JPH01193298A - ペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は有用なペプチド類の製造方法に関し、更に詳細
には、Ｈ−ＳＡＲ−ＬＹＳ−ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ！の
製造のための溶液合成法に関する。

１９７８年１１月１７日出願の「新規テトラペプチド類
および方法」と題する米国特許願第９６０．５５０号に
は、−群のペプチド類が、腺胸機能明細書の浄ｖ！（内
容に変更なし） （ｔｈｙｍｉｃ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ）および免疫学的領
域において有用なものとして開示されている。この部類
の好適な一員は、式Ｈ−ＳＡＲ−ＬＹＳ−９ＡＲ−ＧＬ
Ｎ−ＮＨ２を有している。この特許願は参考のためにこ
こに挙げるものである。この参考特許願においては、一
般に［メリフィールド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　５
ｙｎｔｈｅｓｉｓ）　Ｊと呼ばれる同相合成法によって
、該群のテトラペプチド類を製造している。この群のテ
トラペプチド類の製造のためには、古典的な方法（すな
わち、溶液合成法）を用いることができるということも
記載されている。

メリフイールの固相合成法は、実験室における少量のペ
プチドの製造のためには好都合であるけれども、大量（
たとえば約１００ｇを超える量）のペプチドの製造のた
めには実際的でなく且つ一般に不経済であり、そのため
には溶液合成法のほうが適している。その上、溶液合成
法は一般に、必要とする試薬の量が、比較的少なく且つ
使用するいくつかの試薬の単位原価が遥かに低いために
、同相合成法よりも遥かに経済的である。ポリペプチド
の製造において使用するためのいろいろな種類の溶液合
成法の中で、本発明者は、望ましいテトラペプチドアミ
ドを便利に且つ経済的に製造するための特別な合成方法
を見出した。

そのもつとも広い範囲において本発明は、Ｈ−ＳＡＲ−
ＬＹＳ−ＳＡＲ−ＧＬＮ　　ＮＨｚの製造方法であり、
この方法は下記の各段階から成る：ａ）　後述するよう
にして、Ｚ−ＳＡＲ−ｔＺ’−ＬＹＳ−ＯＨから成るフ
ラグメントＩを生成せしめ： ｂ）　後述するようにして、Ｉ　−ＳＡＲ−ＧＬＮ−Ｎ
Ｈ，から成るフラグメントＩＩを生成せしめ： Ｃ）　　フラグメントＩとフラグメントＩＩを結合させ
て保護したテトラペプチドを生成せしめ；ｄ）保護した
テトラペプチドを精製しく任意的）：ｅ）　保護基Ｚお
よびＺ″を除去し；そしてｆ）　生ずるテトラペプチド
を単離しそして精製する。

フラグメントＩは下記の各段階によって生成せしめるこ
とができる： ｉ）　サルコシンを保護基Ｚを導入しうる試薬と反応さ
せることによって、サルコシンのα−アミノ基を保護す
る： ｉ）　Ｌ−リシンを、ε−アミノ基を特異的に保護する
ような方法で、保護基Ｚ′を導入しうる試薬と反応させ
ることによって、Ｌ−リシンのε−アミノ基を保護する
； ｉ）　更に後述するようにして、段階ｉ）において生成
せしめた保護したサルコシンを、アミンによるカルボキ
シ基における求核性攻撃に関して活性化することにより
カルボキシ活性化した保護したサルコシンを生成せしめ
る；および ｉｖ）　　該カルボキシ活性化した保護したサルコシン
を段階■）において生成せしめたε−保護したＬ−リシ
ンと反応させ、それによってフラグメント■を生成せし
める。

フラグメント■は下記の各段階によって生成せしめるこ
とができる： ｉ）　　Ｚ″−ＧＬＮ−ＮＨ，を製造する、ここでＺ＃
はＬ−グルタミンアミドのσ−アミノ基上の保護基であ
る： Ｌｉ）　　上記段階ｉ）において製造した物質から、好
ましくは接触水素添加によって保護基を除去して、保護
してないＬ−グルタミンアミドを生成せしめる： ｉｉ）　　保護してないＬ−グルタミンアミドを、前項
の段階ｉｉ）に記載のカルボキシ活性化した保護したサ
ルコシンと反応させて、Ｚ−ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ２を
生成せしめる；そしてｉｖ）　　該Ｚ−ＳＡＲ−ＧＬＮ
−ＮＨ，から、好ましくは接触水素添加によって保護基
を除去し、それによってフラグメントｎを生成せしめる
。

保護基２およびＺ″は同一もしくは相異なることができ
且つアミノ酸基を結合するために使用する段階による除
去には安定であるが、しかしなおペプチドのアミド結合
の何れをも開裂することがない条件によって結合段階の
終りに容易に除去することができなければならない。保
護基２＃は、基２およびＺ″と同一もしくは相異なるこ
とができ且つＬ−グルタミンアミドを分解しない条件下
に容易に除去することができるが、しかし保護したＬ−
グルタミンアミドを得るために用いる製造経路に依存し
て、グルタミンまたはグルタミン酸のアミド化の間は安
定でなければならない。適当なアミノ−保護基の例は下
記の式を有するものである： ａ）　　　　　　０ 鳳 Ｒ，−０Ｃ−１ここでＲ１はアリール（たとえばフェニ
ル、トリル、またはキシリル）；アダマンチル；−置換
したメチル（たとえばアリル、β−シアノエチル、フル
オレニルメチル、ベンジル、マタはフェニル環がハロ、
ニトロ、低級アルキルおよび低級アルコキシから選ばれ
る１〜３員で置換されたベンジル）：二置換されたメチ
ル（たとえばジイソプロピルメチル、ジフェニルメチル
、シクロヘキシル、シクロペンチルまたはビニル）；或
いは三置換されたメチル（たとえばｔ−ブチル、む−ア
ミル、ジメチルトリフルオロメチルメチル、またはジメ
チルビフェニルメチル）である； ｂ）　　　　。

直 Ｒ２Ｏ−１ここでＲ２は炭素数２〜４個の低級アルキル
たとえばエチル、イソプロピル、ｔ−ブチルなと、また
は１〜５個のハロゲン原子で置換された炭素数１〜４個
の低級アルキルたとえばトリフルオロメチル、クロロメ
チル、ペンタクロロエチルなどである； ｃ）　　　　　　Ｘ Ｒ３０−Ｐ−１ここでＸはＳまたは０でＯＲ。

あり、そしてＲ１およびＲ４はそれぞれベンジルまたは
低級アルキルである； れぞれ独立に低級アルキルであるか、またはＲ２Ｈ，Ｒ
畠 但しＲ７およびＲ８はそれぞれ水素または低級アルキル
である；および ｅ）　　　　　　　　□ ｐ、１１ チル、ハロまたはニトロである。

二座配位（ｂｉｄｅｎｔａｔｅ）であるアミノ保護基ｅ
）はＬ−リシンのδ−アミノ基およびＬ−グルタミンの
α−アミノ基に対してのみ使用することかでき、サルコ
シンのα−アミノ基には使用することができない。サル
コシンのａ−アミノ基に対する保護基は、そのアミノ基
上のメチル置換基のために一座配位（ｍｏｎｏｄｅｎｔ
ａｔｅ）でなければならない。

その他のアミノ保護基はすべてのアミノ酸に対して使用
することができる。

本明細書中で用いる「ハロ」は、フルオロ、クロロ、−
ブロモおよびヨードを包含するが、クロロおよびブロモ
が好適である。「低級アルキル」および「低級アルコキ
シ」なる語はそれぞれ、炭素数１〜６個の飽和脂肪族炭
化水素基たとえば、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ
−ブチル、ｎ−ヘキシルなどおよび対応するアルコキシ
基たとえばメトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、ｔ−
ブトキシ、ｎ−ヘキソキシなどを包含する。メチル−が
好適な低級アルキルでありそしてメトキシが好適な低級
アルコキシである。

これらの保護基を導入するために用いる試薬（通常は対
応する酸クロライドであるけれども、他の誘導体を用い
ることもできる）は、ある場合には本明細書中で「保護
基試薬」と呼ぶ。その他の適当な保護基は、たとえば、
“Ｐ　ｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇ　ｒｏｕｐｓｉｉｉ　Ｏ
ｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、　Ｊ　、　Ｆ　
、Ｗ、ＭｃＯｍｉｅ。

ｅｄ、、Ｐ　ｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ　、Ｙ、、
　　１９７３に記載されている。

ＺとＺ′は同一であり且つベンジルオキシカルボニル（
ＣＢ　Ｚ）またはトリフルオロアセチル（Ｔ　Ｆ　Ａ）
であることが好ましい。更に好適な実施態様においては
、Ｚ、Ｚ′および２＃がすべて同一であり且つＣＢＺま
たはＴＦＡのどちらかである。

前記のカルボキシ活性化した保護したサルコシンを製造
するためには種々の試薬を使用することができる。

カルボキシ活性化した保護したサルコシンの１種は反応
性エステルである。適当なサルコシンの活性エステルを
製造するのに用いる試薬の例は、フェノール；フェニル
環が１〜５員のハロ（たとえばクロロまたはフルオロ）
、ニトロ、シアノおよびメトキシで置換されたフェノー
ル；チオフェニル；Ｎ−ヒドロキシフタルイミド；Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド；Ｎ−ヒドロキシグルタルイ
ミド：Ｎ−ヒドロキシベンズアミド：ｌ−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールなどである。その他の適当な試薬は、
たとえば前記の“Ｐ　ｒｏｔｅｃｔ　ｉｖｅ　Ｇ　ｒ。

ｕｐｓ　ｉｉｉ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅ＋ｍ１ｓｔｒ
ｙ”　、　Ｊ　、Ｆ　、Ｗ、ＭｃＯｍｉｅ、ｅｄ、、に
記載されている。後記の特定的な実篇例においてはＮ−
ヒドロキシスクシンイミドを使用する。

その他の活性化方法、たとえば、混合または対称無水物
方法、酸塩化物方法、およびアジド方法は公知であり、
たとえば、Ｂ　ｏｄａｎｓｚｋｙら、”Ｐｅｐｔｉｄｅ
　Ｓ　ｙｎｔｈｅｓｉｓ”　２ｎｄ　ｅｄ、、　　ｌ　
９７６　＋　ｐ　ｐ　８２〜１２８に記載されている。

フラグメントＩＩの製造における段階ｉｉｉ）およびｉ
ｖ）に代る方法として、前記のカルボキシ活性化した保
護したサルコシンの代りにサルコシンのＮ−カルボキシ
無水物を使用することができる。

Ｎ−カルボキシ無水物の製造は一般に、上記のＢｏｄａ
ｎｓｚｋｙらの著書の９７頁以下に記載されている。

この環状のサルコシン無水物は、その性質によって、サ
ルコシンアミノ基に対して何らの保護基も必要としない
ため、フラグメントＩＩの製造において有利である。そ
れ故、保護基を除去する必要がなく、段階ｉｖ）を省略
することができる。この代替段階は次のように記載する
ことができる二ｉ）　保護してないし一グルタミンをサ
ルコシンＮ−カルボキシ無水物と反応させ、それによっ
てフラグメントＩＩを生成せしめる。

保護基は保護したテトラペプチドおよびｚ＃−ＧＬＮ　
　ＮＨｔ中間物から接触水素添加によって除去すること
が好ましいけれども、その他・の公知の方法を使用する
こともできる。このような方法は、前記のＢ　ｏｄａｎ
ｓｚｋｙらの著書の１８〜８４頁およびＭｃＯｍｉｅの
著書中に記載されている。これらの方法の例は、トリフ
ルオロ酢酸またはその他の緩和な酸による処理、５０％
含水酢酸の存在下での亜鉛による還元、塩化水素または
その他の強酸による処理、並びに強または弱塩基による
処理が、これらはすべて除去すべき基と存在するその他
の反応性の基の本質に依存する。

本発明の方法の生成物は保護したテトラペプチドの形態
において、または保護基の除去後の何れかにおいて精製
することができる。保護したテトラペプチド（ＣＢＺ保
護基）は酢酸エチル：メタノール溶媒から有利に結晶化
することができる。

その他の溶媒系も使用することができることが予想され
る。

連続的な溶出と再結晶を用いる煩雑な精製方式が、溶液
合成ペプチドの精製において典型的であるけれども、本
発明によって溶液合成したテトラペプチドは、驚くべき
ことに、脂肪族アルコール、低級アルカン酸および水か
ら成る溶離剤を用いるシリカゲルクロマトグラフィーカ
ラム上での一回の溶離によって容易に精製することがで
きるということが見出された。脂肪族アルコールとして
は、たとえばイソブタノール、ｎ−ブタノール、イソプ
ロパツール、アミルアルコール、イソアミルアルコール
などを用いることができ、一方、低級アルカン酸として
はギ酸、酢酸、プロピオン酸などを用いることができる
。有利には使用することができることが認められている
溶離剤の１例は、ｌＯ：２：５の比率のｎ−ブタノール
：酢酸：水である。

本発明の範囲内には、前記のフラグメントＩと■および
保護したテトラペプチド、ならびにこれらのフラグメン
トの製造のための中間体を包含され、さらに本発明の方
法の実施のために有用な組酸物もまた含まれる。

本発明は、そのもつとも広い範囲内において、下記の図
に概念的に示される。

上記の図において、保護基を前記のようにＺ。

２′および２＃によって表わす。サルコシンのカルボキ
シ活性化は文字ＯＡによって示す。

上記の図を参照して、フラグメントＩは一般に以下のよ
うにして製造することができる。サルコシンのアミノ基
を保護するためにサルコシンの水溶性塩基性付加塩を生
成させ、水に溶解する。この塩基性付加塩は、サルコシ
ンをモル的に僅かに過剰の水酸化ナトリウム中に溶解す
ることによって生成させることができる。次いで、この
溶液に対して、同時に、僅かに過剰の保護基２を導入す
るための試薬（たとえばベンジルオキシカルボニルクロ
リドのような対応する酸クロリドおよび反応の間に生成
する酸（たとえばＨＣｌ）と反応させるだめの塩基の溶
液（たとえば水酸化ナトリウム）を加える。保護基添加
試薬は溶液としてまたはそのままで加えることができ且
つ酸クロリドであることが好ましい。反応の完了後に、
過剰の保護基添加試薬を除去しくたとえばジエチルエー
テルまたは水と混合しない何らかの有機溶媒を用いる抽
出によって）、その後、保護したサルコシンを、酸（た
とえば塩酸）による処理によって未反応のサルコシンか
ら単離する。酸処理により、保護してないサルコシンの
塩基性付加塩が保護してないサルコシンの酸付加塩に変
えられるが、この塩は水溶性である。しかしながら、酸
処理は、保護したアミノ基のために、酸付加塩を生ぜし
めることができないから、保護した塩基性付加塩のみを
保護したサルコシンに変える。この保護したサルコシン
は水に不溶性であり、たとえば前記のような混合しない
有機溶媒を用いる抽出によって、保護してないサルコシ
ンの塩から容易に分離することができる。本明細書にお
いて用いる「混和しない有機溶媒」という語は、水と混
合しないすべての一般的な実験室用有機溶媒たとえばジ
エチルエーテル、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、キ
シレンなどを包含する。好適な保護したサルコシン、す
なわちＮ−ベンジルオキシカルボニルサルコシンは既知
の化合物である。その製造方法は、Ｒ、Ｓ　、Ｔ　１ｐ
ｔｏｎおよびＢ、Ａ、Ｐａｖｓｏｎ、　　Ｊ、Ｏｒｇ。

Ｃｈｅｍ、、２６．４６９８　（１９６１）中に示され
ており、且つこの化合物はＢ　ａｃｈｅｍ、　Ｉ　ｎｃ
、、　Ｔ　ｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡから市販されている。

フラグメントＩを生成させるｔ；めの、この保護したサ
ルコシンと保護したりシン分子との縮合のための準備と
して、アミノ保護したサルコシンを、通常、結合の生成
を助長する何らかの方式で活性化しなければならない。

この活性化を行なうための好適な方法は「活性エステル
」の生成によるものであるけれども、公知のその他の活
性他方ふお、たとえば混合または対称無水物、アジドま
たは酸クロリド方法を用いることができるということを
考慮すべきである。加うるに、Ｎ“−保護したし一リシ
ンのカルボニル末端を、サルコシン上の保護基（Ｚ）の
存在下に、ＺまたはＬ−リシン上のＮ・−保護基（Ｚ′
）の何れをも除去することなく除去することがでさる基
によってブロックするときは、このようなブロッキング
は、事前のサルコシンの活性化なしての、保護したサル
コシンのし一リシンへの直接的な結合を可能とするであ
ろう。

［１したサルコシンのどのような活性エステルをも使用
することができるが、好適な１個の活性エステルは、ヒ
ドロキシスクシンイミドによって生成せしめるものであ
る。保護したサルコシンの活性エステルは、たとえば適
当な有機溶媒、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメ
チルホルムアミド サルコシンと活性エステル試薬を反応させることによっ
て製造する。次いでこの溶液に対して当量のカップリン
グ剤、典型的にはジシクロヘキシルカルボジイミド、を
加える。その他のカップリング剤も効果的であるけれど
も、カップリング反応の副生物が使用する該群の溶媒中
に極めて不溶性であり、それ故濾過によってカップルし
た生成物を溶液中に残したまま容易に除去することがで
きるので、ジシクロヘキシルカルボジイミドが特に有用
である。

イプシロン−アミノ基に対して保護しであるし一リシン
は市販品として入手することができ（たとえば、Ｓ　ｉ
ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｓ　ｔ
、Ｌｕ１ｓ。

ＭＯから）、または前記の基準に合致する保護基（２′
）を用いて製造することができる。

フラグメンｌ−１の製造における最終段階は、僅かに過
剰の保護したし一リシンを、２当量の塩形成材料たとえ
ば有機第三級アミンの存在下に、保護したサルコシン活
性エステルと反応させることから成る。どのような有機
第三級アミンをも用いることができるが、トリエチルア
ミンがよく作用することが見い出された。溶媒としては
前記のような適当な有機溶媒を使用する。１当量の塩形
成性第三級アミンがイプシロン−アミノ保護したし一リ
シンのカルボキシル基を保護するけれども、前記の等何
物の−の代りに、このカルボキシル基に対するその他の
保護基も使用することができるということが了解される
。未反応のアミノ酸は、反応混合物の酸（たとえば塩酸
）による処理および前記のような混和しない有機溶媒に
よる抽出によって除去することができる。

適当なカルボキシル保護基の例は、ベンジルおよびその
中のフェニル基が１〜３個のハロ（たとえばクロロまた
はブロモ）、ニトロ、低級アルコキシ（たとえばメトキ
シ）、または低級アルキル（たとえばメチル）で置換さ
れたベンジルである。

このような基のそれ以上の説明は、前記のＭｃＯｍｉｅ
の著書に記載されている。

フラグメントＩＩの製造は、保護したＬ−グルタミンア
ミドの合成によって始まるが、これはＬ−グルタミンま
たはＬ−グルタミン酸の何れかを用いて出発する、いく
つかの合成経路の中の何れかによって得ることができる
。好適な方法は、Ｌ−グルタミン酸の両カルボキシル基
を低級アルカノールを用いてエステル化し、その後に前
記のようなアミノ基保護試薬を用いる処理によって、Ｌ
−グルタミン酸ジエステルのアルファーアミノ基を保護
する方法である。この保護したＬ−グルタミン酸とアン
モニアとの反応は、保護したＬ−グルタミンアミドを与
える。この方法はＪ　、Ｂ　ｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、１６５．３３３　（１９４６）に記載され
ている。この方法の一つの変法において、Ｌ−グルタミ
ン酸のアルファーアミノ基をエステル化反応前に保護す
ることができる。新規であるもう一つの方法はＬ−グル
タミンで始まり、且つそのアルファーアミノ基を前記の
ように保護する。保護したし一グルタミンを次いで、た
とえば活性エステルの形成と、その後の低級アルカノー
ル（たとえばメチルアルコール）中のアンモニアによる
処理によって、保護したＬ−グルタミンアミドに変える
。

この保護したＬ−グルタミンアミドを生成させたのち、
アルファーアミノ基から保護基を除き且つ保護してない
Ｌ−グルタミンアミドを、前記のように活性化（たとえ
ば活性エステルへの転化によって）しであるアルファー
アミノ保護したサルコシンと反応させる。Ｌ−グルタミ
ンアミドからの保護基の除去は、適当な還元性溶媒、た
とえばジメチルホルムアミド、酢酸、低級アルカノール
（たとえばメタノール）などの中の炭素上のパラジウム
触媒の存在下での水素を用いる反応によって行なうこと
が好ましい。生成した保護基を除いたＬ−グルタミンア
ミドと保護したサルコシン活性エステルとの反応は、同
一の溶媒、好ましくはメタノール中で行なうことが好ま
しい。この保護基除去の特定の方法および溶媒の使用は
、保護したＬ−グルタミンアミドと生成した保護したサ
ルコシン−し−グルタミンアミドの両者がメチルアルコ
ール中に不溶であり、一方、保護基を除いたＬ−グルタ
ミンアミドがメチルアルコール中に完全に溶解するとい
う理由で、特に有利な結果を与える。その結果、未反応
の、保護基を除いたＬ−グルタミンアミドを濾過によっ
て容易に除くことができ、この段階に対して優れた収率
をもたらす。

前記のような適当な還元性溶媒（好ましくはジメチルホ
ルムアミド）中の水素と炭素上パラジウムを用いて行な
うことが適当な、この保護したジペプチドからの保護基
の除去はフラグメントＩＩを与える。

フラグメント■およびＩＩを、たとえばジメチルホルム
アミドのような適当な非プロトン性溶媒中でカップリン
グ剤たとえばジシクロヘキシルカルボジイミド させることにより結合させて、保護したテトラペプチド
Ｈ−ＳＡＲ−ε−Ｚ’−ＬＹＳ−ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ
，を生成せしめる。この反応は、フラグメントＩのＬ−
リシン上のカルボキシル基に隣接するラセミ化を最低に
し且つ反応の速度を増大させる物質、たとえばｌ−ヒド
ロキシベンゾトリアゾールの存在下に行なうことが好ま
しい。次いで、生成するテトラペプチドアミド上の残り
の基を、好ましくは、前記のような適当な還元性溶媒（
好ましくは含水酢酸）中の炭素上パラジウム触媒の存在
下での水素ガスを用いる処理によって除去する。水素ガ
スは１気圧を越え．る圧力下にある必要はないけれども
、還元の速度を促進するという理由で、加圧の使用が有
利である。

かくして得られる不純な生成物の単離および精製は、各
フラクション中の物質の正体を監視するために薄層クロ
マトグラフィーを使用する、再結晶とイオン交換クロマ
トグラフィー（好ましくは溶離剤としてｐＨ５の酢酸ア
ンモニウムを使用する）との併用によって達成すること
ができる。下記の実施例においては、いくつかの単離お
よび精製方法を用いているけれども、その他の方法も使
用することができるということは明白である。

先に生成せしめた保護したテトラペプチドは、所望に応
じて、還元段階前に精製することができる。この精製は
、保護したテトラペプチドの溶液から溶媒を除去し、残
渣をジクロロメタン中に溶解し、その溶液を濾過し、且
つ濾液を蒸発させることによって行なうことができる。

生成する固体の熱酢酸エチルによる抽出は、純粋な保護
したテトラペプチドを加え、それを前記のようにして還
元し且つ更に精製することができる。また別の方法とし
て、不純な保護したテトラペプチドを、適当な溶媒系（
たとえば１０ｌｌの比の酢酸エチル：メタノール）から
の再結晶によって精製することができる。

本発明の方法の一好適実施態様を下記の図に示す： 上記図中において略語は下記の意味を有する二〇ＢＺ　
：ベンジルオキシ力ルポニル ＤＣＣニジシクロヘキシルカルボジイミドＨＯ３ｕ：ヒ
ドロキシスクシンイミド Ｏ５ｕニオキシスクシンイミド Ｐｄ／Ｃ：炭素上のパラジウム Ｈ２：水素 ＨＯＢＴ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾールこの好適
実施態様を以下の実施例において更に詳細に記載するが
、これらの実施例は本発明を説明するのに役立つであろ
う。

実施例■ この物質を、Ｒ、Ｓ　、Ｔ　１ｐｔｏｎおよびＢ、Ａ、
ＰａｗｓＯｎの方法［Ｊ　、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ−２６、
４６４８（１９６１）］に従って製造した。サルコシン
（８゜９０ｇ、１．０モル）を、５００ｍｆｆ１の２Ｎ
水酸化ナトリウム中に、水浴中で冷却しながら溶解した
。

同時に、５５０ｍＱの２Ｎ水酸化ナトリウムとクロロギ
酸ベンジル［１９６ｇ（９５％）、１．０９５モル］を
、激しく撹拌しながら、１時間かけて添加した。かくし
て得た反応混合物を、室温において約１８時間撹拌し、
その後それを２５ｏｌずつのジエチルエーテルによって
３回抽出した。

次いで水相に酢酸エチル（５００ｍｇ）を加え、次いで
２００＋Ｍの濃塩酸を注意して加えた。有機相を分離し
、５００ｍ１２ずつの水で２回、次いで３００ｍ１２の
飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネ
シウム上で乾燥した。濾過によって乾燥剤を除去した後
の減圧下における溶媒の蒸発により、核磁気共鳴（ＮＭ
Ｒ）スペクトルによって同定され且つ更に精製すること
なく使用することができる油状物として、２１３ｇ（９
５％）のＮ−フェニルメトキシカルボニル−サルコシン
が得られた。

ＮＭＲ（ＣＤＣｌ　３）δ：　３．０２　（Ｓ、３Ｈ。

−Ｎ−ＣＨ３）、４．０５　（ブロード、２Ｈ９−Ｎ−
Ｃ旦り、５．１５　（Ｓ、２Ｈ，ベンジル）、７．３５
　（Ｓ、５Ｈ，芳香族）。

１０．４　（Ｓ、ＩＨ，酸）。

Ｂ、Ｎ−フェニルメトキシカルボニル−サルコシンＮ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＣＢＺ−ＳＡＲ−
Ｏ５ｕ） 実施例ＩＡにおいて製造したＮ−フェニルメトキシカル
ボニルサルコシン（１４６ｇＳ　Ｏ，６５４７モル）お
よびＮ−ヒドロキシスクシンイミド［７７，６ｇ（９７
％）、０．６５４７モル］を、１５００ｍ＜２の乾燥テ
トラヒドロ７ラン中に溶解した。この溶液に対して激し
く撹拌および冷却しながら、５０（ＩＱの乾燥テトラヒ
ドロフラン中のジシクロヘキシルカルボジイミド（１３
４，９ｇ、０．６５４７モル）の溶液を加えた。生成す
る溶液を室温において約１８時間撹拌した。濾過によっ
て固体を除去し、減圧下に溶媒を蒸発させて油状物を得
、それを２リツトルの無水エタノールから再結晶して、
白色の固体、融点６９〜７８１１Ｑ１　として、１６０
ｇ（７６，３％）のＮ−フェニルメトキシカルボニルサ
ルコシンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを得た
。

ＮＭＲ（ＣＤＣ１ｓ）δ：　２．７　（Ｓ、４Ｈ。

−Ｃ旦、−ＣＨ２−）、２．０６　（Ｓ、３Ｈ。

−Ｎ−ｃＨ，）、４．３　（Ｓ、２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２）
、５．０８　（Ｓ、２Ｈ，ベンジル）。

７．３　（Ｓ、５Ｈ，芳香族）： 赤外（ＫＢｒ）　：　２９４０〜３０７０ｃｍ−”　（
脂肪族および芳香族Ｃ−Ｈ）、１８３０−’（イミ　ド
）　。

Ｃ＋ｓＨＩｏＮ　！Ｏ＠に対する 計算値：Ｃ，５６，２５；Ｈ，５，０３；Ｎ、ａ。

分析値：（：、５５．９３　；Ｈ，５，０６、Ｎ、８゜
Ｃ，Ｎ−フェニルメトキシカルボニル−サルーｙシルー
Ｎ１−フェニルメトキシカルボニル−し−リシン（ＣＢ
Ｚ　　ＳＡＲｔ−ＣＢＺ−ＬＹＳ−ＯＨ）の合成 実施例ＩＢからのＮ−フェニルメトキシ力ルボニル−サ
ルコシン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ
１−フェニルメトキシカルボニル−Ｌ−リシン（Ｓ　ｉ
ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｓ　ｔ。

Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから購入）（２２ｇ、０．０７８６モ
ル）およびトリエチルアミン（２２ｍＱ、１６ｇ。

０．１５８モル）を４５０ｍ１２の乾燥テトラヒドロ７
ランに加え、全体を室温において約１８時間撹拌した。

溶媒を減圧下に除去し、残渣を５００ｍｄの酢酸エチル
及び４００ｒｒｒＱの２Ｎ塩酸中で分配した。水相を分
離し、１００ＩＩ１１２の酢酸エチルで抽出した。合せ
た酢酸エチルフラクションを次いで２００１ＩＯずつの
２Ｎ塩酸によって２回、２００ｍＱの水および２００ｍ
１２の飽和塩化ナトリウム溶液で２回ずつ洗浄したのち
、無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。濾過による乾燥
剤の除去後に、減圧下に溶液から溶媒を除去し、残留物
を９００ｍＱのアセトン−ヘキサン（１：３）と共に摩
砕して白色固体として２９．９　ｇ　（８２，８％）の
Ｎ−フェニルメトキシ力ルポニルーサルコシルーＮ“−
フェニルメトキシカルボニル−し−リシンを得た。ある
いは別法において、摩砕しない固体の５００ｍ（２のト
ルエンからの再結晶により、純粋な生成物が得られた。

ＮＭＲ（ＴＦＡ）Ｃ：１．３〜２．２　（Ｍ、６Ｈ。

リシンのＣ−Ｃ旦２−Ｃ旦２−Ｃ旦ＺＣ）。

３．０８　（Ｓ十Ｍ、５Ｈ，リシンの−Ｎ−Ｃ旦２−お
よびサルコシンのＣＨ，−Ｎ−）。

４．２５　（Ｓ、２Ｈ，０ 儒 −Ｎ−Ｃ旦ＺＣ）。

４．７５　（Ｎ、ＩＨ，０ 冒 −Ｎ−ＣＨ−Ｃ−）。

５．２　（Ｓ、４Ｈ，ベンジル）　、　７．３　（Ｓ＋
Ｍ、１２Ｈ，芳香族＋−Ｎ−Ｈ）。

ＩＲ（ＫＢｒ）：　３３３０ｃｍ−’（アミドＮ　−Ｈ
）。

１６５０−１７５０ｃｍ−’、アミド（酸およびウレタ
ンＣ−０）。（α）、＋１＠＝２゜（ｃ＝１．００．Ｈ
ＯＡｃ） ＣｚｓＨｓｒＮ　３Ｃ７に対する 計算値：Ｃ，６１，８４；Ｈ，６，４４，Ｎ、８゜分析
値：Ｃ，６１，０３；Ｈ，６，４７；Ｎ、８、実施例■ フラグメントＩＩの製造：　Ｈ−ＳＡＲ−ＧＬＮ−ルｂ Ｌ−グルタミン酸（４４ｇ、０．３モル）を２５０ＴＲ
１２の無水メタノール中に懸濁させ、その懸濁液を、そ
の中に乾燥ＨＣＩガスを吹込みながら、還流下に０．５
時間加熱する、その時間の終りに、全物質が溶液中に移
行した。この溶液を還流下に更に約１８時間加熱したの
ち、溶媒を減圧下に蒸発させた。生成する残留物に対し
て２００ｍ１２の水と３００ｍｆｆのクロロホルムを加
え、生成する混合物中に５ｇの酸化マグネシウムと１８
ｇのクロロギ酸ベンジルを添加しながら、家産において
急速に撹拌し、その後急速な撹拌を更に１０分間継続し
た。この添加とその後の１０分間の撹拌を、その後３回
繰返して、酸化マグネシウム（２０ｇ。

０．４９６モル）とクロロギ酸ベンジル（７２ｇ。

０．４２３モル）の全部の添加を完了した。最後の添加
後に、反応混合物を１０分間ではなく１５分間撹拌した
。有機層を分離して、２００ｍＱずつの水で２回、２０
０ＹｎＱずつの０．５Ｎ塩基で２回、２００ｍＭずつの
水で更に２回、２０ＯＩＩＩＱずつの０．５Ｎ水酸化ナ
トリウムによって２回、最後に２００ｍｆｆずつの水に
よって２回洗浄したのち、無水硫酸マグネシウム上で乾
燥した。

濾過により乾燥剤を除去したのち、減圧下に溶媒を除去
した。残留する油を予めアンモニアで飽和しであるメタ
ノール（５００ｒＲ＋２）中に溶解して、室温で６日間
放置した。生成する固体を濾過によって取出し、ＥｔＯ
Ｈから再結晶して、白色固体（１９，３５ｇ、２３％）
、融点１８９〜１９５°Ｃ１を得た。

Ｎ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ　３　Ｃ０２Ｄ　）δ：　４．３　（
Ｍ、ｌ　Ｈ。

メチレン）、５．１　（Ｓ、２Ｈ，ベンジル）、７．３
　（Ｓ、５Ｈ，芳香族）。

ＩＲ（ＫＢｒ）：　３４４０ｃｍ−’、３３２０ｃｍ−
’および３２００　ｃ　ｍ−’　（アミドおよびウレタ
ンＮ−Ｈ）、１６５０ｃｍ−’（アミド）。

１５４０ｃｍ−’（アミド）。

（α）９　　＝＋ａ６　　（Ｃ＝２．ＯＬ　２．ＣＭＦ
）ＣＩ３Ｈ１７Ｎ　３０４に対する 計算値：Ｃ，５５，９１；Ｈ，６，１４；Ｎ、１５゜分
析値：Ｃ，５６，７６；Ｈ，６，２４；Ｎ＋　　１４゜
ＣＢＺ　　ＧＬＮ　　ＮＨ２の合成のための別の方法１
）　　１０Ｃ１＋Ｑのテトラヒドロフラン中の８゜４１
ｇ（３０ミリモル）のベンジロキシカルボニル−し−グ
ルタミンおよび３．４５ｇ（３０ミリモル）のヒドロキ
シスクシンイミドの冷却溶液に対して、撹拌しながら、
６．１８ｇ　（３０ミリモル）のジシクロヘキシルカル
ボジイミドを加えた。

全体を１８時間撹拌したのち、室温まで放冷した。

溶液を濾過゛し、濾液を蒸発乾固させたのち、残留物を
酢酸エチルから再結晶した。得られた固体をアンモニア
で飽和させた７５ｍｍのメタノール中に加熱と共に溶解
したのち、室温で１８時間放置した。かくして得られた
固体を濾別し、冷メタノールで洗浄したのち、９５％の
エタノールから２回再結晶して、１．８ｇの固体、融点
１９１．５〜１９５．５°Ｃ１を得た。ＮＭＲスペクト
ル、ＩＲスペクトル、旋光度および元素分析によって生
成物を同定し、純度を確認した。

２）　　１２５０ｍＱの無水メタノール中の２２０ｇ（
１，４９５モル）のし−グルタミン酸の懸濁液を、還流
温度に加熱し且つその中に塩化水素を、溶解が達成され
るまで吹込んだ。その溶液を還流下に更に１８時間加熱
したのち、減圧下に蒸発させて、Ｌ−グルタミン酸の塩
酸塩を得た。この塩酸塩をＩＱの脱イオン水中に溶解し
且つｌ。

５Ｑのクロロホルムを加えた。次いでこの溶液に対して
３６０ｇ　（２，１１モル）の塩化ベンジルオキシカル
ボニルと１２０ｇ（３モル）の酸化マグネシウムを、１
．２５時間の間隔で撹拌しながら加え、更に３０分間撹
拌を続けた。全体を濾過して、溶解しなかった酸化マグ
ネシウムをすべて除去し且つ濾液の有機層を分離した。

有機層をｌ。

ＯＱの脱イオン水で２回、ｌ　、ＯＱ　（７）０．５Ｎ
水酸化ナトリウム水溶液で２回、最後に１．０αの脱イ
オン水で４回洗浄した。洗浄した有機層を硫酸マグネシ
ウム上で乾燥し、濾過し且つ蒸発乾固して、５００ｇの
粗製固体生成物を得た。この粗製固状物を２．０Ｑのメ
タノールと５００ＴａＱの水酸化°アンモニウムの混合
物中に溶解し、室温で１０日間放置したのち、３日間冷
蔵した。生成した固体を濾別し、メタノールで洗浄し、
真空下に乾燥したのち、１５Ｑのインプロパツールから
再結晶して、１９８ｇの純粋な生成物を得た。生成物の
同定と純度を、ＮＭＲおよびＩＲスペクトル、旋光なら
びに元素分析によって確認した。

実施例１１Ａにおいて製造したＮ−フェニルメトキシカ
ルボニル−し−グルタミンアミド（１３゜６ｇ、０．０
４７３モル）を、３００ＴＲＩ２のメタノール中に懸濁
させた。この懸濁液に対して炭素上のパラジウム（１０
％、１．１ｇ）を加えたのち、懸濁液を４５ｐｓ　ｉの
水素下に振とうした。０゜５時間後に、水素の吸収は、
約０．０５モルの水素に相当する４、５ｐｓｉであった
。触媒を濾過によって除き且つ５０ｍＭのメタノールで
洗浄した。−緒にしたメタノール溶液に対して、実施例
ＩＢにおいて製造したＮ−フェニルメトキシカルボニル
−サルコシン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
（１９，３６ｇ、０．０６０５モル）を加え、その反応
混合物を室温で約１８時間撹拌した。生成する固体を濾
過によって取出し、メタノールで洗浄したのち乾燥して
、１４．９ｇ（９０％）のＮ−フェニルメトキシカルボ
ニル−サルコシル−し−グルタミンアミド；融点１８６
〜１９６°Ｃ１を得た。

ＮＭＲ（ＣＤ、ＣＯ，Ｄ）δ：２．２（グルタミンのＭ
、ＩＨ，−ＣＨ，−Ｃ旦、）、３．０（Ｓ、３Ｈ，−Ｎ
−Ｃ旦３）　、　　４．１　　（Ｓ。

２Ｈ，Ｎ−Ｃ旦、−Ｃ−）、４．６　（Ｍ。

ＩＨ，−Ｎ−ＣＨ−Ｃ−）、５．１５　（Ｓ。

２Ｈ，ベンジル）、７．３　（Ｓ、５Ｈ，芳香族）： Ｉ　Ｒ（ＫＢｒ）：　３４１０ｃｍ−息、　３２９０ｃ
ｍ−’および３２２０ｃｍ−’および３２２０ｃｍ−’
。

（アミドおよびウレタン−Ｎ−Ｈ）、１７００ｃｍ−’
（ウレタンカルボニル）、１６５０　ｃ　ｍ−’および
１６２５ｃｍ−鳳（アミドカルボニル）。

（α）ｔ？　　６＝＋２３．３°　（ｃ−１，０３２，
ＤＭＦ） Ｃ１゜Ｈ２２Ｎ　４０　Ｂに対する 計算値：Ｃ，５４，８５；Ｈ，６，３３；Ｎ、１５゜分
析値：Ｃ，６４，６２；Ｈ，６，２３；Ｎ、１５゜Ｓ　
Ａ　Ｒ−Ｇ　Ｌ　Ｎ　−Ｎ　Ｈ２）の合成実施例１１Ｂ
において製造したＮ−フェニルメトキシカルボニル−サ
ルコシル−し−グルタミンアミド（１７，４ｇ、　０．
０４９７モル）を、２ｇの１０％Ｐｄ／Ｃと共に、３７
０ｍＱのジメチルホルムアミド中に懸濁させ且つその中
に水素ガスを６時間吹込んだ。濾過によって触媒を除去
したのちに、ｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１３
゜４ｇ、０．１０モル）と実施例ＩＤで製造したＮ−フ
ェニルメトキシカルボニル−サルコシル−Ｎ′−フェニ
ルメトキシカルボニル−Ｌ−リシン（２４ｇ、０．０４
９７モル）を濾液に加え、生ずる溶液を水浴中で冷却し
た。次いでジシクロヘキシルカルボジイミド（１０，２
４ｇ、０．０５０５モル）を加え、生ずる混合物を冷却
せずに終夜撹拌し、それによって混合物の温度は徐々に
室温まで上昇した。

懸濁液を濾過し、濾液から減圧下に溶媒を除去した。濾
液からの残留物を塩化メチレン中に溶解し、−２０°Ｃ
に１８時間冷却し、濾過し、濾液を減圧下に蒸発させて
、アミノ−ブロックしたテトラペプチドアミドを得た。

次いでこの物質を３００ｒａＱの５０％含水酢酸中に溶
解し、２．５ｇのｌＯ％Ｐｄ／Ｃの存在において、４０
ｐｓｉの水素下に還元した。２．５時間後に、水素の吸
収は約６ｐｓ　ｉとなった。濾過による触媒の除去後に
、濾液を凍結乾燥して不純な生成物を得、それを次のよ
うにして精製した。

この不純な固体を０．５Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ６
，５０）中で充てんした５Ｐ−Ｃ−２５樹脂の５Ｘ８０
ｃｍクロマトグラフィーカラム（空隙容量５６０ＴＲａ
）上でクロマトグラフィーにかけて、２Ｑの０．５Ｍ酢
酸アンモニウム（ｐＩ（６゜５０）の線形グラジェント
によって溶離した。流速を１５０＋ｉｆｆ／時間とし、
１５禦ｆｆずつのフラクションを集めた。フラクション
番号１６０〜２００を集めて凍結乾燥したのち、得られ
た固体を上記と同一の条件下に再びクロマトグラフィー
にかけて、７ラクシヨン番号８１〜３２０を集めて凍結
乾燥した。

次いで生成物を、ｎ−ブタノール、酢酸および水の４：
ｌ：５の混合物の下方の相中でよく充てんしたＧ−２５
樹脂の分配カラム上でクロマトグラフィーにかけ、且つ
この混合物の上相で溶離した。カラムの大きさは５Ｘ８
３ｃｍであり、流速を１０ＯｍＱ／時間として、２０ｍ
ｒｌずつのフラクションを集めた。７ラクシヨン番号５
１〜２４０゜２４１〜３４０および３４１〜５２０を別
々に集めて蒸発させることにより、それぞれ、４ｇ、５
゜４ｇおよび３．８ｇの生成物を得た。これらの２生成
物をそれぞれ前記の分配カラム上で別々にクロマトグラ
フィーにかけ、得られるフラクションを、シリカゲル板
と４：２：３：　１のｎ−ブタノール／酢酸／水／ピリ
ジンから成る溶媒系を使用する薄層クロマトグラフィー
（ＴＬＣ）によって監視した。上記のようにして得られ
た３生成物のそれぞれに対する純粋な生成物を含有する
７ラクシヨン（約３４０〜４２０の番号）を集めて蒸発
させた。

かくして得た残留物を５００＋ｉＱの無水エチルアルコ
ール中に溶解し、塩化水素ガスで飽和させた１０ｏｍＱ
の無水エチルアルコールの添加によって沈殿させたのち
、５００ｉｆｆの無水エーテルで処理した。生ずる固体
を濾別し、エーテルで洗浄したのち、減圧下に乾燥して
、白色固体として、７．８１ｇのサルコシル−し−リシ
ル−サルコシル−し−グルタミンアミド・二塩酸塩を得
た。

薄層クロマトグラフイｍ：　（シリカゲルプレート）Ｅ
　ｔ　ＯＥ　ｔ　／　Ｈｚ　Ｏｌ　／　ｌ　／　１　／
　Ｉ　　　Ｏ、ｌ　２アミノ酸分析：サルコシン（２，
１９）、グルタミン（１，０３）、リシン（１，００）
”。

ＮＨ，（２，０１）、８０．４％ペプチ、ド分析：ＣＩ
−’：１４．８９％、Ｈ，Ｏ：４．９２％（σｌ　ｆ３
　４＝　　　１４．８°　（ｃ−０，２０２２゜０．１
Ｎ　　ＨＣＩ） 精製のための別の方法は、アルキルシラン基質を用いる
逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。もつと
も簡単なものと認められた精製方法は、前記のような、
脂肪族アルコール、低級アルカン酸（ギ酸を含む）およ
び水から成る溶離剤ヲ用いるシリカゲル上のクロマトグ
ラフィーを包含スる。１０ｏｇのマレンクロットシリカ
−（Ｍａｌｅｎｋｒｏｄｔ　Ｓ　１ｌｉｃａｒ）　ＣＣ
７シリカゲル上でｌ。

ｇの不純なテトラペプチドを精製するために、好適なｎ
−ブタノール：酢酸：水（ｔｏ：２：５）溶離剤を用い
た。１５ｍＱずつの７ラクシヨンを採取した。７ラクシ
ヨン５０〜９５は、３０：２５：ｌＯの比のクロロホル
ム：メタノール：水酸化アンモニウムを使用し且つニン
ヒドリンで発色させるシリカゲルプレート上の薄層クロ
マトグラフィーによって測定するとき、純粋なテトラペ
プチドを含有することが認められた。

テトラペプチドは保護したテトラペプチドを保護基の除
去前に再結晶することによって、純粋な状態で得ること
ができる。不純な保護したテトラペプチドの２８ｇの試
料を、６００＋ａ４の酢酸エチルと７０ｍＱのメタノー
ルの混合物からの再結晶によって精製した。この生成物
は薄層クロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール
；９：１゜Ｒｆ−０，７２）および元素分析によって、
本質的に純粋であった。ＮＭＲスペクトルは帰属した構
造と一致した。

実施例■ 上記実施例■Ｃで製造した純粋なＨ−ＳＡＲ−ＬＹＳ−
ＳＡＲＧＬＮ　　ＮＨ２を、前記の１９７８年１１月１
７日出願の米国特許願第９６０゜５５０号の実施例■に
記載のマウス誘発分析で試験した。前記実施例工および
■に″お゛いて製造したこのテトラペプチドアミドは、
メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相合成法に
従って製造した材料と同一の活性を示した。

手続補正書彷式） ％式％ １、事件の表示 昭和６３年特許願第１１８４００号 ２、発明の名称 ペプチドの製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 名称　オーツ・ファーマシューチカル・コーポレーショ
ン ・４０代理人　〒１０７ ５、補正命令の日付　昭和６３年９月２７日（発送日）
６、補正の対象 明細書（第１５頁〜第６４頁） ７、補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）Ｚ−ＳＡＲ−ε−Ｚ′−ＬＹＳ−ＯＨからなる
   フラグメント I を： ｉ）サルコシンを、保護基Ｚを導入しうる試薬と反応さ
   せることによって、サルコシンのアミノ基を保護し； ｉｉ）Ｌ−リシンを、ε−アミノ基を特異的に保護する
   ような方法で保護基Ｚ′を導入しうる試薬と反応させる
   ことによって、Ｌ−リシンのε−アミノ基を保護し； ｉｉｉ）段階ｉ）において生成せしめた保護したアルコ
   シンを、カルボキシル基におけるアミンによる求核的攻
   撃に関して活性化することにより、カルボキシ活性化し
   た保護したサルキシンを生成せしめ；そして ｉｖ）該カルボキシ活性化した保護したアルコシンを、
   上記段階ａ）ｉｉ）において生成せしめたε−保護した
   Ｌ−リジンと反応させ、それによってフラグメント I
   を生成せしめる ことによって生成せしめ； ｂ）Ｈ−ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２から成るフラグメン
   トIIを： ｉ）Ｚ″−ＧＬＮ−ＮＨ＿２を製造し； ｉｉ）核Ｚ″−ＧＬＮ−ＮＨ＿２から保護基を除去して
   保護してないＬ−グルタミンアミドを生成せしめ； ｉｉｉ）保護してないＬ−グルタミンアミドを、上記段
   階ａ）ｉｉｉ）において生成せしめたカルボキシ活性化
   した保護したアルコシンと反応させてＺ−ＳＡＲ−ＧＬ
   Ｎ−ＮＨ＿２を生成せしめ；そして ｉｖ）該Ｚ−ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２から保護基を除
   去し、それによってフラグメントIIを生成せしめる ことによって生成せしめ； ｃ）フラグメント I とフラグメントIIを結合させて保
   護したテトラペプチドＺ−ＳＡＲ−ε−Ｚ′−ＬＹＳ−
   ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２を生成せしめ； ｄ）該保護したテトラペプチドから保護基を除去し；そ
   して ｅ）生ずるテトラペプチドＨ−ＳＡＲ−ＬＹＳ−ＳＡＲ
   −ＧＬＮ−ＮＨ＿２を単離しそして精製する、 ことから成り、ここでＺ、Ｚ′およびＺ″はそれぞれ： ａ） ▲数式、化学式、表等があります▼、ここでＲ＿１はフ
   ェニル；トリル；キシリル；アダマンチル；アリル；β
   −シアノエチル、フルオレニルメチル；ベンジル；フェ
   ニル環がハロ、ニトロ、低級アルキルおよび低級アルコ
   キシから選ばれる１〜３員で置換されたベンジル；ジイ
   ソプロピルメチル；ジフェニルメチル；シクロヘキシル
   ；シクロペンチル；ビニル；ｔ−ブチル；ｔ−アミル；
   ジメチルトリフルオロメチルメチル；またはジメチルビ
   フェニルメチルである、 ｂ） ▲数式、化学式、表等があります▼、ここでＲ＿２は炭
   素数２〜４個の低級アルキルまたは１〜５個のハロ基で
   置換された炭素数１〜４個の低級アルキルである、 ｃ） ▲数式、化学式、表等があります▼、ここでＸはＳまた
   はＯであり、 そしてＲ＿３およびＲ＿４はそれぞれベンジルまたは低
   級アルキルである、 ｄ） ▲数式、化学式、表等があります▼、ここでＲ＿５およ
   びＲ＿６はそれぞれ独立に低級ルキルであるか、または
   Ｒ＿５およびＲ＿６は一緒になって▲数式、化学式、表
   等があります▼であり、 ここでＲ＿７およびＲ＿８はそれぞれ水素または低級ア
   ルキルである；および ｅ） ▲数式、化学式、表等があります▼、ここでＲ＿９は水
   素、メチル、 ハロまたはニトロである、 から成る群より選ばれる、但しＺは一座配位であるもの
   とする、 ことを特徴とするペプチドＨ−ＳＡＲ−ＬＹＳ−ＳＡＲ
   −ＧＬＮ−ＮＨ＿２の製造方法。 ２、Ｚ、Ｚ′およびＺ″が同一である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３、Ｚ、Ｚ′およびＺ″がそれぞれベンジルオキシカル
   ボニルまたはそれぞれトリフルオロアセチルである特許
   請求の範囲第２項記載の方法。 ４、段階ａ）ｉｉｉ）において生成せしめたカルボキシ
   活性化した保護したサルコシンが、保護したサルコシン
   の反応性エステルである特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ５、保護基を段階ｂ）ｉｉ）、ｂ）ｉｖ）およびｄ）に
   おいて接触水素添加によって除去する特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ６、ａ）ＣＢＺ−ＳＡＲ−ε−ＣＢＺ−ＬＹＳ−ＯＨか
   ら成るフラグメント I を： ｉ）ＣＢＺ−ＳＡＲ−ＯＨをジシクロヘキシルカルボジ
   イミドの存在下に当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミド
   と反応させることによってそれをエステル化してＣＢＺ
   −ＳＡＲ−ＯＳｕを生成せしめ；そして ｉｉ）モル的に僅かに過剰のＣＢＺ＾ε−ＬＹＳ−ＯＨ
   を２当量のトリエチルアミンの存在下にＣＢＺ−ＳＡＲ
   −ＯＳｕと反応させてＯＢＺ−ＳＡＲ−ε−ＣＢＺ−Ｌ
   ＹＳ−ＯＨ（フラグメント I ）を生成せしめる ことによって生成せしめ； ｂ）Ｈ−ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２から成るフラグメン
   トIIを； ｉ）ＣＢＺ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２を製造し； ｉｉ）接触水素添加によってベンジルオキシカルボニル
   基を除去してＨ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２を生成せしめ； ｉｉｉ）ＧＬＮ−ＮＨ＿２をモル的に過剰のＣＢＺ−Ｓ
   ＡＲ−ＯＳｕと反応させてＣＢＺ−ＳＡＲ−ＧＬＮ−Ｎ
   Ｈ＿２を生成せしめ；そして ｉｖ）接触水素添加によってベンジルオキシカルボニル
   基を除去してＨ−ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２（フラグメ
   ントII）を生成せしめる、ことによって生成せしめ； ｃ）当量の各フラグメントを１−ヒドロキシベンゾトリ
   アゾールおよびモル的に僅かに過剰のジシクロヘキシル
   カルボジイミドの存在下に混合することによって、フラ
   グメント I のカルボキシル末端とフラグメントIIのア
   ミノ末端を結合せしめ；ｄ）接触水素添加によってベン
   ジルオキシカルボニル基を除去して粗生成物を生ぜしめ
   ；そしてｅ）生ずるテトラペプチドＨ−ＳＡＲ−ＬＹＳ
   −ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２を単離しそして精製する ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のペプチド
   Ｈ−ＳＡＲ−ＬＹＳ−ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２の製造
   方法。 ７、段階ｅ）において生ずるテトラペプチドの精製が、
   該粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーカラム上
   で、本質的に純粋なテトラペプチドＨ−ＳＡＲ−ＬＹＳ
   −ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２を与えるのに有効な割合の
   脂肪族アルコール、低級アルカン酸および水から本質的
   に成る溶離剤を用いてクロマトグラフィーにかけること
   から成る特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、該溶離剤が１０：２：５の比率のｎ−ブタノール：
   酢酸：水である特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、段階ｃ）において得られる保護したテトラペプチド
   の再結晶による付加的な精製段階を含んで成る特許請求
   の範囲第６項記載の方法。 １０、該保護したテトラペプチドを、約１０：１の比の
   酢酸エチルとメタノールから本質的に成る溶媒から再結
   晶する特許請求の範囲第６項記載の方法。 １１、段階ｂ）ｉ）におけるＣＢＺ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２
   の製造が： ａ）Ｌ−グルタミン酸の両カルボキシル基を低級アルカ
   ノールによってエステル化してＬ−グルタミン酸ジエス
   テルを生成せしめ； ｂ）そのＬ−グルタミン酸ジエステルを塩化ベンジルオ
   キシカルボニルと反応させてＣＢＺ−ＧＬＵジエステル
   を生成せしめ；そして ｃ）ＣＢＺ−ＧＬＵジエステルを低級アルカノール中で
   アンモニアと反応させてＣＢＺ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２を生
   成せしめる 各段階から成る特許請求の範囲第６項記載の方法。 １２、段階ｂ）ｉ）におけるＣＢＺ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２
   の製造が： ａ）Ｌ−グルタミンを塩化ベンジルオキシカルボニルと
   反応させてＣＢＺ−ＧＬＮを生成せしめ；ｂ）ＣＢＺ−
   ＧＬＮをヒドロキシスクシンイミドと反応させることに
   よつてＣＢＺ−ＧＬＮ−ＯＳｕを生成せしめ；そして ｃ）ＣＢＺ−ＧＬＮ−ＯＳｕを低級アルカノール中でア
   ンモニアによって処理してＣＢＺ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２を
   生成せしめる 各段階から成る特許請求の範囲第６項記載の方法。 １３、ａ）Ｚ−ＳＡＲ−ε−Ｚ′−ＬＹＳ−ＯＨから成
   るフラグメント I を： ｉ）サルコシンを、保護基Ｚを導入しうる試薬と反応さ
   せることによって、サルコシンのアミノ基を保護し； ｉｉ）Ｌ−リシンを、ε−アミノ基を特異的に保護する
   ような方法で保護基Ｚ′を導入しうる試薬と反応させる
   ことによって、Ｌ−リシンのアミノ基を保護し； ｉｉｉ）段階ｉ）において生成せしめた保護したサルコ
   シンを、アミンによるカルボキシ基における求核的攻撃
   に関して活性化することによって、カルボキシ活性化し
   た保護したサルコシンを生成せしめ；そして ｉｖ）該カルボキシ活性化した保護したサルコシンを上
   記段階ａ）ｉｉ）において生成せしめたε−保護したＬ
   −リジンと反応させ、それによってフラグメント I を
   生成せしめる ことによって生成せしめ； ｂ）Ｈ−ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２から成るフラグメン
   トIIを： ｉ）Ｚ″−ＧＬＮ−ＮＨ＿２を製造し； ｉｉ）該Ｚ″−ＧＬＮ−ＮＨ＿２から保護基を除去して
   保護してないＬ−グルタミンアミドを生成せしめ； ｉｉｉ）その保護してないＬ−グルタミンアミドをサル
   コシンＮ−カルボキシ無水物と反応させ、それによって
   フラグメントIIを生成せしめることによって生成せしめ
   ； ｃ）フラグメント I とフラグメントIIを結合せしめて
   保護したテトラペプチドＺ−ＳＡＲ−ε−Ｚ′−ＬＹＳ
   −ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２を生成せしめ； ｄ）その保護したテトラペプチドから保護基を除去し；
   そして ｅ）生ずるテトラペプチドＨ−ＳＡＲ−ＬＹＳ−ＳＡＲ
   −ＧＬＮ−ＮＨ＿２を単離しそして精製する ことから成り、ここでＺ、Ｚ′およびＺ″はそれぞれ： ａ） ▲数式、化学式、表等があります▼、ここでＲ＿１はフ
   ェニル；トリル；キシリル；アダマンチル；アリル；β
   −シアノエチル、フルオレニルメチル；ベンジル；フェ
   ニル環がハロ、ニトロ、低級アルキル、および低級アル
   コキシから選ばれる１〜３員で置換されたベンジル；ジ
   イソプロピルメチル；ジフェニルメチル；シクロヘキシ
   ル；シクロペンチル；ビニル；ｔ−ブチル；ｔ−アミル
   ；ジメチルトリフルオロメチルメチル；またはジメチル
   ビフェニルメチルである、 ｂ） ▲数式、化学式、表等があります▼、ここでＲ＿２は炭
   素数２〜４個の低級アルキルまたは１〜５個のハロ基で
   置換された炭素数１〜４個の低級アルキルである、 ｃ） ▲数式、化学式、表等があります▼、ここでＸはＳまた
   はＯであり、 そしてＲ＿３およびＲ＿４はそれぞれベンジルまたは低
   級アルキルである、 ｄ） ▲数式、化学式、表等があります▼、ここでＲ＿５およ
   びＲ＿６はそれぞれ独立に低級ルキルであるか、または
   Ｒ＿５およびＲ＿６は一緒になって▲数式、化学式、表
   等があります▼であり、 ここでＲ＿７およびＲ＿８はそれぞれ水素または低級ア
   ルキルである；および ｅ） ▲数式、化学式、表等があります▼、ここでＲ＿９は水
   素、メチル、 ハロまたはニトロである、 から成る群より選ばれる、但しＺは一座配位であるもの
   とする、 ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のペプチド
   Ｈ−ＳＡＲ−ＬＹＳ−ＳＡＲ−ＧＬＮ−ＮＨ＿２の製造
   方法。 １４、ＺおよびＺ′が同一である特許請求の範囲第１３
   項記載の方法。 １５、ＺおよびＺ′がそれぞれベンジルオキシカルボニ
   ルまたはトリフルオロアセチルである特許請求の範囲第
   １４項記載の方法。 １６、段階ａ）ｉｉｉ）において生成せしめたカルボキ
   シ活性化した保護したサルコシンが保護したサルコシン
   の反応性エステルである特許請求の範囲第１３項記載の
   方法。 １７、保護基を段階ｂ）ｉｉ）およびｄ）において接触
   水素添加によって除去する特許請求の範囲第１３項記載
   の方法。