JPH01181796A - 組換えｄｎａ法を用いたポリペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は組換えＤＮＡ法により形質転換された微生物を
培養して目的とするポリペプチドを製造する方法に関す
る。

〔従来の技術〕

組換えＤＮＡ技術を用りて大腸菌により真核生物由来の
遺伝子などの外来性遺伝子を高レベルで発現させるため
には一般に大腸菌のＴｒｐ７’ロモーターなどの強力な
プロモーターを用い、さらに大腸菌遺伝子の有するシャ
イン・ダルガノ配列を、開始コドンＡＴＧを付した外来
性遺伝子の上流に連結する方法がとられる。

しかしこの方法の場合、外来性遺伝子に由来する採取を
目的とするポリペプチド（以下目的ポリペプチドという
）が菌体内（顆粒状となって蓄積されるほど高レベルに
生産されることは稀であシ、通常は菌体内に溶解した状
態で蓄積されるＫとどまる。このような顆粒状に蓄積さ
れない場合の蓄積量を顆粒状に蓄積された場合の蓄積量
と比較すると、ぎリベプチドの性質により異なるが、通
常１／１００ないし１／１０００と極めて少量である。

従って外来性のポリペプチドを大腸菌を用いて工業的に
生産する場合、目的ポリペプチドを顆粒状に菌体内に蓄
積せしめることが出来るか否かは工業生産を実施する場
合には極めて重要に要素である。

そこで、外来遺伝子の発現性を高める手段として、大腸
菌が本来生産しているポリペプチドの中で高レベルに生
産しているポリペプチドの遺伝子、ｔａｃ　Ｚ　、　ｔ
ｕｆ　Ｂなとの遺伝子に外来遺伝子を連結すると、大腸
菌の高レベル発現ポリペプチドと外来遺伝子由来ポリペ
プチドが融合ポリペプチドの形で多量に生産される場合
が多いことが知られている〔ヤング（Ｙｏｕｎｇ　ｘ　
Ｒ，Ａ、　）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ８０．１１９４−１１９
８（１９８３）］。

これは、ポポリペプチド発現が、大腸菌が本来的にもっ
ているポリペプチドをコードする遺伝子を含むものであ
るために翻訳がスムーズに開始されること、ならびに生
成したポリペプチドが大腸菌自身のもつポリペプチドと
異種ポリペプチドとの融合？す４グチドであるため、大
腸菌のもつプロテアーゼによって異種ポリペプチドとは
認識されにくく、プロテアーゼの分解性に抵抗性をもつ
こと、によると考えられている。しかしこの方法で得ら
れたＩｖ（プチドはその分子内に目的ポリペプチドの構
造を含んではいるものの融合ポリペプチドで、あシ、目
的ポリ−ｅｆチドそのものではないし、また顆粒状に蓄
積されることもない。そこで目的Ｉす（プチドそのもの
を取）出すための技術がこれまでに４つ開示されている
。

その１は、大腸菌の高発現ポリペプチドであるβガラク
トシダーゼポリペプチドの一部の３′末端にメチオニン
コドンを付加し、さらにその下流にソマトスタチンペプ
チドコドンを連結した遺伝子を構築し、これによって形
質転換した微生物を培養して融合ポリ４プチドを取得し
、これをブロムシアン処理してメチオニン部分で切断し
てソマトスタチンを得る方法（イタクラら、サイエンス
１９８．１０５６〜１０６３　（１９７７））である。

しかしこの方法は、目的ポリペプチドにメチオニンが含
まれない場合にだけ適用出来るものであシ、−般の外来
性遺伝子に由来するポリペプチドを取得するのＫこの方
法を適用することはできない。

その２はヨーロッパ特許出願公開３５．３８４号（カリ
フォルニア大）記載の方法で、大腸菌の高発現ポリペプ
チド遺伝子と、目的ポリペプチド遺伝子との間に特定の
切断が可能となるような切断リンカ−を配したＤＮＡを
構築し、この遺伝子により形質転換した微生物を培養し
て融合ポリペプチドを得、これを酵素により特定の切断
位置で切断することにより目的ポリペプチドを取得する
という方法である。具体的には、切断酵素としてエンテ
ロキナーゼを用い、切断リンカ−としてＸ−（Ａｓｐ）
ｎ　−Ｌｙｓ　−Ｙ　（ｎ　−２〜４　）を用いた例が
開示されているが、この方法は、特異性が低いという問
題がある。

その３は、ヨーロッｔＪ？特許出側公開第１６１９３７
号（セルチック社）に開示されている方法で、基本的に
は、上記ヨーロッノ々特許出願公開第３５３８４号と同
様に、大腸菌の高発現ポリペプチド遺伝子と目的ポリペ
プチド遺伝子とを切断リンカ−を介して連結するもので
あるが、切断リンカ−とて血液凝固因子Ｘ８が作用する
ようにＤＮＡを構築したものである。

本法は特異性が高く目的ポリ被プチドを得るためには優
れた方法であるが、切断酵素が血漿より高度な精製を経
て得られるために高価であシ特に工業的大量生産に本法
を適用する場合には経済性の面で問題点を有している。

その４は安枝らが日本農芸化学会６２年度大会で発表し
た方法（同要旨集３５２頁）である。この方法はヒトイ
ンターロイキン２ポリ４デチドのＮ末端部分２１ないし
５９アミノ酸を大腸菌の高発現ポリペプチドとして用い
、これとマウスインターロイチン２ポリペプチドをカリ
クレイン切断リンカ−としてＰｈｅ　−Ａｒｇを介して
連結した融合ポリペプチドとなし、これにカリクレイン
を作用させて目的ポリペプチドであるマウスインターロ
イチン２を得る方法である。また鹿島ら（日本農芸化学
会６２年度大会、要旨集３５２頁）はこの方法をヒトＢ
ＳＦ　−２（Ｂ−ｃｅｌｌ　ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ　
ｆａｃｔｏｒ２）Ｋ適用し目的ポリペプチドの取得に成
功している。この技術の問題点は２つあシーつはカリク
レインの切断認識配列がｉｏ−Ａｒｇの２アミノ酸の配
列であるため目的ポリペプチド中にこのような配列が存
在すると適用出来ないこと、その２はカリクレインが高
価であシ工業的大量生産に用いるためには経済性の面で
不利であるということである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

紙上のととく組換えＤＮＡにより目的ポリベゾチドを工
業的に有利に生産するためには目的ポリペプチドを著量
に発現し高蓄積させることが第一の条件となるが、融合
ポリペプチド法はこの条件を満たすための極めて有効な
手段である。しかし目的ポリペプチドを得るためには蓄
積した融合ポリ（デチドから目的ポリペプチドを活性を
有する形でとシ出す必要がある。従来、この分野ではい
くつかの技術が提供されているが、いずれも目的ポリ−
？プチドの性状によって適用出来ない場合がある、使用
するプロテアーゼが特殊なものであるために高価格であ
シ工業的大量生産には経済性の面で不利であるなどの問
題点がある。

本発明の目的は紙上の問題点を解決し目的ポリペプチド
の性状にほとんど影響を受けない広範囲の目的ポ９−＜
ｆチドに適用可能で、かつ経済性の面でも従来技術に比
し極めて優位な融合ポリペプチドから目的ポリペプチド
を採取する技術を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは組換えＤＮＡ法を用いて目的ポリペプチド
を採取する方法におｈて紙上の問題点を解決するため、
目的ポリペプチドの性状にほとんど影響を受けない広範
囲に適用出来て、かつ経済性も従来の技術より優れてい
る工業的大量生産に有利な技術を開発するために種々の
研究を行ない本発明を完成するに至った。

本発明は以下に述べる知見・技術及び考察を基礎として
問題点を解決するための手段としている。

■　外来遺伝子を微生物で発現させ生産する場合に融合
ポリペプチド法とすることは極めて有利な場合が多い。

■　遺伝子組換え技術では遺伝子を改変し生成するポリ
ペプチドのアミノ酸構成を自由に変えることが出来る。

融合？リベグチド法では目的ポリペプチド部分の改変は
許されないが、付加ポリペプチド部分のデザインは自由
に行うことが出来る。

■　一方、ポリペプチドのＮ末端側からアミノ酸を切断
する酵素としてアミノペプチダーゼが存在するが、アミ
ノペプチダーゼの中にはプロリンのＮ末端側及びＣ末端
側の結合に対して特異性の異なるものがある。

■　以上の事実から融合ポリペプチド法で高発現させた
融合′ポリペプチドにおいて、予じめ付加ポリペプチド
の部分のアミノ酸配列を適切に配置しておけば、各種の
アミノペプチダーゼを適切に用いてプロリンに対する特
異性を利用することにより、付加ポリ被プチド部分をＮ
末端側から順次切断し、目的ポリペプチド部分のみを残
存せしめることが可能である。

■　使用するアミノ−ｅｆチダーゼは大腸菌由来で容易
に安価に入手出来る、或は市販品であっても従来技術で
用いられる血液凝固酵素Ｘ１やカリクレインなどに比し
格段に安価である。

以上述べたように本発明は生産性の点で有利な融合ポリ
ペプチドから目的ポリペプチドを採取するに際しプロリ
ンに対する特異性の異なる各種のアミノ４ｆチダーゼを
巧みに組み合せて付加ポリペプチド部分をＮ末端側から
順次切断遊離し目的ポリペプチド部分のみを残存させる
ことをその本質としてお′夛、いわば多段階選択切断法
といえる技術である。この技術は従来の血液凝固酵素Ｘ
ａやカリクレインを用いる方法が付加ポリペプチドと目
的ポリペプチドの結合部位をその酵素の特異性に因夛−
段で付加ポリペプチドと目的ポリ−ｅｆチドに切断する
いわば一段階切断法ともいえる技術とは全く異なる着想
にもとすく新しい技術である。

以下に本発明で使用するアミノペプチダーゼ及びそれを
用いて融合ポリペプチドから目的４す４ゾチドを取得す
る方法について述べる。

本発明で使用するアミノペプチダーゼは以下の３つのタ
イプのものである。

■　アミノペプチダーゼＰ　（Ａｎｚｉｎｏｐｅｐｔｌ
ｄａｓｅ　Ｐ（ＥＣ３，４，ＩＬ５　）以下ＡＰ−Ｐと
表示する）本酵素はＮ末端側から２番目のアミノ酸がプ
ロリンであるとき１番目のアミノ酸を切断遊離する。従
ってＸ−Ｐｒｏ−Ｙ−（Ｘは任意のアミノ酸、Ｙはプロ
リン以外のアミノ酸）のアミノ酸配列でＸを切断遊離さ
せる場合に本酵素を使用する。

■　グロリンイミノベプチダーゼ（Ｐｒｏ）ｉｎｅ−１
ｚｎｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓ＊　（ＥＣ３，４，１１，
５）以下ＰＩＦと表示する） 本酵素はＮ末端アミノ酸がプロリンであるときプロリン
のみを切断遊離する。従ってＰｒｏ　−Ｘ　−（Ｘはプ
ロリン以外のアミノ酸）のアミノ酸配列でプロリンを切
断遊離させる場合に本酵素を使用する。

■　プロリン以外のアミノ酸で構成されるペプチド結合
を切断するが、プロリンのＮ末端側にもＣ末端側にも作
用しなりアミノペプチダーゼ。

このタイプのアミノペプチダーゼとして種々のものが知
られている。代表的なものはアミノペプチダーゼＭ　（
Ａｍ１ｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ　Ｍ　［：　ＥＣ，３，
４゜１１、２　］以下ＡＰ−Ｍと表示する）、ロイシン
アミノペプチダーゼ（Ｌｅｕｃｉｎｅａｍｉｎｏｐ＠ｐ
ｔｉｄａｓｅ（ＥＣ，３，４，１１，１）　）　、大腸
菌７ミ／−ｅｆ＋！−ゼＩ　（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ａｚｎｌ
ｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ　Ｉ　＋　Ｖｏｇｔ　Ｖ、Ｍ。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｉｎ、　２４５　、４７６０　
、１９７０　）などである。以後■の特性を有するアミ
ノペプチダーゼをＡＰ−Ｍなどと表示する。

４ｆチダ一ゼＭ等はプロリンを含まないアミノ酸配列を
切断遊離させる場合に使用する。なおＡＰ−Ｍの特異性
に関してはプロリンも含めて切断するとの報告があるが
発明者らの研究により市販のＡＰ−Ｍは精製が不充分で
他のペプチダーゼを含有しているためにプロリン切断性
が認メられるのであって、ＡＰ−Ｍ＃’！プロリン切断
性を持たないことが明きらかにされている （　Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ、　Ｔ　ａｎｄ　Ｔｓｕｒｕ　
Ｄ、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈ＠ｍ、　９４＋６１９．１９８３
）。

次にこれらのペプチダーゼを用いて融合ポリペプチドか
ら目的ポリペプチドを取得する方法について述べる。

融合ポリペプチドの構造を一般化して次のように表示す
る。

（Ａ−Ｂ−Ｃ−−−Ｄ−Ｅ−Ｐｒｏ−Ｆ−Ｇ　−Ｈ−Ｉ
−Ｐｒｏ−）＋Ｘ−Ｙ　・−Ｚ　）ここで（Ａ　−Ｐｒ
ｏ　）は付加ポリペプチドで（Ｘ〜２）は目的ポリペプ
チドである。Ａ〜Ｉ、Ｘ、Ｙ及び付加ポリペプチド部分
の・・・はプロリン以外のアミノ酸である。このような
融合ポリペプチドから目的ポリペプチドを取得するため
に以下の操作を行う。■ＡＰ−Ｍ等を単独あるいは複数
混合して作用させＡ−Ｄのアミノ酸を順次切断する。■
（Ｅ−Ｐｒｏ・・−Ｐｒｏ　）が付加された融合ポリペ
プチドを単離しこれにＡＰ　−Ｐ及びＰＩＦを順次或は
同時に作用させてＥ　＊　ｐｒｏを遊離させる。■（ｐ
−、＝ｐｒｏ〕が付加された融合ポリペプチドを単離し
これにＡＰ−Ｍ等を作用させＦ−Ｈを順次切断遊離させ
る。

■（Ｉ　−Ｐｒｏ　）が付加された融合ポリペプチドを
単離し、これにＡＰ−Ｐ及びＰＩＦを順次または同時に
作用させてＩ　、　Ｐｒｏを切断して目的ポリペプチド
を残存させ、これを採取する。

以上本発明の方法を一般形の融合ポリ−ｅｆチドで説明
したが、融合ポリペプチドの構造が一般形と異なる場合
でも基本的には上記のバリエーションとして取扱えばよ
い。パリエージ鵞ンの例を以下に示す。

■　Ａがプロリンである場合は上記の操作に先達ってＰ
ＩＦでプロリンを除去すれば一般形と同じになる。

■　Ｂがプロリンである場合は上記の操作に先達ってＡ
Ｐ−Ｐ　、　ＰＩＦを順次または同時に作用させてＡ、
プロリンを除去すれば一般形と同じになる。

■　付加ポリペプチドの中間部分にプロリンが含まれな
い場合は■、■の操作を省略すればよい。

■　付加ポリペプチドの中間部分にプロリンが複数個存
在する場合は■、■の操作を繰シ返してプロリンとその
Ｎ末端側のアミノ酸を除去すればよい。

■　付加ポリペプチドの中間部分にプロリ／が連続して
存在する場合は■〜■の操作をそのまま行えばよい。

■　目的ポリペプチドのＮ末端側第１アミノ酸、即ちＸ
がプロリンの場合は、〔Ａ〜工〕を付加ポリペプチド、
（Ｐｒｏ　−ｘ・・・２）を目的ポリペプチドとみなし
■■■の操作を行えばよい。なおこの場合付加ポリペプ
チドのＣ末端アミノ酸、即ちＩはプロリンを含む任意の
アミノ酸に適用出来る。

■　目的ポリペグチドＯＮ末端側第１アミノ酸がプロリ
ンでなく、第２アミノ酸がプロリンである場合即ちＸが
プロリンでなくＹがプロリンである場合は付加ポリペプ
チドのＣ末端アミノ酸をプロリン以外のアミノ酸にデデ
インすることによって（Ａ−Ｈ）を付加ポリペプチド（
１−ＰｒＯ−Ｘ・・・２）を目的ポリペプチドと見なす
ことが出来、■、■、■の操作を行えばよい。

以上のように本発明はプロリンに対して特異性の異なる
３種の７ミノペプチダーゼを融合ポリペプチドの構造に
対応して適宜使いわけることによりはとんどすべての融
合ポリペプチドから目的ポリ−′−ｅｆチドを自在に取
得出来る新しい技術である。

本発明を従来の血液凝固酵素Ｘａやカリクレインを用い
る一段階特異的切断と比較すると酵素の経済性の問題の
ほかに従来の技術では目的ポリペプチド中に特異的切断
部位と同じアミノ酸配列が存在すると適用が不可能であ
るのに対し本発明の方法は付加ポリペプチドのアミノ酸
を一つづつ切断する方法であるために目的プリー２ｆチ
ド中のアミノ酸配列にほとんど影響を受けないで適用可
能であるという特長をもつ。本発明で適用出来ない唯一
のケースは目的ポリペプチドのＮ末端側第１アミノ酸が
プロリンであるときそれに続く第２以降のアミノ酸もま
たプロリンである場合である。しかし目的ポリペプチド
がこのような構造である確率は極めて低いので本技術は
殆どすべての融合ポリペプチドに適用出来る汎用技術と
いえるものである。また本発明の適用にあたっては付加
ポリペプチドが長い場合や付加ポリペプチドの中間部分
にプロリンが存在する場合には操作が煩雑になシ効率も
低下する。従って付加ポリペプチドは融合ポリペプチド
法の特長である高発現性、高蓄積性を有意に損わない範
囲で可能な限シ短くし、またポリペプチド中間部分のプ
ロリンを含まないように遺伝子を改変することが本発明
の適用に有利となる。またＡＰ−Ｍなどに属するアミン
（プチグーゼはアミノ酸の糧類により切断する速度が異
なるので単独で使用するよりも多極類の酵素を混合して
作用させる方が一般的には有利である。

以下に実施例を示すがこれらは本発明の適用例を示した
もので発明の範囲を限定するものではない。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

実施例１　マウスインターロイキン２の製造法ヒトイン
ターロイキン２（以下ｈＩＬ−２と略す）蛋白の一部（
アミノ酸数２１）を付加ポリペプチドとして使用し、そ
の下流にマウスインターロイキン２（以下ｍＩＬ−２と
略す）蛋白を接続した融合ポリペプチド（ΔｈＩＬ２（
２１）−ＫＳ−ｍＩＬ２　）の例。

付加ポリペゾチド中１１Ｃｆ′１Ｐｒｏ残基が１つあシ
、目的ポリペプチドｍＩＬ−２ＯＮ末端構造はＡｔａ　
−Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ・・・でＮ末弟２アミノ酸がＰｒｏ
残基である（第６図参照）。この場合は特許請求範囲■
の手法によ、９ｍＩＬ−２を取得した。

（１）　　ｆラスミドＤＮＡの構築と組換え菌の取得大
腸菌体内にｈＩＬ−２を著量に蓄積させることを可能と
した発現ベクターを用いて、ｈＩＬ−２遺伝子の下流Ｖ
ｃｍ　Ｉ　Ｌ　−２遺伝子を融合させたプラスミドｐＴ
１３ｓΔｈｌＬ２−ＫＳ−ｍｌＬ２　（ｎｇｔ　ｎ　）
を構築し、それを大腸菌ＨＢＩＯＩ株に導入して形質転
換株Ｅ、ｃｏｔＩ　ＡＪ　１２３３２を取得した。

ｐＴ１３ｓΔｈｌＬ２−ＫＳ−ｍＩＬ２（Ｂｇｔｌ）の
構築方法は以下の通シである。

まず、ｐＩＬ−２−５ＯＡ　（欧州特許出願公開９１５
３９号）をＰｓｔ　ｌ　、　Ｄｒａ　ｌで切断し、この
ｈｌＬ２構造遺伝子を含む断片とＢａｍＨｌリンカ−１
ｐＢＲ３２２のＰｓｔ　ｌ　−Ｅｅｏ　ｌの大きい断片
（ＥｅｏＲＩ切断部位はフレノウ処理）とをＴ４ＤＮＡ
すが一部で連結しプラスミドを造成した（第１図）。こ
のグラスミドをＨｇ　ｉＡ　ｌで切断しＤＮＡ　／リフ
２−ゼＩ（フレノウ）処理後ＢａｍＨＩで切断した。そ
してとのｈＩＬ２構造遺伝子のＣＣ’ｒより下流を含む
断片とｐＤＲ７２０（ｔｒｉ）ブロモ−ターを搭載した
シラスミドでｐＫｏ−１（Ｒｕ５ｓ＠ｌ　、Ｄ、Ｒ，４
Ｂｅｎ＠ｔｔ　、Ｇ、Ｎ、Ｇ＠ｎｅ　ｔ２０２３１（１
９８２））のＳｍａ　ｌ切断部位Ｋｔｒｐプロモーター
、オペレーター断片が組みこまれたもの〕ヲａｐａｔと
ＢａｍＨＩで切断して得られた大きいＨｐａ　ｌ　−Ｂ
ａｍＨ１断片と、第１図に示した合成オリゴマーａ′を
Ｔ４リガーゼで連結しｐＭ　１−９’を得た。

一方、ｐＢＲ３２２をＰｖｕ　Ｔｌと５ａｔｌで切断し
大きいＰｖｕ　ｌ　−Ｓａｔ　ｌ断片と合成オリゴマー
ｂとを連結し、ｐＴｒｐＡを得た。

このようにして得られたｐＭ　１−９’とｐＴｒｐＡを
共ＫＥｃＯＲＩとＢａｍＨＩで切断しｐＭ　１−９’の
ｈｌｌ、２遺伝子を含む断片とｐＴｒｐ　ＡのｔｒｐＡ
ターミネータ−を含む断片を連結しｐＴ９−１１’を得
た（以上、第１図参照）。

次にこのｐＴ９−１１’をＣ２ａ　ｌ　、　Ｘｂａ　ｌ
で切断し、大きい断片に第２ｂ図の合成りＮＡ断片を挿
入、連結し、ｈＩＬ２をコードする合成遺伝子を有する
グラスミドｐＴ１３８Ｎｃｏ　（第２ａ図）を構築した
。

ｐＴ１３ｓＮｃｏ　ＯｐＴ　９−１１’との構造上の違
いは第２ａ図の（３）の部分で６Ｄ、この部分のＤＮＡ
配列は第２　、ｂ図に示したとおシである。

このＤＮＡ塩基配列は、Ｍｅｔ　ｔ−Ｎ末端に付加した
成熟型ｈＩＬ２の５９アミノ酸残基までをコードしうる
配列であシ、かつ、その配列内に制限酵素切断部位が多
数（Ｓａｅ　ｌ、Ｂｇｔ　ｌ、Ｐａｔ　Ｉ　、　Ｘｈｏ
　１等）存在するよう構築されている。

ｐＴ１３８ＮｃｏをＥ、ｃｏｔｉ　ＨＢＩＯＩに組み込
んだ菌（Ｅ、　ｃｏｌｌｐＴ１３ｓＮｃｏ／ＨＢ　１０
１）は、次のようにして得た。すなわち、構築したｐＴ
１３８ＮｃｏとＥ、ｃｏｔＩＨＢＩＯＩ菌体をＴＣＭ　
（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　ＦＪ（７，５，１０ｒ
ｎｋｌ　ＣａＣｌ２．１０　ｍＭ　ＭｇＣ４２）　２０
０　ＩＩＩ中で０℃にて　。

２０分保ち、その後４２℃、２分間静置し、さらにこれ
に１ゴのＬ−ブロス（トリプトン１チ、酵母エキス０．
５％、ＮａＣＬ　Ｏ，５’１６グルコース０．２％）を
添加して３７℃にて１時間振とうした。その後、その培
養液の一部を、アンピシリン（Ａｍｐと略す）（５０ｔ
ｔｌ”７Ｍ　）を含むＬ−プロス平板に塗抹し、その平
板を３７℃で２０時間培養して出現したコロニーを釣菌
した。得られたコロニーをＬ−プロスに植え、３７℃で
２０時間培養後、常法によ勺プラスミドＤＮＡを調製し
ｐＴ１３８Ｎｃｏを得た。そのコロニーの菌株の中から
１株（Ｅ、ｃｏｔｉ　ｐＴ１３ｓＮｃ。

／ＨＢＩＯＩ）を選択した。

また一方、マウスインターロイキン２　（ｍＩＬ２）遺
伝子部分については第３図に示すように、ｐＭＩＬ２−
４５　（特開昭６１−５８５９０号公報、ｎｘＨ，２ｃ
ＤＮＡ　ｔ−ｐＢＲ３２２上のＰａｔ　１部位に入れこ
んだプラスミド）を制限酵素Ｈｈａ　１％Ｄｒａ　ｌに
て切断しＤＮＡ断片断片口収した。また第３図に示した
核酸塩基配列をもつＤＮＡ断片■を人工合成した。

この断片はＸｂａｌ切断端及びＨｈａｉ切断端に合致す
るＤＮＡ塩基配列を、また内部にＸｈｏｌ切断部位を有
している。次ＫｐＴ１３８ＮｃｏをＢａｍＨＩ　、で切
断後、ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ）処理して、さら
にＸｂａ　Ｉ　Ｋて切断して得られる大きいＤＮＡ断片
断片口収した。

以上のＤＮＡ断片１．ＩＩ、ＩＩＩをＴ４ＤＮＡリガー
ゼによって連結しｐＴ１３ｓΔｈＩＬ２−ＫＳ−ｍＩＬ
２（Ｘｂａｌ）を構築した。

このｐＴ１３ｓΔｈＩＬ２−ＫＳ−ｍＩＬ２　（Ｘｂａ
　１　）　７’ラスミドはＩＡＡ　（インドールアクリ
ル酸）等により誘導可能な高発現性トリプトファンプロ
モーターの下流に、天然型ｈＩＬ２のＮ末端に大腸菌内
での発現に必要なＭｅｔをコードするＡＴＧを付加した
ｈＩＬ２構造遺伝子の第５９番目Ｌｅｕまでとその下流
にＤＮＡ断片の連結に伴い形成される塩基配列５’　−
ＧＴＣ−ＣＴＣ−ＧＡＧ　−ＴＴＣ−ＣＧＣ−３’　（
Ｖａｔ−Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ　−Ｐｈｅ　−Ａｒｇ　）　
、その次に天然型ｍＩＬ２のＮ末端アミノ酸であるＡｌ
ｔで始まるｍ　Ｉ　Ｌ　２構造遺伝子が連らなる構造を
もっている。

シラスミドｐＴ１３８ΔｈＩＬ２−ＫＳ−ｍＩＬ２　（
Ｘｂａ　１）をＥ、ｃｏｔｉ　ＨＢＩＯＩに組みこんだ
菌（Ｅ、ｃｏｔｉｐＴ１３ｓΔｈＩＬ２−ＫＳ−ｍＩＬ
２（Ｘｂａｌ　）／ＨＢＩＯＩ　）を先と同様にして得
た。

次に、ｐＴ１３８ＮｃｏをＢｇｔＩＩで切断後、フレノ
ウ処理し平滑末端とした後、Ｐｖｕ　ｌにて切断しｈＩ
Ｌ２遺伝子の上流側を含む小さい方のＤＮＡ断片■を得
、これと構築したｐＴ１３ｓΔｈＩＬ２−ＫＳ−ｍＩＬ
２（Ｘｂａｌ）をＸｈｏｌ切断し、フレノウ処理後、ｐ
ｖｕ　Ｉ切断して得られるｍＩＬ２購造遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片ＶをＴ　４　ＤＮＡリガーゼにより連結するこ
とによりｐＴ１３ｓΔｈｒＬｚ　−ＫＳ　−ｍＩＬ２　
（Ｂｇｔ　ＩＩ　）を構築した。

ｈＩＬ２−ｍＩＬ２連結部分の構造を第５−に示した。

また同様にしてｐＴ１３ＳΔｈＩＬ２−ＫＳ−ｍＩＬ２
（ＢｇｔＩＩ）をＥ、ｃｏｔｌＨＢＩＯＩＫ組みこんだ
菌株（Ｅ、ｃｏｔｌ−ＡＪ　１２３３２）を得た（本菌
株は微工研寄託９１０１番である）。

（２）培養及び融合ポリペプチドの生産、巻き戻し反応 選択した形質転換株ｐＴ１３ｓΔｈＩＬ　２−ＫＳ−ｍ
ＩＬ２（Ｂｇｔｌ　）　／　ＨＢ　１０１を、トリプト
ン１チ、酵母エキス０．５チ、ＮａＣＬ　Ｏ，５％、グ
ルコース０．２チ、アンピシリン１００　Ｅｌ−／ｍｌ
、ストレプトマイシン２５μｆ／ｍ４及び寒天２チの組
成の平板培地に塗抹し、３７℃で１５〜２０時間培養し
た。そこから１白金耳をｉｏｏｍｊのＭ９−カブミノ酸
培地（カブミノ酸０．２　％　、　ＮＨ４ＣｔＯ，１％
、ＮａＣｔＯ，０５％、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，０５
％、ＣａＣｌ２−２Ｈ２００，００１４７％、Ｌ−Ｌｅ
ｕＯ，０２％、Ｌ−Ｐｒｏ　０．０２　Ｔｏ、ＶＢ、−
ＨＣｔＯ，０００２９Ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４”１２Ｈ２０
ｏ、　６　％、ＫＨ２Ｐ０４０．３％、グルコース０．
２％、アンピシリン１００ｊμ、ストレプトマイシン２
５μｊ；ｌ−／ｌｔｌ　）を含む坂ロフラスコに接種し
、３１℃で培養開始後、３〜４時間経過した時点で２５
μノ〜の３−インドールアクリル酸を添加し、さらに培
養を１５〜２０時間行なった。

その結果、光学顕微鏡で培養菌体を観察し・たところ大
腸菌体内に顆粒が形成されていることが確認できた。

菌体内に生成した顆粒を以下の平原で抽出した。

遠心分離により、菌体を集め、１０倍濃縮になるように
、３０　ｍＭ　ＮａＣｔを含む２０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ−
ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，５）を添加し、懸濁後、そこに
リゾチーム１■／ｍ７　、　ＥＤＴＡ　Ｏ，０５Ｍを添
加し攪拌した後、水中にて、１時間放置した。次いで、
超音波により菌体を破壊し、１０．００Ｏｒｐｍ、５分
の遠心分離で、顆粒を回収した。

得られたΔｈｆＬ２　（２１）　−ＫＳ−ｍＩＬ２顆粒
を６Ｍ塩酸グアニジンで可溶化後、Ｓ・ｐｈａｄ＊ｘ　
Ｇ　−２５による脱グアニジンを行ったところ本融合ポ
リペプチドは析出し殆ど不溶の状態となりた。この不溶
性の融合ポリ−ｅｆチドを７ミノベプチダ一ゼＭ′反応
条件をみたす各種組成の溶媒を用いて可溶化を試みたが
可溶性の溶媒を見出すことは出来なかった。そこで６Ｍ
塩酸グアニジンに溶解した本融合ポリペプチドを２Ｍ塩
酸グアニジン溶液中でグルタチオンなどを用いて巻き戻
し反応を行った。

尚、巻き戻し操作は、通常、例えば酸化還元系を用いる
方法で行なうことができる。該酸化還元系を用いる方法
は、−６以上（上限は、目的蛋白が変性、不溶化しない
声値）の水溶液中で、目的ポリペプチドが変性しない温
度、通常は常温〜４℃で、数時間〜１日、グルタチオン
（１〜１００城還元型グルタチオン及び還元型グルタチ
オンより少量の酸化型グルタチオンの混合系）、ブチオ
スレイトール（ＤＴＴ　）等の還元剤で目的蛋白を処理
することＫより行うことができる。本実験では２Ｍ塩酸
グアニジン溶液で、ＰＩ（ｓ−ｏ、１０ｍＭ還元型グル
タチオン、１ｍＭ酸化型グルタチオン条件下で反応を行
なった。その巻き戻し反応溶液を逆相ＨＰＩ、Ｃで分析
した結果、本融合ポリ＜　７’チドはほぼ定量的に巻き
戻されていることが判明した。

この巻き戻しをされた融合ポリペプチドの溶液（２Ｍ塩
酸グアニジン溶液）を、アミノ、Ｊｊ−７”チグーゼＭ
（以下ＡＰ−Ｍと略す）反応溶液（０，１ＭＴｒｌｓ　
−ＨＣｌ　（ｐＨ７，０）、５　ｍＭ　ＮａＣｔ２）に
５ｅｐｈａｄ＠ｘＧ−２５によるグル濾過で緩衝液交換
を行なったところ、ＡＰ−Ｍ反応溶液に溶解可能であっ
た。

（３）アミノイプチダーゼＭによるＮ末端Ｍｅｔの除去
（第６図反応■） ＡＰ　−Ｍ　ＦｉＳ　ｉ　ｇｍａ社よル購入したものを
ＤＦＰ（ｄｉｉｍｏｐｒｏｐｙｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｏ
　ｆｌｕｏｒｉｄａｔ＠）処理（０，１ｍＭ　ＤＦＰ　
、　３０℃、１０　ｍｉｎ　）及びＰＣＭＢ　（Ｐ−’
ｃｈｌｏｒｏｍ＠ｒｃｕｒｉｂ＊ｎ＋ｃｏａｔｅ　）処
理（０，１ｍＭ　ＰＣＭＢ　。

３０℃、１０ｍ１ｎ）ｌ、て用いた。

（２）で得られた融合ポリ−！グチド（ΔｈＩＬ２（２
１）−ＫＳ−ｍＩＬ　２　）　１１１ＦＫＡＰ−Ｍを添
加し、３７℃、２時間反応した。その反応液は、逆相Ｈ
ＰＬＣＫかけ融合ポリベゾチド相当画分を分取した。な
お、その一部をとシ、プロテインシークエンサーにてＮ
末端側のアミノ酸配列を分析した結果、予想とお勺Ｎ末
端Ｍｅ　を残基が除去されていた。

（４）アミノイグチダーゼＰ（ＡＰ−Ｐ）によるＮ末端
Ａｔａの除去（第６図、反応■） （３）で得られたＭｅｔ除去融合ポリペプチドの溶液を
、０．４ｎＩＭＭｎＣ６２を含む５０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ
−ＨＣｔ緩衝液（ｐＨ＆ｏ）で平衡化した５ｅｐｈａｄ
ｅｘ　Ｇ−２５によるグル濾過でＭｅ　を除去融合ポリ
ペプチド相当画分を得、溶解緩衝液を交換した。

一方アミノイプチグーゼＰ（以下ＡＰ　−Ｐと略す）は
、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｎｏｌ、　１９　、
５２１　（１９７０）に記載されている方法により精製
を行なった。

上で得られたＭｅｔ除去融合ポリペグチドにＡＰ−Ｐを
添加し３７℃、１６時間の反応後、（３）と同様に逆相
ＨＰＬＣＫかけ融合蛋白質相当画分を分取した。この取
得した融合ポリペプチドの一部をプロテインシークエン
サーにかけ、Ｎ末端側のアミノ酸配列を分析した結果、
Ｎ末端Ａｔａが除去されておｉ）　ＰｒｏをＮ末端とす
る融合ポリペプチド忙はぼ定量的に変換されたことが確
認できた。このようにしてＮ末端Ｍｅｔ　、　Ａｊａ除
去の融合ポリペプチドが得られた。

（５）ｆロリンイミノイデチダーゼ（ＰＩＦ　）による
Ｎ末端Ｐｒｏの除去（第６図、反応■）（４）で得られ
た融合蛋白質の溶液を５　ｒｎＭｉ　ＭｎＣｌ２を含む
５０嘘ペロナール緩衝液（ｐＨ８，６）で平衡化した５
ｅｐｈａｄ＠：ｔ　Ｇ　−２５によるｒル濾過で、Ｍｅ
ｔ。

Ａｔａ除去融合ポリベゾチド相当画分を得、緩衝液を交
換した。

一方、プロリンイミノペプチダーゼ（以下ＰＩＦと略す
）は、５ａｒｉｄ　ｒ　ＳらＪ、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈ
ｅｗ、　２３７　。

２２０７　（１９６２）に記載されている方法により精
製した。

上で得られた融合ポリペプチドにＰＮＰを添加し、４０
℃、４時間反応後、逆相ＨＰＬＣで融合ポリベゾチド相
当画分を分取した。さらにグロテインシークエンサーに
てＮ末端側のアミノ酸配列を分析した結果、Ｎ末端のＰ
ｒｏが除去され、はぼ定量的にＴｈｒ末端の融合ポリペ
ゾチｒに変換されたことが確認された。

以上の（３）　、　（４）　、　（５）の操作によ）、
Δｈｌｌ、２（２１）−ＫＳ−ｍＩＬ２から、そのＮ末
端アミノ酸Ｍｅｔ　ｘＡＬａ　、　Ｐｒｏを除去できた
。

（６）目的ポリペプチドの取得（第６図、反応■）（５
）で得られた融合蛋白質の溶液を（３）と同様にして緩
衝液の交換を行ない、融合ポリペプチド５００μノにＡ
Ｐ−Ｍを添加し３７℃、１６時間反応した。

その後、逆相ＨＰＬＣでｍ　Ｉ　Ｌ　−２相当画分を分
取、精製することにより、目的ポリペプチドｍＩＬ−２
を取得した。この産物はプロテインシークエンサーにて
Ｎ末側アミノ酸を分析し、天然型ｍ　Ｉ　Ｌ　−２と一
致することを確認した。

以上、ｍＩＬ−２のｈＩＬ−２との融合ポリペプチドΔ
ｈｌＬ２　（２１）　−ＫＳ−ｍＩＬ２に、第６図に示
したように、ＡＰ−Ｍ　、　ＡＰ−Ｐ　、　ＰＩＦ　、
そしてＡＰ　−Ｍを順次作用させることによ）、付加ポ
リペプチドを除去し目的ポリペプチドｍ　Ｉ　Ｌ　−２
を取得した。

実施例２　マウスインターロイキン２誘導体Ｉの製造法 目的ポリ−ｅｆチドであるマウスインターロイキン２誘
導体Ｉ（以下ｍ工Ｌ−２”（１）と略す）は第７図に示
したアミノ酸配列を有する、アミノ酸数１７１のポリペ
プチドでそのＮ末端側第１、第２アミノ酸はともにＰｒ
ｏではない。本目的ポリペプチドの取得は、そのＮ末側
に付加ポリペプチドとしてＭｅｔ　−Ａｌｔ−Ｐｒｏを
配した融合ポリペプチドを作製、生産した後、特許請求
範囲■の手法を用いることにより達成できた。

（１）グラスミドＤＮＡの構築と組み換え菌の取得ｍｚ
Ｌ−２”Ｇ）の生産、取得に用いた融合ポリペプチドを
発現させるプラスミドは実施例１に記載したｐＴ１３ｓ
ΔｈｌＬ２−ＫＳ−ｍＩＬ２　（ＢｇｔＴｉ　）を用い
た。

その構築方法及び形質転換体（本菌は微工研寄託９１０
１番である）の取得方法にりいては実施例１と同じであ
る。

（２ン　　組み換え菌の培養及び融合ポリペプチドの生
産、巻き戻し反応 実施例１と同様にして、本融合ポリペプチド（Ｍｅｔ　
−Ａｌｉ　−Ｐｒｏ　−ｍＩＬ−２°（１））を取得後
、ＡＰ−Ｍ反応溶液に溶解させることができた。

（３）アミノペプチダーゼＭ（ＡＰ−Ｍ）によるＮ末端
Ｍｅｔの除去（第８図、反応■） 実施例１の（３）と同様にしてＮ末端Ｍｓｔ残基が除去
された融合蛋白（Ａｔａ−Ｐｒｏ−ｍＩＬ−２°（Ｉ）
）が取得できた。

（４）アミノペプチダーゼＰ（ＡＰ−Ｐ）及びプロリン
イミノペプチダーゼ（ＰＩＦ）によるｍＩＬ−２”（Ｉ
）の取得（第８図参照） 実施例１の（４）と同様にしてＡＰ−Ｐ及びＰＩＦを調
製した。まずＡｔｈ　−Ｐｒｏ　−ｍＩＬ−２”（１）
にＡＰ−Ｐを添加し３７℃、１０時間の反応後、その反
応液を逆相ＨＰＬＣにかけ融合ポリペプチド相当画分を
分取した。

次にその画分を５ｅｐｈａｄ・ｘ　Ｇ−２５カラムを用
いたグル濾過操作によ）、法要緩衝液の交換（５ｍＭＭ
ｎＣＬ２を含む５０ｍＭベロナール緩衝液（ＰＨ８，６
））を行なった。こうして得られたＰｒｏ−ｍＩＬ−２
°（１）にＰＩＦを添加し４０℃、５時間反応後逆相Ｈ
ＰＬＣで融合ポリペグチド相当画分を分取した。さらに
７”ロチインシークエンチーにてＮ末端側のアミノ酸配
列を分析した結果、はぼ定量的ＫＴｈｒ末端のｍＩＬ−
２°（１）が取得できたことが確認された。

以上、融合蛋白からＡＰ−Ｍ、ＡＰ−Ｐ及びＰＩＦを順
次作用させることによ、！７　ｍＩＬ−２”（１）を取
得できた。

実施例３　　ＢＳＦ−２誘導体Ｉ（Ｂ−ｃｅｌｌ　ａｔ
ｉｍｕｌａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ　２誘導体■）の製法
（その■）目的ポリペプチドであるＢＳＦ−２誘導体Ｉ
（以下ＢＳＦ−２”（１）と略す）は第９ａ図に示した
アミノ酸配列を有するアミノ酸数１８３のポリペプチド
でそのＮ末端側第２アミノ酸がＰｒｏである。

本目的ポリペプチドの取得は、そのＮ末側に付加ポリペ
プチドとしてＭ＠ｔ　−Ｐｒｏを配した融合ポリペプチ
ドを作製、生産した後、特許請求範囲■の手法を用いる
ことにより達成できた。

なお、ＢＳＦ−２はＢ細胞分化因子（ＢＣＤＦ　）とも
呼ばれることがある。

（１）ｆ−７スミドＤＮＡの構築と組み換え菌の取得Ｂ
　ＳＦ　−２Ｃ）　ｃＤＮＡ　（塩基配列及びアミノ酸
配列は第１０図参照）をクローニングしたシラスミドと
してはｐＢＳＦ２−３８を用いた。

１）シラスミドｐＴ１３８　　Ｎｅｏを制限酵素Ｎｅｏ
　１およびＸｂａｌで切断し、アガロースダル電気泳動
により大きなりＮＡ断片を単離精製した。他方、プラス
ミドｐＢＳＦ２−３８を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、
アガロースゲル電気泳動によυヒトＢＳＦ−２ｃＤＮＡ
インサートを含む小さなりＮＡ断片を回収した。そして
、該ＢａｍＨＩヒトＢＳＦ　２　ｃＤＮＡインサートを
制限酵素Ｘｂａｌで完全切断し、更にＭｖａｌで部分切
断した。

次に、トリフ’）ファングロモーター／オイレーター（
ｔｒｐ　ｐｌｏ　）を含むｐＴ１３８　Ｎｅｏ、断片、
ヒトＢＳＦ　−２ｃＤＮＡを含むＭｖａ　ｌ　−Ｘｂａ
　ｌ断片含有ＤＮＡ混合物および合成りＮＡΦ）　［Ｃ
ＡＴＧＣＣＡＧＴＡＣＣＡＣＣ”とぎ５′ 末端をリン酸化した５′ＴＧＧＴＧＧＴＡＣＴＧＧ　”
　）を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使って結合させた
。得られた組換えＤＮＡを、エシェリヒア・コリＨＢＩ
ＯＩ株へ導入し、アンピシリン抵抗性を有する株を選択
した。得られた株よりコロニーノ・イブリダイゼーショ
ン法により合成りＮＡ　（Ｂ）とノ〜イプリダイズする
ＤＮＡを有する株を選択した。分離した株からプラスミ
ドＤＮＡを得て制限酵素による切断試験および結合部位
付近の塩基配列の決定を行なうことによフ、ｐＴＢＣＤ
Ｆ−０１を保持する菌を選定した（　ｐＴＢＣＤＦ−０
１／Ｉ（ＢＩＯＩ　）。（第１１図）ｉｉ）７’−）ス
ミドｐＢＳＦ２−３８を制限酵素Ｂａｎ　Ｉで切断し、
ＤＮＡポリメラーゼｌ　（Ｋｌ＠ｎｏｖ　）処理し、Ｘ
ｂａ　ｌで切断後、アガロースゲル電気泳動により約１
５０塩基対ＤＮＡ断片を分離した。

ｉｉ）　　ｉ）で得たｐＴＢＣＤＦ　−０１を制限酵素
ＢａｍＨＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅ
ｎｏｗ　）処理後、Ｘｂａｌで切断し、アガロースゲル
電気泳動により大きいＤＮＡ断片を回収した。

ｉｖ）　　ｉｉ）と屑）で得られた２種類のＤＮＡ断片
をＴ４ＤＮＡＩＪが−ゼを使って結合させた。得られた
組換えＤＮＡをエシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ株へ導入
し、アンピシリン抵抗性を有する株を選択した。

得られた株から！ラスミドＤＮＡを得て制限酵素による
切断試験を行なうことによりｐＴＢＣＤＦ−０２を保持
する菌を選定した（　ｐＴＢｃＤＦ−０２／ＨＢＩＯＩ
　、　（ＦＥＲＭｐ−９０６１）　”）。（第１２図） （２）組み換え菌の培養及び融合ポリペプチドの生産。

ｐＴＢＣＤＦ−０２を保持するエシェリヒア・コｖＨＢ
ＩＯＩ株を２５μｆ／ａｔストレグトマイシンおよび２
５　ａ？／ｄ！アンピシリンを含むＬ培地（１％バクト
ドリグトン、０．５°％酵母エキス、０．５　％　Ｎａ
Ｃ６，０，１％グルコース、ｐＨ７，５）１０−中で３
７℃−晩生前させた。ついで培養懸濁液５１１１１をＭ
９−カブミノ酸培地（０，６％　Ｎａ２ＨＰＯ４−１２
Ｈ２Ｏ，０，３％ＫＨ２ＰＯ４、ＯＤ５チＮａＣ１，０
，１％ＮＨ４ＣＬ　、　０．０５チＭｇ５０４−７Ｈ２
０，０−００１４７％　ＣａＣｔｚ、０．２％グルコー
ス、０，２％カデミノ酸、０．０２％Ｌ−ロイシン、０
．０２チＬ−プロリン、０．０００２％チアミン塩酸塩
、１００μｇ／Ｒ１アンピシリン、２５μｇ〜ストレプ
トマイシン、ｐＨ７，４）へ接種し、２８℃に、て３時
間培養した。その後２５μｇ／ｍｌになる様３−インド
ールアクリル酸（ＩＡＡ　）を添加し、２３℃にで２１
時間誘導培養した。培養菌体を遠心分離し、２０　ｍＭ
　）リス−塩酸（ｐＨ７，５，３０ｍＭ　ＮａＣＡを含
む）で洗浄し、同じ緩衝液８ゴに懸濁した。

かくして菌体内に産生される蛋白を５０　ｒｒＭ　ＥＤ
ＴＡ存在下１′％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ　）
又は１　ｍｙ　／　ｙｄリゾチーム消化に引き続きソニ
ック処理（５０Ｗ、３０秒間）することにょ夛抽出した
。

次にその抽出液を限外濾過法にょシ濃縮し、ＡｃＡ　−
３４グル濾過カラム（ＬＫＢ　Ｐｒｏｄｕｋ＊ｒ　、　
Ｓｗｅｄｓ＋ｎ）で処理した。なおグル濾過カラムはあ
らかじめＰＢＳ　（ホスフェート・パッファードセイラ
イン、０、１５　Ｍ　ＮａＣｔを含む０．０１Ｍリン酸
緩衝液（声７、０　）　）で平衡化した濃縮液をＰＢＳ
で溶出し、融合ｄ　ｖｄグチドの７ラクシ覆ンを回収し
、限外濾過法を用いて２５娼ピペラジン−ＨＣｔ緩衝液
（−６，３）に置換した。

次ＫＭｏｎｏＰカラム（ファルマシア裏）及び逆相ＨＰ
ＬＣを用いて、その融合ポリペプチドを精製した。

得られた融合ポリペプチド（Ｍｅｔ　−Ｐｒｏ　−Ｂ５
Ｆ２°（Ｉ））のＮ末端側アミノ酸配列を調べたところ
Ｎ末端アミノ酸としてＭｅｔ　：　Ｐｒｏが２：８（Ｄ
＠合の混合物であった。尚、ともにＮ末端１香百Ｍｅｔ
以降の下流のアミノ酸配列は同じであっ喪。

（３）　　アミノ被グチダーゼＰ（ＡＰ−Ｐ）反応及び
プロリンイミノペプチダーゼ（ＰＩＦ　）反応によるＢ
ＳＦ−２”（１）の取得。（第１３囚参照）（２ンで得
られた融合ポリ−２ｆチド（０，４ｍＭＭｎ　Ｃ１０を
含む５０　ｒｒＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｔ緩衝液（ｐＨ８
，０）に溶解）に実施例１と同様に調製してきたＡＰ　
−Ｐを添加し３７℃で１０時間反応後、反応液を逆相Ｈ
ＰＬＣＫかけ、融合ポリペゾチド相当画分を分取した。

次にその融合４リペゾチドの溶液を５ｍＭＭｎＣ１２含
む５０鯛ペロナール緩衝液（ｐＨ８，６）で平衡化した
５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５によるグル濾過で緩衝液を
交換した後ＰＩＦ　（実施例１と同様に調製）を添加し
４０℃、５時間反応させた。この反応液を逆相ＨＰＬＣ
にかけ目的蛋白相当画分を分取し、一部をプロテインシ
ークエンサーにてＮ末側アミノ酸配列を分析した結果、
予想どおシＮ末端かＶａｔのＢＳＦ−２”（１）蛋白で
あることが確認できた。

以上のよりにして、融合ポリペプチドＫ　ＡＰ−Ｐ　。

ＰＩＦを作用させることＫより目的Ｉソー４ｆチドＢ　
Ｓ　Ｆ　−２”（１）を取得できた。

実施例４　　Ｂ５Ｆ２　（Ｂｅ＊１１　ｓｔｉｍｔＩｌ
ａｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ２又はＢＣＤＦ　、　Ｂ細胞
分化因子）の製法目的ポリ（ゾチドであるＢＳＦ−２は
、第９−ｂ図に示したアミノ酸配列を有するアミノ酸数
１８４のポリペプチドでＮ末端第１アミノ酸がＰｒｏで
ある。

本目的蛋白の取得は、そのＮ末側に付加ポリ（デチドと
して、ｈＩＬ−２のＮ末側２１アミノ酸を、及び連結部
分を介し接続した融合蛋白質を作製、生産し念後、特許
請求範囲■の手法を用いることにより達成できた。

（１）ｆラスミドＤＮＡの構築と組み換え菌の取得ｐＴ
１３８Ｎｃｏ　（第２ｄ図）及び、ｐＢＳＦ　２−３８
を用すてヒトインターロイキン−２（ｈＺＬ−２）との
融合ポリペプチド（ΔｈＩＬ−２−ＢＳＦ−２）を生産
する組み換えＤＮＡを以下のように構築した。（第１４
゜１５図） １）グラスミドｐＴ１３８Ｎｃｏを制限酵素Ｂｇｌ　ｌ
ｉおよびＸｂａｌで切断し、アガロースゲル電気泳動に
より大きなりＮＡ断片を単離精製した。他方、プラスミ
ドｐＢｓＦ２−３８を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動によルヒ）　ＢＳＦ　−２ｃＤＮ
Ａインサートを含む小さなりＮＡ断片を回収した。そし
て、該ＢａｍＨＩヒトＢＳＦ−２ｃＤＮＡ　インサート
を制限酵素Ｘｂａｌで完全切断し、更Ｋ　Ｍｖｇ　Ｉで
部分切断した。

次に、上記プロモータを含むｐＴ１３ｓ（Ｎｃ■）断片
、ヒトＢＳＦ−２ｅＤＮＡを含むＭｖａ　ｌ　−Ｘｂａ
　Ｉ断片含有ＤＮＡ　ｉ合物オヨヒ合成りＮＡ（Ｃ）　
（”　ＧＡＴＣＴＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＴＡＣ
ＣＣＣ３′と５′末端をリン酸化した”　ＴＧＧＧＧＧ
ＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＣＴＧＡＡＧＡ”　）を混合し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使って結合させた。得られた組換
えＤＮＡを、エシェリヒア・；ｖＨＢＩＯＩ株へ導入し
、アンピシリン抵抗性を有する株を選択した。得られた
株ヨ、ｂ　：！　ロ二−ハイツリダイゼーシ璽ン法ニょ
シ合成りＮＡ　（Ｃ）とハイブリダイズするＤＮＡを有
する株を選択した。分離した株からシラスミドＤＮＡ　
ｔ−得て制限酵素による切断試験および結合部位付近の
塩基配列の決定を行なうことにょ夛、ｐＴＢＣＤＦ〜１
１　を保ｎｆ　ｂ　Ｍ　ｅ　Ｊ定Ｌ　７’ｃ　（ｐＴＢ
ｃＤＦ−１１，４ｔＢ１０１）。

（第１４図） ｉｉ）　　プラスミドｐＢＳＦ　２−３８を制限酵素Ｒ
ａｎ　Ｉで切断し、ＤＮＡポリメラーゼ１（Ｋｌ・Ｈ６
ｗ）処理し、Ｘｂａｌで切断後、アガロースゲル電気泳
動により約１５０塩基対ＤＮＡ断片を分離した。

１ｉｌ）１）で得たｐ　ＴＢＣＤＦ−１１を制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼｌ　（Ｋ１＊ｎ
ｏｖ）処理後、Ｘｂａｌで切断し、アガロースゲル電気
泳動により大きいＤＮＡ断片を回収した。

ｉｖ）　　ｉｉ）とｌ１ｉ）で得られた２種類のＤＮＡ
断片をＴ４ＤＮＡ　リが−ゼを使りて結合させた。得ら
れた組換えＤＮＡをエシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ株へ
導入し、アンピシリン抵抗性を有する株を選択した。

得られた株からプラスミドＤＮＡを得て制限酵素による
切断試験を行なうことＫよｊｉ）　ｐＴＢＣＤＦ　−１
２を保持する菌を選定した（　ｐＴＢＣＤＦ−１２／Ｈ
ＢＩＯＩ、（ＦＥＲＭ　ｐ−９０６２）。（第１５図）
（２）組み換え菌の培養及び融合ポリペプチドの生産 実施例１に従いｐＴＢＣＤＦ　−１２７ＨＢ　１０１を
培養し、以下の手順で菌体内に生成した顆粒を抽出した
。

遠・心分離により菌体を集め、１０倍濃縮になるように
、３０　ｍＭ　ＮａＣＡを含む２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｔ緩衝液（ｐＨ７，５）を添加し、懸濁後、そこに
リゾチーム１キ／ゴ、ＥＤＴＡ　Ｏ，０５Ｍを添加し攪
拌した後、水中にて、１時間放置した。次いで、超音波
破砕で菌体を破壊し、１０．００Ｏｒｐｍ、５分間の遠
心分離で顆粒を回収した。

この顆粒を６Ｍ塩酸グアニジンで可溶化し、融合ポリペ
プチド濃度が１００μｆ／ｒｔｔｌ、及び２Ｍ塩酸グア
ニジン溶液となるように、濃度調整を行ない、これＫ、
酸化型グルタチオン１ｒｒＭｉと還元型グルタチオン１
０ｍＭを添加し、ｐＨ８，０、室温で１０〜１６時間放
置した。次に５ｅｐｈａｄｅｚ　Ｇ−２５によるｒル濾
過で塩酸グアニジンを除去すると同時にアミノペプチダ
ーゼＭ（ＡＰ−Ｍ）反応用の緩衝溶液となった融合ポリ
ペプチド相当画分を得た。本物質を５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によ）、分子量は、アミノ酸組成
から計算した値とほぼ−致し、又、グロテインシークエ
ンサーにて、Ｎ末端側のアミノ酸配列を検定した結果、
ｈｌＬ−２の配列であることが確認された。

すなわち、この取得した融合Ｉす（プチドは下記のアミ
ノ酸配列を有する。

ＭＥＴ　ＡＬＡ　ＰＲＯＴＨＲＳＥＲＳＥＲＳＥＲＴＨ
ＲＬＹＳ　ＬＹＳ　ＴＨＲＧＬＮ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　Ｌ
ＥＵ　ＧＬＵ　Ｈｌｓ　ＬＥＵ　ＬＥＵ　ＬＥＵ　ＡＳ
Ｐ　ＬＥＵＰＨＥ　ＡＲＧ　ＡＬＡ　ＰＲＯＭＡＬ　Ｐ
ＲＯＰＲＯＧＬＹ　ＧＬＵ　ＡＳＰ　５ＥＲＩ、ＹＳ　
ＡＳＰ　ＭＡＬ　ＡＬＡ　ＡＬＡ　ＰＲＯＨＩＳ　ＡＲ
Ｇ　ＧＬＮ　ＰＲＯＬＫＵＴＨＲＳＥＲＳＥＲＧＬＵ　
ＡＲＧ　ＩＬＥ　ＡＳＰ　ＬＹＳ　ＧＬＮ　ＩＬＥ　Ａ
ＲＧＴＹＲＩＬＥ　ＬＥＵ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＩＬＥ　
ＳＩＲＡＬＡ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＬＹＳＧＬＵ　ＴＨＲ
ＣＹＳ　ＡＳＮ　ＬＹＳ　ＳＥＲＡＳＮ　ＭＥＴ　ＣＹ
Ｓ　ＧＬＵ　５ＥＲ８ＥＲＬＹＳ　ＧＬＵ　ＡＩＬＡ　
ＬＥＵ　ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＡＳＮ　ＡＳＮ　Ｉ、ＥＵ　
ＡＳＮＬＥＵ　ＰＲＯＬＹＳ　ＭＥＴ　ＡＬＡ　ＧＬＵ
　ＬＹＳ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＣＹＳ　ＰＨＥＧＬＮ　Ｓ
ＥＲＧＬＹ　Ｐ）ｆＥ　ＡＳＮ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　ＴＨ
ＲＣＹＳ　ＬＥＵ　ＶＡＬＬＹＳ　ＩＬＥ　ＩＬＥ　Ｔ
ＨＲＧＬＹ　ＬＥＵ　ＬＥＵ　ＧＬＵ　ＰＨＩ　ＧＬＵ
　ＭＡＬＴＹＲＬＥＵ　ＧＬＵ　ＴＹＲＬＥＵ　ＧＬＮ
　ＡＳＮ　ＡＲＧ　ＰＨＩ　ＧＬＵ　５ＥＲ８ＥＲＧＬ
Ｕ　ＧＬＵ　ＧＬＮ　ＡＬＡ　ＡＲＧ　ＡＬＡ　ＶＡＬ
　ＧＬＮ　ＭＥＴ　５ＥＲＴＨＲＬＹＳＶＡＬ　ＬＥＵ
　ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＰＨＥ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＬＹＳ　
ＬＹＳＡＬＡ　ＬＹＳ　ＡＳＮ　ＬＥＵ　ＡＳＰ　ＡＬ
Ａ　ＩＩＪ　ＴＨＲＴＨＲＰＲＯＡＳＰＰＲＯＴＨＲＴ
ＨＲＡＳＮ　ＡＬＡ　ＳＥＲＬＥＵ　ＬＥＵ　ＴＨＲＬ
ＹＳ　ＬＥＵＧＬＮ　ＡＬＡ　ＧＬＮ　ＡＳＮ　ＧＬＮ
　ＴＲＰ　ＬＥＵ　ＧＬＮ　ＡＳＰ　ＭＥＴ　Ｔ皿ＴＨ
ＲＩ（Ｉｓ　ＩＫＵ　ＩＩＪ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＳＥＲ
ＰＨＥ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＰＨＥＬＥＵ　ＧＬＮ　　Ｓ
ＥＲＳＥＲＬＥＵ　ＡＲＧ　　ＡＬＡ　　ＬＥＵ　ＡＲ
Ｇ　、ＧＬＮ　ＭＥＴ（３）アミノ−ｅｆチダグーＭに
よるＮ末端Ｍｅｔの除去（第１６図反応■） 実施例１と同様にして調整したＡＰ−Ｍを（２）で得ら
れた融合ポリペプチドに添加し３７℃、３時間反応した
。その反応液はＨＰＬＣにおけ、融合ポリペグチド相当
画分を分取した。なお、取得したサングルの一部をグロ
テインシークエンサーにてＮ末端側アミノ酸分析を行な
った結果、予想どおシＮ末端Ｍｅｔ残基が除去されてい
ることがわかった。

（４）アミノペプチダーゼＰ、プロリンイミノ４７＃チ
ダーゼ、アミノペプチダーゼＭによる反応（第１６図反
応■、■、■） （３）で得られた融合蛋白質に実施例１と同様にしてＡ
Ｐ−Ｐ、ＰＩＦを順次作用させることによ、９Ｎ末端が
Ｔｈｒ残基のＢＳＦ−２融合ポリ（ゾチドをほぼ定量的
に得ることができた。次に、ＡＰ−Ｍを上記融合ポリペ
プチドに３７℃、２００時間反応せた後、反応液を逆相
ＨＰＬＣにかけＡＡｄ　−ＢＳＦ　−２融合ポリー２ゾ
チドを精製、分取した。

（５）アミノペプチダーゼＰにょるＮ末端Ａｔａの除去
（第１６図反応■） （４）で得られた融合ポリペプチドに実施例１と同様Ｋ
　ＡＰ　−Ｐを添加し、４０℃４時間反応後、逆相ＨＰ
ＬＣによ、９　ＢＳＦ−２画分を分取した。その一部を
プロテインシークエンサーにかけたところ予想とおシ、
Ｎ末端がＰｒｏであるＢＳＦ−２であることが確認でき
た。ζうして融合ポリペプチドからＢＳＦ−２を取得で
きた。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＴ９−１１’の構築図。 第２ａ図はｐＴ１３８Ｎｃｏの模式図。 第２ｂはｐＴ１３ｓＮｃｏ構築のための合成ｈＩＩ、−
２遺伝子部分の塩基配列。 第３図はｐＴ１３ｓΔｈＩＬ−２−ＫＳ−ｍＩＬ−２（
Ｘｂａｌ）の構築図。 第４図はｐＴ１３ｓΔｈＩＬ−ｚ−ｘｓ−ｍｕ、−ｚ（
ＢｇｔＩ［）の構築物。 第５図はｈＩＬ−２とｍＩＬ−２の融合遺伝子の連結、
部分の塩基配列。 第６図は融合遺伝子から発現された融合蛋白質に対して
、ＡＰＭ　、　ＡＰ−Ｐ　、　ＰＩＰ　、　ＡＰＭを順
次作用させることにより目的蛋白質（マウスインターロ
イキン２　：　ｍＩＬ−２）を取得した手順を示した図
。１は除去領域を示す。 第７図はｍＩＬ−２”（１）のアミノ酸配列。 第８図は発現されたマウスインターロイキン２誘導体１
（ｍＩＬ−２°（Ｉ））融合ポリペプチドにＲ−Ｍ　、
　ＡＰ−Ｐ　、　ＰＩＦを順次作用させることＫよ）目
的ポリペプチド（ｍＩＬ−２°（Ｉ））を取得した手順
を示した図。−は酵素によ）削除した領域を示す。 第９−ａ図はＢＳＦ−２”（１）のアミノ酸配列。 第９−ｂ図はＢＳＦ−２アミノ酸配列。 第１０−ａ図はＢＳＦ−２ｃＤＮＡの塩基配列及び対応
するアミノ酸配列。 第１０−ｂ図はＢＳＦ　−２ｃＤＮＡの制限酵素地図。 第１１図はｐＴＢＣＤＦ−０１の構築図。 第１２図はｐＴＢＣＤＦ−０２の構築図。 第１３図は融合ポリペプチドに対してＡＰ−Ｐ　。 ＰＩＦを順次作用させることにより目的ポリペプチドＢ
ＳＦ　−２”（１）　ｋ取得した手順を示した図。−は
酵素により削除した領域を示す。 第１４図はｐＴＢＣＤＦ　−ＩＩの構築図。 第１５図はｐＴＢＣＤＦ−１２の構築図。 第１６図は発現された融合ポリペプチドにＡｐ−Ｍ。 Ａｐ−Ｐ　、　ＰＩＰ　、　Ａｐ−Ｍ　、　Ａｐ−Ｐ全
順次作用させることにより目的ポリペプチドＢＳＦ−２
ｉ取得した手１称した図。ムは酵素による融合ポリペプ
チドの削除領域を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 採取を目的としているポリペプチド（以下目的ポリペプ
   チドという）のＮ末端側に２個以上のアミノ酸からなる
   ポリペプチド（以下付加ポリペプチドという）が付加さ
   れた融合ポリペプチドから目的ポリペプチドを単離しこ
   れを採取する方法において I ）目的ポリペプチドがＮ末端側より第１及び第２ア
   ミノ酸がともにプロリンでない場合に （１）付加ポリペプチドのＣ末端アミノ酸がプロリンで
   あるように融合ポリペプチドをデザインし、この融合ポ
   リペプチドを採取し、 （２）この融合ポリペプチドにアミノペプチダーゼＭ、
   ロイシンアミノペプチダーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉアミノペプ
   チダーゼＩなどのプロリンのＮ末端側及びＣ末端側のペ
   プチド結合を切断しないアミノペプチダーゼ（以下アミ
   ノペプチダーゼＭなどという）、及びアミノペプチダー
   ゼＰ、プロリンイミノペプチダーゼを適宜作用させて融
   合ポリペプチドのＮ末端側より順次、付加ポリペプチド
   のアミノ酸を切断して付加ポリペプチドＣ末端アミノ酸
   であるプロリンのみが付加された融合ポリペプチドに変
   換し （３）この変換融合ポリペプチドにプロリンイミノペプ
   チダーゼを作用させて付加されているプロリンを遊離す
   ることによって目的ポリペプチドを生成せしめ、これを
   採取することを特徴とするポリペプチドの製造法。 II）目的ポリペプチドがＮ末端側より第１アミノ酸がプ
   ロリンで第２アミノ酸がプロリンでない場合に （１）付加ポリペプチドのＣ末端アミノ酸がプロリンを
   含む任意のアミノ酸であるように融合ポリペプチドをデ
   ザインし、この融合ポリペプチドを採取し、 （２）この融合ポリペプチドにアミノペプチダーゼＭな
   ど、アミノペプチダーゼＰ、プロリンイミノペプチダー
   ゼを適宜作用させて融合ポリペプチドのＮ末端側より順
   次付加ポリペプチドのアミノ酸を切断し付加ポリペプチ
   ドのＣ末端アミノ酸１個のみが付加した融合ポリペプチ
   ドに変換し （３）この変換融合ポリペプチドにアミノペプチダーゼ
   Ｐを作用させて付加されているアミノ酸を遊離すること
   によって目的ポリペプチドを生成せしめこれを採取する
   ことを特徴とするポリペプチドの製造法。 III）目的ポリペプチドがＮ末端側より第１アミノ酸が
   プロリンでなく第２アミノ酸がプロリンである場合に （１）付加ポリペプチドのＣ末端アミノ酸がプロリン以
   外のアミノ酸であるように融合ポリペプチドをデザイン
   し、この融合ポリペプチドを採取し （２）この融合ポリペプチドにアミノペプチダーゼＭな
   ど、アミノペプチダーゼＰ、プロリンイミノペプチダー
   ゼを適宜作用させて融合ポリペプチドのＮ末端側側より
   順次付加ポリペプチドのアミノ酸を切断し付加ポリペプ
   チドのＣ末端アミノ酸１個のみが付加した融合ポリペプ
   チドに変換し （３）この変換融合ポリペプチドにアミノペプチダーゼ
   Ｍなどを作用させて付加されているアミノ酸を遊離する
   ことによって目的ポリペプチドを生成せしめこれを採取
   することを特徴とするポリペプチドの製造法。