JPS61204135A - 発癌遺伝子生成物阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は免疫学並びに癌の診断及び治療的用途に関す
る。さらに詳しくは、この発明は天然のプロト−発癌遺
伝子ではなく変異体発癌遺伝子の生成物に特異的な抗体
、これらの抗体から作られる免疫化学薬剤、並びにこれ
らの免疫化学薬剤を用いる診断及び治療方法に関する。

〔従来の技術〕

発癌遺伝子は細胞の新生物性形質転換に寄与する細胞性
遺伝子である。一般にＷｅｉｎｂｅｒｙ、　Ｒ，、サイ
エンティフィック・アメリカン（５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
−静ｅｒｉｃａｎ　）、皿：　１２６−１４２（１９８
３）を参照のこと。

これらは正常な細胞性遺伝子の変化した形であり、そし
て広範囲のヒト腫瘍及び腫瘍セルラインにおいて検出さ
れている。発癌遺伝子は、ヒト腫瘍又は腫瘍セルライン
からのＤＮＡをＮＩＨ／３Ｔ３細胞として知られている
セルラインにトランスフェクトすることに検出された。

トランスフェクトされたＤＮＡからの発癌遺伝子を取り
込みそして発現する細胞は形態学的に変化し、そして厚
密なフォーカスとして増殖し始める。これらのフォーカ
スからの細胞は、マウスにおいて増殖する場合、腫瘍を
形成することができる。（Ｌａｎｅ、Ｍ、Ａ、　、５ａ
ｉ−ｔｅｎ、Ａ、及びＣｏｏｐｅｒ　、　Ｇ、Ｍ、　、
プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オフ・サイエンシス・オフ・ザ・ユナイテッド・ス
テイン・オフ゛・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ）。

７８７５１８５−５１８９（１９８１）　　；並びに５
ｈｉｌｏ、Ｂ、及びＷｅｉｎ−ｂｅｒｙ、　Ｒ，Ａ、ネ
イチュアー（Ｎａｔｕｒｅ）、２８９　；　６０７−６
０９（１９８１）　）。

ｒａｓプロト−発癌遺伝子族の構成員によりコードされ
るｐ２１蛋白質は、細胞質変異により活性化され培養中
のある種の細胞の新生物性形質転換を生じさせ、そして
種々のヒト癌の発生に関与する。

ｒａｓ遺伝子がヒト腫瘍中で活性化される頻度は２０％
又はそれより高いであろう。ｒａｓ発癌遺伝子の構造の
比較により、これらは、遺伝子生成物であるＰ２１蛋白
質のアミノ酸配列がその１２位又は６１位において変化
する点変異により、それらの非形質転換性正常対応物と
異ることが明らかになった（Ｐａｒａｄａ、　Ｌ、Ｆ、
等、ネイチュア−（Ｎａｔｕｒｅ）　＋２９７；４７４
−４７９（１９８２）；　５ａｎｔｏｓ、Ｅ、等、ネイ
チュアー（Ｎａｔｕｒｅ）２９８；３４３−３４７（１
９８２）　；ユアサ、■１等、ネイチュア−（Ｎａｔｕ
ｒｅ）　、３０３　　；　７７５−７７９（１９８２）
　）。

ｐ２１蛋白質の発癌性活性化を導く最もしばしば観察さ
れる変異は、該蛋白質の位置１２におけるアミノ酸残基
の他の幾つかのアミノ酸残基のいずれかへの変化をもた
らす。Ｍａｒｓｈａｌｌ、　Ｃ，Ｔ、等、キャンサー・
サーベイス（Ｃａｎｃｅｒ　Ｓ肛猥■、）、ユ；１８３
−２１４　（１９８４）。

ｐ２１蛋白質はＧＴＰに特異的に結合しそしてＧＴＰを
ＧＤＰと無機リン酸とに加水分解することが知られてい
る。５ｈｉｈ、Ｔ、Ｙ、等、ネイチュア−（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、２８７．６８１−６９１（１９８０）；ＭｃＧｒ
ａｔｈＪ、Ｐ等、ネイチュアー（Ｎａ　ｔｕｒｅ）　、
　、３４０．６４４−６４９　（１９８０）　；及びＳ
ｗｅｌＪ、Ｗ、等、ネイチュア−（Ｎａｔｕｒｅ）３１
１　；２７３−２７５　（１９８４）。位置５９にスレ
オニン残基を含有するｐ２１蛋白質の形において、前記
のリン酸は自動リン酸化反応によってこのスレニオン残
基に移行する。ＭｃＧｒａ　ｔｈ等、前掲；Ｇｉｂｂｓ
　ＸＪ、Ｂｏ等、プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オフ・サイエンシス・オフ・ザ・
ユナイテノド・ステイ′ン・オフ゛・アメリカ（Ｐ、Ｎ
、八、Ｓ、　ＵＳＡ）、現、；　２６７４−２６７８　
（１９８４）　；及び５ｈｉｈ、Ｔ、Ｙ、等ネイチュア
−（Ｎａｔｕｒｅ）　　（ロンドン”）　２８７．６８
６−６９１（１９８１）。

活性化されたｐ２１の形質転換能力におけるこれらの活
性の役割はまだ知られていない。しかしながら、位置工
２を包囲するｐ２１蛋白質の部分がｐ２１蛋白質とＧＴ
Ｐとの相互作用に関与するであろうことが示唆されてい
る。Ｇａｙ、Ｎ、Ｊ、等、ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ）
、３０１　；２６２−２６４（１９８３）；及びＷｅｉ
ｒｅｎｇａｓＲ，に、等、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ
）　、３０２；８４２−８４４（１９８３）　、　Ｆａ
ｒｔｈ、Ｍ、等、ジャーナ／Ｌ／−オフ・ピロロジー（
Ｊ、　Ｖｔｒｏｌ、）　、　４３：２９４−３０４　（
１９８２）は、種々のｐ２１決定基に対して向けられた
ポリクローナル血清及びモノクローナル抗体の両者がＧ
ＴＰ結合を許容することを開示している。モノクローナ
ル抗体Ｙ　１３−２５９は正常Ｐ２１蛋白質と活性化さ
れたｐ２１蛋白質を識別しない。

Ｃ１１ｎｓ等のヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ　１０８，
５６４は、悪性物の存在についての診断において、ｒａ
ｓ発癌遺伝子を包含するｃ−Ｏｎｃ遺伝子の発現生成物
を検出するために抗体のごときプコープを使用する方法
を開示している。この公開された方法はポリペプチドの
野性タイプと変異形を区別しない。

Ｔ、　Ｐａｐａｓ等のヒト新生物細胞におけるレトロウ
ィルス性ｍｙｃ遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　
ｏｆ　Ｒｅｔｒｏ−ｖｉｒａｌ　ｍｙｃ　Ｇｅｎｅｓ　
ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　Ｃｅ１ｌｓ
）と題する１９８２年４月１日に出願された米国特許出
願Ｎｏ　３６９，５１７は、ヒト腫瘍細胞を検出するた
めの鳥類骨随球腫症ウィルス株（ＭＣ２９）のｍｙｃ発
癌遺伝子配列を含有する３２Ｐブラベルされたクローン
化組撰ＤＮＡプローブの使用を開示している。種々の血
液細胞がＭＣ２９のｍｙｃ遺伝子配列に相同なＲＮＡの
増加した量を生産することが見出された。

検討される蛋白質の注目の領域のアミノ酸配列に正確に
対応するペプチドセグメントを化学合成することができ
、そしてこのペプチドを担体蛋白質に連結して適当な宿
主に注射して抗体を得ることができることが知られてい
る。Ａｌｅｘａｎｄａｒ等、ネイチェアー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）　、３０６．６９７−６９９　（１９８３）は、１
個のアミノ酸のみを異にする２種類の白血球蛋白質（Ｔ
ｈｙ−１）、並びこの蛋白質に対して特異的な抗血清で
あって、前記配列が異る領域を含む短い化学合成された
ペプチドにより誘導されたものを記載している。タムラ
Ｔ０等、セル（（旦）、３４．５８７−５９６（１９８
３）は、ｐ　ｐ　５　Ｑ　Ｓ　ｒ　Ｈの一次構造に対応
する合成オリゴペプチドに対する抗体の生成、及びρｐ
６０ｓｒｃを免疫沈澱せしめるための該抗体の使用を開
示している。Ｌｅｒｎｅｒ等、プロシーディンゲス・オ
フ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブザ・サイエンシ
ス・オフ・ザ・ユナイテッド・ステイ゛ン・オフ゛・ア
メリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、）、邦、　３４０３−３４０７　（１９８１）
は、肝炎８表面抗原のごとき蛋白質のヌクレオチド配列
から予想されるアミノ酸配列に対応するペプチドのワク
チンとしての使用を開示している。さらに、Ｗａｌｔｅ
ｒ、Ｇ。

等、プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オフ・サイエンシス・オフ・ザ・ユナイテッド
・ステイク・オフ・アメリカ（Ｐ、Ｎ、Ａ。

Ｓ、υ５４．）７７；　５１９７−５２００（１９８０
）；及びＬｅｒｎｅｒ、Ｒ，Ａ、、ネイチュアー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）　、２９９　；　５９２−５９６（１９８２
）を参照のこと。ｐ２１蛋白質に関し、Ｗｅｉｎｂｅｒ
ｙ等の１９８４年４月１２日に公開されたＰＣＴ誓０／
８４１０１３８９はヒト膀胱癌細胞から単離されたＤＮ
Ａの発癌遺伝子とその対応するプロト−発癌遺伝子との
間の相違を開示している。１つのタイプのアッセイにお
いて、血清学的試薬、例えば、発癌の検出のために使用
することができるプロト−発癌遺伝子又は発癌遺伝子か
ら発現されたｐ２１蛋白質に対して特異的な抗体が記載
されている。検討される正常な又は変化したペプチド配
列の注目の領域のアミノ酸配列に対応する化学合成され
たペプチドセグメントを使用することにより抗体を生じ
させることができる。

Ｈａｎｄ、　Ｈ，等、プロシーディンゲス・オフ・ザ・
ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシス・オフ・
ザ・ユナイテッド・ステイク・オフ・アメリカ（Ｐ、Ｎ
、Ａ、Ｓ、　ＵＳＡ、）８１．５２２７−５２３１（１
９８４）は、Ｈｕ−ｒａｓ　”’遺伝子生成物のアミノ
酸位置１０−１７を反映する合成ペプチドを用いるモノ
クローナル抗体の生成を開示している。この抗体はｒａ
ｓ遺伝子生成物ｐ２１と反応することが示されたが、し
かし正常ｐ２１蛋白質ではなく活性化されたｐ２１（位
置１２において変化している）に対して特異的であるこ
とは示されなかった。

Ｇａ１１ｉｃｋ、Ｇ、Ｅ、等は、１９８３年９月４日に
、ネズミ肉腫ウィルスの温度感受性変異株により感染さ
れたセルラインにおける、合成Ｖ−ｍｏｓペプチドに対
して生成した抗血清から精製されたＩｇＧの細胞質への
マイクロ注入による形質転換阻害についての講演の要約
を公表した。細胞の形質転換はｐ８５９■−′″０１融
合蛋白質により誘導された。この抗体が活性化された（
変異体）発癌遺伝子生成物に対して特異的であることは
示されていない。

キャンサー・レター（Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔｅｒ）Ｖ
ｏｆ　９において、鳥類及び哺乳類レトロウィルスの発
癌遺伝子生成物に対するモノクローナル抗体に対する研
究についてのＮＩＨＲＦＰの提案の通知が存在する。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ｐ２１蛋白質の位置１２における１個のアミノ酸の相違
に対して特異的な抗体を製造する場合の１つの困難性は
、所望の特定のアミノ酸エピトープ部位に抗体が結合す
ることを許容しない蛋白質の複雑な構造によるものであ
った。このような抗体を製造する場合の他の困難性は、
所与のペプチド断片が必要な抗体を生成せしめる際の免
疫原として有効であるか否かをあらかじめ予想すること
ができないことである。従って、適当な抗体を生じさせ
るために有効なペプチド免疫原の必要性、及び露出した
エピトープを有する変形されゆるめられた蛋白質（この
露出したエピトープに抗体が結合することができその結
果１個のアミノ酸の相違を検出することができる）を得
る方法の必要性が当業界に存在する。さらに、ｐ２１蛋
白質の活性化の機作を決定して、該蛋白質の発癌効果に
対抗するために有効な療法剤を開発する必要性が存在す
る。

〔問題点を解決す°るための手段〕

この発明は特に、発癌遺伝子生成物が、この発癌遺伝子
生成物の発癌活性に必要な細胞成分に結合するのを阻害
する方法に関し、この方法は、該発癌遺伝子生成物を、
該発癌遺伝子生成物の特徴的マーカーエピトープ（この
エピトープは対応するプロト−発癌遺伝子生成物中には
存在しない）を含有する該発癌遺伝子生成物の領域に選
択的に結合する阻害剤（この阻害剤は、発癌遺伝子生成
物と前記細胞成分との結合に対して直接的効果を有する
）と接触せしめることを含んで成る。好ましい態様にお
いては、前記細胞成分はＧＴＰであり、前記阻害剤は抗
体であり、前記発癌遺伝子生成物はｐ２１蛋白質の活性
化された形であり、そして前記エピトープは該ｐ２１蛋
白質の位置１２を含む。組成物としての阻害剤もまたこ
の発明の範囲に含まれる。

この発明の他の態様は癌の処置方法であって、この方法
は、少なくとも部分的に癌のために機能する発癌遺伝子
生成物の特徴的マーカーエピ）−プ（このエピトープは
対応するプロト−発癌遺伝子生成物中には存在しない）
に選択的に結合する抗体を含んで成る組成物に、■又は
複数の癌性細胞を接触せしめることを含んで成る。

この発明に従う１つの特定の具体例としての、ヒト細胞
中のＲＡＳ発癌遺伝子の生成物の検出は、１個のアミノ
酸を異にする蛋白質問を識別する幾つかの抗体の能力に
基礎を置いている。ｒａｓ遺伝子の正常な蛋白質（ｐ２
１蛋白質）と位置１２又は６１における１個のアミノ酸
の相異による変異体活性化形との間を識別することがで
きる抗体を用いて、免疫螢光法、免疫パーオキシダーゼ
染色法、免疫沈澱法、ＥＬＩＳＡ法又はウェスタンプロ
ット法のごとき標準的方法により、ｒａｓ発癌遺伝子生
成物を検出することができよう。

この明細書において使用する“エピトープ”なる語は、
この発明の抗体を認識する発癌遺伝子生成物の結合部位
を意味する。

この明細書において使用する・“抗体”なる語は、ポリ
クローナル抗体及びモノクローナル抗体の両者を意味す
る。さらに、この用語は全免疫グロブリン、及びその抗
原結合性断片を包含する。ポリクローナル抗体は、宿主
動物、例えばラビット、ラット、ヤギ、マウス、等に、
天然蛋白質から変異体蛋白質を区別するアミノ酸を担持
する、発癌遺伝子によりコードされるペプチドセグメン
トを注射することによって製造することができる。宿主
動物から血清を抽出し、これをスクリーニングしてペプ
チド免疫原に特異的なポリクローナル抗体を得る。モノ
クローナル抗体は、例えばマウスを上記のペプチドで免
疫することにより製造することができる。免疫原として
有効な量のペプチドをマウスに腹腔内接種し、そして次
に同様な量の免疫原ペプチドにより追加免疫する。最終
追加免疫の数日後に、免疫されたマウスから肺臓を集め
、これから細胞懸濁液を調製し、そして融合のために使
用する。

ハイブリドーマは、肺細胞とネズミ腫瘍パートナ−とか
ら、Ｋｏｈｌｅｒ、　Ｂ、及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，
、ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ）　　（１９７５）　２
５６　：４９５−４９１の一般的体細胞ハイブリダイゼ
ーション技法を用いて調製することができる。このハイ
ブリダイゼーションにおいては、入手可能なネズミ骨髄
腫セルライン、例えばサークインスティテユート、セル
ディストリビューシゴンセンター、サンジエゴ、カリホ
ルニア、米国から入手できるセルラインを使用すること
ができる。基本的に、この技法はポリエチレングリコー
ルのごとき融合剤を用いて腫瘍細胞と肺細胞を融合せし
めることを含む。融合の後、融合媒体から細胞を分離し
、そして選択増殖培地、例えばＨ′ＡＴ培地中で増殖せ
しめて未融合の親細胞を除去する。所望によりハイブリ
ドーマを拡げ、そして抗原として免疫原を使用する常用
のイムノア、セイ法（例えば、ラジオイムノアッセイ、
エンザイムイムノアソセイ、又は螢光イムノアッセイ）
により上清液を測定することができる。陽性クローンを
さらに特徴付けてこれらがこの発明の抗体の基準に合致
するか否かを決定することができる。

このような抗体を生産するハイブリドーマを公知の方法
を用いてイン−ビトロ又はインービボで増殖せしめるこ
とができる。モノクローナル抗体を、場合に応じて培地
又は体液から、所望により常用の免疫グロブリン精製法
、例えば硫酸アンモニウム沈澱、ゲル電気泳動、透析、
クロマトグラフィー、及び限外濾過により単離すること
ができる。

この明細書において、“部分的に変性された”蛋白質と
は、特徴的な未変性蛋白質中では露出していない特徴的
なマーカーエピトープを有し、そしてこの発明の抗体に
対してエピトープ部位を露出するのには十分であるがし
かし同時に溶液中で該抗体を無傷で且つ活性に維持しそ
して抗原−抗体結合を実質上阻害しない程度に部分的に
変性され又はゆるめられている蛋白質を意味する。この
目的のために使用することができる蛋白質変性剤の例に
は、尿素、デオキシコレート、グアニジン塩酸塩、ドデ
シル硫酸ナトリウム、及びこれらに類イ以するものが含
まれる。

蛋白質への抗体の結合は、十分に高い濃度のアフィニテ
ィー精製された抗体を使用する場合に増強され得る。ア
フィニティー精製は当業界においてよく知られ゛た技法
であり、この方法においては免疫化のために使用された
のとは異る抗原ペプチドが担体に結合され、そして抗体
が精製のためにこの担体を通される。

ｐ２１に対する抗体を血清学的に得るために使用されそ
してそれ故に免疫原として宵月なペプチドは、位置１２
における可変アミノ酸、抗体がそれに選択的に結合する
特徴的マーカーエピトープを規定するのに十分な量のフ
ランキング残基、及び該ペプチドのＣ−末端へ２番目の
位置にあるシスティン残基を含有する。このペプチドは
、宿主に注射する前に、前記システィン残基を介して担
体蛋白質、例えばキーホールリンベットヘモシアニン又
はウシ血清アルブミンに接合され得る。

ペプチド断片は、検出される蛋白質セグメントのエピト
ープであるものを規定するために十分なアミノ酸残基を
有しなければならないが、しかし検出される蛋白質のコ
ンホーメーションと異る限定されたコンホーメーション
を有するほど大きくてはならない。ペプチド断片が短か
過ぎる場合、この断片は無関係の他の蛋白質の中に存在
することになろうし、そしてこれは免疫用担体蛋白質中
に物理的に埋没してしまうかもしれない。Ｃ−末端へ２
番目に位置するシスティン残基は、ペプチド断片に担体
蛋白質を連結するために使用される。

、第１図は、ｐ２１蛋白質のための１つの有用な断片を
示す。

この発明において使用される発癌遺伝子生成物は、プロ
ト−発癌遺伝子生成物とは異る構造的に変形された（変
異体）発癌遺伝子生成物である。

このような発癌遺伝子生成物の例には、ｒａｓ発癌遺伝
子生成物（ｐ２１ｃ−ト′■及びｐ　２１ｃｍトゝ■）
から成る細胞性遺伝子生成物、ｎ＋ｙｃ発癌遺伝子生成
物（ｐ　５Ｂ”Ｙｃ）　、ｓｉｓ発癌遺伝子生成物（Ｐ
ＤＧＦ　　Ｂ−ｔｍ）　、及びこれらに類似するものが
含まれる。好ましくは、この発明における発癌遺伝子生
成物は活性化された形のｐ２１蛋白質である。

蛋白質について適用される“活性化”なる語はＤＮＡに
おける変化を意味し、今度はこの変化が発癌形質転換を
生じさせるように蛋白質を変化せしめる。

この発明の抗体を代表するｐ２１蛋白質に対するペプチ
ド抗血清は次の方法により調製することができる。天然
ｐ２１蛋白質の位置１２に存在する正常なアミノ酸グリ
シンを、この位置のコドン中の１つの塩基の変化から生
ずることができる各可能性あるアミノ酸により置き換え
ることによって、ｐ２１ＲＡＳ遺伝子生成物のアミノ酸
５−１７に対応する６種類のペプチドを調製する。これ
らのアミノ酸はセリン、アルギニン、システィン、バリ
ン、アラニン、及びアスパラギン酸である。第１図は、
ｐ２１蛋白質の位置５−１７に対応する部分のアミノ酸
配列を示す。調製されるペプチドは、Ｃ−末端のセリン
へ２番目の位置にある追加のシスティン残基を含有しな
ければならないテトラデカペプチドであり、このシステ
ィン残基は担体蛋白質に結合するであろう。位置１２に
おける各アミノ酸の変化の効果は右側の欄に示されてい
る。このペプチドは、当業界において知られておりそし
てＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄにより記載された固相合成法に
より合成することができ、自動ＳＡＭペプチドシンセサ
イザー及び手動固相合成装置“ベプチダー”を用いる合
成を例１に示す。液体沸化水素により合成に使用した樹
脂からペプチドを切断し、そしてカラムクロマトグラフ
ィーにより精製する。合成の後、ペプチドを、Ｃ−末端
のシスティン残基を介して担体蛋白質、例えばキーホー
ルリンペットヘモシアニン（ＫＬ）Ｉ）又はウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）に共有結合により連結し、そしてラ
ビットに注射する。

抗体価はＥｌ、ＪＳＡ法によ測定する。この方法におい
ては、イムロンプレートを、免疫用ペプチドにおいて使
用された担体蛋白質とは異る担体蛍白質に共有結合によ
り連結された各ペプチドによりコートし、こうして抗体
のスクリーニングができるようにする。位置１２に特異
的な抗体の非特異的抗体からの分離は、ペプチドＢＳＡ
複合体が共有結合により結合されたアフィニティーカラ
ムに血清を通すことにより達成される。位置１２にセリ
ンを有するペプチドに対して生じた抗血清の場合には、
この位置にグリシンを有するアフィニティーカラムを用
いる。このアフィニティーカラムに結合しない抗体が、
ＥＬＩＳＡにより判定した場合位置１２のセリンに対す
る特異性を有する。

ｐ　２１ｉ白質の部分的変性条件下での免疫沈澱を用い
て、全体蛋白質（Ｗｈｏｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）中の位
置１２におけるアミノ酸置換を識別するその能力につい
て、生成された抗−ペプチド抗体を試験する。

すなわち、抗体と蛋白質を混合し、そしてＳＤＳ及び／
又はデオキシコレートを含有する蛋白質変性剤緩衝液の
存在下でｐＨ７，５〜８．０にて０．５〜１時間インキ
ュベートする。さらに一般的には、蛋白質変性条件はよ
く知られているが、この発明の目的のためには生理的ｐ
Ｈ１例えばｐ２１については約７．５〜９、好ましくは
８のｐｌ＋において、約０．０５〜０．１０重量％のＳ
ＤＳ及び／又は約０．１〜１重量％、好ましくは０．５
〜１重量％のデオキシコレートの濃度を用いて、０．５
〜１時間にわたって行う。

これらの条件のすべては、例えば使用される特定の発癌
遺伝子生成物及び抗体の純度に依存するであろう。

免疫沈澱の後、免疫複合体をプロティンＡセファロース
上に集め、洗浄し、そして５ＯＳ−ＰＡＧＥにより分析
する。

この発明においては、抗体を、治療及び診断の両目的の
ための免疫化学物質として使用することができる。治療
的用途のためには、担体に結合した抗体を腫瘍に導入し
その悪性効果を転換することができよう。

遺伝子生成物（ｐ　２１蛋白質）中の１個のアミノ酸の
相違によりＲＡＳ発癌遺伝子をその正常対応物から識別
することができる抗体は、多くの臨床的状況において悪
性細胞の診断的検出のために適用することができる。例
えば、ＲＡＳ発癌遺伝子の存在は、特定のタイプの癌の
治療の方針の決定において予測的意義を有する。他の状
況において、悪性細胞中のＲＡＳ発癌遺伝子の検出は、
多数の正常細胞中の悪性細胞の検出を促進することがで
き、そしてそれ故に疾患の経過を監視するため及びその
早ｒＩＪ４検出のための有用な手段である。抗−ｐ２１
抗体の一次的診断的用途は、ｃ−ｒａｓ変異が関与する
癌を検出するために、又は血清マーカーとして免疫組織
化学的である。

最も重要なこの発明の抗体の免疫化学的誘導体はラベル
された（例えば放射性ラベル、酵素ラベル、又は螢光色
素ラベルされた）誘導体であり、この場合ラベルはラベ
ルされた抗体を含む免疫複合体の同定手段を提供する。

抗体がイムノトキシンのごとき療法剤方式において機能
するか否かは抗原である蛋白質が何であるかに依存する
。

抗体のラベル部分を形成するために使用されるラベルに
は、直接検出することができる成分、例えば螢光色素及
び放射性ラベル、並びに検出のために反応するか又は誘
導体化しなければならない成分、例えば、酵素が含まれ
る。このようなラベルの例には３Ｚｐ、　　１２３■、
’Ｈ％　′４Ｃ％フルオレノセイン及びその誘導体、ロ
ーダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン
（ｕｍｂｅ　ｌ　１　ｉ　ｆ　ｅｒｏｎｅ）ルシフェリ
ン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ホースラディ
ツシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼ、リゾチーム、及びグルコース−６
−ホスフニトデヒビロゲナーゼが含まれる。抗体は、こ
れらのラベルにより、公知の方法を用いて標識すること
ができる。例えば、前記の螢光ラベル、化学ルミネッセ
ントラベル及び酵素ラベルにより抗体を標識するために
カップリング剤、例えばジアルデヒド、カルボジイミド
、シマレイミド、ビス−イミデート、ビス−ジアゾ化ベ
ンジジン及びこれらに類似するものを使用することがで
きる。

抗体及びラベルされた抗体は、種々のイムノアッセイ法
において、ヒトの患者において癌の存在を検出するため
、又はすでに癌を有すると診断された患者において癌の
状態を監視するために使用することができる。このよう
に監視においては、定期的にアッセイが行われ、そして
その結果を比較することによって宿主の腫瘍の重荷が増
加したか減少したかが決定される。使用し得る一般的ア
ッセイ法には直接アッセイ及び間接アッセイが含まれる
。直接アッセイには、宿主からのＭｉ織サンプル又は細
胞を１又は複数のラベルされた抗体と共にインービボ又
はイン−ビトロでインキュベートすることを含む。サン
プルが癌細胞を含んでいれば、ラベルされた抗体がそれ
らの細胞に結合するであろう。組織又は細胞を洗浄して
未結合抗体を除去した後、組織サンプルをラベルされた
免疫複合体の存在について読み取る。間接アッセイにお
いては、組織又は細胞サンプルを１又は複数の非ラベル
抗体と共にインキュベートする。次にこのサンプルを前
記抗体に対するラベルされた抗体（例えば、ラベルされ
た抗−ラビット抗体で処理し、洗浄し、そしてラベルさ
れた３元複合体の存在について読み取る。

体液サンプルにおいて癌を検出するためのイン−ビトロ
アッセイにおいては、サンプルを、好ましくは個体支持
体に固定化されているラベルされていない抗体（蛋白質
に対して向けられている）とインキュベートする。この
インキュベーションの前、インキュベーション中又はそ
の後に、サンプルをラベルされた他の抗体とインキュベ
ートする。洗浄した後、サンプルをラベルされた複合体
について読み取る。使用する２つの抗体は両方ともｐ２
１（異なるエピトープ）に対して向けられたものでもよ
く、又は第２抗体が第１抗体に対して向けられていても
よい。

さらに、競争的ＲＩＡ方式において抗体を使用すること
もできる。

診断的使用においては、抗体は典型的にはキットの形で
分配されるであろう。これらのキットは典型的には、適
当な容器中ラベルされた形又はラベルされていない形の
１種類又は複数種類の抗体、変性緩衝液、所望によりイ
ンキュベーション用及び洗浄用試薬、並びにラベルの性
質に依存し′て基質又は誘導体化剤を含んで成るであろ
う。ヒト癌抗原対照及び指示書を含めることもできる。

さらに、キット中の抗原はアフィニティー精製されてい
てもよい。

特定の発癌遺伝子生成物に対するこの発明の抗体の高い
特異性は、発癌遺伝子生成物の生化学的活性を調節する
その能力と相まって、これらの抗体を、発癌遺伝子生成
物の構造並びにイン−ビトロ及びインービボの両方での
発癌におけるその役割の研究のために非常に有用なプロ
ーブにしている。潜在的には、これらの抗体は、イン−
ビトロ系において複合体中の発癌遺伝子生成物の活性を
制御するため及び発癌遺伝子生成物と他の細胞性成分と
の相互作用を検知するために使用することができよう。

この発明の抗体はまた、癌治療において使用することも
できる。例えば、これらは他の適当な医薬製剤又は薬剤
と同様に、発癌遺伝子生成物の発癌活性のために必要な
細胞性成分の発癌遺伝子生成物への結合を阻害する過程
における阻害剤として使用することができる。このよう
な過程において、前記のごとき発癌遺伝子生成物が阻害
剤と接触し、これが細胞性成分への発癌遺伝子生成物の
結合を阻害することができるにちがいない。使用される
特定の阻害剤は、例えば発癌遺伝子生成物及び関与する
細胞性成分に依存するであろう。発癌遺伝子生成物がプ
ロト−発癌遺伝子生成物の変異的であれば、阻害剤は対
応するプロト−発癌遺伝子生成物中には存在しない発癌
遺伝子生成物の特異的マーカーエヒトープに選択的に結
合するであろう。この阻害剤はまた、発癌遺伝子生成物
への細胞性成分の結合に対して直接的効果を発揮するに
ちがいない。この直接的効果は、細胞性成分が発癌遺伝
子生成物に結合する部位の少なくとも部分をエピトープ
が含むことであるか、あるいは阻害剤がエピトープから
離れて結合又は作用しそして発癌遺伝子生成物の３次構
造を撹乱することにより結合性を変化せしめることであ
ろう。この発明は、阻害剤が結合に対していかに作用す
るかに関するある特定の理論に限定されるものではない
。

発癌遺伝子生成物が機能するために必要な細胞性成分は
例えば、蛋白質、脂質、炭水化物、核酸、代謝物、例え
ばヌクレオチド、例えばＡＴＰ　、　ＣＴＰ、ＧＴＰ　
、、ＵＴＰ　、及びこれらに類するものであろう。

発癌遺伝子生成物が機能するために必要な細胞の特定の
成分は関与するその生成物に依存するであろう。例えば
、活性化されたｐ２１蛋白質については、細胞性成分は
ＧＴＰであってこれが活性化されたｐ２１蛋白質に結合
してそれを発癌性にするであろう。他の蓋白質は同一の
又は異る細胞性成分に対して特異性を有するであろう。

好ましくは、阻害剤は抗体であり、この抗体はアフィニ
ティー精製されたポリクローナル抗体であってよく、そ
して発癌遺伝子生成物はその蛋白質の位置１２を含む特
異的マーカーエピトープを有する活性化されたｐ２１蛋
白質である。

この発明の抗体は癌を有する患者の処置方法のために特
に使用することができ、この方法においては、患者の１
又は複数の癌性細胞が癌のために少なくとも部分的に機
能する発癌遺伝子生成物の特異的マーカーエピトープ（
このエピトープは対応するプロト−発癌遺伝子生成物中
には存在しない）に選択的に結合する抗体を含んで成る
組成物と接触する。抗体をマイクロ注入によって細胞と
接触せしめることができ、あるいは注入を必要としない
で抗体が自由に細胞膜を通過することを可能にするであ
ろう担体分子に連結することができる。この目的のため
の担体分子は疎水性であることができ、そして細胞膜を
通してリシンの活性Ａ−鎖を引き付けるリジンのＢ−鎖
と類似しており、又はおそらく同一であろう。好ましく
は、この目的のための発癌遺伝子生成物は、蛋白質の位
置１２を含むマーカーエピトープを有するｐ２１蛋白質
の活性化形である。

次に、例によりこの発明をさらに詳細に説明する。特に
ことわらない限り、％は重量％であり、すべての温度は
℃で示す。

第１図の下部に示すテトラデカペプチド（式中、Ｘはｇ
ｌＶ　％　ｖａｌ　％　５ＩＢｒ　％　ａｒｇ　％　Ｃ
ｙｓ　％　ａｓｐ又はａｌａであり、そしてＣ−末端ｓ
ｅｒへ２番目に追加のシスティン残基を含有する）を、
自動化ＳＡＭペプチドシンセサイザー（ビオサーチ社）
、及び手動固相合成装置“ペプタイダー”を用いて固相
合成法により合成した。

この発明において使用した固相合成法は、Ｍｉｒｒ−ｉ
ｆｉｅｌｄＳＲｏＢ、、アドバンス・イン・エンチモロ
ジ一二アンド・リレーテッド・エレアス・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Ａｄｖ、Ｅｎｚ　ｍｏｌ、Ｒｅ
１ａｔ。

ＡｒｅａｓＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、）、３２　：　２２１−
２９６（１９６９）　、及び“ザ・ケミストリー・オブ
・ポリペブチトス（Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍ−ｓｔｒｙｏｆ　
Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）″（Ｐ、Ｇ、Ｋａｔｓｏｙ
ａｎｎｉｓ　１ｇ）、３３６−３６１頁、プレナム、ニ
ューヨーク（１９７３）に記載されている。この方法の
実験室的観点はＳｔｅｗａｒｔ、Ｊ、Ｍ、等、“ソリド
・フェーズ・ペプチド・シンセシス（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈ
ａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）”、フ
リーマン、サンフランシスコ、カリホルニア（１９６９
）に記載されている。

この合成は、Ｃ−末端アミノ酸として、ベンジルエステ
ルによりポリスチレン樹脂に共有結合により連結されて
いるＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−セリン（Ｏ
−ベンジルエーテル）　（商業的に入手できる）を用い
て行った。この合成は、トリフルオロ酢酸によるα−ア
ミノ基からの保護基の除去、ジイソプロピルエチルアミ
ンによるトリフルオロ酢酸塩の中和及びカルボジイミド
による次のＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル保護アミノ
酸のカップリングから成る反復循環法である。

すべてのアミノ酸誘導体及びすべての試薬は商業的に入
手可能である。

合成中、すなわち各反応（脱保護、中和及びカップリン
グ）の後に、樹脂を十分に洗浄する必要があった。樹脂
を適当な有機溶剤、例えばジクロロメタン、ジオキサン
及びジメチルホルムアミドにより洗浄した。

システィンはｐ２１蛋白質のアミノ末端から位置１６又
は１７位には天然には存在しないが、次にペプチドを免
疫のために必要な蛋白質担体に連結することができるよ
うにこれらの位置の間にシスティンを導入した。

少量のアニソールと共に液体弗化水素により樹脂からペ
プチドを切断した。切断されたペプチドを、樹脂から２
Ｎ水性酢酸中に抽出し、そして凍結乾燥した。１ｇの空
気乾燥ペプチド−樹脂から３３９ｍｇの粗ペプチドが得
られた。

精製のため、ペプチド（１００ｍｇ）を５ｍｌの２Ｎ酢
酸中ジチオスレイトール（３０ｍｇ）の溶液で処理し、
そして２Ｎ酢酸中で１５０ｍ１のベッドボリウムのＬＨ
セファデックスカラム上でクロマトグラフ処理した。ペ
プチドの大部分を含有する両分を一緒にし、そして凍結
乾燥した。合計５６ｍｇのペプチドが回収された。

アミノ酸の均一性を逆相ＨＰＬＣにより、及びペプチド
の加水分解物のアミノ酸組成により試験した。

これらのペプチドのキーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ）への又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）への
接合はシスティン残基中のスルヒドリル基を介して行っ
た。ヘテロ２官能架橋剤１−ヒドロキシ−２−ニトロベ
ンゼン−４−スルホン酸ナトリウム塩のＮ−マレイミド
−６−アミノカプロイルエステルを、次の方法により調
製した。

１モル当量（２，２４ｇ）の４−ヒドロキシ−３−ニト
ロベンゼンスルホン酸（ＨＮＳＡ）ナトリウム塩を、２
５ｍ６のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中１モル当量
（２，０６ｇ）のジシクロへキシルカルボジイミド及び
１モル当量（２，１０ｇ）のＮ−マレイミド−６−アミ
ノカプロン酸と室温において一夜混合した。ジシクロヘ
キシル尿素の白色沈澱物が生成した。沈澱を濾過し、そ
して３００ｆｆ＋ｊ２のジエチルエーテルを母液に加え
た。約１０分間〜４時間の後、母液からガム状固形物が
沈′澱生成した。この固形物は５８％の活性１（ＮＳＡ
エステル及び４２％の遊１ｉｊｌｆＨＮｓＡを含有する
ことが見出された。

分析は、少量の沈澱をリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶
解しそして４０６ｎｍにおける吸収を測定することから
成り、この読みが１（ＮＳ＾エステル標品中の汚染物質
である未反応遊離ＩＩ　Ｎ　Ｓ　Ａ量をもたらす。非常
に少量の１強塩基（例えば５Ｎ　Ｎａ０１１）が形成さ
れたエステルを激しく加水分解し、そして第２の読みが
得られる。第２の読みから第１の読みを引いたものが最
初の物質中のエステルの量を与える。次に、固形物をＤ
ＭＦに溶解し、そしてＬＨ２０セファデックスカラム上
に置き、そしてＤＭＦで？客用して汚染Ｍ離ＩＩ　Ｎ　
Ｓ　Ａからエステルを分離する。精製の進行を、クロロ
ホルム、アセトン及び酢酸（６：３　：　Ｉ　Ｖ／Ｖ）
から成る溶出側を用いる薄層クロマトグラフィーにより
監視した。生成物を、それとアミンとの反応によりｍａ
ｌ−ｓａｃ　ＨＮＳＡエステルとして陽性同定した。純
粋なエステルの収率は理論量の約３０％であると算定さ
れ、精製された物質は９９％のエステルから成っていた
。

こうして得られたエステルは水に十分に溶解することが
見出され、そして親核性物質が与えられなければ数時間
にわたって水中で安定であることが見出された。ＩＮア
ンモニアに入れた場合、エステルは対応するアミドを生
成し、一部分は遊離酸に加水分解する。精製されたエス
テルはデシケータ貯蔵した場合延長された期間にわたっ
て安定であることが見出された。

約０．５ｍｇの精製されたｍａｌ−ｓａｃ−ＨＮＳＡエ
ステルを１ｍＡの蒸留水に溶解した。この溶液の１０μ
ｅのアリコートを１ｍＩ！の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）中に溶解した。４０６ｎｍにおける吸収を用
いて、上記のようにして遊離ＨＮＳＡの濃度を計算した
。

５０μｌの４．８Ｎ水酸化ナトリウム溶液をエステルの
稀釈されたアリコートに加えそして攪拌した場合、４０
６ｎｍにおける溶液の吸収が有意に増加し、水酸化物親
核物質がエステルを構成酸と遊離ＨＮＳＡ陰イオンとに
急速に加水分解したことが示された。

塩基で処理した後の遊離ＨＮＳＡ濃度と最初の遊離ＨＮ
　Ｓ　Ａ　濃度との差がエステルの濃度を示す。

エステルと蛋白質アミノ基との実際の濃度から、所望の
程度の置換を達成するために蛋白質溶液に加えるべきエ
ステル量を計算することができる。

次に、精製されたｌｌＮ５Ａエステルを次のようにして
ＢＳＡと反応せしめた（ＫＬＨとの反応はこの方法と同
様であった）。

合計２２ｍｇ　（２０μｍｏｌｅ）のＢＳＡ　（分子量
６６、２９６）を２．Ｑｍｊ！の０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，５）に溶解して合計アミン濃度を１．　ＯＸ
　１０−２ｍｏｌｅ　／　Ｉｔ（５９リジン／ＢＳＡ分
子と仮定する）とした。

計算された量（ｌ１ｍｇ、　２．３５Ｘ１０−５ｍｏｌ
ｅ）の粉末状の上記のようにして調製されたｍａｌ−ｓ
ａｃ　ＨＮＳＡエステル（９７，７％純度）を２．０ｍ
ｌの前記ＢＡＳ溶液に溶解した。室温にで反応を行った
。時間的間隔をおいて？容ン夜から１０μｌのアリコー
トを取り出し、そしてそれぞれをｌ、Ｑｒｒｌの０．０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に稀釈した。各稀釈さ
れた了りコートのスペクトルを、ヒューレソト−パソカ
ード分光光度計を用いて記録し、そして４０６ｎｍにお
ける吸収を測定した。次に、合計５０μβの４．８Ｎ　
Ｎａ０１１を各アリコートに加え、各アリコートを混合
し、そしてそのスペクトルを再録し、そして４０６ｎｍ
における吸収を測定した。結果を第１表に示す。

１４　０．１４７３．７７ｘｌＯ−５０，５９７１，４
９ｘｌＯ−“ｔ、ｎｘｌｏ”　　７４．５１反応混合物
について、塩基の添加の前後の４０６ｎｍにおける吸収
から、残基エステルの濃度及び反応したエステルのパー
セントを決定した。この結果は、反応速度が１５分間に
わたって実質上直線的であること示している。

反応時間の１５分間において、０．１　Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６，０）により平衡化したＰＤＩＯ脱塩セファデ
ックスＧ−２５カラム（ファルマシア社）に反応混合物
を適用することにより反応を停止した。

２、６　Ｘ　１０−３ｍｏｌｅ　／　ｌのエステルが反
応し７（−Ｌ”’ｉ：ＢＳＡの２５．９％のε−アミノ
基がおそらく置換されたことが見出された。

０、１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）により平衡化さ
れたＰＤＩＯ脱塩セファデックスＧ−２５カラムに反応
混合物を適用することにより、第１反応の生成物ｍａｌ
−ｓａｃ−ＲＡＳ（又はｍｏｌ−ｓａｃ−ＫＬＨ）を単
離した。カラムを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）
により溶出し、１．０ｍ／ずつの画分を得た。カラム溶
出に続き吸収スペクトルを監視し、そしてｍｏｌ−ｓａ
ｃ　ＢＳＡを含有するピーク画分をプールした。上記の
ようにして合成されたシスティン含有テトラデカペプチ
ド１８＋ｎｇを加え、そしてプールされた混合物を室温
にて一夜攪拌した。接合体を蒸留水に対して十分に透析
しそして凍結乾燥し、そしである場合にはアミノ酸組成
の変化について分析した。

Ｂ、五鬼遣■訓ｌ ニューシーラントホワイトラビットを、フロイント完全
アジュバント中ペプチドのＫＬＨ誘導体１／２ｍｇの末
梢リンパ節注射、及びそれに続く２週間後のフロインド
不完全アジュバント中１／２ｍｇの皮下注射（ｓｕｂ、
ｑ、）により免疫した。３週間の間隔で３回の追加の１
／２ｍｇ　ｓｕｂ、ｑ、注射を行った。１箇月後に１／
２ｍｇずつの３回の静脈内追加免疫を４日間隔で行い、
そしてこれらの研究に使用する血清サンプルを１１日後
に採取した。

Ｃ６を濱　　るためのＥＬＩＳＡア・・セイ９６ウエル
イムロン■プレートを４℃にて、適切なりＳＡ−ペプチ
ド接合体の２５０μｇ７ｍｌ！溶液５０μｌ　（ウェル
当り）をコートした。ウェルをＰＢＳ−）ウィーンで洗
浄した後、試験すべき抗血清の稀釈物を添加し、そして
インキュベーションを室温にて２〜３時間行った。さら
にＰＢＳ−トウィーン洗浄を行った後、１／１０００稀
釈のヤギ抗−ラビットＩｇＧ（パーオキシダーゼ接合体
）を加え、そして室温にて１時間インキュベートした。

ＰＢＳ−トウィーンでさらに洗浄した後、パーオキシダ
ーゼ基質（ＡＢＴＳ、シグマ）を加え、そして３０分間
後に読み取った。

Ｄ、抗体のアフィニティー精製 ペプチドＢＳＡ接合体が共有結合的に連結されているリ
アクチ−ゲル（Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ）アフィニティー
カラムに血清を通すことにより位置１２−特異的抗体で
非特異的抗体から分離した。位置１２にセリンを有する
ペプチドに対して生成した抗血清の場合には、この位置
にグリシンを有するペプチドをアフィニティーカラムに
おいて使用した。このアフィニティーカラムに結合しな
い抗体が位置１２のセリンに対する特異性を有すること
がＥＬＩＳＡにより判定された。このカラムからの流過
物を、位置１２にセリンを有するペプチドが共有結合的
に連結されている第２カラムに通した。このカラムに結
合した抗体を５０ｍＭグリシン・ＨＣｊ！　　（ｐＨ２
，５）で溶出し、１／２０ｘリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢ
Ｓ）に対して透析し、そして真空下での遠心によりＰＢ
Ｓ中１０ｍｇ／ｍＩｌの最終濃度に濃縮した。

Ｅ、　ｒ体による　２１　　白　の　　ンｐ　２１Ｗ白
質を沈澱せしめる抗−ペプチド抗血清の能力を第２図に
示す。この図は５Ｏ５−ＰＡＧＥゲルのオートラジオダ
ラムである。

この例にシ３いては、位置１２にセリンを含有すること
が知られている形のｐ２１蛋白質を免疫沈澱せしめるた
めに抗体を用いた。この蛋白質はＥ。

コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）発現ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ　ｐ　２
１蛋白質であり、この蛋白質はＭ、Ｉｎｏｕｇｅ、サニ
ー、スト−ニーブローク、ニューヲークにより造成され
そしてここから入手したプラスミドｐｌＮＩ［［−ｒａ
ｓを用いて調製された。このプラスミドにおいては転写
がｌａｃプロモーターにより指令される〔マツイ、Ｙｏ
等、エクスペリメンタル・マニピユレーション・オブ・
ジーン・エクスプレッション（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ　Ｍａｎｉ−ｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、Ｍ、　Ｉｎｏｕｇｅ編、アカデ
ミツク・プレス、ニューヨーク、１５−３２頁（１９８
３）　）。２ｍＭイソプロピルチオガラクトシドにより
培養物を処理することによりこの蛋白質の発現を誘導す
る。細胞ペレットを、５０ｍＭグルコース、２５ｍＭ　
Ｔｒｉｓ　　・１Ｉｃｌ（ｐｌ＋８．０）　、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、　２　ｍｇ／ｍｌリゾチーム及び０６０１％
アプロチニンを含む溶液中に再懸濁し、そして４℃にて
３０分間インキュベートした。トリトンＸ−１００をさ
らに５分間にわたり１％濃度に加えた。１０分間！５，
０００ｘ　ｇで回転した後、上清をさらに２時間１５０
．０ＯＯＸ　ｇで回転して透明な細胞溶解物を調製した
。透明な細胞溶解物の１０μρのサンプルを、４０μＣ
ｉ”Ｐ　γ−ラベルグアノシントリホスフェート（ＧＴ
Ｐ）　と共に３７℃にて３０分間インキュベートした。

これらの抽出物の２５μｌのアリコートを、０．２μｇ
の下に記載する対照モノクローナル抗体Ｙ　１３−２５
９、ｌＱ＃ｆの抗ｐ２１”’　、Ｉ　Ｑ　ｌ！の抗−ｐ
２１”Ｌ、　又ハ１０　μｍ１０）抗−ｐ２１ｓｔｙ（
後二者の血清はそれぞれＸがバリン又はグリシンである
第１図のペプチドと同一のペプチドに対して生成したも
のである）とインキュベートした。

このインキュベーションは、０．０５％ＳＤＳ、２ｍＭ
ジチオスレイトール、０．５％ＮＰ４０．５０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ　　・ＨＣ／　　（ｐＨ８，０）、及び１２０ｍ
Ｍ　　Ｎａ（Ｊから成る部分的変性緩衝液の存在下で行
った。１時間後、免疫複合体を１０μｌのプロティンＡ
セファロースビーズ上に集めた。このビーズはＹ　１３
−２５９及びラット■ｇＧを用いる反応においては、フ
ァイニティー精製したヤギ抗−ラソトＩｇＧでプレコー
トしておいた。免疫複合体を０．５％ＮＰ４０、ＩＭ　
ＬｉＣ！、５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２　　（ｐＨ
８，０）及び１２０ｍＭ　　Ｎａ（Ｊを含む溶液で洗浄
し、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。こうして
得られたゲルを紙片上で乾燥し、そして標準的オートラ
ジオグラフ法によりフィルム片上に置いて第２図を得た
。この図はこれらの分析の結果を示す。左側の対照は、
この特定の形のｐ２１蛋白質を免疫沈澱することが知ら
れているモノクローナル抗体Ｙ　１３−２５９　（スロ
ーン・ケッタリングインスティテユート、ファーストア
へ、ニューヨーク、Ｎ、ＹのＭａｒｋ　Ｆｕｒｔｈから
送られたもの）に関する。Ｆｕｒｔｈ’　％　Ｍ、等、
ジャーナル・オブ・ピロｏギー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、
　４３：　２９４−３０４（１９８２）　、第２図は、
３種の試験した血清の内、この形のｐ２１蛋白質と反応
するのはセリン含有ペプチドに対して生成した血清のみ
であった。従って、この抗体は蛋白質の１個のアミノ酸
の変化を識別することができる。

免疫沈澱についての他の実験において、ハーベイ（Ｈａ
ｒｖｅｙ）肉腫ウィルスＤＮＡ（ｖ−Ｈａ−ｒａｓ）又
はキルステン（Ｋｉｒｓｔｅｎ）肉腫ウィルスＤＮＡ（
ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ）により形質転換された哺乳動物細胞
をｐ２１抗原の入手源として使用した。前者の細胞（Ｋ
Ｐ６と称するＲａｔ−２線維芽細胞系）はフォックスー
チュージキャンサーインスティテユート、７７０１バー
ホルムアベ、フィラデルフィア、ＰＡ　１９１１１の旧
ｋｅ　Ｋｒｅｉｇｌｅｒ博士から贈られたものである。

後者の細胞（Ｋ−ｂａｌｂ）はアメリカン・タイプ・カ
ルチュアー・コレクション、１２３０１パークラウンド
ライブ、ロックビル、Ｍｏ　２０８５２−１７７６から
ＡＴＣＣ−ＣＣＬ　１６３．３（Ｋ−２３４）として入
手したものであり、そしてクリステンネズミ肉腫ウィル
ス形質転換Ｂａｒｂ／３Ｔ３、非生産株として記載され
ている。後者の培養物にネズミ白血病ウィルスのエコト
ロープ株を感染させてｖ−Ｋｉ−ｒａｓｐ２１の発現を
増加した。これらの形質転換された細胞の単層を、５０
ｍｍのプレート当り２μＣｉの無担体無機リン酸により
３７℃にて４時間代謝的にラベルし、そして抽出物を、
界面活性剤としての１％トリトンＸ４００、洗剤として
の０．５％デオキシコレート及びプロテアーゼ阻害剤と
しての０．０１％アプロチニンを含むＰＢＳ中に調製し
た。ｖ−１１ａ−ｒａｓ　ｐ２１　（位置１２にアルギ
ニンを有する）又はシーＫｉ−ｖａｓ　　ｐ２１　（位
置１２にセリンを有する）を含有するこれらの抽出物の
アリコートを、室温にて１時間、０．２５μｇのラット
ＩｇＧ、５μｇの免疫前ラビット血清、又は５μｇのア
フィニティー精製抗−ｐ　２１”’抗血清〔すなわち、
位置１２にセリンを有するペプチドに対して生成しそし
て上記のアフィニティークロマトグラフィー（ここで、
アフィニティーカラムに使用されるペプチドはｐ２１蛋
白質の位置１２に対応するアミノ酸としてグリシンを有
する）により精製した抗−ｐ２１ｓ＊ｒ抗体〕と反応せ
しめた。反応は、上記と同じ部分的変性条件下で行った
が、ＳＤＳの使用量は０．０５重量％ではなく０．１％
とした。免疫複合体をプロティンＡセファロース上に集
め、洗浄し、そして第２図に関して上記した標準的オー
トラジオグラフ法を用いて５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析
した。オートラジオグラフである第３図において、最古
レーン上の対照は分子量標準であり、その次の対照レー
ンは免疫前のラビット血？ＦＦに関するものであり、そ
して各群の左側の２本のレーンはそれぞれ上記のモノク
ローナル抗体Ｙ　１３−２５９及び対照としてのＲａｔ
　ＴｇＧに関する。第３図はセリン含有ペプチドに対し
て生じた血清は位置１２にセリンを有するキルステン肉
腫ウィルスのｐ２１を免疫沈澱せしめることができるが
、この位置にアルギニン残基を有するハーベイ肉腫ウィ
ルスのｐ２１を免疫沈澱せしめることができないことを
示している。同じ抗血清が位置１２にグリシンを含有す
るｐ２１蛋白質と反応することが見出されなかった。Ｓ
ＤＳ又はデオキシコレートによる部分変性の非存在下で
は免疫沈澱が生じなかった。

この結果は、位置工２のアミノ酸残基（セリン）が抗−
ｐ２１ｓ″ｒエピトープ中に含まれることを示している
。さらに、抗−ｐ２１”１は、ユアサ、Ｙ等、ネイチュ
アー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０３−１７７５−７７９　（
１９８３）により記載されたセルラインｈｓ　２４２か
らの、位置１２にグリシンを含有するｐ２１（正常ｐ２
１）と反応しなかった。

抗−ｐ　２１”’抗体はまた、イン−ヒドロ実験におい
てｖ４ｉ−ｒａｓ発癌遺伝子生成物のオートホスホリレ
ーションを阻害することが見出され、位置１２を含むｐ
２１Ｗ白質の部分がｐ２１蛋白質とＧＴＰとの相互作用
に関与することが示された。

Ｅ、コリ発現ｖ−Ｋｔ−ｒａｓ　ｐ　２１の抽出物を、
上記の抗ｐ２ｆ”’抗体、又はＹ　１３−２５９モノク
ロ一ナル抗体により免疫沈澱せしめ、そして得られた免
疫複合体を１０μＣ４”Ｐ　γ−ラベルＧＴＰと共に３
７°Ｃにて３０分間インキュベートした。免疫複合体を
プロティンＡセファロース上に集め、洗浄し、５ＯＳ−
ＰＡＧＥで分析し、そして上記の標準的オートラジオグ
ラフ法にかけた。この結果、抗−ｐ２１ｔ＠ｒ免疫複合
体においてはオートホスホリレーションが生じなかった
。これに対して、Ｙ　１３−２５９モノクロ一ナル抗体
により免疫沈澱したＥ、コリ生産ｐ２１は活発にリン酸
化された。両物質のオートラジオグラフである第４図Ａ
を参照のこと。あらかじめラベルされたｐ２１は使用さ
れた条件下で効率的に免疫沈澱した。すなわち、オート
ホスホリレーションの欠落は酵素活性の阻害及び血清が
ｐ２１に結合したことの結果であった。

Ｅ、コリ発現ｖ−Ｋｉ−ｒａｓからの合計２５μｌの抽
出物をまず１００ｍＭ　ＮａＣ４、５ｍＭ　Ｍｇ（ｌ　
ｚ及び５０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２　　（ｐＨ８
，０）に調整し、そして得られた免疫複合体をｌＯμＣ
４のγ−ラベルＧＴＰと共に３７°Ｃにて３０分間イン
キュベートした。

次に、抗−ｐ２１ゝ１又はＹ１３−２５９モノクロ一ナ
ル抗体との免疫沈澱を、上記と同じ条件下で行った。

この免疫沈澱物を５Ｏ５−ＰＡＧＥ上で移動せしめ、そ
して上記のようにしてオートラジオグラフィーにかけ第
４図Ｂを得た。

第４図Ａは、Ｅ、コリにより生産されたｐ２１”ゝ抗体
のＧ、ＴＰ−依存オートホスホリレーションが抗−ｐ２
１ｔａｒ抗体による免疫沈澱後に完全に除去されたこと
を示している。これに対して、ｐ２１蛋白質は、ｐ２１
蛋白質によるＧＴＰの加水分解を阻害しないことが知ら
れている対照モノクローナル抗体Ｙ１３−２５９による
免疫沈澱後に効率的にオートホスホリレートされた。し
かしながら、免疫沈澱に先立ってｐ２１がリン酸化され
た場合、側坑体はラベルされたｐ２１蛋白質を効率的に
沈澱せしめることが認められた（第４図Ｂ）。

従って、ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ　ｐ　２１への抗−ｐ　２１
”’の結合がｐ２１オートホスホリレーションの阻害を
もたらした。この結果のほとんど確実であると考えられ
る説明は、抗体が同じ部位での結合に関してＧＴＰと競
争することである。

Ｇ、＝−２１”’　　ｊ　グロブリンによるＧＴＰ上記
の結果を確認し、そして抗体が位置５９のスレオニンへ
のリン酸の移動ではなくむしろＧＴＰの結合をブロック
することを決定するために、発明者はモノクローナル抗
体リンクドイムノアブゾープションアッセイにおいて、
ｐ２１蛋白質へのα−３２ＰｄＧＴＰの結合を直接ブロ
ックする抗−ｐ２１ｓｓｒ抗体の能力を試験した。

Ｅ、コリ中で生産されたｖ−Ｋｉ−ｒａｓ　ｐ　２１を
、ピースケミカル社から得られるリアクチゲルビーズに
連結されたモノクローナル抗体Ｙ１３−２５９２μｌに
より免疫沈澱せしめた。免疫複合体を、０．５％ＮＰ４
０．５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ（！！　　（ｐＨ８，０）、
ＬＭ　ＬｉＣｊ２及び１２０ｍＭ　　ＮａＣｌ！の溶液
により洗浄した。この洗浄された複合体を、０．５％ト
リトンＸ−１００，０，５％デオキシコレート、１５０
ｍＭ　　ＮａＣ１％　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　　・ＨＣＩ
！（ｐＨ７，５）、５ｍＭ　ＭｇＣ１１２，０，１ｍＭ
　Ａ　Ｔ　Ｐ及び２ｍＭＤＴＴを含む溶液中で、４°Ｃ
にて１時間、抗−ｐ　２１”’抗体又は非免疫正常ラビ
ット免疫グロブリンの添加を伴ってインキュベートした
。これらの免疫複合体を洗浄し、そして１００ｍＭ　Ｎ
ａ（Ｊ！、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　　−１１ｃｊｌ！　　
（ｐＨ７，２）、５ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ’　ｚ　、１％トリ
トンＸ　−１００及び０．１ｍＭＡＴＰから成るＧＴＰ
結合緩衝液中に、４〜１０μＣｉのα−ララベｆｆ２ｐ
ｄＧＴＰ　（０，２〜０．５２μＭ　、８００Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌ）の添加を伴って４℃にて３０分間再懸濁した。

次に、免疫複合体をＧＴＰ結合緩衝液中で洗浄し、そし
て液体シンチレーションカウンター中で計数した。結果
を第５図に示す。この図は、各タイプの抗体対照（抗体
無添加）について、ｐ２１蛋白質へのＧＴＰの結合％を
、各抗体の濃度の関数として示したグラフである。デー
タ点は、抗体を添加しない対照に対する５個の測定の平
均を示す。

抗−ｐ２１ｓ″’抗体で処理した後、免疫沈澱したｐ２
１蛋白質に結合するＧＴＰは５分の１に減少し、他方、
対照非免疫抗体については減少は見られなかった。これ
らの結果から、ｐ２１蛋白質上の抗−ｐ２１”’結合部
位がＧＴＰ結合部位とオーバーラツプしているようであ
る。これに代る説明は、抗体はＧＴＰ結合部位から幾ら
が離れて結合するが、蛋白質の３次構成を撹乱すること
によってＧＴＰ結合を変化せしめることである。第１の
説明の方が確からしい。なぜなら、（１）　Ｆｕｔｈ等
、前場、は、種々のｐ２１決定基に対して向けられたポ
リクローナル血清及びモノクローナル抗体の両方がＧＴ
Ｐ結合を許容することを見出しており、そして（ｂ）本
発明者等は、高濃度（１０ｍＭ）のＧＴＰ　（ＬかしＡ
ＴＰテハナイ）カル２１蛋白質へ（７）抗ｐ２１ｓ！’
抗体の結合を実質上阻害することを見出したからである
。この発明はこれらの説明のいかんにより限定されない
。

これらの結果は、位置１２のアミノ酸の変化がいかにし
てｐ２１蛋白質を発癌的に活性化することができるかと
いう問題に答えている。位置１２を認識すると抗体によ
るＧＴＰ結合のブロックが、このアミノ酸がｐ２１とＧ
ＴＰとの相互作用に関与すること、及びこの相互作用の
変化が蛋白質の発癌能力に直接的に寄与するであろうこ
とを強く示唆している。

廿り一％ 上記のようにＡＴＣ（Ｊ’６Ｎｏ　ＡＴＣＣＣＣＬ　１
６３．３として得られたキルステン肉腫ウィルスにより
形質転換された正常ラット腎（ＮＲＫ）　ｆｌｌＩＩＩ
胞（Ｋ−２３４）に、抗、　２１ｓ＠ｒを、アフィニテ
ィー精製した抗体５ｍｇ７ｍ１！’１８液としてマイク
ロ注入した。キルステン肉腫ウィルスは、位置１２にセ
リンを有するｐ２１の生産によって細胞を形質転換する
。注入して１２時間後、注入された細胞は形態学的に変
化し、そして今や正常な非形質転換ＮＲＫ細胞に類似す
ることが認められた。３０時間後、細胞はその十分に形
質転換された状態に復帰した。対照としての非免疫正常
ラビット抗体は効果を有しなかった。

位置１２にアルギニンを有するｐ２１により形質転換さ
れた細胞への抗−ｐ２１′″１抗体の注入もまた効果を
有しなかった。このことは、抗−ｐ２１ｓｅｒが、形質
転換された表現型、すなわち蛋白質の既知の生化学的性
質を阻害し、他方、非免疫正常抗体はそうしないことを
示している。

上記のマイクロ注入実験を反復した。この新たな実験に
おいては、注入された細胞は注入後２４時間（第６図ｂ
）で形態学的に変ネヒすることが認められた（第６図ａ
は０時間における細胞を示す）。

注入後３６時間において、注入された細胞はなお一層変
化し、正常な非形質転換フラットＮＲＫ！ＩＩ胞に類似
した。対照としての正常非免疫ラビット抗体は、第６図
ｄ−ｆに示すように、形質転換された細胞に影響を及ぼ
さないことが見出された（ｄは０時間の状態を示し、ｅ
は２４時間の状態を示し、そしてｆは３６時間の状態を
示す）。最後に、細胞はその十分に形質転換された状態
に復帰したが、それらはなお生存していた。

要約すれば、この発明は、蛋白質の１個のアミノ酸位置
におけるアミノ酸の置換を識別することができる抗−ペ
プチド抗血清（抗体）を提供する。

従ってこの抗体は、ヒトの癌を担当する発癌遺伝子生成
物の存在を検出するため、又は診断的用途のために使用
することができる。例えば抗−ｐ２１抗血清中に抗体を
生成するであろう幾つかのペプチドを合成することによ
り抗体が調製され、このペプチドは正常ｐ２１蛋白質の
アミノ酸５−１７を含有し、但し位置１２のグリシンが
バリン、セリン、アルギニン、システィン、アスパラギ
ン酸又はアラニンにより置き換えられており、そしてＣ
−末端へ２番目の位置にシスティン残基が挿入されてい
る。前記の抗体を生成せしめるためＧこは他のペプチド
が必要であろう。抗体により免疫沈澱されるべき蛋白質
は一般に蛋白質のエピトープが露出するように部分的に
変性されている。この蛋白質と接触した抗体はｐ２１蛋
白質へのその結合を強化するためにアフィニティー精製
することができる。

抗−ｐ２１ｓｏｒ抗体は位置１２にセリンを有するｐ２
１蛋白質を免疫沈澱することが見出された。さらに、抗
体は、モノクローナル抗体イムノアブゾープションアソ
セイにおいて、ＧＴＰを結合するｐ　２１　ｖ−Ｋｉ−
ｒａｓの能力を非常に低下せしめる。従って、位置１２
における抗−ｐ２１ｓ＊ｒ結合部位はＧＴＰ結合部位の
部分を含むであろう。これらの結果は、ｐ２１のＧＴＰ
結合及び加水分解活性が発癌性活性化の過程で必須の役
割を演するとする概念を強く支持する。従って、抗−ｐ
２Ｉｓ′ｒｒ抗体は、インービポ及びイン−ビトロにお
けるｐ２１蛋白質の機能の研究のための強力な手段とし
て機能するであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｘで示す位置１２を包囲するｐ２１蛋白質の
アミノ酸配列の略図である。この蛋白質の位置１２はペ
プチドの位置８に相当する。アミノ酸５〜１７のペプチ
ド（位置１６と１７の間にシスティン残基が挿入されて
いる）を、この明細書の例の抗体を製造するために免疫
原として使用した。 第２図は、位置１２におけるＮＶ　Ｘ５ｅｒ　、又はｖ
ａｌに対して向けられたアフィニティー精製された抗ｐ
２１血清とＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）により発現された
セリン成分を含有するｖ−Ｋｉ−ｒａｓ　ｐ　２１蛋白
質との免疫複合体の５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析のオートラジ
オグラムである。左のレーンは対照を示す。 第３図は、位置１２にｓｅｒ及びａｒｇアミノ酸置換を
有する形質転換されだ補乳類細胞由来の２種類のｐ２１
蛋白質であって、抗−ｐ２１ｓａｒ抗体により免疫沈澱
したものの５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析のオートラジオグラム
である。各群の左の２つのレーンは対照であり、そして
最古側のレーンは分子量標準である。免疫前と表示され
た右から２番目のレーンは、注射前のラビット血清を免
疫沈澱せしめたものである。 第４図は、Ｅ、コリ発現ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ　ｐ　２１と
抗−ｐ２１′″ｅｒ又はｐ２１Ｗ白質によるＧＴＰの加
水分解を阻害しないことが知られているモノクローナル
抗体Ｙ１３−２５９　（図中、抗−１）２１ＭＡＢとし
て示されている）のいずれかとの、γラベルされたＧＴ
Ｐによりラベルされた免疫複合体の５Ｏ３−ＰＡＧＥ分
析のオートラジオグラムである。Ａと表示されたレーン
はリン酸化前の免疫沈澱を表わし、そしてＢと表示され
たレーンはリン酸化後の免疫沈澱を示す。 第５図は、ｐ２１蛋白質に結合するＧＴＰを対照（抗体
を添加しない）に対する％として、非免疫正常ラビット
免疫グロブリン又は抗−，２１ｓａｒ抗体（これらはＹ
１３−２５９と共に免疫沈澱したｖ−Ｋｉ−ｒａｓ　ｐ
２１に加えられる）の量に対してプロットしたものであ
る。 第６図は、抗−ｐ２１ｓ＊−抗体（ａ　−ｃ　）又は対
照としての非免疫正常ラビット免疫グロブリン（ｄ−ｆ
）を注入された、ｖ４ｉ−ｒａｓ　ｐ　２１で形質転換
された細胞の写真であって生物の形態を表わす図面に代
る写真である。ａ及びｄは注射後０時間、ｂ及びｅは注
射後２４時間、そしてＣ及びｒは注射後３６時間のもの
である。ａ　”−ｃは、形質転換されたく癌性）状態か
ら形質転換されていない（非癌性、正常）状態への細胞
の進行を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、発癌遺伝子生成物の発癌活性のために必要な細胞性
   成分への発癌遺伝子生成物の結合を阻害する方法であっ
   て、該発癌遺伝子生成物を、特異的マーカーエピトープ
   （このエピトープは対応するプロト−発癌遺伝子生成物
   中には存在しない）を含有する発癌遺伝子生成物の領域
   に選択的に結合する阻害剤（この阻害剤は前記の結合に
   対して直接的作用を有する）と接触せしめることを特徴
   とする方法。 ２、前記阻害剤が抗体であることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ３、前記細胞性成分が代謝産物又はヌクレオチドである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記
   載の方法。 ４、前記細胞性成分がＧＴＰであり、遺伝子生成物が活
   性化された形のｐ２１蛋白質であり、そしてエピトープ
   が位置１２を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１
   項〜第３項のいずれか１項に記載の方法。 ５、位置１２のアミノ酸がバリン、セリン、アルギニン
   、システイン、アスパラギン酸又はアラニンであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ６、アミノ酸がセリンであり、そして阻害剤がアフィニ
   ティー精製されたポリクローナル抗体である特許請求の
   範囲第５項記載の方法。 ７、癌の処置方法であって、１又は複数の癌性細胞を、
   癌のために少なくとも部分的に機能する発癌遺伝子生成
   物の特異的マーカーエピトープ（このエピトープは対応
   するプロト−発癌遺伝子生成物中には存在しない）に選
   択的に結合する抗体を含んで成る組成物と接触せしめる
   ことを特徴とする方法。 ８、前記組成物が１又は複数の癌細胞に注入される特許
   請求の範囲第７項に記載の方法。 ９、前記発癌遺伝子生成物が活性化された形のｐ２１蛋
   白質であり、そして、エピトープが位置１２を含む特許
   請求の範囲第７項又は第８項に記載の方法。 １０、位置１２のアミノ酸がバリン、セリン、アルギニ
   ン、システイン、アスパラギン酸又はアラニンである特
   許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、発癌遺伝子生成物の発癌活性のために必要な細胞
   性成分への発癌遺伝子生成物の結合を阻害する阻害剤。 １２、癌のために少なくとも部分的に機能する発癌遺伝
   子生成物の特異的マーカーエピトープ（このエピトープ
   は対応するプロト−発癌遺伝子生成物中には存在しない
   ）に選択的に結合する抗体を含んで成る癌治療剤。