JPH01171485A - 新規なキシロオリゴシル転移酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術分野」 本発明は、重要なバイオマス原料であるキシランもしく
はキシラン加水分解物から酵素触媒を用いた糖転移反応
により有用な物質を製造し、キシランの利用範囲を拡大
するものとして、新規なキシロオリゴシル転移酵素を提
供するものである。

「従来技術」 キシランは、広葉樹およびイネを代表とする禾本科植物
の主要なヘミセルロース成分であり、これら植物体の構
成成分の２Ｏ−３０ｘをしめる重要なバイオマス原料で
ある。このキシランは、パルブ工業の副産物として、ま
た農産廃棄物、特にトウモロコシ穂軸から多皿に得られ
、飼料の改質剤あるいはキシリトール製造の原料として
用いられてきた。　しかし、これらの需要はそれほど大
きいものではなく、キシランの利用範囲を拡大する技術
の開発が望まれている；毛７．．：？？虻。

”Ｊ、ｔ。

近年、キシランを原料パとした新しい製品として、キシ
ロオリゴ糖が注目され、その水分活性調節作用を利用し
た、食品への応用などが試みられている。一方、糖質の
利用では最も先行している分野である澱粉糖工業におい
ては、糖転移酵素をもちいて澱粉あるいは澱粉氷解物か
ら、より付加価値の高い転移生成物を製造する手段がＷ
４発されつつある。キシラン系においても、従来から糖
転移作用を持つ酵素の存在は知られていたが、未だ澱粉
糖工業にみられるような展開はみられない、これは、キ
シロース系糖質に関して従来知られている糖転移活性が
、はとんど加水分解酵素の逆反応によるものであり、充
分な活性をもつ糖転移酵素がないこと、また糖以外の受
容体としては、水に可溶な一級アルコール類のみが知ら
れているにすぎないことなどが原因である。これらの問
題点が解決されるならば、キシランを原料として糖転移
作用による新しい物質の製造が酵素的に可能であり、キ
シランの利用範囲を拡大することができる。

「目的Ｊ 本発明者らは、植物性バイオマスに多量に含まれている
キシランの、より高度な利用法を提供するという観点か
ら、キシ、ランあるいはキシランから調製されるキシロ
オリゴ糖を供与体として、キシロシルあるいは従来まっ
たく知られていなかったキシロオリゴシル転移により、
有用な糖転移物を製造することを目指し、キシロース系
での糖転移酵素の開発に着手した。その結果、中温性糸
状［？Ｊの一種アクレモニウム属の一菌株が、重合度２
以上のキシロオリゴシル残基の転移作用をもち、かつ糖
以外に一級および二級アルコール類を広く受容体として
利用でき、またこれらアルコール類の水に対する溶解度
が低い場合にも、効率よく糖転移を行う能力のある新規
なキシロオリゴシル転移酵素を生産することを見いだし
、本発明を完成するに至った。

「構成」 以下に、本発明の内容を具体的に説明する０本発明にお
いては、キシロオリゴシル転移酵素生産菌の例示菌株と
して、アクレモニウム・セルロリティカスが有効に利用
される。

次に、本発明において使用されるキシロオリゴシル転移
酵素生産菌の菌学的性質を示すと下記の通りである。

生育：　麦芽エキス寒天培地上では生育は速く、３０℃
７日間で直径７０ｍｍに達する。集落は最初白色で後に
やや黄色味をおびる。気生菌糸は緩く盛り上がり羊毛状
を呈し、時に絹状の菌糸束を形成する。

培養後期には集落裏面は桃褐色ないし赤褐色を呈する。

ツアペック寒天上でもほぼ同様な生育を示すが、気生菌
糸の盛り上がりはより少ない、生育ｐ１１範囲は３．５
〜６．０で最３１１ｐＨは４付近、生育温度範囲は１５
℃〜４３℃で、最適生育温度は３０℃である。

形Ｒ：　菌糸の直径は０．５〜２．５μ町　無色で菌糸
には隔壁が認められる。また、菌糸表面は平滑であ分生
子：　分生子形成能は非常に不安定で、ツアペック寒天
および麦芽エキス寒天培地による継代培養により容易に
消失した０分離時における観察では、分生子柄は気生菌
糸側面より突出し、無色であった０分生子は亜球形で滑
面、無色で連鎖は非常に緩く分散しやすかった。

以上の菌学的性質について、Ｗ、Ｇａｍ！Ｉｒ　（Ｃｅ
ｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｌｌａｒｔｉｇｅ　Ｓｃｈｉｍ
ｍｅｌｐｉｌｇｅ）　ｐ８４．　Ｇ、ＦｉｓｈｅｒＲＩ
Ａ（１９７１）　ＪおよびＣ，Ｉｌ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ　　ｒ　ＭｉｃｏｌｏｇｉｃａｌＰａｐｅｒｓ　１１
５巻　ｐｌＯ（１９６８）Ｊを参照した結果、本菌はア
クレモニウム（Ａｃｒｅ夙ｏｎｉｕ＋ｎ）属に近縁の糸
状菌と考えるのが妥当であると考えた。なお、本菌はキ
シロオリゴシル転移酵素の他に著量のセルラーゼを生産
するという特徴をもっており、従来アクレモニウム属菌
にはセルラーゼ生産能の高い閑が知られていなかったこ
とから、本菌をアクレモニウム・セルロリティカス　（
＾ｃｒｅｍｏｎｌｕｍ　ｃｅｌｌｕｌ。

Ｉｙｔｉｃｕｓ）と命名した。木菌はＦＥＢＮ　Ｐ−６
８６７として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている。

；：＼　゛ 本発明の一キシロオリゴシル転移酵素をアクレモニウム
属菌により生産するためには、通常、キシログルカン、
セルロース、アビセル、キシラン、フスマ、稲ワラ、バ
ガスなと植物性バイオマスを炭素源とし、これに窒素源
として、硝酸塩、アンモニウム塩あるいはペプトン、酵
母エキスのような無機または有機の窒素源と小量の金属
塩を含む液体または個体培地を用い、２０〜４０℃で、
２〜１５日間程度、好気的に培養される。キシロオリゴ
シル転移酵素は菌体外に生産される酵素であるため、液
体培地の場合は培養後、−過あるいは遠心分離した上澄
液を、そして個体培養の場合は培養後、水または適当な
無機塩類で抽出した液を粗酵素液として用いることがで
きる。粗酵素液は、そのまま使用してもよいが、例えば
硫安塩析法やアセトン沈澱法など公知の方法により酵素
粉末を得ることができる。さらに、本酵素は耐熱性であ
ることから、この性質を利用して、ｐｌ＋　４．９　６
５℃で２時間３０分の熱処理を行うことにより、キシロ
オリゴシリゴシル転移酵素純度の高まった酵素液を簡単
に調製することができる。′このようにして得られた、
キシロオリゴシル転移酵素標品は次のような性質を持っ
ている。

（１）　分子旦および等電点 精製されたキシロオリゴシル転移酵素は、分子１Ｌ５１
．０００で等電点は約５．０である。

（２）　作用 本発明のキシロオリゴシル転移酵素は、キシランおよび
キシランから１ｉｌ製されたキシロビオ（−ス以上のキ
シロオリゴ糖に作用し、これをキシロシルまたはキシロ
オリゴシル供与体として、受容体のアルコール性水酸基
に転移し、キシロシルまたは、キシロオリゴシル転移生
成物を生成する。この転移作用について、キシロペンタ
オースの場合を例に具体的に述べると、本供与体は該酵
素によってキシロトリオシル転移およびキシロビオシル
転移を引き起こす供与体として利用される。それが約１
５％の確率で起こる。その他の直鎖キシロオリゴ糖につ
いて初期反応におけるキシロオリゴシル転移の起こる確
率を、キシロペンタオースも含めて表−１に示した。

表−１ 表中の　Ｘ−〜ｘ６−はそれぞれキシロシル残基がらキ
シロトリオシル転移を示している。

ラオシル転移物以上の転移物が生成するが、反応時間が
長（なるとこれらは再分解され、最終的にキシロビオシ
ル転移物およびキシロトリオシル転移物を与える。

本酵素は、基質オリゴ糖の濃度が１％という低い濃度で
明かな転移活性を有し、またキシロビオシル以上のオリ
ゴ糖残基を受容体のアルコール性水酸基に転移できる。

このような作用をもつ糖転移酵素はこれまでまったく知
られていなかったものであり、これを文献未記載の新規
なキシロオリゴシル転移酵素と認めた。

（３）供与体 供与体としてはキシロビオース以上のキシロオリゴ糖ま
たはキシランを直接利用できるが、キシロテトラオース
以上のキシロオリゴ糖またはキシランを供与体としたと
き転移活性が充分となる。

（４）受容体 受容体としては、キシロビオース以上のキシロ糖のキシ
ロシド結合の再配置、いわゆる、結合の不均化がおこる
。キシロース、グルコースなとの単糖類は、受容体とし
て適していない、また、蔗糖、マルトースなど、キシロ
ース系以外のオリゴ糖も受容体として適さない。

有機化学的合成手法あるいは天然物より得られる糖以外
のアルコール類のうち、水溶性および微水溶性のアルコ
ール類は、受容体となり、その水酸基に対してキシロオ
リゴ糖転移が起こり、キシロオリゴ糖誘導体を生成する
。ただし、３級アルコールは受容体とならない。

（５）作用ｐＨおよび最適作用ｐＨ 本酵素の伴用ｐｔｔ範囲は、４５℃で１０分間作用させ
たとき第１　ｒ；！Ｉ　ａに示したように、ｐ１１３〜
６であり、最適作用ｐＨよ約５に認められた。

（６）安定ｐＨ範囲 クエン酸−リン酸塩Ｍ街液中で、２５℃２４時間放置し
たときの本酵素の安定ｐＨ範囲は、第１図すに０．１ｘ
キシロテトラオースを供与体および受容体として用い、
ｐＨ４，９で１０分間作用させたとき、第２図ａに示し
たように、約９０℃までの高温まで転移活性が認められ
たが、最適作用温度は８０℃であった。一方、キシロオ
リゴ糖以外のアルコール類を受容体として用いたときは
、第２図すに示したように作用温度の低下がおこり、５
０％プロピルアルコール存在下では、５５℃まで作用し
、最適作用温度は５０℃であった。

（８）熱安定性 キシロオリゴシル転移酵素を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ１
１４．９）のもとで、各温度で１時間加熱処理した残存
活性は、第３図ａに示したように、７０℃まではほとん
ど失活せず、７５℃で約４０罵そして８５℃、ｌｖｔ間
の加熱で約９５翼が活性を失った。また、５０％　ｎ−
プロピルアルコール存在下、ｐＨ４，９で加熱処理した
場合は、第３図すに示したように、４５℃まではほとん
ど失活せず、５５℃で約２襞、そして７０℃、１時各種
金属イオンのうちで、１ｍＭ以上の水銀イオンおよび銅
イオンにより、本酵素は強く阻害された。

（１０）精製法 本酵素は培養Ｐ液を、６５℃２時間３０分加熱処理し、
含まれる不純タンパク質を変性させ生じた沈澱を遠心分
離により除いた後、ＤＥＡＥ−）ヨバール、陰イオン交
換体ＰＢＥ　９４のカラムをもちいたイオン交ｅｌｋお
よび吸着クロマトグラフィー、さらにバイオゲルＡ０．
５〜カラムによるゲルー過により、ディスクゲル電気泳
動的に均一にまで分＃Ｉ精製できた。

（１１）活性測定法 本酵素は、キシロオリゴ糖を受容体および供与体として
転移をおこなうことから、キシランから調製した、キシ
ロテトラオースの０．１ｚ水溶液１００μ＋　（ｐＨ４
，９）に対して、ａｍの酵素を添加し全量を１５０μｍ
とし、４５℃で１０分間反応させ、生成するキシロペン
タオース以上の転移生成物を、リクロソルブ旧（２カラ
ムをもちいた高速液体クロマトグラフ「効果」 以上のとおり、本発明に開示した新規なキシロオリゴシ
ル転移酵素は、キシランおよびキシランから調製される
キシロオリゴ糖を供与体として、キシロオリゴシル転移
をおこなう新規な酵素であり、また５０％アルコール中
で安定に転移作用をおこない、キシロオリゴ糖誘導体を
生成するという有用な性質を６つものである。そして、
このように生成したキシロオリゴ糖誘導体は、親水性の
糖部分と疎水性の修飾部分をもつことから界面活性作用
をもつものが多くあると推定され、キシランからこれま
で考えられなかった有用なキシロオリゴ糖誘導体を酵素
反応により製造する道を開くものである。このように本
発明は、重要なバイオマス原料であるキシランの利用分
野に新しい技術的進歩をもたらしたものである。

実施例１ セルロース４χ、ペプトンｌχ、硝酸カリウム０．６％
、塩化カリウム０，１５％、ｗＲ酸マグネシウムｏＴｉ
ｚｘ−ｔａ酸−カリウム１．２ｘおよび硫酸亜鉛、硫酸
銅、硫酸マンガンをそれぞれｏ、ｏｏｔに含む培地（ｐ
ｉ（４，０）２０ｍｌを２００ｍ１容の三角フラスコに
いれ、常法により殺菌後アクレモニウム・セルロリティ
カス　（ＦＥＲＮ　Ｐ−６８６７）を接種し、３０℃で
６日間通気培養した。培養後遠心分離により除菌し、得
られた上澄液についてキシロオリゴシル転移酵素活性を
測定した結果、培養液１１当り２２０単位であった。

実施例２ 実施例１において、炭素源をセルロースに代えて、キシ
ログルカン（大日本製薬製　グリロイド−３９）４％を
添加した培地に、アクレモニウム・セルロリティカス（
ＦＥＲＮ　Ｐ−６８６７）を接種し３０℃で８日間通気
培養した。遠心分麟した上澄液中のキシロオリゴシル転
移酵素活性は］−“：′“晶養液！１当り１２００単位
、′−弓 であ、え　　　　　　　、、ｉ−、＋ この培養上澄液のｐｌ＋を４．９に調製して、６５℃２
時間３０分加熱処理した後−生じた沈澱を遠心分離によ
り除き、キシロオリゴシル転移酵素活性をもつ酵素原品
を得た。キシロオリゴシル転移酵素の回収率は、　９２
．４％であった。

実施例３ 実施例２で得た熱処理酵素種晶を、濃縮、脱塩後ＤＥＡ
Ｅ−１，ヨパールＭ６５０および陰イオン交ＩＩＡ体Ｐ
ＢＥ　９４ラムによりイオン交換クロマトグラフィーを
おこない活性画分を得た。この活性画分をさらにバイオ
ゲルＡｎ、　５ｍ＋カラムによるゲルｒ過をおこないキ
シロオリゴシル転移酵素を精製した。精製酵素はディス
ク電気泳動的に均一であり、活性の収率は培養上清にた
いして２２にであった。また、凍結乾燥酵素標品ｌａｇ
あたりのキシロオリゴシル転移酵素活性は、６１単位で
あった。

ロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオー
スおよびキシロヘキサオースに６０℃１５分間および２
時間作用させ、反応生成物をバイオゲルＰ−２カラムに
より分析した。第４Ｉ２Ｉａに示すように、１５分の初
期反応において、キシロトリオースからはキシロテトラ
オースが、キシロテトラオースからはキシロヘキサオー
スが、キシロペンタオースからはキシロオクタオースが
、またキシロヘキサオースからはキシロノナオースおよ
びキシロデカオースが主たる転移生成物として得られ、
本酵素がキシロオリゴシル転移を触媒していることが示
された。さらに、反応時間２時間では、第４図すに示し
たように、転移反応が進み、加えた基質より大きな重合
度をもつキシロウンデカオース以下の多数の転移生成物
が生成し１分子間糖転移反応がおこっていることが示さ
れた。

−＋”’・１．一 実施例５　　’；、、：バ 実施例３誉得られた精製酵素０．５単位を、ｌχキシロ
テトラオースおよび炭素数ｌからｌＯまでの直鎖アルキ
ルアルコールをそれぞれ２５×含む反応液中で４５℃、
２時間反応させ、転移生成物をリクロソルブ旧１２カラ
ムをもちいた高速液体クロマトグラフィーにより分析し
た結果、キシロテトラオースに対する収率が、表−２に
示したような収率でアルキル化キシロビオースが得られ
た。

−ν尺丁余自− 表−２，４＜（＝１ ｉ’＝ 実施例６ 実施例３で得られた精製酵素０．５単位を、ｌ冗キシロ
テトラオースおよび炭素数２からｌＯまでの両末端に水
酸基を持つ直鎖アルキルジオールをそれぞれ果、キシロ
テトラオースに対する収率が、表−３に示したような収
率でそれぞれのジオールからアルキル基の末端に水酸基
をもった、アルキル化キシロビオースが得られた。

表−３ 実施例７ 実施例３で得られた精製酵素０．５単位を、ＩＫキシロ
テトラオースおよび゛５ｅｃ−ブチルアルコールを２キ
シロテトラオースに対する収率が２６χで５ｅｅ−ブチ
ルアルコールの水酸基にキシロビオースの転移した転移
物が得られた。

実施例８ 実施例３で得られた精製酵素０．５単位を、１罵キシロ
テトラオースおよびベンジルアルコールを２５に含む反
応液中で、４５℃、２時間反応させた後、転移生成物を
実施例５と同様に分析した。その結果、キシロテトラオ
ースに対する収率が３２％でベンジルアルコールの水酸
基にキシロビオースの転移した転移生成物が得られた。

実施例９ 実施例５のキシロテトラオースの代わりに、キシロペン
タオースをもちいて同様な反応を行った結果、アルキル
化キシロビオースのほかに、アルキル化キシロトリオー
スも生成した。

ラン（大麦由来）および２５χｎ−プロピルアルコール
を含む反応液中で、４５℃、１８時間反応させた後、転
移生成物を実施例５と同様に分析した。その結果、キシ
ランに対する収率が８％でプロピルアルコールの水酸基
にキシロビオースの転移した転移生成物が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はアクレモニウム・セルロリティカス（ＦＥＲＮ
　Ｐ−６８６７）の生産する。キシロオリゴシル転移酵
素の最適作用ｐｉｆ　（ａ　）、ｐｌ＋安定範囲（１）
）をそれぞれ示している。 第２図は　アクレモニウム　セルロリティカス（ＦＥＲ
Ｎ　Ｐ−６８６７）の生産する、キシロオリゴシル転移
酵素の、酢酸緩衝液中（ａ）、および５０％ｎ−プロピ
ルアルコール中（ｂ）での最適作用温度を示している。 第３図は、アクレモニウム・セル口リテイカスルアルコ
ール中（ｂ）での熱安定性を示している。 第４図は、キシロトリオース（ｘ３）からキシロヘキサ
オース（Ｘ６）を供与体および受容体として１５分間（
ａ）および２時１ｍ（ｂ）キシロオリゴシル転移酵素と
反応させたときの、反応生成物のバイオゲルＰ−２によ
るゲル濾過分析の溶出パターンを示している０図の上部
に示したｌ〜１２はキシロオリゴ糖の重合度を示し、ま
たＡ〜Ｅは１５分間反応における主要な転移生成物を示
し、それらがキシロテトラオースからキシロデカオース
であることを示している。 第１図 Ｈ 第２図 反応温度（℃） 第３図 処理温度（℃） 図面の浄書 溶出液量（ｍｌ） 官庁出願 手続補正書く方式） ％式％ １、事件の表示　　　昭和６２年特許願第３２８４６９
号２、発明の名称 新規なキシロオリゴシル転移酵素 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　　所　　東京都千代田区霞が関１丁目３番１号氏　
　名　　（１１４）工業技術院長　飯　塚　幸　三４、
指定代理人　　〒３０５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 重合度２以上のキシロオリゴ糖残基の転移能を有する以
   下の酵素的性質により特徴付けられる新規なキシロオリ
   ゴシル転移酵素。 １、分子量が約５１，０００であること。 ２、等電点ｐＨが約５．０であること。 ３、糖を受容体としたとき至適作用温度が８０℃付近に
   あること、 ４、糖を受容体としたとき至適作用ｐＨが４．９付近に
   あること。 ５、糖以外のアルコールを受容体としたとき至適作用温
   度が５０℃付近にあること。 ６、糖を受容体としたとき熱安定な温度が ７０℃付近まであること。 ７、糖以外のアルコールを受容体としたとき熱安定な温
   度が５０℃付近まであること。