JPS6069030A - Ｂ型肝炎ウイルス感染に対するワクチン及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の属する技術分野〕 この発明は、Ｂ型肝炎ウィルス感染に対するワクチン及
び組成物に関する。この発明は、治療した患者において
、その患者のＢＷ肝炎ウィルス感染を予防し、少なくと
もその辛さを軽減するに効果的な力価でのＢ型肝炎つィ
ルスｅ抗原（以下、抗−ＨＢｅと記す）に対する抗体形
成を誘起する組成により特徴づけられるワクチン及び薬
剤として許用される組成物に特に関する。

また、この発明は、治療した患者において、上述の抗−
ＨＢｓと同様にＢ型肝炎ウィルスコア抗原（以下、抗−
ＨＢｃと記す）に対する抗体形成を誘起する組成により
特徴づけられる組成物及び方法にも関する。この発明に
関するワクチン及び組成物に続く開示から評価されるよ
うに、それらの使用方法は、Ｂ型肝炎ウィルス感染患者
の治療及びそれらの感染に対する一定期間の予防に有用
である。

〔従来技術〕

Ｂ型肝炎ウィルス（以下、ＨＢＶと記す）は、非常に早
い速度で人間に感染する。この病気は、世界中で２億人
に影響を与えている。例えば、米国の入口の４ｔ％は感
染していると推定され、アフリカ及びアジア諸国におい
ては、／ｊ％以上が感染しており、大人の人口の約１０
％が慢性的なＨＢＶ保持者として伝染している。

ＨＢＶ感染は、一般的には以下の３通りのメカニズムで
伝染する。（１）多量（輸血のような）な場合、及び少
量（偶然による皮）の切り傷のような）な場合のいずれ
においても、感染された血液または体液と・Ｇ接種、（
２）近親又は性的な接触、（３）母体から子へのウィル
スの伝染といった妊娠中の感染。

大部分のＨＢＶ感染は潜伏性であり、潜伏性及び臨床の
感染からは通常完全に回復する。しかしながら、るる場
合には長期にわたる重大な結果を引き起こす。（１）急
性）ＩＢＶ感染の約！チは、他の深刻な衰弱的な肝臓病
の感染への一定の可能性を持つ慢性ＨＢＶ感染となる。

（２）ＨＢＶの過去における感染は、電撃性肝炎、肝硬
変及び初期肝臓ガンの部分的または全体としてさえ原因
となるようでわる。例えば、初期肝臓ガンの通常の発生
率は／　：　１００，０００であるがｔ慢性的ＨＢＶ患
者の発生率は／：３００である。

その毒性と、慢性又祉致命的な肝臓病に関連したＨＢＶ
の広域にわたる発生によりその治療に関する問題は重大
となった。一定の危険が以下の場合に存在している。（
１）輸血を受ける人、血液透析おるいは腎臓透析をうけ
る患者及び病院収容者、（２）その家族、及び（３）医
療従事者（特に看護婦、外科医、歯医者）。したがって
、危険度の高い人を、一般大衆を予防すると同様に少な
くとも一定期間、Ｂ型肝炎ウィルス感染から予防するた
めのワクチンは最も重要である。

ゲイン粒子は、ＨＢＶの感染性ライロンと一致している
かめるいは関連していると思われてイア；５　（Ｄ、　
Ｓ、Ｄａｎｅ　ａｎｄ　Ｃ，Ｈ，Ｃａｍｅｔｏｎ　、”
Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　Ｉｎ　Ｓ
ｅｒｕｍ　ｏｆ　ＰａｔｉｅｎｔｓＷｉｔｈ　Ａｕ５ｔ
ｒａｌｉａ　−Ａｎｔｉｇｅｎ　Ａｓ５ｏｏｉａｔｅｄ
Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ″、　Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ；／、
ｐｐ、ＡＰｊ〜り♂（／り７０））。一般的に、ゲイン
粒子は、外層と内側のコアからなると思われている。粒
子の外層には、Ｂ型肝炎表面抗原（以下、ＨＢｓＡｇと
記す）として知られるポリペプチドが含まれているのが
一般的である。内側のコア（直径−２７ａｍ）には第２
のポリペプチドであるＢ型肝炎コア抗原（以下、ＨＢｅ
Ａｇと記す）長さの変化する７本鎖ギャップを含む内因
性２本鎖、環状で２−／　Ｘ　／　０６ダルトンのＤＮ
Ａ分子と同様に含まれて、いる。ディン粒子には、ＤＮ
Ａをプライマーおるいは型として使用したポリメラーゼ
反応により、内因性ＤＮＡ中の１本鎖ギャップに部分的
に近接したＤＮＡ依存型のＤＮＡポリメラーゼも含まれ
ていると思われる。

第３のポリペプチド、Ｂ型肝炎ｅ抗原（以下、ＨＢ　ｅ
　ｋｇと記す）ゲイン粒子に関連しているであろう。例
えば、ＨＢ　ｅ　Ａ　ｇはＨＢＶのＤＮＡポリメラーゼ
酵素（Ｊ、Ｌ、　Ｍｅｌｎｉｃｋ　ａｔ　ａｌ。

Ａｐｐｒｏａｃｈｉｎｇ　Ｔｈｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｏ
ｆ　ＶｉｒａｌＨａｐａｔｉｔｉｓ　Ｔｙｐｅ　Ｂ　”
　、Ｊ、ＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓＤｉｓｅａｇｅｓ、　／
ＪＪ　、　ｐｐ、コ１０〜ａｓ　、（ｔり７Ａ））。

ＩｇＧのイデイオ型（Ａ、Ｒ，Ｎｅｕｒａｔｂ　ａｎｄ
Ｎ、　８ｔｒｉａｋ　、　”Ｈｏ５ｔ　５ｐｅｃｉｆｉ
ｃｉｔｙ　６）Ｆ　ＡＳａｒｕｍ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｆｏ
ｒ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　：　Ｅｒ１ｄａｎｃｅＴ
ｂａｔ　Ｖｉｒｕｓ　ｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｈａｓ　Ｔ
ｈｅ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ小型のペプチドに関連した
Ｉ　ｇ　Ｇの２ｉｋ体（ｌ（、Ａ。

Ｆｉｅｌｄｉ　ａｔ　ａｌ、　”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ　ＡｎｄＰａｒｔｉａａｌ　Ｃｂａｒａｏｔｅｒｉ
ｔａｔｉｏｎ　Ｏｆ　）Ｉｅｐａｔｉｔｉｓｅ　Ａｎｔ
ｉｇｅｎ　”　、　Ｉｎｆｅａｔｉｏｎ　＆　Ｉｍｍｕ
ｎｉｔ　、２０゜ＰＰ、７タコ〜♂０３　（／り７ｔ）
）、乳酸脱水素酵素イソ酵素ＡｊＫ関連した組成物（Ｇ
、Ｎ、　Ｖｙａｓ　ｅ’ｔａｌ、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　
Ｂ　Ｖｉｒｕｓ　ｅ　Ａｎｔｉｇａｎ　：　ＡｎＡｐｐ
ａｒｅｎｔ　Ａｇ５ｏｏｉａｔｉｏｎ　Ｗｉｔｈ　Ｌａ
ｅｔａｔｅＤｅｂｙｄｒｏｇｅｎａｓａ　Ｉｍｏｅｎｚ
ｙｍｅ　Ｎｏ　ｊ　”　、　５ａｉｅｎａｅ。

／　５’ｇ　、　ｐｐ、／Ｉｔｇ〜７０（／り７７））
またはゲイン粒子及びチューブ形態表面における抗原性
マーカー（Ｎｅｕｒａｔｈ　ｅｔ　ａｌ　、　”　Ｉｄ
ｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ０ｆＡｄｄｉｔｉｏｎａｌ　
Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　５ｉｔｅ　Ｏｎ　ＤａｎｅＰａｒ
ｔｉｏｌｅｓ　Ａｎｄ　Ｔｈｅ　Ｔｕｂｕｌａｒ　Ｆｏ
ｒｍ　０ｆＨｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　５ｕｒｆａｏｅ　
Ａｎｔｉｇｅｎ　’　Ｊ、　Ｇｅｎｙ力り、３θ、ｐｐ
、、２７７〜ざｊ（ｌり７６））から様々に証拠付けら
れている。さらに最近になって。

ＨＢ　ｅ　Ａ　ｇは、）ＩＢｃＡｇ由来であると主張さ
れている（欧州特許用＃１ｌｔ７ｊｌＪりり。

ＨＢＶ感染により、ウィルスの抗原に対する抗体の発生
が引き起こされることは知られている。例えば、第３図
、欧州特許用ｙｍ７ｔ＋３り！参照。こうした抗原のｌ
である、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｇＡｇ）は、
ＨＢＶ感染を予防する抗体（以下、抗−ＨＢｓと記す）
の形成を誘起する能力があると思われている。ＨＢＶの
他の抗原（ＨＢｏＡｇおよびＨＢｅＡｇ）は。

）（Ｂ　Ｖ感染を防がない抗体（それぞれ抗−ＨＢ。

及び抗−ＨＢｓ）形成を誘起すると思われている。

例えば、欧州特許ｊｅｔａ参照のＨＢＶ抗原性組成物中
には、検出可能なＨＢａＡｇが存在すると記載されてい
ない。実際には、その抗原性組成物からＨＢｃＡｇを取
り除＜　％別な努力が払われている。同様に、ＨＢｃＡ
ｇはその欧州特許において、ＨＢＶ再感染を予防すると
いう単なる付加的な防護だけがＨＢ８ＡＫＫ基づく抗原
性組成物にはあると言われている。また、米国特許４Ｚ
、／　／　ｆｆ、弘７Ｆにオイ”ｒｔｔ、Ｔ（Ｂ　ｅ　
Ａｇ１ｄＨＢＶの多量服用患者への抗−ＨＢｓの防護効
果の表われを補足するだけでるると言われている。上記
のＮａｕｒａｔｈ　ａｔ　ａｌ　（／り７６）参照。従
って、ＨＢｓＡｇに基づいたＨＢＶワクチン創出のため
多大でかつ長年にわたる努力がなされている。

しかしたから、こうした努力は、ＨＢＶの持つ限られた
宿主範囲により制限されてきた。例えば１人への高い感
染性にもかかわらず、Ｂ型肝炎ウィルスによる実験的な
感染は、特別な霊長類でしか、大部分はチンパンジーで
あるが、得られていない。ウィルスを組織培養物で繁殖
させ１弱めることｉｊ：ｌｌいことでめる（米国特許ｕ
、３０　／、Ｊ　ｊ　Ｏ参照）。従って、現在利用でき
るＨＢＶに対するワクチンは、患者の血清から抽出した
ＨＢｓＡｇより作られるものでるる（米国特許Ｊ、Ｊ　
Ｊ　ｊ、／り／、！１，０／７ＪｌａＯ。

弘、ｊ　Ｏ／、２　ｊ　Ｏ参照）。ＨＢｓＡｇのこうし
た採取源は、そこからのＨＢｓＡｇの分取に使われる技
術同様、本来のＨＢｓＡｇに基づくワクチンの生産を５
時間のかかる高価なものにしている。例えば、血清は感
染性である。それゆえ、それについての作業は、その病
気に免疫された作業者により分離した場所でおこなわな
ければならない。さらに、血清由来のＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ
ワクチンはバッチごとにＨＢＶ感染性物質が存在してい
ないことを保証するためチンパンジーで厳密にテストし
なければならない。必要なＨＢ　ｚ　Ａｇ血清の供給に
も限界がある。従って、感染された血清由来のＨＢｓＡ
ｇｌ：対するワクチン線、限られた供給量で、非常に危
険な患者以外への使用を可能とするに拡高価すぎる価格
でしか利用できないのである。こうした供給量と価格と
いう短所に加え、血清由来のワクチンには、生きたウィ
ルス由来のワクチンによる治療は感染の危険があり、特
に血清由来組成物による治療は１少ないながらもその中
の血清由来の他の汚染物質による感染の危険性があるか
らという患者における嫌悪による使用拒否という短所も
ある。これらＫついては、ワクチンが血漿の高力価をめ
ており、そうした血漿が性病及び後天性免疫不全症（Ａ
ＩＤＳ）の高発生率な感染された人から得たものでるる
から特に現在関心をもたれている。最後に、患者のうち
のある程度の者は、血清由来のＨＢ　ｓ　Ａ　ｇワクチ
ンに対して敏感ではない。特に、Ｂ型肝炎ウィルス感染
の危険度の高い透析患者の２０〜３０％は、このワクチ
ンによって防ぐことができない。

血清由来のＨＢＶに対するＨＢｖワクチンのもつ固有の
短所を除く様々な試みの中で、組み換えＤＮＡ技術によ
って様々な宿主中でＨＢｓＡｇを生産することが試みら
れている。例えば、欧州特許出願／３１２１０ 組み換えにより生産され九ＨＢｓＡｇがチンパンジーに
おいてＢ型肝炎ウィルス感染に始する抗体（抗−ＨＢｇ
）を引き出し、ＨＢＶ＠染からチンパンジーを予防する
ことが示されたとしても（例えば、　Ｍｏ　Ｇｒａｙ　
−Ｈｉ　ＩＩ’ｓＢｉｏｔｅａｂｎｏｌｏｇｙ　Ｎｅ＋
ｒｓｖａｔｃｂ　、　Ｊ　、　ｐｐ　、　／＋％＋、２
（Ａｕｇｕｓｔ　／　、　／りｔ３））、そうした生産
物に基づくワクチンには、一般的に大衆に使用するには
短所が６る。例えば、大部分の宿主においては、ＨＢｓ
ＡｇをコードするＤＮＡ配列の発現レベルが所望の値よ
りも小さい。さらに、生産され７１ＨＢｓＡｇの免疫源
の活性のレベルが、使用に供される宿主に大部分依存し
ているように思われる。例えば、遺伝子工学的に生産さ
れた酵母は、免疫源組成物を生産するに最も好適な菌の
中にあると思われるが、こうした菌株は、現在、所望量
のＨＢｓＡｇを生産しない。さらに、組換えによるＨＢ
ｓＡｇワクチン杖、治療した患者を偶然感染させること
はできないにもかかわらず、これらはめる種の患者、特
に透析中の患者における上述の非敏感性を避けることが
できないのである。従って、Ｂ型肝炎ウィルス感染に対
するワクチンの他の採取源が研究されている。

〔発明の開示〕

この発明は、治療する患者にＢ型肝炎ウィルス感染を予
防するに効果的又虹少なくともその辛さを軽減するに効
果的な力価のＢ型肝炎つィルスｅ抗原に対する抗体形成
′ｆ：銹起する組成により特徴づけられるワクチン及び
薬剤として許用される組成物を提供することにより関連
する問題を解決することにある。こうしたワクチン及び
組成物＃ｉ、それらの使用方法同様に、Ｂ型肝炎ウィル
ス感染に対する患者の治療及びそうした感染に対する一
定期間の予防に有用である。

この発明の利点により、少なくともＢ型肝炎ウィルス感
染に対して一定の期間式を予防すること、又は少なくと
も期間と病毒性において。

その感染の辛さを軽減することを、医薬的に効果的な方
法で、ＨＢＶ感染から人を予防するに効果的な力価でＢ
型肝炎ウィルス６抗原に対する抗体（抗−ＨＢａ）形成
を誘起する組成により＠徴づけられるワクチン又は組成
物を患者に治療することＫよシ、予想外Ｋ、Ｌがも初め
て可能としたものである。また、この発明の方法及び組
成物は、治療した患者に上記抗−ＨＢｅ同様にＢ型肝炎
ウィルスコア抗原の抗体形成を誘起する組成によ仄特徴
づけられる。

さらに、この発明の他の利点としては、こうしたワクチ
ン及び組成物においては、ＨＢｓＡｇが存在する必要が
ない点である。

〔発明実施の最適な態様〕

ここに記載された発明をより十分に理解するために、以
下に詳細表記載を示す。

この記載においては、以下の語句を用いる。

ポリペプチド５ｌｌｌｉ接したアミノ酸のα−７ミノ基
とカルボキシル基間のペプチド結合により互いに連結し
たアミノ酸の線状列。

蛋白質：　約−ｔＱｔｆｃｈそれ以上のアミノ酸からな
るポリペ１チド。

抗　体：　外来蛋白質の出現により動物に作られる蛋白
質。抗体はその外来蛋白質と強く、特異的に結合する。

抗　原：　ｌまたは複数の抗体に結合されるポリペプチ
ドまたは蛋白質およびその部分。

血　清：　赤血球を除いた後の血液の分画。

なかんずく、抗体及び抗原を含む。

ＤＮＡ配列：　隣接したペントースの３′及び３′炭素
間のリン醗ジエステル結合により互いに連結したヌクレ
オチドの線状列。

発　現：　遺伝子からポリペプチド又は蛋白質を生産す
ることによりなされる過程であって、転写と翻訳とから
なる。

発現調節配列：　機能的にそうした遺伝子と連結した時
に遺伝子の発現を調節、制御するＤＮＡ配列。

クローニング担体またはプラスミド：ＤＮＡ配列で６っ
て、宿主細胞中でそれ自体蓼製し、ｌまたはいくつかの
工°ンドヌクレアーゼ認識部位により特徴づけられ、上
記部位にてこうしたＤＮＡ配列が基本的なそのＤＮＡの
持つ生物学的機能の補足的な欠損なく切られるものであ
って、形質転換前後におって、テトラサイクリン耐性、
アンピシリン耐性のような形質転換された細胞の同定に
利用できるマーカーを含むもの。

組み換えＤＮＡ分子：　通常では自然界において一緒に
は見出されない、少なくとも第１の配列と第コの配列と
からなるハイブリッドＤＮＡ配列。

すでに上述したように、ワクチン、薬剤として許用され
る組成物およびその使用方法は、この発明においては、
治療した患者において、Ｂ型肝炎ウィルス感染から少く
とも一定期間の間患者を予防し、少なくとも期間及び病
毒性においていかなるＨＢＶ感染の辛さを軽減するに効
果的な力価の抗−ＨＢｅの形成を誘起する組成により特
徴づけられる。

この発明での抗−ＨＢｅに基づくワクチンと組成物を特
徴づける抗−ＨＢａｔ−誘起する成分は利用できる多様
な採取源から選ばれる。例えば、それらは薬剤として許
容できる多様な組成物から選ばれ、患者へのｔｉたはそ
れ以上の治療により、要求される抗−ＨＢｅ力価を誘起
するに効果的なＨＢｅＡｇの血清学的変形を７００チか
ら最低の濃度まで含むものである。

こうした抗−ＨＢｅを誘起する成分は、　ＨＢａＡｇの
血清学的変形のいかなる前駆体を含む組成物由来のもの
でもよい。後者の場合には、前駆体からの所望の量のＨ
ＢｅＡｇへの変換は、薬剤として許用される方法により
、薬剤として許用されない副産物の同時生成なしになさ
れなければならないことを考慮されるべきである。それ
らはまたこの変換が好ましくはこの発明の組成物または
ワクチンが患者の治療に先立ってなされるにもかかわら
ず、この変換が生体内での代謝系の結果として患者にお
いてもなされることも考慮されるべきである。この場合
、使用に供される組成物は、代謝物として患者において
所望の抗−ＨＢａを誘起する組成物を生み出す前枢回薬
品のように作用する。

この発明のワクチンと組成物を特徴づける所望の抗−Ｈ
Ｂｅを誘起する成分へのＨＢｅＡｇの血清学的変形のい
かなる前駆体からの変換に有用な一般的な方法のうちで
、周知の特異的または非特異的蛋白分解的、解離的また
は酵素的分解方法がある。特有な方法は、前駆体及び特
有な組成物またはワクチンのための変換レベルによシ選
択された。

この発明において、抗−ＨＢｅを引き出す組成物の採取
源として有用な上述の組成物の実例としては、Ｉ（ＢＹ
感染患者の血清またはその血清からのディン粒子から分
離可能な多様なＨＢａＡｇ、ＨＢａＡｇである。例えば
、血清から精製されたＨＢＶコア粒子から解離したＨＢ
ｅＡｇ（Ｔａｋａｂａｓｂｉ　ａｔ　ａｔ、　Ｊ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、　／７．　ｐｐｔｏλ〜ｔｏｒ　（／り
７Ａ）Ｌ肝臓から精製された同様の粒子（Ｂｕｄｋｏｖ
ｓｋａ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

／２３．ｐｐ、／４Ａ／６〜／４ｔＩ＆　（／り７り）
　ｉ　Ｙｏｓｂｉｚａｖａａｔ　ａｌ、Ｊ、Ｇａｎ　Ｖ
ｉｒｏｌ、ｆ、２．ｐｐ　！／３−４／９゜（ｌり７り
））、プロナーゼによる処理によるもの（Ｂｕｄｋｏｗ
ｓｋａ　ｅｔ　ａｌ、同上）、プロナーゼと２−メルカ
プトエタノール（ｘ−ＭＥ）によるもの（Ｔａｋａｈａ
ｓｂｉ　ｅｔ　ａｌ　、同上）、ドブクル硫酸ナトリウ
ム（８Ｄ８　）と２−メルカプトエタノールによるもの
（Ｂｕｄｋｏｗｓｋａ　ａｔ　ａｌ　。

Ｔａｋａｈａｓｈｉ　６Ｌａｌ　、　Ｙｏｇｈｉｚａｗ
ａ　’ｅｔ　ａｌ　）超音波処理による破壊及び分散剤
による処理または塩化セシウム中での遠心分離による（
Ｈ。

０ｈｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ、Ａｎ１３ｇｅｎｉｃ　Ｃｏｎ
ｖｅｒ＋＋ｉｏｎＦｒｏｍ　ＨＢ　ｃＡｇ　Ｔｏ　ＨＢ
　ｅＡｇ　ｂｙ　ＤｅｇｒａｖａＬｉｏｎＯｆ　Ｈｅｐ
ａｔｉｔｉｓ　Ｂ　Ｃｏｒｅ　Ｐａｒｔｉａｌ＋＋＋’
ｌｎｔａｒｙｉｒｏｌｏｇｙ。

／Ｊ、ｐｐ７Ｆ〜Ｉλ（ｌりざ０））も＋７）２＞Ｅ報
告すｎている。しかし、血清由来のワクチンに関連した
問題により、こうした採取源はこの発明のワクチン及び
組成物には好適ではない。

好ましく蝶、この発明において有用な組成物は、形質転
換され、ＨＢａＡｇの抗原性を示すポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を発現する宿主（例えば、Ｂｕｒｒａ
ｌｌ　ａｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ。

λ７り、　ｐｐ、４ｔ３〜４１７　（／り７り）、；　
Ｐａ５ａｋ　ａｔａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、ＪＪＪ　、ｐｐ
　、ｊ７ｊ〜７Ｆ（／り７り））または形質転換され、
ＨＢｅＡｇの抗原性を示すポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を発現する宿主（例えば、欧州特許出願７ｊ、
３り３）の培養により調整することが望ましい。また−
カルボキシル末端の除かれたＨ　Ｂ　ａ　Ａ　ｇをコー
ドするＤＮＡ配列により形質転換された宿主も好適であ
る。こうした調整にはｅ抗原活性も含まれる。最終的に
好適なものは、ＨＢｅＡｇ抗原性を示すかまたはこうし
たＨＢｅＡｇ活性の前駆体である合成ペプチドである。

こうした組成物は、感染された患者の血清から成分を分
離する必要がなく、従って作業者のワクチン調整中の感
染またはそれらによる治療をうける患者の感染の危険が
なくなり、心配がなく好適である。

さらに好適なことに、抽出物にはＨＢ　ａ　Ａ　ｇ抗原
性を示す既に抽出可能なポリペプチドを高レベルで含有
しているから、形質転換され、少なくともＨＢ　ｏ　Ａ
　ｇの抗原性を示す７つのポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を発現する宿主の培養抽出物から、この発明の
組成物を調整できるものである。

さらに好適なことに、こうしたＨＢｅＡｇ含有抽出物は
、欧州特許出願７ｊ、３り３記載の方法またはすでに利
用された同様の方法の１つにより処理されることである
。こうした方法には、例えば、Ｂ型肝炎ウィルスコア抗
原の抗原性を示すポリペプチドの発現により特徴づけら
れる宿主の培養抽出物の調整及びこの抽出物の還元剤中
での還元剤−抗プロチアーゼによる分解も含むものであ
る。この処理により抽出物のＨＢ　ｃ　Ａ　ｇの１部ま
たは全てがＨＢｅｋｇ抗原性を示すポリペプチドへ変換
する。代わシに、より濃縮され精製された培養抽出物で
の、少なくともＨＢ　ｃ　Ａ　ｇの抗原性を示すポリペ
プチドの１部分をＨＢｅＡｇの抗原性を示すポリペプチ
ドへの変換紘、解離的な条件下１例えばＳＤＳや同様な
争件での還元剤によるものが効果的である。結局、５Ｄ
Ｓｑ単独で、全体的または部公的変換に有利のため使用
することができる。

上述の方法における還元剤−抗プロチアーゼは、例えば
プロナーゼ、サブチリシン、パパイン、キモトリプシン
、ブロメリン、トリプシン、チルモリシン、プロテアー
ゼに１カルボキシペプチダーゼＡ１カルボキシペプチダ
ーゼＢのよう外、広く知られた多様なプロテアーゼの中
から選ばれるものでるる。同様に、還元剤も、例えば、
コーメルカブトエタノール（、ｚＭＥ）、ジチオスレイ
トール（ｄＴＴ）、ジチオエリスリトール、チオグリコ
しノート、グルタチオン。

ホウ酸水素ナトリウムのような周知の還元剤から選べる
ものである。ＨＢ　ｃ　Ａ　ｇの部分的または全部のＨ
ＢｅＡｇへの変換のだめの様々な試薬の量は、簡便な血
清試験によるこの技術分野における技術により決められ
る。こうした変換過程によりＨＢ　ｃ　Ａ　ｇの分解生
成物が生じ、その内にはＨＢｅＡｇ活性が存在すると思
われる。

それゆえにこりした活性の高い生成物は、ＨＢｅ　Ａｇ
の多様な血清学的変形を表わしているもので必る。

抗−ＨＢｅ形成を誘起する他の組成物を生成する多様な
組成物と処理方法を秒り示するために、表Ｉに多様な組
成物により処理し７た兎の一連の＼　へ　も　４′＋６
　喝　へ　喝　喝　ト　ヘ　ト　＼宿主と発現ベクター
は、上述の培養抽出物を生成するための多様なものが使
用される。例えば、周知の発現ベクターのすべてが使用
されるだろう。こうしたものには、染色体、非染色体お
よび合成りＮＡ配列の部分由来のベクターも含まれ１例
えば公知の５ｖ−ａｏ由来のもの、細菌のプラスミド、
例えばＢ、ｃｏｌｉ由来のプ２ｘ　ミ）”、ｌ！：　し
てｏｏｌＥ／　、ｐＣＲ／　、ｐＢＲＪ、２．２　。

ｐＭＢりおよびその誘導体が、広宿主域グラスミドとし
て、例えばＲＰＦ７アーシＤ　Ｎ　Ａ　ｓ　例えばファ
ージλの多数の誘導体、例えばＮＭＰざり及びその他の
ＤＮＡファージ、例えばＭ／Ｊ及び糸状１本鎖ＤＮ人フ
ァージ及び例えばファージＤＮＡ又は発現調節配列又は
λμプラスミド又はその誘導体のような酵母プラスミド
を用いるよう修正されたプラスミドとファージＤＮＡを
結合した誘導体ベクターが用いられる。

こうしたベクターは様々な発現調整配列により特徴づけ
られる。例えば、オペレーター、プロモーター及びＥａ
ｏｌｉのラクトースオペロン（ｌａｏシステム）のリボ
ゾーム結合及び相互作用配列（例えば、シャインーダル
ガーノ配列を含む）ｂＥｏｏｌｉのトリプトファン合成
システム（ｔｒｐシステム）の同様な配列、７アージλ
の主要ナオペレーター、プロモータ一部位（上述のＤＬ
ＰＬ及びＤＲＰｎ）ｂ糸状１本鎖ＤＮＡファージの調節
部位、または真核、原核細胞、ウィルスまたはそれらの
結合したものの遺伝子の発′ｆＪｌを調節するその他の
配列が含まれる。

同様に周知の宿主が用いられる。例えと１それらには、
Ｂａｏｌｉ　ＨＢ／　０／　、　Ｅ　ａｏｌｉ　Ｘ／７
７６゜Ｅ　ｏｏｌｉ　ＸＪＪ＆　、２　、　Ｂ　ｏｏｌ
ｉ　ＭＲＣ／　、及びＰｇｅｕｄｏｍｏｎａｓ　、　Ｂ
ａｃｉｌ］ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｊｓ、　Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ＋１ｕｓ　のような細
菌類、及びその他の細菌、放ＭＩＩ、酵母及びかび、動
物（人を含む）又は植物細胞のような培養中の動。

植物細胞又はその他の宿主が含まれる。もちろん、全て
の宿主ベクター系が同等に十分であるわけではない。

全ての宿主ベクター系が与えられるＤＮＡ配列の発現の
ため同等に機能しないとしても、宿主クローニング担体
系の選択は、この発明の範囲から逸脱しない範囲でこの
技術分野で十分に認められている理論を用いる技術によ
りなされる。

上述の抗−ＨＢｅを誘起する成分に加えて、この発明の
ワクチンと組成物は他の成分を含むものでわることが理
解されるべきである。こうした他の成分としては５例え
ば、治療する患者に抗−ＨＢｅ６るいは抗−ＨＢｓある
いは両方の形成を誘起するものである。例えば、この発
明の好適な具体例は、上述の抗−ＨＢｓの効果的力価に
加え、抗−ＨＢｏの形成を誘起する組成物により特徴づ
けられる。しかしながら、抗−ＨＢｓを誘起する成分は
ＨＢＶの予防のためＫこの発明のワクチン、組成物、及
びその方法において必要でないことはこの発明の驚くべ
き重要な特性である。ＨＢ　ａ　Ａ　ｇの供給の限界及
びある種の患者におけるＨＢｓＡＨへの非敏感性の観点
からみて、このこと紘この発明における４Ｈｌすべき重
要な利点である。

この発明の組成物は、その免疫源的特性を高め、患者へ
の耐薬量を改善する調整中に他の成分を含み、他の治療
へも用いられることかめる。

例えば、ワクチンに一時的に用いられる多様な薬剤とし
て許用されるアジュバント及び他の化合物が用いられる
。現在、みょうばんが好適でｂる。さらに、ミ・セル形
成のような様々な処理がこの発明のワクチン及び組成物
の調整と関連して有効に用いられる。

この発明のワクチンと組成物は、皮下注射あるいは筋肉
内注射により投与される。好適には、筋肉内注射が用い
られる。投与の頻度は、ワクチンの組成及び治療される
患者により決まる。

しかしながら、６ケ月から７年での効能促進剤に引き続
き、ｌケ月間隔での１回まｆｃＬコ回の投与で十分であ
ろう。投与量は、治療される患者の大きさと状態による
。また、引続いての投与または効能促進剤の必要性杖最
初の免疫化の結果としての抗−ＨＢｅ力価のレベルによ
り決まる。

この発明をより十分に理解する丸めに、以下に実施例を
示す。これらの実施例、条件及び手順は例示の目的に限
られるものである。

実施例１ この実施例は、この発明の組成物のＨＢｃＡｇ抗原性を
示すポリペプチドを発現し、形質転換された宿主の菌抽
出物の使用に関する。

この実施例では、　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ／Ｊ株ＨＢ１０／
（Ｈ，Ｂｄｙｅｒ　ａｎｄ　Ｄ、　Ｒｏｎｌｌａｎｄ　
−Ｄｕｓ＊ｏｉｘ　。

Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、ＩＩ／　、ｐｐ　弘！ターフ
２（ｌり６り））をプラスミドｐＨＢＶ−ＲＩ−／／に
より形質転換し、ＨＢｏＡｇの抗原性を示すポリペプチ
ドの生成に用い冬。このポリペプチドは、この発明のワ
クチン、組成物及び方法を特徴づける抗−ＨＢｅを誘起
する成分として用いられる。

適当な宿主内にてＨＥｏＡｇの抗原性を示すポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列を発現するプラスミドｐＨＢ
Ｖ−ＲＩ−／／れ、以下のようにして作製した。Ｐａｔ
　Ｉによる切断部位上にＨＢ　ｃ　Ａ　ｇ遺伝子すべて
をコードするプラスミドｐＨＢＶ／ＪＦＡを持っＥｓｃ
ｂｅｒｉａｂｉ６ｃｏｌｉＫ−／λ株ＨＢ／Ｑ、の／ｌ
培養を（Ｍ。

Ｐａ５ｅｋ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｎａｔｕｒｅ　、＋２Ｌ
２　、ｐｐ　！７ｊ−７Ｆ（／Ｐ７Ｆ））０．Ｄ、／ｊ
！０＝／、０’Ｊで培饗し。

得られた細胞からグラスミドをり、ＣＩｅ＊・ａｌｌ　
。

Ｊ、Ｂａｏｔｅｒｉｏｌ、、ｌｌ０　、ｐｐ、ｌｔ７〜
７Ａ（／り７コ）の方法により分離した。得られた精製
ｐＨＢＶ／３Ｐｋプラスミド６０μｇをＰｇｔＩ　ｌユ
ニットを用い、１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ＰＨ７，Ａ
）、ｊｍＭ　ＭｇＣｌ！２、／ｍＭジチオスレイトール
（ｄＴＴ）、ｊ　ＯｍＭ　ＮａＣ／中で３７℃にてｌ晩
分解する。分解されたプラスミドは、調整されたｌチポ
リアクリルアミドグル上にて電気泳動をうけ、割出され
たＨ　Ｂ　ｃ　Ａ　ｇをコードする配列を含むＤＮＡ断
片は、ＵＶシャドウィングによりゲルより再生し、Ａ、
Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｗ。

Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｍｓｔｂｏｄｇ　Ｅｎｚ　ｍす、、
ｊ、ｔ、ｐｐ４ＡＰＰ〜ｚＡＯ（／Ｙ♂Ｏ）の記載のよ
うに溶出する。

分離したＤＮＡ断片の末端は、コ。ｍＭトリス塩酸緩衝
液、　／　２　ｍＭ　ＣａＣｌ２．　／　２　ｍＭ　Ｍ
５ＩＣ／２、Ａ　ＯｍＭ　ＮａＣｌ　％／　ｍＭエチレ
ンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ　）　０．６　ｔｔｒ
ｌ中のエキソヌクレアーゼＢＡＬＪ／にて分解する。反
応は等量のフェノールによる抽出で停止させる。ｏｏ、
２μｐの旦狸ＲＩ又はＨｉｎｄ　［１リンカ−（制限酵
素旦臼ＲＩ。

Ｈｉｎｄｌｌそれぞれの認識部位をコードする）をｌユ
ニットのポリヌクレオチドキナーゼを用い、Ａ、Ｍａｘ
ａｍ　ａｎｄ　Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ　、　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　Ｅｎｚ　ｒｎｏｌ、。

６ｊ、ｐｐＨ夕５’　〜５ｔｏ（／ｙｔｏ）に記載され
たようにアデノシン３燐酸（ＡＴＰ）とγ−３．２ｌ−
ＡＴＰが１：／の割合の１０μｌ中にてリン酸化させる
。

リン酸化しラベル化されたリンカ−は、ｏ、λμｐのＢ
ＡＬＪ／分解断片と、ｌユニットのりガーゼを用い、ｊ
ＯｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ）Ｉ７．６）、ｔ　ＯｍＭ
　ＷＨ／Ｃ１２，／　ＯｍＭ　ＤＴＴ。

／ｍＭ　ＡＴＰよりなる結合用緩衝液コ。Ｍ中で１時間
／ｊ℃にて反応させる。結合は上記のように７エノール
抽出により停止され、生産物は１０ユニツトの−Ｅｏｏ
ＲＩまたはＨｉｎｄ　ｌｌ１（適宜）及びＩＯユニット
の垣ＨＩにて、ｔＯｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，ｊ
　）　、　ｊ　ＯｍＭ　ＮａＣ１゜ｊｍＭ　Ｍ９Ｃ１２
ｂ／ｍＭ　ｄＴＴ、及び０．／ｊチドリトンＸ−１００
からなる緩衝液りＯμｌの添加により一晩、３７℃にて
分解される。試料は１分間卓上医療用遠心分離器にてｌ
Ｏ，ｍＭトリス塩酸緩衝液（ＰＨＩ）、ｉ　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ中のコシのセファデックスＧ−ｊｏを通して遠心さ
れる。クローン化した遺伝子の発現に適したＥｃｏ　Ｒ
Ｉ及びＥＩｉｎｄ［ｌの制限部位を有するクローニング
担体である。ｐＥｘｌａａ　／！０プラスミド０．２μ
９をＨ，Ｗｅｉｂａｒ、論文Ｕｎｉｖａｒｓｉｔｙｏｒ
　Ｈｅｉｄｅｌｂａｒｇ　（／　Ｆｒ　Ｏ）　Ｏ記載Ｋ
ｊ５作製し、上述のｐＨＢＶ／ＪりＡのように分離し、
上述の緩衝液ｌＯμｌ中にて、ｌユニットのＢａｏＲＩ
また蝶Ｊ暉」■及び１５Ｈ！にて分解し、上記調整した
断片をクローニング担体中へ、結合緩衝液−〇μｌ中の
ｌユニットのりガーゼを用い室温にて参時間反応させ、
挿入する。

Ｅｓｏｂｅｒｉｃｉａ　ａｌ１．１Ｋ−１−菌ＨＢｉｏ
ｉは、上記調整した組換えプラスミドにょシ、Ｍ、Ｍａ
ｎｄｏｌａｎｄ　Ａ、Ｈｉｇａ　、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ
ｌ、、！３　、ｐｐ、／６ター／Ａ、２（／り７０）の
方法を用いて形質転換される。形質転換体は、ｚｏｔ＃
／ｍｌアンピシリンへの耐性を、栄養寒天プレート中で
調べ選択し、ＨＢ　ａ　Ａ　ｇの抗原性を示すポリペプ
チドの発現は、Ｓ、Ｂｒｏｏｍｓ　ａｎｄ　Ｗ、Ｇ目ｂ
ａｒｔ、　Ｐｒｏｏ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ　）　、　７１　、　
ｐｐ　Ｊ７’１６〜ＩＩり（／Ｐ７Ｉｒ）に記載された
方法、めるいはＣ，Ｂｕｒｒｅｌｌ。

ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、＋２７２．ｐｐ４ｔ３〜弘
ｒ（ｔり７り）の方法によシスクリーニングされる。

こうしたポリペプチドを発現する宿主の７つに含有され
、ｌ＠ＨＢＶ−Ｒ１−ｔｌと名付けられり（Ｅｃｏ　Ｒ
Ｉのリンカ−を含有）組み換えプラスミドは、ＨＢＶ　
ＤＮＡとｐＥＸｌａｃ　／！０のβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子の融合する部位において、　Ａ、Ｍａｘａｍ　ａ
ｎｄ　Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙ
ｍｏｌ、、Ａｊ　、ｐｐ　４Ａタタ〜ｊ６０（／りｔｏ
）の方法により配列される。ヌクレオチド配列は、Ｅｏ
ｏＲＩリンカ−によりコードされる３ケのアミノ酸によ
ｌＨＢｃＡｇの３ケのアミノ酸がβ−ガラクトシダーゼ
のにケのアミノ酸と融合していることを表わしている。

ＨＢ　ａ　Ａ　ｇの抗原性を示す生産物は、人肝臓より
分離し、本来のＨＢＶコア粒子に類似の粒子形成のため
集められる生産物を生産するために、ｐＨＢＶ−Ｒ／−
／／により形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ−／２　Ｈ
Ｂ１０／を培養することにより調整した。（−８，５ｔ
ａｂｌ　ｅｔ　ａｌ、”ｆ−ＩｅｐａｔｉｔｉｓＢ　Ｖ
ｉｒｕｓ　Ｃｏｒｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ、　Ｉｔｒ＋　５
ｙｎｔｈｅｓｉｓＩｎ　Ｅｓｏｂｅｒｉａｂｉａ　ｃｏ
ｌｉ　ａｎｄ　ＡｐｐｌｉｏａｔｉｏｎＩｎ　Ｄｉａｇ
ｎｏｓｉｓ”、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）、７り、ｐｐ／Ａ０６〜１０（ｉ９ざ／）及
びＲ３ｏｂｍｏｎｄ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、　Ｎａｔｕ
ｒｅ、　、２りｔ。

ｐｐ＋６７〜Ａ♂（ｌり♂−））。

培養物の抽出は、ＨＢｃＡｇの抗原性を示すポリペプチ
ドの実質的に純粋な試料に、やや大規模な、超遠心分離
、クロマトグラフによる排除、及び他の精製ステップの
結合による調整が適用される。こうした調整により兎に
おいては抗−ＨＢｅ及び抗−ＨＢｏを誘起している。表
１ｔ−参照。抗−ＨＢｅの存在により、培養あるいは精
製中、または多分生体内での代謝によりＨＢｃＡｇの調
整により少なくともある程度はＨＢｅＡｇ抗原性を示す
ポリペプチドを含有する組成物に変換したことを意味す
るものと思われる。こうした調整がリムラス試験により
発熱源のないものであることが示された。

この発明に従い、公認のＨＢＶ研究のだめの動物試験及
びＨＢＶ感染に対する予防を強調するチンパンジーへの
接種のため組成物を調整し、Ｅ、ａｏｌｉ　Ｋ／２　Ｈ
Ｂ１０／　（ｐＨＢＶ−Ｒ／−／／）の培養物を用いる
。上述のように、この菌株はＨＢｏＡｇを示すポリペプ
チドを特異的に生産する。

ポリペプチドを培養物から分離し、それらを精製するた
めに、多様なりロマトグラフ、ｒ過、抽出、沈殿ステッ
プの組合せが使われる。すべては周知の精製技術である
。　・ 例えば、そうした菌株からの培養抽出物からこうしたポ
リペプチドの組成物を低速遠心分離により細胞破砕物を
除き（１００００ｒｐｍ、　／　０分）、（ＮＨ４）２
８０４　（、ｔ　ｊチ飽和）溶液により沈殿させ、ＰＢ
Ｓ緩衝液で溶解し、透析、セファローズ４ｃ１３カラム
により分画し、ＨＢｃＡｇ活性分画を（ＮＨ４）　２８
０４により沈殿させ、前記のようにＰＢＳで溶解し、透
析することにより調整する。

しかしながら、ＨＢａＡｇ抗原性を示すポリペプチドの
粗い調整のものであっても、この発明の組成物と方法に
あっては同様に有効であるから、この発明の組成物の調
整においては、多少大規模な精製体系でもよいかもしれ
ないことを考慮すべきでおる。必要なことは、活性な抗
−ＨＢａを誘起する成分又はその前駆体が十分な量であ
って、調整において、治療する患者に抗−ＨＢａの十分
な力価が形成されればよい。このことに関して、ＨＢａ
Ａｇの粗調整品を使用することは、こうした調整品には
すでに抗−ＨＢａを誘起する成分の高レベルのものが分
解生成物として含まれているから好適である。

接種するために、上述の精製体系により調整した調整品
を用い、ＰＢＳ緩衝液に溶解し、等量のｔ　Ｍ　ＮＨ４
ＨＣＯｓ　、及び最終体積と等量の７０％みょうばんと
をグ℃にて混合する。溶液を遠心分１１％　（２０００
ｒｐｍ、　７０分、＜ｃ’ｃ）ｌ、た後、上述のＮＨａ
ＨＣＯｓと１０％みょうばん溶液にて洗浄し、再び遠心
分離し、ＰＢＳにペレットを分散させ２〜λ、ｊゴとす
る。得られた調整品は一７０℃にて貯蔵する。

接種のために、上述の調整品を溶解させ、７００４ｇの
ＨＢ　ｃ　Ａ　ｇ含有の試別を２匹のチンパンジーに対
して筋肉内注射した。

傘　抗−ＨＢｅの効果的力価が表われるに十分な）ｆＢ
ｅを含む調整品でるることを確めるために、高レベルの
ＨＢ　ｃ　Ａ　ｇを用いた。抗−ＨＢｅを誘起する成分
の濃度に応じて、低いレベルをも用いる。接負における
実際のＨＢｅＡｇ濃度は、こうした測定がＨＢ　ｃ　Ａ
　ｇのもとでは難しいことから測定しなかった。

チンパンジー　性別　生年月日　体重 Ｇｖａｎ　雌　ｌり７Ｊ、Ｌ♂　４（７ＫｐＲｉｎｋａ
　＠　／り７／　、１　、Ｊ７　！　ＪＫＰＧｖａｎは
、≠ケ月あけてこの発明の組成物を一回接種された。Ｒ
ｉｎｋａは、最初は３週間、次いで７ケ月の間隔でこの
発明の組成物の注射を３回受けた。同−回においては、
同一の組成物を用いた。

ＨＢＶｉＣさらされた経験を持たない２匹のチンパンジ
ーを対照として用いた。

チンパンジー　性別　生年月日　体重 Ｐｅｔｅｒ　雄　ｌり７ｇ、ハ２６　λＩＫｙＦｒａｎ
ｋｊｅ　＄　７２７６．１１．６　３４（Ｋｐ≠匹のチ
ンパンジーに対してＨＢＶ血清型ａｙｗ　（ＲｏＨ，Ｐ
ａｒｃｅ１１氏より寄贈）のｊＸ１０感染量を皮下注射
により接種した。ＧｗｅｎとＲｉｎｋａはこの発明の組
成物の注射を受けて３０日後にウィルスを接種した。

第１図および第２図に参照されるように、血清の変換分
析（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗−ＨＢｇ。

抗−ＨＢｅ、抗−ＨＢｃ）をこのμ匹のチンパンジーの
血清を１週間ごとに採取して行なった。

第１図に示すように、上述のように、この発明の組成物
を接種したチンパンジーは異なる反応を示した。Ｒｉｎ
ｋａには、ただちに抗−ＨＢｃ力価が顕著に出現したが
、抗−ＨＢｅ力価は検出できなかった。Ｇｗｅｎ　ｌｃ
線、　Ｒｉｎｋａと同様にただちに抗−ＨＢｏ力価が顕
著に出現したが、抗−ＨＢｅ力価も低いながらも認めら
れた。両方とも抗−ＨＢｏ力価を数ケ月にわたり保持し
ていた。グケ月の叩隔の後の調整品の付加的な接種によ
る重大な増加は認められなかった。Ｇｗｅｌの抗−ＨＢ
ａ力価はλ回目の接種後に幾分増加したが、　Ｒｉｎｋ
ａには検出できる変化は認められなかった。

また、第１図に示すように、ＨＢＶ血清型ａ’ｙｙ接種
後の、抗−ＨＢｅ力価を顕著に有するチンパンジーＧｗ
ｅｎは、何ら感染の徴候を示さず、何ら抗ゲネミア（ａ
ｎｔｉｇｅｎｅｍｉ’ａ　）も１抗体レベルの重大な変
化ももたらさなかった。

＊　オランダｂＴＮＯ，霊長類センターでのここ数年の
ワクチンの評価で、こうした検討が目打なわれ、ＨＢＶ
接種をうけ感染しなりままの比較の動物は残っていなか
った。

結局、Ｇｗｅｎは抗−ＨＢｓ力価を出現し始めた（第１
図には図示せず）。

Ｊ（ＢＶ血清型ａｙｖｒの接種後、顕著な坑−ＨＢａ力
価を示さないチンパンジーＲｉｎｋａは軽微で一時的な
感染をうけた。激烈でなく、シかも短期間のこの感染は
、Ｒｉｎｋａの中でウィルス複製の短いバーストが起こ
ったものと推定される。

第１図に示すように、複製のバーストはＨＢｓＡｇの温
和な合成を招き、しかしＨＢｏＡｇの合成を招かず、抗
−ＨＢｓ、特に抗−１１Ｂａで急激に押し上げることに
なる。第一図に示すように、２匹の対照のチンパンジー
では病毒性）Ｉ　Ｂ　Ｖ感染が出現している。

こうした結果は、仁の発明の組成物により引き出される
抗−ＨＢｅが、しかも抗−ＨＢｓの存在なしにＨＢＶ感
染を予防しｂ　Ｒｉｏｋａのような低いレベルであって
も少なくともＨＢＶ感染の病毒性と進行を弱めるという
予想外のしかも驚くべきことを強調している。例えば、
この発明の組成物による処置をうけた後、抗−ＨＢａが
低いながらも検出可能なレベルのＧｖａｎは。

ＨＢＶ感染とウィルス複製から予防できた。他方、　Ｒ
ｉｎｋａはこの発明の組成物による処置の後、最初は抗
−）ＩＢｅｆ）ｌｌｌ察できるレベルの抗−ＨＢａを示
さなかった。しかしながら、　Ｒｉｎｋａにおける抗−
ＨＢｅ力価の急激な上昇及びＨＢａＡｇ合成の欠除を考
率すると、接種後にＲｉｎｋａ　ｉｊ最初は例え観察さ
れなくともこの発明の組成物にょシ引き出された抗−Ｈ
Ｂｓ力価が低レベルで持っていたものと思われる。この
低レベルの力価は、　Ｒｉｎｋｓを予防するに十分で社
なかったが１顕らかにＲｉｎｋｓに起こるその後のＨＢ
Ｖ感染の激烈さを軽減した。

実施例コ この実施例は、形質転換されＨＢ　ｏ　Ａ　ｇ抗原性を
示すポリペプチドを発現する宿主の菌体抽出物からｉｌ
ｌ！！したこの発明の組成物のうちの、活性抗−ＨＢｅ
を引き出す成分の濃度を上げるための５ＤＳｉたＪｄ、
８Ｄ８及びコーメルカブトエタノール（，２ＭＥ）の使
用に関する。

この実施例においては、実施例１における記載と同様に
Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ／Ｊ　ＨＢｔＯ／　（ｐＨＢＶ−Ｒｔ
　−ｔ　ｔ　）より調整したＨＢｏＡｇを用いた。

しかしながら、この実施例においてｉ、ＰＨ６中の調整
品を／％ＳＤ８または１％ＳＤ８及び２チメルカプトエ
タノールにて３７℃で一定時間（，２時間弱）処理し、
少なくとも抽出物中のＨＢ　ｃ　Ａ　ｇ活性の一部をＨ
Ｂ　ｅ　Ａ　ｇ活性に変換した（例えば、欧州特許出願
７３，３り！参照）。

その後、接極前に、ＰＨ６中の調整品を０．Ｉ　Ｔ。

ＳＤＳに希釈した。

接種のために、再びｉｏｏｔｔｇのＨＢ　ａ　Ａ　ｇ含
有調整品を用−た。８Ｄ８がろるゆえに、みようばんは
用いなかった。

上述の処理の結果、こうした試料には比較的高ＩＩＩ度
のＨＢａＡｇが含まれる。これらを接種されたチンパン
ジーは抗−ＨＢａの高力価を出現させた。こうした力価
はＧＷ６ｎで見られたものの２倍以上であり、こうした
力価のレベルでめるから、チンパンジーはＨＢｖから予
防されると思われる。

結局、こうしたチンパンジーに対して、以下のように調
整した効能促進剤（１００μｇ、ＨＢａＡｇ／みようｄ
ん）を接種した　Ｈ’ｒＡｃプロモーターの調節を除い
て上述と同様に調整したＨ　Ｂ　ａ　Ａ　ｇをダ、よＭ
尿素中のトリプシン（ｊ多重量）にて夛解し、ＳＤＳな
しでＨ，Ｂ　ａ　Ａ　ｇをＨＢｅｋｇに変換する。反応
分解物を重炭酸緩衝液（−タ、≠）、セファクリルｊコ
ＯＯ（ファルマシア）のゲル濾過によシ分画し、ＢＰＳ
中で透析した後、前記のようにみようｄん上に沈殿させ
る。この効能促進剤は、チンパンジーにおいて抗−ＨＢ
ａの高力価をもたらした。その後、上記のように、チン
ノくンジーにＢｆｉ肝炎ウィルスを接種した。

第３図を参照すると、ウィルス接Ｍｌ、２匹の動物（人
とＢ）から週ごとに採血し、血清試料中の血清変換分析
（ＨＢｅｋｇ＋抗−）ＩＢ−抗−１（Ｂｅ、抗−ＨＢｏ
）を描いた結果がわかる。

第３図に表われたように１チンノシンジ−Ａの抗−ＨＢ
ａ及び抗−ＨＢｅの力価は、接種後数ケ月にわた９減少
している。しかしながら、チンノくンジーＡは、この発
明の組成物によりＨＢＶ感染から予防できると強調する
ＨＢｓＡｇ（図示せず）−！たは抗−１（Ｂｓの出現が
みられなかった。

チンパンジーＢにおける抗−ＨＢｏと抗−ＨＢｅとが接
種後徐々に減少した。しかじな力（ら、接種後約ｔ００
日において、抗−ＩｉＢｅ力価の上昇と１弱いながらも
短期間（１日間）にわたるＨＢａＡｇ（図示せず）の力
価の出現がみらオした。結局％ＨＢｓＡｇ力価は観察さ
れな力λつたが。

抗−ＨＢａはみられた。こうした結果は、１ｉｎｋａと
同様に、この発明の組成物が部分的にチンノくンジーを
Ｂ型肝炎ウィルス感染よシ予防したことを意味している
。

この発明の幾つかの具体化をここまでに示してきたが、
この発明の方法を利用する他の異体化では基本的な構成
が変わることは明らかである。それゆえに、ここまでに
実施例として示した特異的な具体化よりも、むしろ特許
請求の範囲によシこの発明の範囲を定義することが適当
であると思われる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明に従い組成物を接種し、ＨＢＶ血清型
ａｙｖの静脈注射により接種したチンパンジーＧｗ　ｅ
　ｎとＲｉｎｋａから毎週採血し、血清試料の血清変換
分析（ＨＢ　ｍ　Ａｇ　、　ＨＢｅＡｇ　。 抗＝ＨＢｓ、抗−ＨＢｅ、抗−ＨＢｏ）ｌ、た結果を日
数を横軸として示す。 第２図はこの発明に従った処理をせず、　ＨＢＶ血清型
ａｙｗの静脈注射により接種したチンパンジーＰｅｔａ
ｒとＦｒａｎｋｊｅから毎週採血し、血清試料の血清変
換分析（ＨＢ　ｍ　Ａｇ　、　ＨＢ　ａ　Ａｇ　。 抗−ＨＢｓ、抗−ＨＢｅ、抗−ＨＢ　ｏ　）　Ｌ７を比
較実験の結果を日数を横軸として示す。 第３図はこの発明に従−組成物を接種し、ＨＢＶ血清型
ａｙＷの静脈注射により接種したチンパンジーＡとＢか
ら毎週採血し血清試料の血清変換分析（ＨＢａＡｇ、抗
−ＨＢｓ、抗−ＨＢｅ。 抗−ＨＢＯ）した結果を日数を横軸と“して示す。 図中、ＯはＨＢｓＡｇ、・はＨＢｅＡｇ、Δは抗−ＨＢ
ｓ、ムは抗−ＨＢｅ、ｘは抗−ＨＢｏを表わす。 第１図における　、　はこの発明の組成↓　↓１↓ 物による処理を表わす。 特許出願人　バイオジエン　ナームローズベンノクトシ
ャップ ゴ二　糸ダ９　ネ市　−ｔＪ下　７片（方ｊＯ■漆ＩＪ
５９年７０刀３０１１ ね詐庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示 １１７、ｊｌＪ　５　！］イＩ”ｔｊｒｔｉ’ＦＩＭＪ
Ｉ　第１　Ｇ　７９５０５；’２、発明の名称 ３、補正をする壱 事件との関係　ｑ）詐出騨しＸ 名称ハイオシ１．ン　ナー１％　ｌ：Ｉ　ズ　ヘンノア
１ツヤ、プ（国？１シ）　（オーンンダ領）′ンヂル）
４、代理人 、λ・１．篠ｒへ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　治療する患者において、ＢＷ肝炎ウつルスｅ抗
   原に対する抗体を、Ｂ型肝炎ウィルス感染に対して一定
   の期間患者を予防するに効果的な力価又はその患者のＢ
   型肝炎ウィルス感染の辛さを軽減するに効果的な力価で
   の形成を誘起する成分により特徴とする薬剤として許用
   される組成物。 （２）Ｂ型肝炎表面抗原又はその前駆体が欠除している
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の組成物。 （３）Ｂ型肝炎ウィルス感染に対して一定の期間治療す
   る患者を予防するに効果的な力価である特許請求の範囲
   第１項又は第２項記載の組成物。 （４）Ｂ型肝炎つィルスｅ抗原に対する抗体力価の形成
   を誘起する成分が、患者へのｌ乃至複数回の治療の後に
   該抗体力価を誘起させるに効果的な、Ｂ型肝炎ｅ抗原の
   血清学的な変形のいずれかを１００％から最低の濃度含
   む薬剤として許用される組成物からなるグループより選
   ばれる特許請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記
   載の組成物。 （５）　薬剤として許用される組成物が、形質転換され
   、少なくともＢ型肝炎ウィルスコア抗原の抗原性を示す
   １つのポリペプチドをコードする配列または少なくとも
   Ｂ型肝炎ウィルスＣ抗原の抗原性を示す１つのポリペプ
   チド配列からなるグループよシ選ばれるＤＮＡ配列を発
   現する宿主の培養抽出物から調整される特許請求の範囲
   第ｖ項記載の組成物。 （６）形質転換され、Ｂ型肝炎ウィルスコア抗原の抗原
   性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現す
   る宿主の培養抽出物を酵素的又は蛋白分解的に処理し、
   少なくともＢ型肝炎ウィルスコア抗原の抗原性を示すボ
   リペプチドの１部分をＢ型肝炎つィルスｅ抗原の抗原性
   を示すポリペプチドへ変換する特許請求の範囲第５項記
   載の組成物。 （力　上記処理が生体外で行なわれ、該処理が還元剤の
   存在下での還元剤−抗プロチアーゼによるかまたは解離
   条件下での還元剤によるかまたはドデシル硫酸ナトリウ
   ムによるかのいずれかのうちから選択されるものでるる
   特許請求の範囲第６項記載の組成物。 （８）薬剤として許用される組成物がＢ型肝炎つィルス
   ｅ抗原の抗原性を示すｌまたは複数の合成ポリペプチド
   から調整された特許請求の範囲第５項記載の組成物。 （９）治療する患者においてＢ型肝炎つィルスｅ抗原に
   対する抗体の形成を特徴とする特許請求の範囲第１項か
   ら第１項のいずれかに記載の組成物。 αＩ　％許請求の範囲第１項から第２項で定義した組成
   物により治療する段階を特徴とするＢ型肝炎ウィルス感
   染に対する患者の治療方法。 住υ　Ｂ型肝炎ウィルス感染に対して一定の期間治療す
   る患者を予防する特許請求の範囲第１０項記載の方法。