JPH01171492A - キシロオリゴ糖誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「技術分野」 本発明は、糖転移酵素を用いたキシロオリゴ糖誘導体の
製造方法に関するものである。

「従来技術」 キシランは、広葉樹およびイネを代表とする禾本科植物
の主要なヘミセルロース成分であり、これら植物体の構
成成分の２０−３０％をしめる重要なバイオマス原料で
ある。このキシランは、パルプ工業の副産物として、ま
た農産廃棄物、特にトウモロコシ穂軸から多量に得られ
、飼料の改質剤あるいはキシリトール製造の原料として
用いられてきた。　しかし、これらの需要はそれほど大
きいものではなく、キシランを原料としたより高付加価
値製品の開発が望まれている。

近年、キシランを原料とした新しい製品として、キシロ
オリゴ糖が注目され、その水分活性調節作用を利用した
、食品への応用などが試みられている。一方、糖質の利
用では最も先行している分野である澱粉糖工業において
は、糖転移酵素をもちいて澱粉あるいは澱粉氷解物から
、より付加価値の高い転移生成物を製造する手段が開発
されつつある。キシラン系においても、従来から糖転移
作用を持つ酵素の存在は知られていたが、未だ澱粉糖工
業にみられるような展開はみられない、これは、キシロ
ース系糖質に関して従来知られている糖転移活性が、は
とんど加水分解酵素の逆反応によるものであり、充分な
活性をもつ糖転移酵素がないこと、また糖以外の受容体
としては、水に可溶な一級アルコール類のみが知られて
いるにすぎないことなどが原因である。これらの問題点
が解決されるならば、キシランを原料として糖転移作用
による新たな物質の製造が酵素的に可能であり、より付
加価値の高まった製品をキシランから製造することがで
きる。

「目的」 本発明者らは、植物性バイオマスに多量に含まれている
キシランの、より高度な利用法を提供するという観点か
ら、キシランあるいはキシランから調製されるキシロオ
リゴ糖を供与体として、キシロースあるいは従来まった
く知られていなかったキシロオリゴ糖転移により、有用
な糖転移物を製造することを目指し、キシロース系での
糖転移酵素の開発に着手した。その結果、中温性糸状菌
の一種ア≦１モニウム属の一菌株が、キシロオリ、、１ ゴ糖転移作用をもつ新しい糖転移酵素を生産することを
見いだし、かつ本酵素が糖以外に一級および二級アルコ
ール類を広く受容体として利用できること、またこれら
アルコール類の水に対する溶解度が低い場合にも、効率
よく糖転移を行うことを見いだした。すなわち、糖以外
に各種のアルコール類を本酵素の受容体とすることで、
糖転移反応の結果、水酸基の修飾されたキシロオリゴ糖
誘導体が生成することを見いだし、本発明を完成するに
至った。

「構成」 本発明は、キシロオリゴ糖転移酵素を酵素触媒としても
ちい、キシランあるいはキシラン氷解物から水酸基の修
飾されたキシロオリゴ糖誘導体を製造する方法に関する
ものである。

以下に、本発明の内容を具体的に説明する０本発明にお
いては、その例示菌株としてアクレモニウム・セルロリ
ティカスが有効に利用される。

シル転移酵素Ａ生産菌の菌学的性質を示すと下記の通り
である。

生育：　麦芽エキス寒天培地上では生育は速く、３０℃
７日間で直径７０■−に達する。集落は最初白色で後に
やや黄色味をおびる。気化菌糸は緩く盛り上がり羊毛状
を呈し、時に繊状の菌糸束を形成する。

培養後期には集落裏面は桃褐色ないし赤褐色を呈する。

ツアペック寒天上でもほぼ同様な生育を示すが、気化菌
糸の盛り上がりはより少ない、生育、ｐｉ１範囲は３．
５〜６．０で最適ｐ旧よ４付近、生育温度範囲は１５℃
〜４３℃で、最適生育温度は３０℃である。

形Ｒ：　菌糸の直径は０゜５〜２．５μ組　無色で菌糸
には隔壁が認められる。また、菌糸表面は平滑である。

分生子：　分生子形成能は非常に不安定で、ツアペック
寒天および麦芽エキス寒天培地による継代培養により容
易に消失した０分離時における観察では、分生子柄は気
化菌糸側面より突出し、無色であった０分生子は亜球形
で滑面、無色で連鎖はｏｓｐｏｒｌｕｓ　　ａｒｔｌｇ
ｅ　　Ｓｃｈｉ−ｍｅｌｐＨｇｅ）　　ｐ８４．　　Ｇ
、ＦＩｓｈｅｒ編（１９７１）ＪおよびＣ，Ｉｌ、Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ　　ｒ　ＭｙｃｏｌｏｇｉｃａｌＰａｐ
ｅｒｓ　１１５巻　ｐｌＯ（１９６８）　＋を参照した
結果、本国はアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）
属に近縁の糸状菌と考えるのが妥当であると考えた。な
お、本国はキシロオリゴシル転移酵素の他に著量のセル
ラーゼを生産するという特徴をもっており、従来アクレ
モニウム属菌にはセルラーゼ生産能の高い菌が知られて
いなかったことから、本国をアクレモニウム・セルロリ
ティカス　（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌ。

１ｙｔｌｃｕｓ）と命名した６本国はＦＥＢＮ　Ｐ−６
８６７として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている。

本発明のアクレモニウム属によるキシロオリゴシル転移
酵素Ａを生産するためには、通常、キシログルカン、セ
ルロース、アビセル、キシラン、　フスマ、稲ワラ、バ
ガスなと植物性バイオマスを炭素源とし、これに窒素源
として、硝酸塩、アンモニウム塩あるいはペプトン、酵
母エキスのような無−″ままたは有機の窒素源と小量の
金属塩を含む液体または個体培地を用い、２０〜４０℃
で、２〜１５日間程度、好気的に培養される。キシロオ
リゴシル転移酵素Ａは菌体外に生産される酵素であるた
め、液体培地の場合は、培養後濾過あるいは遠心分離し
た上澄液を、そして個体培養の場合は培養後、水または
適当な無機塩類で抽出した液を、粗酵素液として用いる
ことができる。粗酵素液は、そのまま使用してもよいが
、例えば硫安塩析法やアセトン沈澱法など公知の方法に
より、酵素粉末を得ることができる。さらに、本酵素は
耐熱性であることから、この性質を利用して、ｐＨ４，
９６５℃で２時間３０分の熱処理を行うことにより、キ
シロオリゴシル転移酵素Ａの活性を損なうことなく、不
純物を変性沈澱させて除くことができ、キシロオリゴシ
ル転移酵素＾活性の純度の高まった酵素液を簡単に調製
することができる。このようにして得られた、キシロオ
リゴシル転移酵素Ａ標品は次のような性質を持っている
。

（１）　分子量および等電点 （２）作用 キシロオリゴシル転移酵素Ａは、キシランおよびキシラ
ンから調製されたキシロビオース以上のキシロオリゴ糖
に作用し、これをキシロシルまたはキシロオリゴシル供
与体として、受容体のアルコール性水酸基に転移し、キ
シロシルまたは、キシロオリゴシル転移生成物を生成す
る。この転移作用について、キシロペンタオースの場合
を例に具体的に述べると、本供与体は該酵素によってキ
シロトリオシル転移およびキシロビオシル転移を引き起
こす供与体として利用される。それぞれの転移の起こる
確率は、キシロトリオシル転移が約８５％の確率で、ま
たキシロビオシル転移が約１５％の確率で起こる。その
他の直鎖キシロオリゴ糖について初期反応におけるキシ
ロオリゴシル転移の起こる確率を、キシロペンタオース
も含めて表−１に示した。

表−１ 表中のＸ−〜ｘ６−はそれぞれキシロシル残基からキシ
ロトリオシル転移を示している。

表に示したように、キシロヘキサオース以上のキシロオ
リゴ糖を供与体としたとき、キシロトリオシル転移物以
上の転移物が生成するが、反応時間が長くなるとこれら
は再分解され、最終的にキシロビオシル転移物およびキ
シロトリオシル転移物を与える。

本酵素は、基質オリゴ糖の濃度が１％という低い濃度で
明かな転移活性を有し、またキシロビオシル以上のオリ
ゴ糖残基を受容体のアルコール性水酸基に転移できる。

このような作用をもつ糖転移酵素はこれまでまったく知
られていなかったものであり、本発明による開示が最初
のものである。

そこで、本酵素をキシロオリゴシル転移酵素＾と命名し
た。

（３）供与体 供与体としてはキシロビオース以上のキシロオリゴ糖お
よびキシランが利用できるが、キシロテトラオース以上
のキシロオリゴ糖およびキシランを供与体としたとき転
移活性が充分となる。

（４）受容体 受容体としては、キシロビオース以上のキシロオリゴ糖
が利用でき、これらは供与体としても働くので、これら
を受容体とすると、事実上オリゴ糖のキシロシド結合の
再配置、いわゆる、結合の不均化がおこる。キシロース
、グルコースなどの糖も受容体として適さない。

有機化学的合成手法あるいは天然物より得られる糖以外
の各種アルコール類のうち、水溶性および微水溶性のア
ルコール類は、受容体となり、その水酸基に対してキシ
ロオリゴシル転移が起こり、キシロオリゴ糖誘導体を生
成する。

（５）作用ｐｉ（および最適作用ｐＨ 本酵素の作用ｐＨ範囲は、４５℃で１ｏ分間作用させた
とき第１図ａに示したように、ｐＨ３〜６であり、最適
作用ｐＨは約５に認められた。

（６）安定ｐＨ範囲 クエン酸−リン酸塩＆！街液中で、２５℃２４時間放置
したときの安定ｐＨ範囲は、第１１１ｂに示したように
、約ｐＨ２，５〜８．５であった。

（７）作用温度範囲および最適作用温度０．１％キシロ
テトラオースを供与体および受容体として用い、ｐＨ４
，９で１０分間作用させたとき、第２図ａに示したよう
に、約９０℃までの高温まで転を受容体として用いたと
きは、第２図すに示したように作用温度の低下がおこり
、５０％プロピルアルコール存在下では、５５℃まで作
用し、最適作用温度は５０℃であった。

（８）熱安定性 キシロオリゴシル転移酵素＾を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４，９）のもとで、各温度で１時間加熱処理した残存
活性は、第３　［！Ｉ　ａに示したように、７０℃まで
はほとんど失活せず、７５℃で約４０％そして８５℃、
１時間の加熱で約９５瓢が活性を失った。また、５０％
　ｎ−プロピルアルコール存在下、ｐＨ４，９で加熱処
理した場合は、第３図すに示したように、４５℃までは
ほとんど失活せず、５５℃で約２５χ、そして７０℃、
１時間の加熱で約９５駕が活性を失った。

（９）阻害剤 各種金属イオンのうちで、１ｓＭ以上の水銀イオンおよ
び銅イオンにより、本酵素は強く阻害された。

（１０）１精Σ製法 本酵素は培養ｒ液を、６５℃２時Ｉｆｉ１３０分加熱処
理し、含まれる不純タンパク質を変性させ生じた沈澱を
遠心分離により除いた後、ＤＥＡＬ！−）ヨパール、陰
イオン交換体ＰＢＥ　９４のカラムをもちいたイオン交
換および吸着クロマトグラフィー、さらにバイオゲルＡ
０．５ｉ＋カラムによるゲルー過により、ディスクゲル
電気泳動的に均一にまで分離精製できた。

（１１）活性測定法 本酵素は、キシロオリゴ糖を受容体および供与体として
転移をおこなうことから、キシランから調製した、キシ
ロテトラオースの０．１１水溶液１００μｒ　（ｐＨ４
，９）に対して、適量の酵素を添加し全量を１５０μ！
とし、４５℃で１０分間反応させ、生成するキシロペン
タオース以上の転移生成物を、リクロソルプＭＨ２カラ
ムをもちいた高速液体クロマトグラフィーにより分離定
量して活性を求めた。この条件で、１分間に１μｇのキ
シロペンタオース以上のキシロオリゴ糖を生成する酵素
量を１単位としな。

「効果Ｊ 以上のとおり、本発明に開示したキシロオリゴシル転移
酵素Ａは、キシランから調製されるキシロオリゴ糖ある
いはキシランを供与体としてキシロオリゴシル転移をお
こなう、新規な酵素であり、また５０％アルコール中で
安定に作用しキシロオリゴ糖誘導体を生成するという有
用な性質をもつものである。そして、このように生成し
たキシロオリゴ糖誘導体は、親水性の糖部分と疎水性の
修飾部分をもつことから界面活性作用をもつものが多く
あると推定され、キシランからこれまで考えられなかっ
た有用なキシロオリゴ糖誘導体を酵素反応により製造す
る道を開いたものである。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ セルロース４ｘ、ペプトン１駕、硝酸カリウム０．６％
、塩化カリウムｏ、１５ｘ、ｖｌ酸マグネシウム０．１
２χ、燐酸−カリウム１．２πおよび硫酸亜鉛、硫酸銅
、硫酸後アクレモニウム・セルロリティカス　（ＦＩＲ
Ｍ　Ｐ−６８６７〉を接種し、３０℃で６日間通気培養
した。培養後遠心分離により除菌し、得られた上澄液に
ついてキシロオリゴシル転移酵素Ａ活性を測定した結果
、培養液１１当り２２０単位であった。

実施例２ 実施ｒＮ１において、炭素源をセルロースに代えて、キ
シログルカン（大日本製薬製　グリロイド３３）　４％
を添加した培地に、アクレモニウム・セルロリティカス
（ＦＥＲＮ　Ｐ−６８６７）を接種し３０℃で８日間通
気培養した。遠心分離した上澄液中のキシロオリゴシル
転移酵素＾活性は、培養液１ｍｌ当り１２００単位であ
った。

この培養上澄液のｐｌを４．９に調製して、６５℃２時
間３０分加熱処理した後、生じた沈澱を遠心分離により
除き、キシロオリゴシル転移酵素Ａ活性をもつ酵素標品
を得た。キシロオリゴシル転移酵″素Ａの回＋＋。

実施例３ 実施例２で得た熱処理酵素標品を、濃縮、脱塩ｔＩｋＤ
Ｉ！ＡＩ！−）ヨバールＭ６５Ｇおよび陰イオン交換体
ＰＢＥ　９４ラムによりイオン交換クロマトグラフィー
をおこない活性画分を得た。この活性画分をさらにバイ
オゲルＡ０．５−カラムによるゲｌしｒ過をおこないキ
シロオリゴシル転移酵素Ａを精製した。精製酵素はディ
スク電気泳動的に均一であり、活性の収率は培養上清に
たいして２２罵であった。また、凍結乾燥酵素標品１ｍ
ｇあたりのキシロオリゴシル転移酵素＾活性は、６１単
位であった。

実施例４ 実施例３で得られた精製酵素０．’４位を、ｌπキシロ
トリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース
およびキシロヘキサオースに６０℃１５分間および２時
間作用させ、反応生成物をバイオゲルＰ−２カラムによ
り分析した。第４図ａに示すように、らはキシロヘキサ
オースが、キシロペンタオースからはキシロオクタオー
スが、またキシロヘキサオースからはキシロノナオース
およびキシロデカオースが主たる転移生成物として得ら
れ、本酵素がキシロオリゴシル転移を触媒していること
が示された。さらに、反応時間２時間では、第４図すに
示したように、転移反応が進み、加えた基質より大きな
重合度をもつキシロウンデカオース以下の多数の転移生
成物が生成し、分子間糖転移反応がおこっていることが
示された。

実ｈｆｉ例５ 実施例３で得られた精製酵素０．５単位を、１％キシロ
テトラオースおよび炭素数１から１０までの直鎖アルキ
ルアルコールをそれぞれ２５％含む反応液中で４５℃、
２時間反応させ、転移生成物をリクロソルブＮＨ２カラ
ムをもちいた高速液体クロマトグラフィーにより分析し
た結果、キシロテトラオースに対す実施４例３で得られ
た精製酵素０．５単位を、１％キシロテトラオースおよ
び炭素数２から８までの両末端に水酸基を持つ直鎖アル
キルジオールをそれぞれ２５％含む反応液中で、４５℃
、２時間反応させた後、転移生成物を実施例５と同様に
分析した。その結果、キシロテトラオースに対する収率
が、表−３に示したような収率でそれぞれのジオールか
らアルキル基の末端に水酸基をもった、アルキル化キシ
ロビオースが得られた。

表−３ ０テトラオースおよび５ｅｅ−ブチルアルコールを２５
ｘ含む反応液中で、４５℃、２時間反応させた後、転移
生成物を実施例５と同様に分析した。その結果、キシロ
テトラオースに対する収率が２６％で５ｅｅ−ブチルア
ルコールの水酸基にキシロビオースの転移した転移物が
得られた。

実施例８ 実施例３で得られた精製酵素０．５単位を、Ｂキシロテ
トラオースおよびベンジルアルコールを２５χ含む反応
液中で、４５℃、２時間反応させた後、転移生成物を実
施例５と同様に分析しな、その結果、キシロテトラオー
スに対する収率が３２％でベンジルアルコールの水酸基
にキシロビオースの転移した転移生成物が得られた。

実施例９ 実施例５のキシロテトラオースの代わりに、キ実語例１
０ 実施例３で得られた精製酵素０．５単位を、１％キシラ
ン（大麦由来）および２５％ｈ−プロピルアルコールを
含む反応液中で、４５℃、１８時間反応させた後、転移
生成物を実施例５と同様に分析した。その結果、キシラ
ンに対する収率が８駕でプロピルアルコールの水酸基に
キシロビオースの転移した転移生成物が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は　アクレモニウム・セルロリティカス（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−６８６７＞の生産する、キシロオリゴシル転移
酵素Ａの最適作用ｐ　ＩＩ　（ｉ）、ｐｌ＋安定範囲（
ｂ）をそれぞれ示している。 第２図は　アクレモニウム・セルロリティカス（ＦＥＢ
Ｍ　Ｐ−６８６７）の生産する、キシロオリゴシル転移
第３図は、アクレモニウム・セルロリティカス（ＦＥＢ
Ｎ　Ｐ−６８６７）の生産するキシロオリゴシル転移酵
素Ａの、酢酸緩衝液中（＆）、および５０！　ｎ−プロ
ピルアルコール中（ｂ）での熱安定性を示している。 第４図は、キシロトリオース（ｘ３）からキシロヘキサ
オース（ｘ６）を供与体および受容体として１５分間（
＆）および２時間（ｂ）キシロオリゴシル転移酵素と反
′応させたときの、反応生成物のバイオゲルＰ−２によ
るゲルー過分析の溶出パターンを示している。 図の上部に示した１〜１２はキシロオリゴ糖の重合度を
示し、またＡ−Ｅは１５分間反応における主要な転移生
成物を示し、それらがキシロテトラオースからキシロデ
カオースであることを示している。 第１図 ｐＨ 第２図 反応温度ｃ℃） 第３図 処理温度（”Ｃ） 図面の浄書・ 溶出液量（ｍｌ） 官庁出願 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示　　　昭和６２年特許願第３２８４７０
号２、発明の名称 キシロオリゴ糖誘導体の製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　　所　　東京都千代田区霞が関１丁目３番１号氏　
　名　　（１１４）工業技術院長　飯　塚　幸　三４、
指定代理人　　〒３０５

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. キシロオリゴシル転移酵素Ａ生産能を有するアクレモニ
   ウム属菌を培養し、得られた培養物もしくは培養物より
   採取されたキシロオリゴシル転移酵素Ａをアルコール存
   在下でキシランもしくはキシラン加水分解物と接触させ
   ることを特徴とするキシロオリゴ糖誘導体の製造方法。