JPH01199575A - 新規なサイクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はデンプンからβ−サイクロデキストリン（以下
β−ＣＤと略す）を優先的に生成する新規なサイクロマ
ルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ
，２，４、■、１９、Ｃｙｃｌｏｍａｌｔｏｄｅｘｔｒ
ｉｎ　ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、以下Ｃ
Ｇ　Ｔａ５ｅ　と略す）並びにその製造法に関する。

更に詳しくは、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）　　に属する新規な中等
度好熱性細菌を培養して得られ、デンプンもしくはその
部分加水分解物からβ−ＣＤを優先的に生成し、該ＣＤ
を主成分とする糖質を生成する新規なＣＧ　ＴａＳｅ及
びその製造法に関する。

（従来の技術） ＣＧ　Ｔａ５ｅ　は、デンプン、アミロース、アミロペ
クチン、グリコーゲンなどのα−１，４−グルカン及び
それらの部分加水分解物中のα−１，４−グルコピラノ
シド結合に作用してサイクロデキストリン類（以下ＣＤ
ｓ　と略す）を生成するＣＤ生成反応、そしてＣＤｓを
開裂して蔗糖やマルトースなどの糖残基受容体に転移す
るカップリング反応及び種々のマルトオリゴ糖量の分子
間転移反応により種々の重合度を異にするマルトオリゴ
糖を生成する不均化反応を触媒する酵素である。また、
ＣＤＳ　はグルコース６分子から構成されるα−ＣＤ　
（シクロへキサアミロース）、７及び８分子から成る（
β−ＣＤ（シクロヘプタアミロース）及びγ−ＣＤ（シ
クロオクタアミロース）などが良く知られているが、こ
れらのＣＤｓ　以外にもＣＤ、分子内のグルコースの６
位の炭素原子からα−１，６−グルコピラノシド結合で
分岐した分岐ＣＤ、も工業的に製造されている。

これらのＣＤ、は分子内に疎水性の空洞を有する王冠状
の特異的な構造から、その空洞内に種々の有機化合物（
ゲスト化合物）を取り込み包接化合物を形成して該ゲス
ト化合物□の物性、例えば、熱や酸素あるいは紫外線に
対する安定性、水や各種溶媒に対する溶解性などを改善
する効果を有する。そのため食品分野ばかりでなく医薬
品、化粧品、農薬その他の工業分野で広く用いられてい
る。

これらのＣＤＳは先にも述べたようにＣＧ　Ｔａ５ｅを
デンプンなどのα−１，４−グルカンもしくはその部分
加水分解物に作用させることにより各種ＣＤ、　とマル
トオリゴ糖の混合物として得られるが、ＣＤＳ　の生成
量や各ＣＤの生成比は使用するＣ　Ｇ　Ｔａ５ｅの起源
により若干異なると言われている。現在までにいくつか
の微生物がＣＧ　Ｔａ５ｅの給源として見出されている
がバチルス属に属す微生物が比較的良くこの酵素を生産
し、例えば、バチルス・マセラ７　ス（Ｂ、　ｍａｃｅ
ｒａｎｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｆｒｙ。

７巻、１１４頁、１９６８年、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、。

３８巻、３８７頁、１９７４年、及び同、３８巻、２４
１３頁、１９７４年）、バチルス・サーキュランス（Ｂ
、　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、アミラーゼシンポジウム、８
巻、２１頁、１９７３年）、バチルス・メガテリウム（
Ｂ、ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、　Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ１３８巻、３８７頁、１９７４年及び同、３
８巻、２４１３頁、１９７４年）、バチルス・ステアロ
９４７３３５号、Ｊ、Ｊａｐ、　Ｓｏｃ、　５ｔａｒｃ
ｈ　Ｓｃｉ、、　２９巻、７頁、１９８２年）あるいは
好アルカリ性ハチ）ｌｉミス菌（Ｄｉｅ　Ｓｔａ’ｒｋ
ｅ、　　２７巻、４１０頁、１９７５年、Ａｇｒｉｃ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　　４０巻、９３５頁、１
９７６年及び同、４０巻、１７８５頁、１９７６年）な
どが良く知られている。

また、バチルス属以外の細菌では、タレブシエラ・ニュ
ーモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ、八ｒｃｈ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　　１１１巻、２７１頁、
１９７７年、Ｃａｒｂｏｈｙｃｌｒ、Ｒｅｓ、、　７８
巻、１３３頁、１９８０年及び同、７８巻、１４７頁、
１９８０年）がＣＧ　Ｔａ５ｅを生産することが報告さ
れている。これらの給源を異にするＣ　Ｇ　Ｔａ５ｅ　
は、デンプンからの反応初期生成物によりα−ＣＤ型と
β−ＣＤ型とに大別され、バチルス・マセランス（Ｂ、
　ｍａｃｅｒａｎｓ）　　やタレブシエラ・ニューモニ
エ（Ｋ、　ｐｎｅａｍｏｎｉａｅ）　　のＣＧＴａｓｅ
　はα−ＣＤ型であり、バチラス・サーキュランス（Ｂ
、　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・メガテリウス（
Ｂ、　ｍｅｇａｔｅｒ　ｉｕｍ）　　あるいは好アルカ
リ性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　属細菌などはβ−
ＣＤ型と報告されている。また、バチルス・ステアロサ
ーモフィラス（Ｂ、　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）の生産するＣ　Ｇ　Ｔａ５ｅのデンプンに対す
る反応最終生成物中のＣＤ８組成はβ−ＣＤ＞α−ＣＤ
＞Ｔ−ＣＤと報告されているが反応初期産物はα−ＣＤ
であるので本酵素はα−ＣＤ型に分類するのが妥当と思
われる（特許第９４７３３５号、Ｊ、Ｊａｐ。

Ｓｏｃ、　　５ｔａｒｃｈ　Ｓｃｉ、、　　２９巻、１
３頁、１９８２年）。

さらに最近、ｒ−ＣＤ生成型のＣＧ　Ｔａ５ｅ　も発見
されているが、デンプンからのｒ−ＣＤの生成率は極端
に低く、工業的意味は殆んど無いと思われる（＃粉科学
、３３巻、１３７頁、１９８６年、特開昭６１−２７４
６８０号）。

（発明が解決しようとする課題） 先にも述べたようにＣＧ　Ｔａ５ｅ　はその起源により
ｐＨや温度に対する挙動を異にするばかりでなく、デン
プンからのＣＤｓ　の生成量や各ＣＤの生成比なども異
にするため使用目的に応じて適宜使い分けるのが便利で
ある。しかし酵素反応の至適温度や至適ｐＨあるいは温
度やｐＨに対する安定性が適度に優れたものが工業的に
は使用しやすい。一般にデンプン糖の生産に用いられる
アミラーゼなどの酵素類の至適温度は６５〜７０℃、至
適ｐＨは４．５〜６．５の弱酸性が好ましいとされてい
る。至適温度を６５〜７０℃とする理由は、反応中に微
生物汚染が発生するのを防止するためである。微生物汚
染は、それに起因する反応液のｐＨ低下を補償するため
力性ソーダなどのアルカリ剤が多量必要となり以後に行
なう糖液の脱塩や脱色などの精製操作に多くの費用と技
術的困難をもたらす。また、至適温度や温度安定性があ
まりにも嵩い場合には反応槽の保温や酵素の失活処理に
膨大なエネルギーを要するため、これも経済的でない。

さらに、至適ｐＨがアルカリ性にある場合には酵素反応
時に副次的に起る異性化反応や着色などが結果的に生産
物の減少や精製操作の煩雑化などを引き起すし、経済的
に問題がある。

以上述べたように工業用酵素として有用なＣＧ　Ｔａ５
ｅ　の具備すべき性質はデンプンからのＣＤ、の収量が
高いことは当然のことながら、使用しやすい適度な至適
温度、至適ｐＨ及び温度安定性を有していることが重要
である。そこで、本発明の目的は、デンプンからＣＤｓ
　を安価かつ高い生産性で製造し得るβ−ＣＤ型のＣＧ
　Ｔａ５ｅを提供することにある。即ち、反応途中での
雑菌汚染を防止できる６５℃前後の至適温度を有し、８
０℃前後で容易に失活し、かつ至適ｐＨが弱酸性である
β−ＣＤのＣＧ　Ｔａ５ｅを提供することにある。

さらに、本発明の目的は上記の如き性質を有する新規な
ＣＧ　Ｔａ５ｅを製造する方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明は以下の理化学的性質を有するＣ　Ｇ　Ｔａ５ｅ
に関する。

（イ）作　用 デンプンやグリコーゲンなどのα−１，４−グルカン及
びそれらの部分加水分解物中のα−１，４−グルコピラ
ノシド結合を切断転移しサイクロデキストリン順を生成
し、該糖鎖転移反応の初期生成物がβ−サイクロデキス
トリンである。

（口〉基質特異性 マルトトリオース以上の重合度を有するα−１，４−グ
ルコピラノシド結合からなるマルトオリゴ糖に作用し、
基質相互の分子間糖鎖転移反応により重合度を異にする
各種マルトオリゴ糖及びサイクロデキストリン類を生成
する。

（Ｊｌ）至適ｐＨ約６．５ （二〉安定ｐＨ４０℃、２時間の条件下でｐＨ６〜９で
安定である。

（ホ）作用適温　　　約６５℃ （へ）失活条件　　　４０℃、２時間の条件下ではｐＨ
４，５及び１１．５で完全に失 活し、ｐＨ６，１５分間の条件 下で７５℃で完全に失活する。

（ト）温度安定性　　ｐＨ６，１５分間の条件下で５０
℃まで安定であり、６０ ℃及び７０℃での残存活性は それぞれ９５％、及び２０％ Ｉ である。

（チ）阻害化　　　　２価の水銀及び銅で阻害される。

（す）活性化及び安定化 カルシウムで安定化される。

（ヌ）分子量（ＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法）、　　３６，０００　±Ｌ　０００（ル）等電点
（クロマトフオーカシング法）４．８　±０．１ 本発明のＣＧＴａｓｅ　は例えば土壌中から採取した中
等度好熱性細菌であるバチルス・コアギュランス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）　　に属するｃＧ
Ｔａｓｅ生産菌［ＹＨ−１３０６（ＦＢＲＭ、　　Ｎｏ
、　−９７３５）：］を培養することにより培養物中に
生成蓄積されたＣ　Ｇ　Ｔａ５ｅを採取することにより
製造される。

本発明の方法において使用できる前記ＣＧ　Ｔａ５ｅ生
産菌株は本発明者により新たに検索単離されたものであ
り、バージニーズ・マニュアル・オブ・システマティッ
ク・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’　ｓＭａｎｕａ
］　　ｏｆ　　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ）　第　１　巻（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ａｎ
ｄ　Ｗｉ１ｋｉｕｓ社刊、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ／Ｌｏｎ
ｄｏｎ　）及びザ・ジーナス・バチルス（Ｔｈｅ　Ｇｅ
ｎｕｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ。

米国農務省列）に従って同定すると好気性有胞子桿菌で
運動性が有り、周鞭毛を有し、ダラム氏染色陽性である
ことからバチルス属に属す細菌であると同定した。さら
に、６５℃で生育せず３０〜６０℃で生育し、０．０２
％窒化ソーダ存在下で生育でき、また尿素からアンモニ
アを生成しないこと、及びジヒドロオキシアセトンを生
成することからバチルス・コアギュランスに属するもの
と同定した。

一方、特許第９４７３３５号中にはバチルス・ステアロ
サー％　７　、ｔラス（Ｂ、　Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ）に属するＣ　Ｇ　Ｔａ５ｅ生産菌の一
種（ＦＥＲＭ　　Ｐ−２２１９）が６０℃で生育し、６
５℃では生育しないことが記載されている。しかし、本
発明のＣＧ　Ｔａ５ｅ生産菌であるＹＨ−４３０６菌は
３％食塩存在下で生育すること、無機窒素源を利用しな
いこと、あるいは胞子のうの形状などがＦＢＲＭ−２２
１９菌とは異なるため新菌株である。さらには、後述す
るようにＹＨ−１３０６菌により生産されるＣＧＴａｓ
ｅの酵素化学的諸性質や基質特異性に関しても特許第９
４７３３５号中に記載されているＣ　Ｇ　Ｔａ５ｅ　と
は大きく異なっていることからＹＨ−１３０６菌は、新
菌株と考えられる。

また、ＹＨ−１３０６菌はアルカリ性条件下では生育で
きずクエン酸も資化できないことから好アルカリ性バチ
ルス属菌やバチルス・メガテリウム（Ｂ、　ｍｅｇａｔ
ｅｒ　ｉｕｍ）　　とは異なる。さらに、グルコースよ
り酸を生成しガスを生産しないこと、あるいはカゼイン
を加水分解することなどからバチルス・マセランス（Ｂ
ｏｍａｃｅｒａｎｓ）　　やバチルス°サーキュランス
（Ｂ、　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）とは明らかに異なる。以
上のことから本発明の分離菌株はバチルス・コアギュラ
ンス（Ｂ、　ｃｏａｇｕｌａｎｓ）に属する菌株と認め
た。

以下の第１表に単離したＹＨ−１３（１６菌の菌学的諸
性質を示す。

第１表　ＹＨ−１３０６菌の菌学的性質１．形態学的性
質 ダラム氏染色陽性の桿菌（０，７〜１．０μ×２〜４μ
）で運動性が有り周鞭毛を有す。胞子のうは膨らんでい
ないかもしくはわずかに膨らんでおり、胞子（０，９〜
１．０μ×１．５〜２．０μ）は末端もしくはやや末端
側に有りだ円状を呈す。

２、各種培地での生育 肉汁寒天平板培養コ黄色を呈し、円形状の集落を形成す
る。表面の隆 起は頭状を呈す。

肉汁寒天斜面培養：拡幅状に生育する 肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンを液化しない。

リドマスミルク：　酸を生成し凝固しない。

肉汁液体培養： ０．５％ＮａＣｆｆ１：白濁し、沈渣を生ずる３％Ｎａ
ＣＲわずかに生育する ５％ＮａＣｊ！ニー ０．０２％アザイド：十 ３、生育のｐＨと温度 生育ｐＨ：ｐＨ５，８〜７５（生育至適ｐ８６．５〜７
．０） 生育温度＝３０〜６０℃（生育至適温度４５〜５０℃） ４、生化学的性質 硝酸塩の還元　　　　　　　　　− 脱窒反応　　　　　　　　　　　− メチルレッドテスト　　　　　　− ＶＰテスト　　　　　　　　　　　− ＶＰブロスでの酸の生成　　　　士 尿素からのアンモニアの生成　　− インドールの生成　　　　　　　− 硫化水素の生成　　　　　　　　− ジヒドロオキシアセトンの生成　十 チロシンの分解　　　　　　　　− クエン酸の利用　　　　　　　　− カゼインの加水分解　　　　　　十 デンプンの加水分解　　　　　　士 ゼラチンの液化　　　　　　　　＋ 無機窒素源の利用　　　　　　　− 色素の生成　　　　　　黄色の色素を産生ウレアーゼテ
スト　　　　　　　十 オキンダーゼテスト　　　　　　− カフラーゼテスト　　　　　　　＋ クルコースからのガスの生成− 糖からの酸の生成 グルコース　　　　　＋ アラヒ゛ノース　　　　＋ 乳　　　　　糖　　　　　　　　− マンニトール　　　　＋ ５、その他の性質 ＯＦテスト　　酸化的 酸素に対する態度 好気く嫌気条件下でもわずか に生育する） ＣＣ含量　　　４６±１％（ＨＰ　Ｌ　Ｃ法）十：陽性
もしくは良く生育する ｍ：陰性もしくは生育しない なお、上記菌は工業技術院微生物工業研究所にＰＥＲＭ
　　Ｐ　−９７３５として寄託されている。

本発明の新規なＣＧＴａｓｅ　につきさらに詳しく説明
する。上記のバチルス・コアギュランス（Ｂ、　ｃｏａ
ｇｕｌａｎｓンに属するＣ　Ｇ　Ｔａ５ｅ生産閑をｐＨ
５，８〜７．５好ましくはｐＨ６，５〜７．０に調整し
た適当な培地に接種し、３０〜６０℃好ましくは４５〜
５０℃にて３０〜８０時間好気的に培養することにより
培養液中に菌体外分泌型酵素として該ＣＧ　Ｔａ５ｅが
生成蓄積される。

本発明に用いられる培地には安価に人手し得る公知の各
種材料を使用することができる。例えば、窒素源として
は、コーン・ステイープ・リカー、ポリペプトン、大豆
粕、フスマ、肉エキス、酵母エキス、アミノ酸液などで
あり、炭素源としては、水飴、マルトース、各種デンプ
ン、可溶性デンプン、デンプン液化液、デキストリン、
プルランなどである。

また、これらの炭素源や窒素源の他に各種の塩、例えば
マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩等の無機
塩や各種ビタミン類を必要により添加する。

本発明の上記方法において使用するのに適した培地は、
例えば５％コーン・ステイープ・リカー、０．１％に２
８ＰＯ，，０，０２％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，０、００
５％ＣａＣｊ！　２・２Ｈ２０を含有する液体培地であ
る。

本発明において有用な前記ＣＧ　Ｔａ５ｅ生産菌（ＦＢ
ＲＭ−Ｐ　９７３５　）は菌体外分泌型の酵素を産生ず
る。培養後培養上清中に蓄積される菌体外分泌型酵素は
、粗酵素として遠心分離により菌体を除去することによ
り得られる。粗酵素液はそのまま用いることが経済的で
有利である。しかしこれをさらに精製して使用すること
もできる。精製のために、例えば硫安等による塩析、エ
タノール、アセトン、インプロパツール等による溶媒沈
澱法、限外濾過法、イオン交換樹脂等による一般的な酵
素精製法を用いることができる。

以下に、本発明のＣＧ　Ｔａ５ｅの好ましい製造法を１
例を挙げて更に詳しく説明する。

中等度好熱性細菌バチルスＹＨ−１３０６菌株を例えば
１％可溶性デンプン、５％コーン・ステイープ・リカー
、０．１％に２ＨＰＯ，，０，０２％Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ
２０、Ｏ，ＯＯ５％ＣａＣ１２２・２Ｈ２０を含む培地
に植菌し、４５℃にて７２時間、通気量ｌ　ｖ、　ｖ、
　ｍ、　。

２５　Ｏｒ、ｐ、ｍで好気的に培養して得られる培養液
を１０．００　Ｏｒ、ｐ、ｍ、　４℃にて連続遠心して
菌体を除き、上澄液（粗酵素液）を得る。次いで該上澄
液に固型硫酸アンモニウムを添加し、２０％飽和とし、
これをとうもろこしデンプン層に通して酵素を吸着させ
た後、４０ｍＭ！Ｉン酸２ソーダ溶液を用いて抽出する
。抽出した溶液は平均分画分子１１０．０００の限外濾
過膜を用いて濃縮した後、１ｍＭｃａｃｊ！２を含むｌ
ＱｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）に対して一夜４℃で透
析する。透析により生じる沈デンは遠心分離により除き
、得られる上澄液を例えば１ｍＭｃａｃＡ２を含む同上
緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−）コパール６５０Ｍカラ
ムに吸着させ、Ｏ−０，７ＭのＮａＣ１を含む上記と同
様な緩衝液の濃度勾配法によって酵素を溶出させる。溶
出した活性画分を集め、前述と同様の限外濾過膜を用い
て濃縮した後、０．１Ｍ食塩を含む上記酢酸緩衝液で平
衡化したセファクリルＳ−２００カラムに重層し、同上
緩衝液を用いて溶出する。

溶出した活性画分を集め、前述の限外濾過膜を用いて濃
縮した後、ショデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）　　Ｗ　Ｓ−
２００３カラムを用いる高速液体クロマトグラフ法にて
再度クロマトグラフィーに付して活性画分を集める。か
くして得られる精製酵素はポリアクリルアミドゲルディ
スク電気泳動（ゲル濃度７．５％）的に単一であり、活
性収率は約２５％である。

さらに、ＣＧＴａｓｅの活性測定法並びに活性表示法は
、金子らの方法（Ｊ、Ｊｐｍ、　Ｓｏｃ、　５ｔａｒｃ
ｈ、Ｓｃｉ、。

３４巻、４５〜４８頁、１９８７年）によりフェノール
フタレインを用いるβ−ＣＤの合成活性を測定した。

即ち、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０＞に溶解させた
４％（Ｗ／Ｖ）　の可溶性デンプン溶液１，０−に酵素
液Ｑ、ｌ＋ｎｊ！を混合し、６０℃で２０分間反応させ
た後、３０ｍＭ　ＮａＯＨ溶液３．５−を加えて反応を
止める。次いで、５　ｍＭ　Ｎａ２ＣＯ３溶液に溶解さ
せた０、０２％（Ｗ／Ｖ）フェノールフタレイン溶液０
．５　ｍＩｌを添加し、同時に処理した１、０ｍｌの０
．５ｍｇ／−のβ−ＣＤ溶液を標準とし、その着色度を
クレットーサマーソン（Ｋｌｅｔｔ−３％ｍｉｎｅｒｓ
ｏｎ）型光電比色計フィルターＮｏ、５４　（５５０ｎ
ｍ）を用いて測定する。酵素活性の単位は前述の条件下
で１分間に１ｍｇのβ−ＣＤ生成に相当する吸光度の減
少を行なう酵素量を１単位とする。本発明の方法によっ
て得られるＣ　Ｇ　Ｔａ５ｅの理化学的、酵素化学的諸
性質と従来公知の細菌由来のＣＧ　Ｔａ５ｅ　との比較
を第２表に示す。

本発明のＣＧ　Ｔａ５ｅは第２表に示すように、デンプ
ンからの初期産物に於いてバチルス・ステアロサーモフ
ィラス（Ｂ、　Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ）
やバチルス・マセランス（Ｂ、’ｍａｃｅｒａｎｓ）　
　のＣＧ　Ｔａ５ｅ　と異なる。また、反応終了時の生
成したＣＤ組成から好アルカリ性バチルスの酵素とも異
なる。

一方、バチルス・メガテリウム（Ｂｏｍｅｇａｔｅｒ　
ｉｕｍ）のＣＧ　Ｔａ５ｅ　は初期生成物や最終のＣＤ
組成に関して本発明のＣＧ　Ｔａ５ｅ　と同一であるが
、ｐＨや温度に対する挙動が大きく異なっている。工業
的意味から考えるとα−ＣＤの製造にはバチルス・マセ
ランス（Ｂ、　ｍａｃｅｒａｎｓ）　　の酵素が、そし
てβ−ＣＤとγ−ＣＤの製造には好アルカリ性バチルス
由来の酵素が適しているが至適温度や温度安定性に問題
がある。

α、β、Ｔ型の各ＣＤをバランス良く製造するにはバチ
ルス・メガテリウム（Ｂ、　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）　
　やバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂ、　Ｓｔｅ
ａｒｏ−ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣＧＴａｓｅは
適していると考えられるが、バチルス・メガテリウム（
Ｂ、　ｍ’ｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の酵素は至適温度や温
度安定性に若干の問題点を有しており、反応槽内での微
生物汚染を十分に防止し得ない。一方バチルス・ステア
ロサーモフィラス（Ｂ、　Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）の酵素は至適温度は高く温度安定性に於い
ても非常に優れている。

一般に至適温度や温度安定性は基質不存在下あるいは稀
薄状態で測定しているが、実際の製造現場では経済性の
見地から１０−２０％（Ｗ／Ｖ）の濃厚な基質を用いて
酵素反応を行う。かかる場合、酵素は基質の保護作用に
よりさらに安定化されるのが一般的であり、ＣＧ　Ｔａ
５ｅ　もこの例外ではなく、安定温度は基質不存在下で
測定された値よりもさらに高いものとなる。ＣＤ、　は
デンプンにＣＧ　Ｔａ５ｅを作用させた後結晶化や膜分
離法、あるいはイオン交換樹脂やゲル濾過樹脂を用いる
各種クロマトグラフィーにより精製されるのが一般的で
あるが、ＣＧ　Ｔａ５ｅ反応終了後においても反応液中
には該酵素の基質特異性に起因してかなり高分子のデキ
ストリンやマルトオリゴ糖が残存している。これらは、
脱塩や濾過などの精製操作を事実上不可能ならしめるの
で各種α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラ
ーゼ、α−１，６−グルコシダーゼなどのデンプン分解
酵素を作用させてこれらを加水分解して低分子化し、反
応液の粘性を低下させている。この際、ＣＤ、生成反応
に使用したＣ　Ｇ　Ｔａ５ｅの活性が残存している場合
には先に述べたＣ　Ｇ　Ｔａ５ｅの基質特異性により生
成したＣＤ、をさらに加水分解し、糖液中のＣＤＳ量が
減少する結果となる。以上の理由から各種デンプン分解
酵素によるＣＤ以外のデキストリンやオリゴ糖の再糖化
時にはＣＧ　Ｔａ５ｅを完全に失活させる必要がある。

この際、ＣＧ　Ｔａ５ｅの失活に酸やアルカリ剤を用い
ることは加水分解や異性化などの望ましくない副次的な
化学反応が起るだけでなく、再糖化時には再度、アルカ
リ剤や酸を添加して再糖化に使用する酵素の至適ｐＨま
で再調整する必要があることがら脱塩・脱色などの精製
に多大なエネルギーと労力がかかり経済的でない。その
ため、−船釣にＣＧ　Ｔａ５ｅの失活には加熱失活が用
いられているがＢ、ステアロサーモフィルス（Ｂ、Ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　のＣＧ　Ｔａ５
ｅのように温度安定性が高すぎる場合には該酵素を完全
に失活させるために多大な熱エネルギーが必要となり、
これもまた経済的でない。かかる見地から本発明にかか
るＣＧＴａｓｅは反応槽内の微生物汚染を防止し得る適
度な至適温度と容易に加熱失活し得る適度な温度安定性
を有しているばかりでなくデキストリンやオリゴ糖の再
結Ｋに使用する各種アミラーゼ類とほぼ合致する至適ｐ
Ｈを有することから非常に経済的である。

かくして本発明の方法によればデンプンからのＣＤ、生
産のために有用なＣＧ　Ｔａ５ｅを安価かつ大量に供給
でき、またかくして得られる酵素によりα、β、ｒ−Ｃ
Ｄをバランス良く含有する糖質の製造を工業的大規模か
つ有利に実施できる。

（実施例） 以下、実施例に従って本発明の新規ＣＧ　Ｔａ５ｅ並び
にその製造方法につき更に具体的に説明する。

しかしながら、本発明の範囲は以下の実施例によって何
隻制限されるものではない。

実施例１ 中等度好熱性細菌バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　Ｎｏ
、　Ｙ　Ｈ−１３０６（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９７３５）菌
株を２リツトル容のヒダ付三角フラスコ中の可溶性デン
プン１％、ポリペプトン１．５％、酵母エキス０．５％
、Ｋ２ＨＰＯ，０，１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０
２％、ＣａＣＬ−２Ｈ２［＋　、０．００５％を含む培
地（ｐＨ６，８）３００艷に植菌し、４５℃、２０　Ｏ
ｒ、ｐ、ｍで２０時間培養して種菌液とした。該種菌液
２９０ｍ１を３０リツトル容のジャーファーメンクー中
の前記と同様な組成を含む培地１５リツトルに添加し、
４５℃、２５　Ｑｒ、ｐ、ｍ　、通気量１，５ｖ、ｖ、
ｍで４８時間通気攪拌培養した。培養終了後、１２．０
００ｇ、４℃で連続遠心して菌体を除いた後、平均分画
分子量１０．０００の限外濾過膜を用いて約１０倍に濃
縮し、１８０単位／証のＣＧ　Ｔａ５ｅ活性をもつ粗酵
素成約１．５リツトルを得た。

得られた粗酵素液を０．１　Ｍ食塩を含む１０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したセファクリルＳ−２
００カラムに重層し、同上緩衝液を用いて溶出した。溶
出した活性画分を集め、前述の限外濾過膜を用いて濃縮
した後、ショデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）Ｗ　Ｓ　−２０
０３カラムを用いる高速液体クロマトグラフ法にて再度
クロマトグラフィーに付して活性画分を集めた。かくし
て得られた精製酵素はポリアクリルアミドゲルディスク
電気泳動（ゲル濃度７．５％）的に単一であり、活性収
率は約２５％であった。

実施例２ （イ）　　３ｍＭ　ＣａＣｊ２２・２Ｈ２０を含む１０
０ｍ１の１３％（Ｗ／Ｖ＞馬鈴薯デンプン懸濁液（ｐ）
１６．５）を細菌液化型α−アミラーゼ（大和化成（株
）製、クライスターゼＬ−１）を用いて９Ｑ〜９２℃で
液化した後、ただちに１２５℃で３０分間加熱し、０．
Ｅ、　（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　：
直接還元糖に対する全固型物の割り合い）が１．２のデ
ンプン液化液を得た。ついで、該デンプン液化液中のデ
ンプン１ｇ当り３単位の実施例１で得た本発明の精製Ｃ
Ｇ　Ｔａ５ｅを添加し、７０℃、ｐｌ（６，５で反応さ
せた。経時的にサンプリングした反応液中ＣＤ　Ｃ、Ｄ
　ｓをバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂ）社製Ｈ
ＰＸ−４２Ａカラムを用いる高速液体クロマトグラフ法
（ＨＰＬＣ）で測定した結果を第１図に示す。

（１１２）特異性 ５５ｍｇのマルトース、マルトトリオース及びマルトテ
トラオースの各オリゴ糖と１ｍＭ［ａＣｊ２２・２■２
０　とをそれぞれ１．０ｍｌの水に溶解させた後５単位
の本発明の精製ＣＧ　Ｔａ５ｅを添加し、６５℃で２４
時間反応させた。反応生成物をＨＰＬＣ法で測定した結
果を第３表に示す。

（ハ）至適ｐＨ Ｏ，Ｉ　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，２，５，０，５，５，
６，０）または０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ１６，ｏ、
６．５．７．０．８．０）に溶解させた４％（Ｗ／Ｖ）
可溶性デンプン溶液１．　ｏ　ｒｎｌに本発明の精製酵
素を予め１ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む水で一夜透析した後
、さらにＥＤＴＡを含まない水で一夜透析したＣ　Ｇ　
Ｔａ５ｅ含有溶液０．１−を混合し、先に述べた方法で
ＣＧ　Ｔａ５ｅ活性を測定した。ＣＧ　Ｔａ５ｅの至適
ｐＨはｐＨ６，５における酵素活性を１００とする相対
活性で示した（第２図）。

（ニ）安定ｐＨ ｐＨ４〜１０の範囲で（ハ）で用いた酵素と同様に処理
した本発明のＣＧ　’ｒａｓｅを４０℃で２時間処理し
、ｐＨ６，５で処理した時の残存酵素活性を１００とす
る相対活性を第３図に示す。なお、使用した緩衝液は酢
酸（ｐＨ４〜６）、リン酸（ｐＨ６〜８）及びグリシン
−ＮａＯＨ−ＮａＣβ（ｐ）Ｉ　９．１０）である。

（ホ）作用適温 （ハ）で用いた酵素と同様に処理した本発明のＣＧ　Ｔ
ａ５ｅ含有溶液の活性を各温度で測定した。

６５℃で測定した時の酵素活性を１００とした時の相対
活性を第４図に示す。

（へ）失活条件及び（ト）温度安定性 精製した本発明のＣＧ　Ｔａ５ｅを（ハ）で用いた酵素
と同様に処理した後、５ｍＭＣａＣｌ２・２Ｈ２０存在
下及び不存在下で４０〜８０℃の各温度で１５分間処理
し、残存する活性を測定した。その結果を第５図に示す
。

（チ）阻害化 （ハ）で用いた酵素と同様に処理した本発明のＣＧ　Ｔ
ａ５ｅ含有溶液に終濃度１ｍＭ（水銀は０．１ｍＭ）と
なるように各種金属の塩酸塩を添加し活性を測定した。

無添加時の活性を１００とした時の相対活性を測定した
結果を第４表に示す。

第４表　各種金属塩の酵素活性に及ぼす影響（１０安定
化 （ハ）で用いた酵素と同様に処理した本発明のＣＧ　Ｔ
ａ５ｅ含有溶液に０〜３ｍＭのＣａＣ１２を添加し、７
５℃で１５分間処理し、その残存活性を３ｍＭ　　Ｃａ
ＣＲ２存在下で測定した活性を１００とした時の相対活
性として示した。

その結果を第６図に示す。

（ヌ）分子量 に、ウェーバ−（Ｗｅｂｅｒ）とＭ、オずボーン（Ｏｓ
ｂｏｒｎ＞　、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２４４巻
、４４０６頁、１９６９年に記載の５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミド電気泳動法により分子量を求めた（第７図）。

本発明のＣＧ　Ｔａ５ｅの分子量は３６．　ＯＯＯ±Ｌ
　０００であった。

（ル）等電点 ファルマシア社製ＰＢＥ９４ゲル及びポリバッファー７
４を用いるクロマトフオーカシング法により求めた本発
明のＣＧ　Ｔａ５ｅの等電点は４．８±０．１であった
（第８図）。

（発明の効果） 以上詳しく述べたように、本発明によれば６５℃前後の
温度域に酵素反応の至適温度を有し、しかも８０℃程度
の温度で完全に失活し、さらに、ＣＤｓ生成反応後の再
糖化に用いる各種デンプン分解酵素の至適ｐＨともほぼ
合致する至適ｐＨを有するＣＧＴａｓｅが提供できる。

このものはデンプンに作用させた時β−ＣＤを主成分と
し、α−ＣＤ及びγ−ＣＤを適度に含有するデンプン糖
を生成する。また、本発明のＣＧ　Ｔａ５ｅを用いるＣ
Ｄｓ　の生産においては余分な試゛薬が不要であり、脱
塩などの後処理工程が簡素化できるばかりでなく余分な
熱エネルギーも節約可能であることから経済性も著しく
向上する。

かくして、本発明は安価かつ大規模でのＣＤ。

の製造を可能とするので工業的に極めて大きな意義を有
するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図には、本発明のＣＧ　Ｔａ５ｅを用いた場合のα
、β、Ｔ及び全ＣＤの生成率の経時変化を示す。第２図
及び第４図には、それぞれ本発明のＣＧ　Ｔａ５ｅの相
対活性のｐＨ依存性及び温度依存性を示す。第３図及び
第５図には、それぞれ本発明のＣＧ　Ｔａ５ｅ　の残存
活性とｐＨ及び温度との関係を示す。第６図には、本発
明のＣＧ　Ｔａ５ｅの相対活性のＣａＣｊ２２濃度依存
性を示す。第７図は、本発明のＣＧＴａｓｅを含む蛋白
質の分子量と移動度との関係を示す図である。第８図は
、本発明のＣＧ　Ｔａ５ｅの等電点が４．８±０．１で
あることを示す図である。 温度（°Ｃ）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下の理化学的性質を有するサイクロマルトデキ
   ストリン・グルカノトランスフェラーゼ。 （イ）作　用 デンプンやグリコーゲンなどのα−１，４ −グルカン及びそれらの部分加水分解物中のα−１，４
   −グルコピラノシド結合を切断転移しサイクロデキスト
   リン類を生成し、該糖鎖転移反応の初期生成物がβ−サ
   イクロデキストリンである。 （ロ）基質特異性 マルトトリオース以上の重合度を有するα −１，４−グルコピラノシド結合からなるマルトオリゴ
   糖に作用し、基質相互の分子間糖鎖転移反応により重合
   度を異にする各種マルトオリゴ糖及びサイクロデキスト
   リン類を生成する。 （ハ）至適ｐＨ約６．５ （ニ）安定ｐＨ４０℃、２時間の条件下でｐＨ６〜９で
   安定である。 （ホ）作用適温約６５℃ （ヘ）失活条件４０℃、２時間の条件下ではｐＨ４．５
   及び１１．５で完全に失 活し、ｐＨ６、１５分間の条件 下で７５℃で完全に失活する。 （ト）温度安定性ｐＨ６、１５分間の条件下で５０℃ま
   で安定であり、６０ ℃及び７０℃での残存活性は それぞれ９５％、及び２０％ である。 （チ）阻害化２価の水銀及び銅で阻害され る。 （リ）活性化及び安定化 カルシウムで安定化される。 （ヌ）分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
   動法）３６，０００±１，０００ （ル）等電点（クロマトフォーカシング法）４．８±０
   ．１
2. （２）バチルス・コアギュランス（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   ｃｏａｇ−ｕｌａｎｓ￥）に属するサイクロマルトデキ
   ストリン・グルカノトランスフェラーゼ生産菌を培養し
   、培養物からサイクロマルトデキストリン・グルカノト
   ランスフェラーゼを採取することを特徴とするサイクロ
   マルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの製
   造法。
3. （３）バチルス・コアギュランスに属するサイクロマル
   トデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ生産菌が
   ＦＥＲＭＰ−９７３５である請求項（２）記載の製造法
   。
4. （４）培養を３０〜６０℃で好気的に行なう請求項（２
   ）記載の製造法。
5. （５）培養液のｐＨが５．８〜７．５の範囲内にある請
   求項（２）記載の製造法。