来のビリルビン類を化学的に分解して測定するとこ
ろから、分解前のビリルビン類の正確な構造を知り得な
いことから、単に黄痕の成因や病態等を把握できないと
いう致命的な欠点がある。従って、遊離ビリルビンやビ
リルビン抱合体を、生体内の構造を分解せずに分離定量
ができる直接定量分析法が強く要望されている。

かかる直接定量分析法の１つとして、高速液体クロマト
グラフィー（＋−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）による定〒法か報告
されている（山口等：Ｐｒｏｃ、　、Ｊａｐａｎ　Ａｃ
ａｄ、、　５５Ｂ、　８９−９３、　１９７９）。この
方法によれば、遊離のビリルビンやビリルビン抱合体を
生来の構造を分解せずに、しかも高い検出感度で分離定
量することができる。しかしながら、この方法は、高価
な機器を必要とし、ｌ検体の分析に１時間前後という長
時間を要し、更に分析技術を習熟したオペレータを養成
する必要があり、その上分離した分画が均一な物質であ
るという保証が必ずしもないなどの問題点がある。

そこで、本発明者は、遊離ビリルビンやビリルビン抱合
体を分解せずに生来の構造を保持したままで短時間内に
かつ簡Ｃｖ、に分離定量できる直接定［ｄ分析法を完成
した。この方法は、ビリルビン類を抗原として生成した
モノクローナル抗体を便用するものである（特開昭６１
−５０２５号）。しかし、この方法で使用するモノクロ
ーナル抗体でも、ビルルピン類の生体内における立体構
造そのものを認識できないという欠点がある。従って、
生体内のビリルビンをより正確に定量分析しかっ黄痕の
成因や病態等を的確に把握するためには、生体内におけ
るビリルビン類の立体構造までも正確に認識できるモノ
クローナル抗体を得ることが要望されてきた。

（発明が解決しよう・とする問題点） そこで、この発明は、ビリルビン類の構造が生体内で存
在する構造を反映しうる状態で抗原として作用しうる新
規なビリルビン抗原を提供することを目的とするもので
ある。

また、この発明は、かかるビリルビン抗原を正確にかつ
高感度に認識しうるモノクローナル抗体を提供すること
を別の目的としている。

さらに、この発明の別の目的は、かかるとリルビン抗原
およびモノクローナル抗体の製造ノブ法を提供すること
である。

また、この発明の更に別の目的は、かかるモノクローナ
ル抗体をビリルビン抗原を認識もしくは検出するために
使用するようことを提供するものである。

なお、この明細書においては、「ビリルビン」または「
ビリルビン類」と相称した用語でも、特記した場合や技
術的に不合理である場合を除いて、遊離ビリルビンやビ
リベルジンばかりでなく５ビリルビン抱合体ならびにビ
リルビンＣのほかに、各種のビリルビン異性体やビリル
ビンの代謝物質等をも包含するものと理解さるへきであ
る。

（問題点を解決するための手段、作用）この発明に係る
新規なビリルビン抗原は、特に生体内に存在するビリル
ビン類の構造を変化させない状態もしくはで生体内に存
在するビリルビン類を測定しうる状態で抗原としてモノ
クローナル抗体に認識もしくは検出されるものである。

かかるビリルビン抗原としては、例えば、ビリルビン類
がスペーサーを介しもしくは介さずにタンパク質に結合
して得られるものである。具体的には、ビリルビン類が
スペーサーを介してタンパク質に結合して得られるビリ
ルビン抗原である場合は、そのビリルビン類の最外側ビ
ニルノ古のピロリン環側の炭素原子にスペーサーを介し
てタンパク質を結合した作成することができる。また、
ビリルビン類がスペーサーを介さずにタンパク質に結合
して得られるビリルビン抗原である場合には、ビリルビ
ンの２個のカルボキシル基のうちの少なくとも１個をタ
ンパク質に結合させて得ることができる。

この発明に係るビリルビン抗原を作成するための出発物
質の１つであるビリルビン類としては、例えば、遊離ビ
リルビンやビリベルジンばかりでなく、ビリルビン抱合
体ならびにビリルビンＣの他に、各種のビリルビン異性
体やビリルビンの代謝物質等をも包含するものと理解さ
るべきである。。

この発明に係るビリルビン抗原のうち、スペーサーを介
してタンパク質に結合して得られるビリルビン抗原を製
造するために使用されるスペーサーとしては、ビリルビ
ン類の最外側のビニル基とタンパク質の両方に結合でき
て、かつ、そのビリルビンの構造を変化させることなく
ビリルビン抗原として作用を保持させることができるも
のであればいかなる物質でもよい。

すなわち、スペーサーを介してタンパク質に結合して得
られるビリルビン抗原は、−設入（）： ビリルビン残基−ＣＨ（ＣＨ！ｌ）　−ＳＰ−Ｎ−ＰＴ
で表めすことができる。−１−記入中において、ビリル
ビン残基とは、遊離ビリルビンやビリベルジンばかりで
なく、ビリルビン抱合体ならびにビリルビンＣのほかに
、各種のビリルビン異性体やビリルビンの代謝物質等の
最外側の環からビニル基を除いた残基を意味し、ＳＰと
はスペーサー残基を意味し、そしてＰＴはタンパク質残
基を意味する。

かかるスベー→ノー−としては、例えば、アルデヒドチ
オール、アルデヒドアルコール、置換アルデヒドチオー
ル、アルデヒドチオール等のチオール類やアルコール類
、アミ５ノ基含有チオール類か挙げられる。

更に、４４体的には、ｉｆｆ述したチオール類やアルコ
ール類は、−＝−船人（■）： Ｈ−Ｘ−Ｒ，−ＣＨｏ （式中、Ｘは硫黄原子または酸素原子を、＠味し、Ｒ１
は飽和もしくは不飽和脂 肪族残基、芳香族または芳香脂肪 族残基を意味する） で表わされる。

前述した脂肪族残基とは、炭素原子数が１〜６個の直鎖
状もしくは分岐状の２価の炭化水素残基を意味するもの
である。また、脂肪族または芳香族には適当な置換基を
有していてもよい。　このようなチオール類としては、
例えば、飽和脂肪族アルデヒドチオール、不飽和脂肪族
アルデヒドチオール、芳香族アルデヒドチオール、芳香
脂肪族アルデヒ［・チオール等が挙げられる。かかる飽
和脂肪族アルデヒドチオールとしては、例えば、アセト
アルデヒドチオール、プロピオンアルデヒドチオール、
ブチルアルデヒドチオール、イソブチルアルデヒドチオ
ール、バレルアルデヒドチオール、ラウソンアルデヒド
チオール等が　挙げられる。かかる不飽和脂肪族アルデ
ヒドチオールとしては、例えば、メルカプトアクロレイ
ン、クロトンアルデヒドチオール等が挙げられる。かか
る芳香族アルデヒドチオールとしては、例えば、メルカ
ブトヘンズアルデヒト、メルカプトトルアルデヒト等が
挙げられ、そしてかがる芳香脂肪族アルデヒドチオール
としては、例えば、メルカプトヘンシルアルデヒド、メ
ルカプトフェネチルアルデヒド、メルカブトエチルフェ
ニルヘンズアルデヒド、メルカプトメチルフェネチルア
ルデヒド等が挙げられる。

またアルデヒドアルコール類としては、面述した飽和も
しくは不飽和脂肪族アルデヒド、芳香族アルデヒドもし
くは芳香脂肪族アルデヒド等の脂肪族、芳香族もしくは
芳香脂肪族部分に水酸基が結合したものである。具体的
には、前述した飽和脂肪族アルデヒドチオール、不飽和
脂肪族アルデヒドチオール、芳香族アルデヒドチオール
、芳香脂肪族アルデヒドチオール笠のチオール基に代わ
りその部分に水酸基が存在するものであって、代表的な
例としては、グリコールアルデヒド、エチレングリコー
ルアルデヒド、プロピレングリコールアルデヒド、ブタ
ングリコールアルデヒド、ピナコールアルデヒド、ホル
ミルヘンシルアルコール、ホルミルフェネチルアルコー
ル、ヒドロキシメチルフェニルアルデヒド、ヒト℃７キ
シエチルフエニルアルデヒド等が挙げられる。　なおこ
れらのアルデヒドチオール残基またはアルデヒドアルコ
ール残基には、種々の置換基が存在していてもよく、か
かる置換基としては、例えばヒドロキシ基、ハロゲン原
子、ニトロ基、カルボキシ基等の置換基が挙がられる。

　　」二記−・船人（１）で表わされるチオール類やア
ルコール類のアルデヒドＩｔ、　　Ｉ＋−１ｆｃ−，１
，−Ｃ／　　ハ　　イ＞　　％７ｒ　　／ｎ　　ア　　
タ　　ノ　　ｊ、（）−１６Ｔ、ｉ’−デ〈十トて、シ
ッフ塩基を形成してビリルビン抗原を構成することかで
きる。この場合、ビリルビンと］二記一般式（Ｔ）で表
わされるチオール類やアルコール類とを最初に反応させ
て、次いでタンパク質を反応させてもよく、また上記−
船人（Ｉ）で表わされるチオール類やアルコール類とタ
ンパク質とをまず反応させ、次いでビリルビンと反応さ
せてもよい。

なお、この発明にお番づるビリルビン抗原を構成するＰ
Ｔで表わされるタンパク質残基としては、アルブミン、
ヘモシアニン、チログロブリン、オバルミン等のビリル
ビン抗原を構成しうるものであればいかなるタンパク質
の残基でもよい。

また別のビリルビン抗原の例としては、−設入％式％）
： ビリルビン残基−ＣＨ（ＣＨ，、）−Ｘ　−Ｙ　、　−
Ｎ　Ｈ２（式中、Ｙｌは炭素原子が１〜６個の置換基を
有していてもよい低級アルキレン基 を意味し、ビリルビン残基およびＸ は前記と同じ、Ｃ：味を有する） で表わされるビリルビン化合物を、−設入（ＩＩＩ）ビ
ＩＪ　／Ｌ、ビン残基−Ｃ１ｌ　（ＣＩローＸ−Ｙ、−
Ｎ＝ＣＨ−Ｙ、−ＣＨｏ（式中、Ｙ２はジアルデヒド残
基を意味し、Ｙ　＋　、ビリルビン残基およびＸは 前記と同じ意味を有する） で表わされるビリルビン−アルデヒド化合物に変換し、
次いて一般式（ＩＶａ） ビリルビン残基−ＣＨ（Ｃ１１，ｌ）　−Ｘ−Ｙｌ　□
Ｎ＝ＣＨ−Ｙ、−ＣＨ＝Ｎ−ＰＴ（式中、ビリルビン残
基、Ｘ、Ｙｌ　、Ｙ２およびＰＴは前記と同じ意味を有
する） で表わされるビリルビン抗原もしくは一設入％式％）： で表わされるビリルビン抗原に変換して得られるたちの
が挙げられる。

」二記一般式（ＩＩ）において、Ｙ、で表わされる低級
アルキレン基としては、炭素原子が１〜６個の、直鎖状
または分岐状の２価飽和脂肪族炭化水素残基を意味し、
ヒドロキシ基、カルボキシル基等の置換基を有していて
もよい。かかる低級アルキレン基としては、例えば、メ
チレン、エチレン、プロピレン、メチルプロピレン、ジ
メチルプロピレン、ヘキシレン、ヘトロキシエチレン、
カルボキシルエチレン等が挙げられる。　このようなト
記一般式（ＩＴ）で表わされるビリルビン化合物を、ビ
リルビンと結合して形成できるものとしては、アミノ含
有チオール類やアルコール類が挙げられる。かかるアミ
ノ含有チオール類やアルコール類としては、アミツノ古
とスルフヒドリル（Ｓ　Ｈ１基とを有する化合物であっ
て、例えば、システィン、システアミン等が挙げられる
。ビリルビンとアミノ含有チオール類やアミノ含有アル
コール類との反応は、トルエンスルホン酸等のスルホン
酸とを用いて、酸性下で行なうのが好ましい。また５こ
の反応は、出発物質として使用するビリルビンが不安定
であることから室温もしくはそれ以下の温度の緩和な条
件丁で行なうことが好ましい。

一１二記−設入（ＴＴＴＩで表わされるビリルビン抗原
ルデヒド化合物は、」−記一般式（ＩＩ）で表わされる
ビリルビン化合物を下記−設入： ％式％ （式中、ｎは整数を意味する） で表わされるジアルデヒド化合物と反応させて得ること
ができる。かかるジアルデヒド化合物としては、例えば
、マロンジアルデヒド、スクシンジアルデヒド、ゲルタ
ールジアルデヒド、アジピンジアルデヒド等が挙げられ
る。すなわち、この反応によって、上記−設入（ＴＩ）
で表わされるビリルビン化合物のアミノ基は、上記−設
入で表わされるジアルデヒド化合物の一方のアルデヒド
基と結合してシッフ塩基を形成する。　さらに、」−記
一般式（ＩＩＩ）で表わされるビリルビン−アルデヒド
化合物のアルデヒド基は更にタンパク質のアミン基と反
応させてシッフ基を形成させて、−設入（ＩＶａ）て表
わされるビリルビン抗原を形成することができる。

更に、−１二記−設入（ＩＶａｌで表わされるビリルビ
ー）棺ＩＩ′ニアｔ＋　α′渉Ｃ−よりｉ饗介してｌ−
記一般式（ＴＶｂ）で表わされるビリルビン抗原に変換
することができる。

更に別のビリルビン抗原の例としては、」−記一般式（
ＩＩ）で表わされるビリルビン化合物に二官能性架橋化
合物とを反応させて一般式（Ｖ）：ビリルビン残基−Ｃ
Ｈ（ＣＨ，）−Ｘ　−Ｙ　、　−Ｎ　＝　Ｙ　３（式中
、￥３は二官能性架橋化合物残基を意味し、ビリルビン
残基、ＸおよびＹ、は 前記と同じ意味を有する） で表わされる化合物にタンパク質を反応させてシッフ塩
基を形成して得られる一般式（ＶＩａ）　：ビリルビン
残基−ＣＨ（’ＣＨ３）−Ｘ−Ｙ、−Ｎ＝Ｙ３°＝Ｎ−
ＰＴ（式中、￥３°は二官能性架橋化合物残基を意味し
、ビリルビン残基、ＸおよびＹｌ は前記と同じ意味を有する） で表わされるもの、または上記−設入（Ｖａ）で表わさ
れるビリルビン抗原を常法により還元して得られる」二
記一般式（ＶＩｂ）： ビリルビン残基−ＣＨ（ＣＨ９）　−Ｘ−Ｙ　１−ＮＨ
−Ｙ３”−ＮＨ−ＰＴ（式中、Ｙ、“°はＹ３°の還元
基を意味し、ビリルビン残基、Ｘ、Ｙ、およびｐ　’ｒ
は前記と同し意味を有する） で表わされるものが挙げられる。

なお、」二記一般式（ＩＩ）で表わされるビリルビン化
合物には、二官能性架橋化合物とタンパク質とを別々に
反応させるひつようはなく、二、官能性架橋化合物とタ
ンパク質とを同時に反応させて」−記一般式（ＶＩａ）
で表わされるビリルビン抗原を得ることもでき、これを
前記と同様にして還元して上記一般式（ｖｒｂ）で表わ
されるビリルビン抗原に変換することもできる。　」二
記一般式（Ｖ）で表わされる化合物は、上記一般式（Ｉ
Ｉ）で表わされるビリルビン化合物に二官能性架橋化合
物をｐ１１７〜１１において反応させて得ることができ
る。かかる二官能性架橋化合物としては、例えば、ジサ
クシニミジルタートレート、エチレングリコールビス（
ジサクシニミジルサクシネート）等のシサクシニミジル
化合物、ビス（スルホサクシニミジル）スベレート等の
ビススルホサクシニミジル化合物もしくは１．５−　ジ
フルオロジニトロベンゼン等のフルオロジニトロヘンセ
ンなどが挙げられる。

上記のようにシッフ塩基の形で得られたビリルビン抗原
は、次いで還元して還元型のビリルビン抗原に変換する
ことができる。この還元反応に使用できる還元剤は、従
来使用されているものであって、シッフ塩基を還元でき
、かつ、その他の部分に好ましくない影響を及ぼさない
ものであればいずれであってもよく、例えば、水素化物
はう素ナトリウム、水素化はう素カリウム、水素化シア
ノはう素ナトリウムなどの水素化はう素アルカリ金属の
ような水素化はう素金属などが挙げられる。

また、ビリルビン類がスペーサーを介さずにタンパク質
に結合して得られるビリルビン抗原としては、ビリルビ
ンの２個のカルボキシル基のうちの少なくとも１個をタ
ンパク質に結合させて得られるものが挙げられる。従っ
て、この場合におけるビリルビン類は、前述したビリル
ビン類のうち、ビリルビンの両方のカルボキシル基がグ
ルタリン酸等によって抱合されているもの以外のビリル
ビン類を相称しているものと理解しておくべきである。

この形式のビリルビン抗原は、ビリルビン類のカルボキ
シル基にタンパク質を常法に従ってアシル化剤、縮合剤
などを使用して結合することにより得ることができる。

使用できるアシル化剤としては、例えば、無機塩基塩、
有機塩基塩、酸無水物、酸ハライドなどが使用できる。

無機塩基塩としては、例えば、ナトリウム、カリウムな
どのアルカリ金属塩、カルシウムなどのアルカリ土類金
属塩などが挙げられる。有機塩基塩としては、例えば、
トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジベンジル
メチルアミン塩などの三級アミン塩などが挙げられる。

酸ハライドとしては、酸クロライド、酸ブロマイドなど
が挙げられる。酸無水物としては、イソブチルクロロギ
酸などが挙げられる。また縮合剤としては、例えば、Ｎ
．Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−シクロへ
キシル−Ｎ−（４−ジエチルアミノシクロヘキシル）カ
ルボジイミド、Ｎ．Ｎ−ジエチル力ルポジイミト、Ｎ．
Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、　Ｎ−エヂルー
Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
などのカルボジイミド化合物、Ｎ．Ｎ’−カルボニルビ
ス（２−メチルイミダゾール）、ペンタメチレンケテン
−Ｎ−シクロヘキシルイミド、ジフェニルケテン−Ｎ−
シクロヘキシルイミドなどのケミンイミン化合物、■−
（４−クロロベンゼンスルホニルオキシ）−６−クロロ
−ＩＨ−ヘンシトリアゾールなどのＮ−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール化合物などが挙げられる。またこれらの
反応は、水、アセトン、ジオキサン、アセトニトリル、
クロロホルム、ベンゼン、メチレンクロライド、デトラ
ヒドルフラン、酢酸エチルなどの慣用溶媒の存在下で行
なうことができる。反応温度にしても、特に限定される
ものではなく、通常冷却下などの緩和な条件下で行なう
のがよい。

この発明に係るモノクローナル抗体は、あくまでもビリ
ルビン類の生体内での構造もしくは形態を変化させずに
もしくは正確に認識しうるものを意味するものである。

従って、この発明にかかるモノクローナル抗体は、重連
したビリルビン抗原の具体的な例に限定されるものでは
ないことを理解しておくべきである。

この発明に係るモノクローナル抗体は、動物をビリルビ
ン類を結合した抗原によって免疫された抗体産生細胞と
、培養系で分裂増殖しうる能力を有する腫瘍細胞とを融
合させたハイブリトーマ細胞から得ることができる。　
この発明において使用される抗原としては、ビリルビン
類をタンパク質に結合させて得られたものが挙げられる
。以下、この抗原を単にビリルビン抗原と相称すること
もある。ビリルビンとしては、ビリベルジン、遊離ビリ
ルビンのほかに、グルクロン酸、グルコース、キシロー
ス等とのモノ抱合体を含む各種のビリルビン抱合体、ビ
リルビンＣ等のビリルビンの誘導体や異性体であって、
そのビリルビンが少なくとも１個のカルボキシル基を有
するものが挙げられる。このビリルビンが結合されてビ
リルビン抗原を形成するタンパク質としては、例えば、
各種動物由来のヘモシアニン、アルブミン、オバルミン
、チログロブリン等が挙げられる。

この発明において抗原として使用されるビリルビンは、
重連したように、ビリルビンの種々の異性体ならびに誘
導体であるので、マウス等の動物を免疫する場合、ビリ
ルビンを結合した抗原を弔−物質として使用してもよい
し、抗原を混合したものを使用してもよい。抗原の混合
物を使用する場合には、産生された抗体をスクリーニン
グして各ビリルビンに特異性を有する抗体を有するハイ
ブリドーマを選択することができる。

この発明において、ビリルビン抗原を用いてマウス、ラ
ット等の動物を免疫する方法は、常法に従って行なうこ
とができる。使用する抗原の量、免疫回数や間隔は、動
物の免疫応答能力、抗原の。

精製程度などによって異なる。抗原量が極めて少ない場
合には、免疫が充分に成立しないので、抗原の投与を繰
り返す必要がある。通常の場合でも、初回免疫のほかに
、追加免疫を行なうのが好ましい。免疫は、通常アジュ
バントを使用して行なわれ、たとえばフロインドアジュ
バント、ミョウバン等を挙げることができる。　抗体産
生細胞は、最終免疫後数日を経過してその細胞を有する
臓器から調製される。この調製は、通常最終免疫後３〜
４日目に行なうのが好ましい。このようにして調製され
た抗体産生細胞はできるだけ速やかに腫瘍細胞と融合さ
せるのが好ましい。融合効率を高めるために種々の方法
を用いることができ、例えば、細胞中の赤面球を融合面
に破壊する手法なども好ましい。

融合に使用される腫瘍細胞としては、例えば、Ｐ３・Ｘ
６３−Ａｇ（Ｘ６３）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８　（旧）
、　Ｐ３・ＮＳ−１／ｌ−Ａｇ４・（ＮＳ−１）などの
ミエローマ細胞株が最も好ましい。ミエローマ細胞株は
、ＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するものが普通に使用され
るが、ＢＡＬＢ／ｃマウス以外の系統のマウスから得ら
れるもの、またラットか乙らζ柄楓蜘杓すｒし１し巨山
Ａセ斗てｔ、哀１ハハノブ１１トーマ形成率を得ること
も可能である。なお、ミエローマ細胞株の起源となった
動物源と、抗体産生細胞の供与動物源は一致するのが好
ましい。また細胞融合の場合には、対数増殖期の細胞を
使用するのが好ましい。

この発明において、ハイブリドーマの増殖のために使用
される培地としては、ＮＳ−１培地が通常使用される。

この培地の基本培地としては、ＲＰＭＩを使用するのが
好ましく、１．−グルタミン、ピルビン酸などを添加す
ることもできる。またこのＮＳ−］培地にはウシ胎児血
清（Ｆｅ２）を添加することもできる。

この発明における細胞融合にしても、常法に従って、ポ
リエチレングリコールなどの細胞融合試薬を使用して行
なうことができ、また電気的細胞融合法を用いて行なう
こともできる。使用できるポリエチレングリコールとし
ては種々の平均分子量のものが使用でき、一般には平均
分子量が１０００．１５圓、２０００．４０００．６０
００のものが使用される。また、使用されるポリエチレ
ングリコール濃度は３０％−５０％の範囲で通常使用さ
れる。ポリエチレングリコール溶液の添加手順について
は何ら制限されるものではなく、例えば抗体産生細胞と
ミエローマ細胞にポリエチレングリコール溶液を添加し
て撹拌もしくは振とうしてもよいし、また抗体産生細胞
とミエローマ細胞とをポリエチレングリコール溶液と混
和して低速遠心をして細胞融合を行なってもよい。更に
、抗体産生細胞と腫瘍細胞との細胞数の比率も特に限定
されるものではないが、約１対１〜２０対１　（抗体産
生細胞対腫瘍細胞）になるように混和するのがよい。

前述のようにして細胞融合されて得られたハイブリドー
マは、未融合細胞が混在しているので、例えばヒボキサ
ンチンーアミノプリテリンーチミシン培地（ＨＡＴ培地
）で培養することによって未融合細胞を除去してハイブ
リドーマだけを選択して得ることができる。

次に、得られたハイブリトーマの上清中に含まれる抗体
活性を調べて、目的とする抗体活性を有するクローンの
みをクローン化する。このクローン化も常法に従って行
なうことができる。このようにして得られた培養上澄に
ついて再度目的とする抗体活性を調べ、抗体陽性の細胞
だけを更に培養する。このようにクローニングは２回ま
たはそれ以上性なうのが好ましい。

このようにして得られた目的とする抗体活性を有するク
ローンを大量に培養して、組織適合抗原の一致したマウ
スなどの動物の腹腔に注入して得られた腹水から目的と
するモノクローナル抗体を得ることができる。なお、こ
の発明にかかるモノクローナル抗体を得る方法にしても
、腹水から得る方法のほかに、無血清培地を使用しても
、または動物細胞を利用してインビｉ・口に培養させて
生産することも可能であるのは勿論のことである。

このようにして得られたモノクローナル抗体は、そのま
ま凍結乾燥して保存することができ、常に均一の標品と
して得ることができ実用上極めて有用である。

（実施例） 実施例１：ビリルビン抗原の製造法 ウシ血清アルブミン１０ｍｇをジオキサ＞２．　Ｏｎ＋
１に溶解してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を得た
。

これとは別に５ビリルビンｌ０ｍｇをジメチルスルホキ
シド１．　Ｏｍｌに溶解し、トリーｎ−ブチルアミン３
．０μｍとイソブチルクロロホルメート２．０μｌによ
って活性化した。これにＯ，ＩＮ水酸化ナトリウム５０
μｍを添加した後、この溶液を、前述したようにして得
たウシ血清アルブミン溶液に滴加した。この溶液のｐＨ
をＩＮ塩酸または水酸化ナトリウムで約９．５に調整し
た後、この混合液を４℃で１２時間撹拌してカップリン
グを終了した。この反応液からセファデックスＧ−２５
を使用したゲル濾過によりビリルビン結合ＢＳＡ　（ビ
リルビン８千ル／タンパク１モル）を得た。

実施例２：ビリルビン抗原の製造法 ヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ）フラクションＶを使用す
る以外は、実施例１と同様にしてビリルビン結合Ｈ３Ａ
（ビリルビン１１干ル／タンパク１モル）を得た。

実施例３：ビリルビン抗原の製造法 ニワトリ卵アルブミン（オバルミン）を使用する以外は
、実施例１と同様にしてビリルビン結合オバルミン（ビ
リルビン６干ル／タンパク１モル）を得た。

実施例４：ビリルビン抗原の製造法 ウシサイトグロブリン（ＢＴＧ）を使用する以外は、実
施例１と同様にしてビリルビン結合ＢＴＧ（ピリル１２
２２モル／タンパク１モル）を得た。

実施例５　ビリルビン抗原の製造 未抱合ビリルビン（［ＪＣ［３）　ＩＸαｌ０ｍｇをジ
メチルスルホキサイド１．　Ｏｍｌに溶解し、この溶液
に、結晶が生じないことが確実になった後、トリーｎ−
ブチルアミン　３．０μｌおよびイソブチルクロロホル
メート２．０μｌを添加した。

別に、ウシ血清アルブミンｌｏｍｇを０．０２４Ｍ　Ｎ
ａＯＨに溶解し、この溶液にジオキサン２．Ｏｍｌを添
加し、この混合液を１０，０ＯＯＧで５分間遠心分離し
て、不溶物質を除去した。

次いで、上で得たビリルビン溶液にＮａＯＨ５０μＩを
添加した後、別に作成したアルブミン溶液に直に滴加し
た。この混合液をＮａＯＨまたばＨＣＩでｐＨが９５に
なるように調整し、次いでこの溶液を４℃で一夜撹拌し
た。

得られた結合物は、セファデックスＧ−２５によるゲル
濾過によって精製した。

未結合ビリルビンを４５０ｎｍによる吸収、アルブミン
をプロテインアッセーは調べた結果、得られた結合物に
は、アルブミン１モルに対して、ビリルビン８モルが結
合していることが判明した。

実施例６：ビリルビン抗原の製造 ウシ血清アルブミンの代りに、ヒト血清アルブミンを使
用した以外は、実施例６と同様に処理して、アルブミン
１モルに対して、ビリルビン８モルが結合したビリルビ
ン抗原を得た。

実施例７：ビリルビン抗原の製造 ビリベルジンをメタノールに溶解し、その溶液をシリカ
ゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（展開溶
媒：クロロフォルム／メタノール＝　ｓｏ／　２０　Ｖ
／Ｖ）によって精製した。この薄層クロマトグラフィー
では、２つのバンドが現われ、そのうちの主バンドを精
製ビリベルジンとして以下の処理に使用した。なお、こ
の主バンドは、高速液体クロマトグラフィー（（ＨＰＩ
、Ｃ）によってａ−タイプのビリベルジンであることが
確認された。

このビリベルジンを最少量のジメチルホルマミドに溶解
した。この溶液５００μｌに、イソブチルクロロホルメ
ート　１７μｍおよびトリーｎ−ブチルアミン　３１μ
ｍを添加して撹拌後、室温で２０分間放置した。

これとは別に、カブトガニ−ヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ
）　３０　ｍ　ｇを、蒸留水３．２ｍｌとＩＮ水酸化ナ
トリウム　０．１ｍｌとの混液に溶解して、ＩＯ，００
［ＩＧで遠心分離をして未溶解物質を除去した。このＫ
　Ｌ、　Ｈ溶液に、前のビリベルジン溶液を滴加した後
、ｐＨを９．１に塩酸または水酸化ナトリウムで調整し
て、４℃で一夜放置した。

この溶液をゲル濾過によって、タンパク結合ビリベルジ
ンと未結合ビリベルジンとに分離し、その後遠心分離を
して得られた溶液なカラムクロマトグラフィー　（５ｅ
ｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−２５）　　（溶出剤：ＰＢＳ）を
用いて精製して、ＫＬＭにビリベルジンが結合したビリ
ルビン抗原を得た。

実施例８：ビリルビン抗原の製造 ビリルビン０．２２ｍｍｏｌを最少量の１．４−ジオキ
サンにゆっくり還流しながら溶解し、その溶液を冷室に
移し、結晶ができないように注意深く８℃に冷却した。

この溶液に、イソブチルクロロホルメート０．２２ｍｍ
ｏｌおよびトリーｎ−ブチルアミン　０２２ｍｍｏｌを
添加し撹拌後、８℃で２０分間放置した。

これとは別に、カブトガニ・ヘモシアニン（Ｋｌ、１１
）４μｍｏｌを１．４−ジオキサン８ｍｌに溶解した。

このＫ　Ｌ　Ｈ溶液に、前のビリベルジン溶液を滴加し
た。ｐＨを８７〜９．２の間に塩酸または水酸化ナトリ
ウムで調整して、４℃で１時間反応させた。

更に、ｐＨを調整して、撹拌しながら、４℃で２時間反
応させて、目的とするＫ　Ｌ　Ｍが結合したビリルビン
抗原を得た。

実施例９：ビリルビン抗原の製造法 ビリルビンを５％ｐ−ヒトロキシヘンズアルデヒドを含
有するクロロホルム（１ｍｇ／ｍｌｌに溶解し、この溶
液にｐ−トルエンスルホン酸の結晶数個を添加した。こ
の混合液を暗所で約８時間放置したところ、ビリルビン
のエキソ−ビニル基にホルミルフェノキシ基が結合した
ビリルビン誘導体が得られた。

得られたビリルビン誘導体は、次いで子牛血清アルブミ
ンと、水酸化カリウムでｐＨ９に調整した０、　３３Ｍ
リン酸水素二カリウムの存在下で反応させて、ビリルビ
ン誘導体とアルブミンとが結合したシッフ塩基を生成し
た。

次いで、このシッフ塩基を水素化はう素ナトリウムを用
いて室温で撹拌した後、還元して対応したシッフ塩が還
元された化合物が得られた。

実施例１０：ビリルビン抗原の製造法 ｐ−ヒトロキシペンズアルデヒトの代りに、ｐ−メルカ
プトベンズアルデヒドを使用すること以外は、実施例９
と同様にしてビリルビンとアルブミンとがベンズアルデ
ヒドを介して結合した化合物を得た。

実施例１１：ビリルビン抗原の製造法 ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒトの代りに、システィン
を使用すること以外は、実施例９と同様にして、ビリル
ビンのエキソ−ビニル基にシスティンのチオール基が結
合したビリルビン誘導体を得た。

このビリルビン誘導体５ｍｇを、Ｏ，１Ｍリン酸緩衝液
（ｐｌ＋６．８１　１　ｍｌに溶解し、この溶液に子牛
血清アルブミン１２ｍｇを滴下した。この反応溶液を室
温で２時間放置し、次いで緩衝液を添加した生理食塩水
容５リットルを用いて２回４℃で一夜透析した。次に、
生成した沈殿物を４℃、２０，０ＯＯＧで３０分間遠心
分離して除去した。得られたアルブミン結合ビリルビン
誘導体の溶液は、使用するまで一８０℃で保存した。

実施例１２：モノクローナル抗体の製造法実施例５で得
たビリルビン抗原を同量のフロイント完全アジュバント
で乳化した乳化液１００μ１（６０μｇ）をＢ　Ａ　Ｌ
　Ｂ　／　ｃマウスに腹腔内注射をして免疫した。細胞
融合する４日前から５マウスに１日当たり　２００μｍ
、４００μＩ、４００μｍ、４００μＩをそれぞれ追加
注射した。

この免疫したマウスの肺臓細胞とマウス骨髄細胞（Ｐ３
−Ｘ６３−Ａｇ８−旧）とを１０対１　（肺臓細胞対骨
髄細胞）の割合で混合して、４５％ポリエチレングリコ
ール６０００を用いて３７℃で８分間処理して細胞融合
を行なった。このように処理した細胞をヒポキサンヂン
ーチミヂン（ＨＴＩ培地に＋９濁し、組織培養プレート
ウェルに注入した後、５％ＣＯ２インキュベーター中に
おいて３７℃で培養した。２４時間後、ハイブリドーマ
を選択するために、この培地をＨＡＴ培地に変えると、
２〜３週間後にコロニーの発生が目視できた。このよう
にして得られたコロニーの上澄液を除去してＥＬＩＳＡ
法で所望のモノクローナル抗体が産生じているかを調べ
た。

次に、この方法でモノクローナル抗体産生が陽性であっ
たコロニーをマウス肺臓細胞と共に更に培養した。

（スクリーニング） ＵＣＢ−Ｈ３Ａ　　（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
　Ｉｏｎμｌ中１μｍ）の抗原溶液をポリスチレンプレ
ートウェルに入れて、４℃で一夜放置【ノた後、そのウ
ェルをＰＢＳで３回洗浄して吸着していない抗原を除去
し、次いで１％ゼラチン（ＰＢＳ）溶液を注入して室温
で１時間放置した。続いて、０．０５％ツイーン２０を
含有するＰＢＳで３回洗浄して未結合タンパクを除去し
た。次に、抗体を含有する上清液を１０倍量の１％ｌｌ
５Ａ−ＰＢＳで希釈し、アリコート１０μｍをウェルに
添加した。このウェルを３７℃で３０分間培養して、０
０５％ツイーン２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した後
、ウサギ抗マウス　ＩｇＧ（Ｆａｂ’）ｚ−ウレアーゼ
・コンジュゲート（予め０゜２５％ＢＳＡ−ＰＢＳ’ｒ
　１００倍に希釈シタも））ヲ添加した。このウェルを
３７℃で３０分間培養して、０．０５％ツイーン２０を
含有するＰＢＳで３回洗浄した後、基質溶液１００μｍ
を各ウェルに添加して、室温で３０分間放置して、ＥＬ
ＩＳＡリーダー（東洋側型製）を使用して５９０ｎｍの
吸収を測定した。この測定の結果、６４個のクローンが
、キャリヤータンパクには結合してなく、ＵＣＢに結合
した特異的な抗体を産生していることが判明した。

このようにして得たクローンのうち、Ｃｏｍｐｅｔｉ−
ｔｉｖｅ　５ａｔｕｒａｔｉｏｎΔｎａｌｙｓｉｓによ
って、［ＪＣＢ抗原に対して最も高い反応性を示した１
６個のクローンを選択した。これらのクローンのサブク
ラスを常法により調べた結果、ＩｇＧ］が７個、ＩｇＧ
２ａが３個、ＩｇＧ２ｂが４個、ＩｇＧ３が１個、Ｉｇ
ＧＭが１個であることが判明した。

このＣｏｍｐｅｊｉｔｉｖｅ　Ｓａシｕｒａｔｊｏｎ　
Ａｎａｌｙｓｉｓは、ＵＣＢに関連する種々の物質に対
する千ノクローナル抗体の相対的親和性を決定するため
に行なった。この結果、ＵＣＢに対するモノクローナル
抗体全ての反応性が、ｌｏ−８〜１０−６Ｍの範囲のＵ
ＣＢ−Ｈ３Ａによって著しく阻害されることが示された
。

１（Ｓ　Ａ溶液に単に溶解したＵＣＢ溶液は、１個のク
ローンとは反応したが、その他のクローンとは殆どもし
くは全く作用しなかった。ビリルビンモノグルクロネ−
１・およびシグルクロネートは、各モノクローナル抗体
と比較的反応した。ビリベルジン、ヘミンおよびタビロ
ール類は、弱い反応性を示した数個のモノクローナル抗
体を除いて、その他のモノクローナル抗体に対して阻止
効果を有してなかった。コール酸は、１０−’Ｍの濃度
まで全く交叉反応性を有していなかった。　したがって
、この発明によるモノクローナル抗体は、種々の検査の
結果、プレートにコーティングしたＨ３Ａに対して反応
しないので、ビリルビンと特異性があり、Ｉ　Ｓ　Ａは
ＵＣＢとモノクローナル抗体との反応を阻［にしなかっ
た。ビリベルジンとヘミンも、ビリルビンとその化学構
造式が近似しているにもかかわらず、モノクローナル抗
体の反応をほとんど阻害しなかった。胆汁酸もこの反応
を阻害しなかった。

実施例１３：　モノクローナル抗体の製造実施例４て得
た結合ビリルビン−Ｆ３　Ｓ　Ａを同量のフロイント完
全アジュバントに乳化した乳化液１００　μｌ　（６０
ｕｇ）をｂ　ａ、　１　ｂ　／　ｃマウス雌の腹腔内に
注射して免疫した。このようにして得られたマウスＩｌ
！ｌ！臓細胞を実施例８と同様に処理して、ハイブリド
ーマを得た。これを更に実施例８と同様に処理して所望
のモノクローナル抗体を得た。

実施例１５：モノクローナル抗体の製造法実施例１で得
た結合ビリルビン−ＢＳＡを同量のフロイント・アジュ
バントで乳化した乳化液１００　μｌ　（６０ｕｇ）を
ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔的注射をして免疫した。細胞
融合する４日前から、マウスに１１１当たり　２００μ
ｌ、４００μｌ、４圓μｍ、４００μｍをそれぞれ追加
注射した。この免疫したマウスの肺臓細胞とマウス骨髄
細胞（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ−旧）とをボジエチレングリコ
ール法にて細胞融合を行なった。細胞融合した細胞をＨ
Ａ　Ｔ培地で培養して選択した後、ビリルビンに特異的
なモノクローナル抗体を産生じたハイブリドーマを常法
により処理して所望のモノクローナル抗体を得た。

実施例１６：　モノクローナル抗体の製造法実施例１３
で得られたビリルビン抗屍を用いる以外は、実施例１２
と同様にして処理して、対応するモノクローナル抗体を
得た。

（発明の効果） この発明にかかるモノクローナル抗体をアッセーに使用
することは、種々の面で有利である。つまり、この発明
のモノクローナル抗体を使用すれば、ビリルビン類に対
して極めて高い特異性を有していて、ほかの同族体やジ
ビロール誘導体は検出されず、かつ、従来のジアゾカッ
プリング法に見られるような非特異的な反応は一切認め
られない。またその感度は５ＸｌＯ−”モルと非常に高
く、他のどの方法よりもオーダーが２つほど高く極めて
有利である。更に、この方法は、ＨＰ　Ｌ　Ｃとは異な
り、抽出を要しないという利点がある。更にまた、胆汁
酸との交叉反応性がないことは、この発明にかかるモノ
クローナル抗体は、胆汁中のビリルビンの測定をも可能
にすることを示唆している。それに、この発明にかかる
モノクローナル抗体を２種類使用することにより、総ビ
リルビンと抱合ビリルビンを同時に測定することも可能
にすることができる。

更にまた、この発明にかかるモノクローナル抗体を使用
することにより、非結合ビリルビンを高い感度と特異性
をもって測定することも可能となり、臨床検査の面から
も極めて有用である。また、定常相に結合させたこのは
つめいにかかるモノクローナル抗体は、固定ビリルビン
オキシダーゼを使用した酵素法と同様に、生命を脅かす
疾患である高ビリルビン廂症の血清からビリルビンを特
異的に除去することにも使用することができ、臨床応用
の面でも極めて有用である。

さらに、この発明にかかるモノクローナル抗体は、特定
の各ビリルビンに対して高い特異性を有している。従っ
て、従来の分析方法では不可能であった各ビリルビンの
直接定量分析が極めて短時間でかつ効率よく行なうこと
が可能となった。また各ビリルビンを、従来の方法では
不可能であったそれらの生体内構造を変えることなく定
量出来るので、黄痕の病因、病態などを正確に分析する
ことが可能となった。従って、この発明にかかるモノク
ローナル抗体を使用すれば、例えば、出生直後またはす
でに母胎内で種々の先天性の代謝異常や奇形を診断する
ことができ、それぞれに対して適切な治療方針“を決定
することができる。更に、血液疾患、肝疾患、あるいは
悪性腫瘍などの鑑別診断が可能になるなど、従来の検査
法とは比較にならないほど、この発明のモノクローナル
抗体は臨床検査−Ｌ有用性が高い検査法を提供できるも
のである。

特許出願人　有限会社バイチクリサーチ（ほか１名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ビリルビン類がスペーサーを介しもしくは介さずに
   タンパク質に結合しているビリルビン抗原。 ２、前記ビリルビン類がそのビリルビン類の最外側ビニ
   ル基のピロリン環側の炭素原子にスペーサーを介してタ
   ンパク質を結合していることを特徴とする請求の範囲第
   １項記載のビリルビン抗原。 ３、前記ビリルビン類がその少なくとも１個のカルボキ
   シル基部位においてタンパク質に結合していることを特
   徴とする請求の範囲第１項記載のビリルビン抗原。 ４、前記ビリルビン抗原が、一般式： ビリルビン残基−ＣＨ（ＣＨ＿３）−ＳＰ−Ｎ−ＰＴで
   表わされることを特徴とする請求の範囲第２項記載のビ
   リルビン抗原。なお、上記式中において、ビリルビン残
   基とは、ビリルビン類の最外側の環からビニル基を除い
   た残基を意味し、ＳＰとはスペーサー残基を意味し、そ
   してＰＴはタンパク質残基を意味する。 ５、前記ビリルビン抗原が一般式： ビリルビン基−ＣＯ−ＮＨ−ＰＴ または一般式： ビリルビン基▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされることを特徴とする請求の範囲第３項記載の
   ビリルビン抗原。なお、上記式中において、ビリルビン
   基とは、ビリルビン類からカルボキシル基１個もしくは
   ２個を除いたビリルビン類の残基を意味し、そしてＰＴ
   はタンパク質残基を意味する。 ６、ビリルビン類がスペーサーを介しもしくは介さずに
   タンパク質に結合しているビリルビン抗原を認識するこ
   とができるモノクローナル抗体。 ７、ビリルビン類を使用して免疫して得られた抗体産生
   細胞と、培養系で分裂増殖しうる能力を有する腫瘍細胞
   とを融合させたハイブリドーマ細胞からモノクローナル
   抗体を得ることを特徴とするモノクローナル抗体の製造
   方法。 ８　ビリルビン類がスペーサーを介しもしくは介さずに
   タンパク質に結合しているビリルビン抗原を認識するこ
   とができるモノクローナル抗体を対応するビリルビン抗
   原を認識するために使用することを特徴とするモノクロ
   ーナル抗体の使用方法。