JPH01199578A - Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ＫＥＸ２エンドプロテアーゼ及び該酵素のア
ミノ酸配列をコードする遺伝子、さらにＣ末端領域に疎
水性アミノ酸配列が存在しない可溶性ＫＥＸ２エンドプ
ロテアーゼ及び該酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝
子、並びにこれらの酵素の製造方法、並びにこれらの酵
素の利用に関するものである。

〔従来の技術〕

サツカロマイセス酵母のＫＥＸ２エンドプロテア−ゼは
接合型因子、キラー因子の成熟体のプロセッシングを行
う特異的なプロテアーゼである。その性質は以下のよう
に報告されている。すなわち、■切断部位は接合型因子
の場合、Ｌｙｓ−Ａｒｇ配列のＣ末端側、キラー因子の
場合はＬｙｓ−Ａｒｇ配列及びＰｒｏ−Ａｒｇ配列のＣ
末端側を切断する。■ＫＥＸ２エンドプロテアーゼの精
製も試みられており、膜画分に存在し、その活性化にカ
ルシウムを要求するチオール酵素である。■糖蛋白であ
り、その分子量は１００Ｋ−１２０にダルトンである。

■基質特異性はＡｒｇ−Ａｒｇ配列、Ｌｙｓ−Ａｒｇ配
列、Ｐｒｏ−Ａｒｇ配列のＣ末端側を特異的に切断する
（ＢＢＲＣ，１４４，８０７−８１４゜１９８７）。

一方、動物のホルモン（生理活性ペプチド）も前駆体よ
り特異的なプロテアーゼにより切断を受は成熟体が生じ
ると考えられている。その切断部位はＫＥＸ２エンドプ
ロテアーゼの基質特異性と酷似している。例えば、イン
シュリンはＢ鎖−Ｃ−ペプチド−Ａ鎖の前駆体より、Ｃ
−ペプチドが切り出され、成熟体が住じる。このＣ−ペ
プチドの両端にはＡｒｇ−Ａｒｇ及びＬｙｓ−Ａｒｇ配
列がみられる（Ｎａｔｕｒｅ、２８２．５２５−５２７
．１９７９）　、また、グルカゴンの前後にもＬｙｓ−
Ａｒｇ配列がみられ（Ｐｒｏｃ　、　Ｎａ　ｔ　Ｉ　、
＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９，３４５−３４９．１９８２）、
ガストリンもＣ−末端にはＡｒｇ−Ａｒｇ配列が見られ
（ＰＮＡＳ、７９．１０４９−１０５３゜１９８２）　
、ソマトスタチンは前駆体のＣ−末端側に位置し、成熟
ソマトスタチンの直前にＡｒｇ−Ｌｙｓ配列がみられる
（Ｎａｔｕｒｅ、２８８．１３７−１４１．１９８０）
。

一方、組換えＤＮＡ技法により、ペプチドホルモン（目
的物質）などを生産する場合、直接発現法を用いること
は宿主細胞内で目的物質が不安定であることなどにより
困難であることが多い。この問題点の解決方法のひとつ
として、保護（または安定化）蛋白質との融合蛋白質と
して発現させ、後の操作で目的ペプチドまたは蛋白質を
切断する手法が用いられており、切断方法も動物由来の
ホルモン等の生理活性物質の場合、切断部位が限定され
ており、その配列がＫＥＸ２エンドプロテアーゼによる
切断部位と同じであることより、融合蛋白質の切断にＫ
ＥＸ２エンドプロテアーゼを用いることば有利であると
考られる。

しかし、ＫＥＸ２エンドプロテアーゼは通常のサツカロ
マイセス酵母からは膜画分に回収され、ある種の界面活
性剤を用いて可溶化しなければ回収精製が行えない等、
工業的製造のためには問題がある。これらの問題点を解
決するには遺伝子工学的手法を用いるのが有利であり、
可溶性でかつ同じ基質特異性を有する酵素が得られれば
より一層有利である。

〔発明が解決しようとする課題〕

よって、本発明は組換えＤＮＡ技法を用いたＫＥＸ２エ
ンドプロテアーゼの製造において、ＫＥＸ２エンド′プ
ロテアーゼ、及び可溶性でありＫＥＸ２エンドプロテア
ーゼ活性を有する蛋白質（可溶性ＫＥＸ２エンドプロテ
アーゼ）並びにそれをコードする遺伝子、さらに該酵素
の組換えＤＮＡ技法による工業的製造方法を提供するこ
とを目的とするものである。

〔課題を解決するための手段〕

上記の目的を達成するため、本発明者等はＫＥＸ２エン
ドプロテアーゼをコードするｃＤＮＡをクローニングし
、そのＤＮＡ配列を決定し、そして該ＤＮＡ配列から全
アミノ酸配列を推定し、ＫＥＸ２エンドプロテアーゼが
Ｎ−末端側及びＣ−末端側に２つの疎水性領域を有する
ことを見出した。さらに、本発明者等は、Ｃ−末端側に
ある疎水性領域が酵素と酵母のゴルジ体との結合に寄与
しているとの推定のもとに、この領域を欠損せしめるこ
とにより、ゴルジ体への酵素の結合を阻止し、目的とす
る酵素を容易に可溶化せしめることができ、しかもこの
様な可溶性にされた酵素が、なお本来の酵素と同じ基質
特異性を保持しているという全く新しい知見を得、この
知見に基いて本発明を完成した。

従って本発明は、組換ＤＮＡ技術により生産されるＫＥ
Ｘ２エンドプロテアーゼ、及びＣ−末端側の疎水性領域
を含む領域が欠損しており、可溶化されているＫＥＸ２
エンドプロテアーゼ（本発明において、可溶性ＫＥＸ２
エンドヌクレアーゼと称する）；これらの酵素のアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ　。

これらのＤＮＡを含有する発現プラスミド；これらのプ
ラスミドにより形質転換された組換え体；並びにこれら
の組換え体を培養することによる前記酵素の製造方法を
提供するものである。

本発明はさらに、前記のようにして製造された酵素の使
用方法、すなわち、生理活性ペプチドまたは蛋白質（以
下、生理活性物質）の製造方法において、該生理活性物
質の両端または片側に、ＫＥＸ２エンドプロテアーゼの
基質となりえるアミノ酸配列を有する前駆体または融合
蛋白質に、水性媒体中で、可溶性ＫＥＸ２エンドプロテ
アーゼを作用させることにより、該前駆体または融合蛋
白質より目的とする該生理活性物質を採取することを特
徴とする生理活性物質の製造方法を提供するものである
。

〔具体的な方法〕

以下、本発明の遺伝子の作製方法、及びそれを用いる目
的酵素の製造方法、並びにその使用方法について詳細に
記載する。

（１）ＣＤＮＡの単離 ＫＥＸ２遺伝子は既に１９８４年にり、Ｊｕｌｉｕｓら
によりクローニングされている（Ｃｅｌｌ、３７．１０
７５−１０８９．１９８４）が、塩基配列は未だ報告さ
れていない。そこで、ＫＥＸ２遺伝子の構造を知るため
に、まずｋ　ｅ　ｘ　２変異を相補するクローンの分離
（クローニング）を行う。

すなわち、サツカロマイセス酵母Ｘ２１８０−ＩＢ（Ｍ
ＡＴα５ＵＣ２ｍａｌ　ｇａ１２　ＣＩＩＰＩ：　Ｙｅ
ａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒカ
リフォルニア大学バークレー校から入手可能）の染色体
ＤＮＡをＣｒｙｅｒらの方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｃ
ｅｌ］Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、２．３９−４４．１９
７５）に従って分離する。

さらに、前記り、Ｊｕｌｉｕｓらの報告に従い、ｋｅｘ
２変異を相補できるＤＮＡ断片を分離する。ずなわち、
Ｘ２１８０−２Ｂの染色体ＤＮＡを制限酵素で分解し、
寒天ゲル電気泳動法により分離し、目的とするＤＮＡ断
片を含む寒天ゲルを切り出し電気溶出法（ｅｌｅｃ−ｔ
ｒｏｅｌｕｔｅ）により遊離させ、エタノール沈澱によ
りＤＮＡを回収する。

一方、ＴＲＰＩ遺伝子、２ｔＭ複製起点、ＰＢＲ３２２
のアンピシリン耐性遺伝子及び同複製起点を含むＹＥｐ
型シャトルベクター（例えば、ｐＹＥ２０）を制限酵素
で切断したＤＮＡ断片を得、この両ＤＮＡ断片を混合し
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、宿主細胞、例え
ば大腸菌Ｄ　１１−　’１株を形質転換する。次に、独
立に得られたアンピシリン耐性形質転換体を混合し、常
法に従いプラスミドＤＮＡを分離し、ｘ２１８０−１１
Ｂ染色体ＤＮＡシーンバンクを作製する。次に、このＤ
ＮＡシーンバンクを用いてｋｅ×２−８変異を有する酵
母（例えばに１６−５７Ｃ株（ＭＡＴαＩｅｕ２ｈｉｓ
３　ｕｒａ３　ｔｒｐｌ　ｋｅｘ２−８））を形質転換
する。得られたＴｒｐｌ”の形質転換体よりキラー感受
性株（例えば、５×１０株（ＭＡＴａ／Ｍ＾Ｔａ　ｈｉ
ｓｌ／＋　ｔｒｐｌ／＋　ｕｒａ３／＋。

Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８２，４２９−４４２．１９７６）
を用いてｌｉｌｉｃｋｍｅｒとＬｅｉｂｏｗｉｔｚ（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ、　８２，４２９−４４２．１９７６）
の方法によりｋｅｘ２−８を相補する形質転換体、すな
わち、キラー因子産生株の分離を行う。この形質転換体
（キラー因子産生株）より５ＤＳ−アルカリ法（Ｒｉｃ
ｏｍｂｉｎａｎｔ　　ＤＮＡ　　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
：Ａｎ　　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｅｄ、　Ｒ，Ｌ、
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　ａｎｄ　Ｒ，Ｃ，Ｔａ１ｔ、ＡＤ
ＤＩＳＯＮ−ＷＥＳＬＥＹＰＵＢＬＩＳＨＩＮＧ　ＣＯ
ＭＰ、　　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ｐｐ１７１−
１７２゜１９８３）にてプラスミドＤＮＡを分離し、宿
主細胞、例えば大腸菌ＤＩ−１株を形質転換する。得ら
れたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドＤＮＡ
〔例えば、ｐＹＥ−ＫＥＸ２（５，０）　、又はｐＹＥ
−ＫＥＸ２（ＲＪ）ａ　）を分離し、再びｋｅｘ２−８
変異を有する酵母（例えば、Ｋ１６−５７Ｃ株）を形質
転換する。得られたＴｒｐ十形質転換体がキラー産生株
であれば該プラスミドはｋｅｘ２−８を相補するＤＮＡ
断片を有していると判断できる。

次に、該プラスミドより、制限酵素で分解し得られたＤ
ＮＡ断片をｐＵｃ１８にサブクローニングする。ｋｅｘ
２−８変異を相補するＤＮＡを適当な制限酵素（例えば
、Ｎ５ｉＩ、　ＨｉｎｄＩＩＩ、５ａｕ３ＡＩ、　Ｈａ
ｅｌｌｌ、ＸｂａＩ。

Ｂａｌ　Ｕ　、ＣｆｒｌＯｌ、Ｃ１ａＩ、Ｔａｑｌ、　
Ｐｖｕ　ＩＩ　、ＥｃｏＲＩ）を用いて切断して得られ
るＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９ベ
クターのマルチリンカ一部分に挿入し、ジデオキシ法（
Ｍａｒｋｌａｎｄ、　Ｆ、Ｓ、＆Ｓｎ＋ｉ　ｔＬ　Ｅ、
Ｌ、　＋　１９７Ｌｉｎ　Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅ、ｖｏ
ｌ、３．ｅｄ　Ｂｏｙｅｒ、Ｐ、Ｄ、＋Ａｃａｄｅｍｉ
ｃＰｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ、５６１−６０
８）によりＤＮＡ塩基配列を決定し、ＫＥに２エンドプ
ロテアーゼのｃＤＮＡクローン（例えば、ｐＵＣ１８−
ＫＥＸ２（５，０））を得ることができる。

（２）ｃＤＮＡの解析 得られたクローンより常法に従いプラスミド（例えば、
ｐＹＥ−ＫＥＸ２（５，０））を単離し、ｃＤＮＡの制
限酵素地図を作成する（第５Ａ図参照）。次に、このｃ
ＤＮＡの塩基配列を決定するために、まず種種の制限酵
素で切断したｃＤＮＡ断片をＭ１３ファージにサブクロ
ーニングし、各クローンのｃＤＮＡ部分の塩基配列をＳ
ａｎｇｅｒ等の方法（Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ、ｅｔ　ａｌ、
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ’、ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　、
　３４．５４６３−５４６７、１９７７）により決定す
る（第５Ｂ図参照）。ＤＮＡ塩基配列の解析の結果、本
発明におけるｃＤＮＡクローン（例えば、ｐＵｃ１８−
ＫＥＸ２　（５，０）　）が含有する塩基配列は、８１
４アミノ酸残基をコードする翻訳領域を有していた（第
１図参照）。

ＤＮＡ塩基配列より予想されるアミノ酸配列は以下に述
べるような特徴を持つ。すなわち、■Ｎ末端部分（第１
図におけるアミノ酸配列番号ｌから２８）及びＣ末端に
近い部分（アミノ酸配列番号６７９から６９９）に疎水
性アミノ酸に富む領域を有しており、■アミノ酸配列番
号９６から４２１にかけて、セリンプロテアーゼである
ズブチリシン（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）とよく似たアミ
ノ酸配列を有している（第６図参照）。ズブチリシンと
の相同性よりＫＥＸ２エンドペプチダーゼはセリンプロ
テアーゼファミリーの一種であると考えられる。■Ｎ末
端およびＣ末端近くに疎水性アミノ酸に富んだ領域が存
在する構造は最近報告されたα−接合因子及びキラー因
子のプロセッシングに関与していると考えられるＫＥＸ
Ｉカルボキシペプチダーゼ（Ｃｅｌｌ、５０゜５７３−
５８４．１９８７）によく似ている。ＫＥＸＩもＫＥＸ
２と同様にゴルジ体に存在すると予想されており、Ｎ末
端の疎水性域は粗面小胞体通過に関与しており、Ｃ末端
近くの疎水性域はゴルジ体への移行及び位置するのに必
要な膜通過領域であると推定できる（第７図参照）。

（３）宿主細胞での発現 本発明におけるｃＤＮ八クコクローンえばＫＥＸ２（５
，０）にコードされているＫＥＸ２エンドプロテアーゼ
を宿主細胞内で発現させるために発現ベクターを作製す
る。ここで用いられるベクターとしては２廂複製起点を
有するＹＥｐヘクター（マルチコピー）とＡＲ３ＩとＣ
ＥＮ４を有するＹＣｐヘクター（シングルコピー）など
である。次に、宿主細胞（宿主細胞は通常遺伝子組換え
の行われる微性物、例えば大腸菌、枯草菌、酵母等が使
用できる。前記のベクターは酵母の場合を示したが、そ
れぞれの宿主に応した発現ベクターを選択すれば大腸菌
、枯草菌などを宿主とすることができる）へ形質転換し
、目的とする発現菌〔例えば、Ｋ１ｆ３−５７Ｃ（ｐＹ
Ｅ−ＫＥＸ２（５，０））を得る　（第４図参照）。

また、Ｃ末端近くの疎水性領域がゴルジ体に位置するた
めに必要であるのであれば、それを除くことにより可溶
性蛋白となり細胞外に活性を有したまま分泌されること
が期待できるので、様々なＣ末端側欠損ＫＥＸ２エンド
プロテアーゼ（例えば、ＫＥＸ２Δ５など）を作製する
。発現株を培養する方法は、通常知られている方法、例
えば、液体培地に菌を接種し、通気、攬はん状態で行う
。このようにして発現された蛋白質は通常用いられる破
砕法（超音波処理またはフレンチプレス破砕法）で細胞
から可溶性画分または膜画分に、もしくは培養液を遠心
分離することにより培地上清に回収される。

（４）酵素活性の測定 酵素活性の測定はに、Ｍｉｚｕｎｏらの方法（ＢＢＲＣ
，１４４゜８０７−８１４．１９８７）に準じて行う。

すなわち、カルシウム依存性エンドプロテアーゼ活性を
Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを基質として
測定する。

Ｃ末端が欠損したｃＤＮＡ−例えばＫＥＸ２（Ｒ１）は
ＹＥｐベクターでも、ＹＣｐヘクターにおいて挿入方向
が異なったものでもｋｅｘ２変異を相補でき、エンドプ
ロテアーゼ活性も認められる。シングルコピーベクター
では野性型（例えば、Ｒ２７−７Ｃ株）とほぼ同様の活
性が認められ、Ｉ）ＹＥベクターではそれより高い活性
が認められる。また、完全な翻訳領域を有するｃＤＮ八
クコクローンえばＫＥＸ２　（５，０）をＹＥｐベクタ
ーで発現した場合も高い活性が認められるが、これらは
、遺伝子多重（ｇｅｎｅ　ｄｏｓａｇｅ）効果によると
考えられる。また、挿入方向により多少活性の高低が認
められるが、ＫＥＸ２（Ｒ１）でも活性が挿入方向に関
係なく認められる。また、Ｃ末端近くの疎水性領域を除
いたもの（可溶性ＫＥＸ２エンドプロテアーゼ）は期待
通り培地中に分泌され、カルシウム依存性エンドプロテ
アーゼ活性を示す（第３表にＣ末端側のアミノ酸が欠損
したＫＥＸ２エンドプロテアーゼのｋｅｘ２変異の相補
性及び酵素活性を示す）。エンドＫＥＸ２プロテアーゼ
活性はＰｖｕ　ＩＩ切断部位付近までの領域（アミノ酸
配列番号１から６１４）を含んでいれば該活性を有する
ことが認められる。従って、活性を示すにはＣ末端近く
の疎水性域は必要ではない。

さらに詳しく可溶性ＫＥＸ２エンドプロテアーゼの培地
中への分泌性について検討するためには、膜画分と培地
上清におけるＫＥＸ２活性を測定すればよい。Ｃ末端近
くの疎水性域を持つもの（例えば、ＫＥＸ２　（５，０
）　、　ＫＥＸ２Δ３）は培地中にほとんど活性が認め
られず、膜画分にその活性が認められ、疎水性域を持た
ないもの（例えば、ＫＥＸ２Δ５．ＫＥＸ２（Ｒ１−Ｐ
ｖｕ　ｎ　））は逆に膜画分での活性は低く、培地上清
に活性が認められる。

以上の結果はＣ末端近くの疎水性域は膜結合に必要であ
り、それを除くことにより、培地中に分泌されてくるこ
とを示している。さらに、培地中に放出されたカルシウ
ム依存性活性の基質特異性について検討すると、前記Ｋ
ＥＸ２（５，０）の膜画分と同じ基質特異性を持つこと
が判明した。すなわち、培地中へ分泌されるようになっ
たＣ末端近くの疎水性アミノ酸が欠損したＫＥＸ２エン
ドプロテアーゼは可溶性であり、ＫＥＸ２エンドプロテ
アーゼ本来の性質を保持している酵素である。

以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

ｍユ　ＹＥ２０　　びＹＣＬｅシャトルベクターのｐＹ
Ｅ２０は２崩ＤＮＡの複製起点とＹＲｐ７由来のＴＲＰ
Ｉ遺伝子をｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性遺伝子
及び複製起点を有する大腸菌−酵母シャトルベクターで
あり、以下の方法で得られる。

すなわち、プラスミドｐＹＥ２２０１　（特開昭６１−
５６０７８参照）をＩＥｃｏＲＩで切断後、Ｔ４ＯＮＡ
ポリメラーゼ及び４ｄＮＴＰを用いて粘着末端を満たし
た後、生じた２つのＤＮＡ断片をリガーゼにより結合し
、ｐＹＥ２２０１’を得た。このｐＹＥ２２０１’はｐ
ＹＥ２２０１よりＥｃｏＲＩ切断点が除かれたものであ
る。（第２図参照。図中のカッコで示したものはＥｃｏ
ＲＩ切断点が除かれたことを示している。）次に、ｐＹ
Ｅ２２０１”を５ａｌＩにより部分的に切断し、前記の
ごとく粘着末端を満たした後、結合し、ｐＹＥ２２０２
を得た。

ｐＹＥ２２０２はｐＹＥ２２０１’の一方の５ａｌｌ切
断点が除かれたものである。第２図中のカッコで示した
位置の同切断点は除かれたことを示している。次に、ｐ
ＹＥ２２０２をＨｉｎｄｌ［で部分的に、５ａｉｌで完
全に切断した。粘着末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及び
４ｄＮＴＰで満たした後、ＧＡＰ−ＤＩ＋遺伝子を除い
た断片を得た。

この断片をｌＯ塩基よりなるＥｃｏＲＩ　リンカ−（５
’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧ−３”）を介して結合し、ｐ
ＹＥ２０を作製した（第２図）。

ＹＣｐＬｅはＹＣｐ１９（Ｓｔｉｎｃｈｏｍｂ、Ｄ、Ｔ
、ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　、　１５８．１５７−１７９．１９８２）
由来の八Ｒ３Ｉ、ＣＥＮ４領域及びＹＥｐ１３（Ｂｒｏ
ａｃｈ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、Ｇｅｎｅ、８，１２１−１３
３．１９７９）由来のＬＥＵ２遺伝子をｐＢＲ３２２由
来の断片（アンピシリン耐性遺伝子及び複製起点を持つ
）と結合した大腸菌−酵母シャトルベクターである。ま
ず、ＹＣｐｌＱ上にあるＴＲＰＩ遺伝子を不活化するた
めに、ＹＣｐ１９をＨｉｎｄｌｌｌで部分分解し、その
粘着末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及び４ｄＮＴＰで満
たした後、結合し、ＴＲＰＩ遺伝子上の旧ｎｄＤＩ切断
部位が消失したＴ’ＲＰＩ遺伝子不活化ＹＣｐ１９（Ｈ
）を得た。次に、ＹＣｐ１９　（Ｈ）を旧ｎｄＩｌｒと
Ｐｖｕ　ＩＩで切断後同様に粘着末端を満たし、ＵＲＡ
３遺伝子が除かれたＤＮＡ断片を得た。−方、ＹＥｐ１
３をＸｈｏＩ及び５ａｌＩで切断した後、前記の方法に
より粘着末端を満たした２、２ｋｂのＬＥＩＪ２遺伝子
を含む断片をＥｃｏＲＩ　リンカ−（５’　−ＣＧＧＡ
ＡＴＴＣＣＧ−３’　）と共に混合、結合し、ＹＣｐＬ
ｅを得た（第３図参照）。

これらのｐＹＥ２０は実施例２において、ＹＣｐＬｅは
実施例４で用いた。

遺Ｊ１例２．　　ＫＥＸ２’　　−（Ｄへ’）ローニン
クサソ力ロマイセス酵母Ｘ２１８０−ＩＢ　（ＭＡＴα
５ＬＩＣ２ｍａ１ｇａ１２　ＣＵＰＩ）の染色体ＤＮＡ
を前記Ｃｒｙｅｒらの方法に従って分離した。さらに、
前記り、Ｊｕｌｉｕｓらの報告に従い、ｋｅｘ２変異を
相補できる３、４ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を分離した。す
なわち、Ｘ２１８０−ＩＢの染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩ
で分解し、寒天ゲル電気泳動法により分離し、約３．５
ｋｂのＤＮＡ断片を含む寒天ゲルを切り出し電気溶出法
（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅ）により遊離させ、エタノ
ール沈澱によりＤＮＡを回収した。

一方、実施例１で得られたｐＹＥ２０をＥｃｏＲＩで切
断したＤＮＡ断片を得た。この両ＤＮＡ断片を混合し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、大腸菌１））ｌ−
１を形質転換した。独立に得られたアンピシリン耐性形
質転換体約３０００クローンを混合し、常法に従いプラ
スミドＤＮＡを分離し、Ｘ２１８０−ＩＢ染色体ＤＮＡ
シーンバンク（ＲＩ）を作製した。

次に、このＤＮＡシーンバンクを用いてｋｅｘ２−８変
異を有する酵母Ｋ１６＝５７Ｃ株（Ｍ＾７α１ｅｕ２　
ｈｉｓ３ｕｒａ３　ｔｒｐｌ　ｋｅｘ２−８）を形質転
換した。得られたＴｒｐｌ＋の形質転換体より５×４７
株（ＭＡＴａ／ＭＡＴ　αｈｉｓｌ／＋　ｔ−ｒｐｌ／
＋　ｕｒａ３／＋）をキラー因子感受性株として用い前
記−ｉｃｋｍｅｒとＬｅｉｂｏｗｉｔｚの方法によりｋ
ｅｘ２−８を相補する形質転換体、すなわち、キラー因
子産生株の分離を行った。その結果、約２０００個のＴ
ｒｐ”形質転換体より４株のキラー因子産生株を得た。

このうち、２つの形質転換体より５ＤＳ７アルカリ法に
てプラスミドＤＮＡを分離し、大腸菌ＤＩ（−１株を形
質転換した。得られたアンピシリン耐性形質転換体より
プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　（ｐＹＥ−ＫＥＸ２（Ｒ１）ａ
）を分離し、再び、Ｋ１６−５７Ｃ株を形質転換した。

得られたＴｒｐ”形質転換体のキラー産生能を検討した
ところ、すべてキラー産生株であった。

すなわち、得られたプラスミドｐＹＥ−ＫＥＸ２（Ｒ１
）ａはｋｅｘ２−８を相補するＤＮＡ断片を有している
と判断した。

次に、ｐＹＥ−ＫＥＸ２（ＲＩ）ａより、ＥｃｏＲＩで
分解し得られた３、４ｋｂの断片をｐＵｃ１８にサブク
ローニングした。制限酵素器ｎｄｌｌｌ及びＢｇｌｌＩ
を用いての解析の結果、前記り、Ｊｕｌｉｕｓらの報告
と一致した。３．４ｋｂのｋｅｘ２−８変異を相補する
ＤＮＡを適当な制限酵素（例えば、Ｎ５ｉｌ、　ｔｌｉ
ｎｄｎｌ、５ａｕ３ＡＩ、　ｌ１ａｅｌｌｌ、Ｘｂａｌ
。

ＢｇＩ　ＩＩ　、Ｃｆｒｌｏｌ、Ｃ１ａｌ、ＴａｑＩ、
　Ｐｖｕ　ＩＩ　、ＥｃｏＲＩ）を用いて切断して得ら
れるＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ１８またばＭ１３ｍｐ１９
ヘクターのマルチリンカ一部分に挿入し、ジデオキシ法
によりＤＮＡ塩基配列を決定した。

その結果７１５アミノ酸残基をコードする翻訳領域はみ
られたが、終止コドンは欠損していた。そこで次に、そ
の下流域を含むＤＮＡ断片の分離を試みた。ｐＹＥ−Ｋ
Ｐ、Ｘ２（Ｒ１）ａをＢｇｌｌＩと５ａｌＩで切断し大
きい方のＤＮＡ断片と、Ｘ２１８０−２Ｂ染色体ＤＮＡ
を５ａｌＩとＢｇｌｒｌで切断し前記の方法で得た約２
．６ｋｂのＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで
結合して大腸菌ＤＩ＋−１株を形質転換した。独立に得
られたアンピシリン耐性形質転換体約３０００クローン
を混合し、シーンバンク（５，０）を得た。

次に、このＤＮＡバンクを用いてｋｅｙ２−８変異を相
補するクローンを前記方法で得た。約２０００個のＴｒ
ｐ’形質転換体より５株のキラー因子産生株を得た。こ
のうち、１つの形質転換体より前記のごとくプラスミド
ＤＮＡを回収し、それを用いて大腸菌ＤＨ−１株を形質
転換し、アンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐ
ＹＥ−ＫＥＸ２（５，０）を得た。このプラスミドを再
びＫＬ６−５７Ｃ株に導入したところ、得られたＴｒｐ
＋形質転換体はすべてキラー生産能を示した。ｐＹＥ−
ＫＥＸ２（５，０）をＥｃｏＲＩで部分的に、５ａｌｌ
で完全に分解して得られる５、０ｋｂのＤＮＡ断片を、
ｐＵｃ１８のＥｃｏＲＩおよび５ａｌ１部分に導入し、
）ＵＣｌ３−ＫＥＸ２（５，０）を得た（第４図）、　
、：（７）ＤＮＡ断片を前記の方法によりＤＮＡ塩基配
列を決定したところ、８１４アミノ酸をコードする完全
な翻訳領域を認めた。なお、ｐＨｃ１８−ＫＥＸ２　（
５，０）を用いて大腸菌Ｄ１１−１を形質転換して得ら
れたＤｌｌ−１／ｐＵＣ１Ｂ−ＫＥＸ２（０，５）　は
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｓ　ｃｏｌｉ　５８Ｍ２９８　と
命名され、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第９７９６号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９７９６）　として寄
託されている。

失１１↓　プロテアーゼ・′　土の測４　法形質転換酵
母もしくは非形質転換酵母を１％カザミノ酸、０．７％
Ｙｅａｓｔ　Ｎ１ｔｒｏにｅｎ　Ｂａ５ｅ（Ｄｉｆｃｏ
社製）、２％デキストロース及び３０μｇ　／　ｍｅの
ウラシルを含む培地で３０℃１８時間培養後、遠心分離
により細胞を得た。酵母細胞内のプロテアーゼ活性は、
前記り、Ｊｕｌｉｕｓらの方法に従い、界面活性剤Ｂｒ
１ｊ５８を用いて細胞を易透過性（Ｐｅｒｍｅａｂｉｌ
ｉｚｅｄＣｅｌｌ）にしたものを酵素標品として用い測
定した。

酵素活性測定法は、Ｋ、Ｍｉｚｕｎｏらの方法（ＢＢＲ
Ｃ。

１４４．８０７−８１４．１９８７）に準じて行った。

すなわち、２０ｎｍｏｌのＢｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−ＭＣＡを基質として用い、０．４Ｍのトリス塩酸
（ｐＨ７，０）　、０．１％ルブロール、１　ｍＭ　Ｅ
ＧＴＡ　、　１　ｗ／ｍｅペプスタチン、１ｍｇ　／　
ｍｌヘスタチンを含む２５０μ！反応液中で２ｍＭのＣ
ａＣ１□を加えたものまたは加えないものを３７°Ｃで
１時間反応させた後、励起波長３８０ｎｍでの４６０ｎ
ｍの蛍光を蛍光分光光度計を用いて測定した。

ＫＥＸ２産物の活性はＣａＣ１□を加えることにより増
加した蛍光量として測定した。

実施例２で示したｐＹＥ−ＫＥＸ２（ＲＩ）ａ、及びｐ
ＹＥ−にＥＸ２　（５，０）は何れも酵母細胞内では２
ｎｌＤＮへの複製レプリコンによりマルチコピープラス
ミドとなる。そこでシングルコピープラスミドでのプロ
テアーゼ活性及びｋｅｙ２−８変異の相補性を検討する
たしたもの及びｐ［Ｉｃ１８−ＫＥＸ２（Ｒ１）をＥｃ
ｏＲｒで分解しＫＥＸ２遺伝子を含む３．４ｋｂＤＮ＾
断片を混合、結合しＫＥＸ２遺伝子の挿入方向の異なる
ＹＣｐＬｅ−ＫＥＸ２（Ｒ１）ａ及び、ＹＣｐＬｅ−Ｋ
ＥＸ２（ＲＩ）ｂを得た（第８図）。また、前記３．４
　ｋｂ　ＤＮＡ断片をｐＹＥ２０のＥｃｏＲＩ切断部位
に挿入し、ＫＥＸ２遺伝子の方向の異なるｐＹＥ−ＫＥ
Ｘ２（Ｒ１）ａ（前記第４図中と同じもの）とｐＹＥ−
ＫＥＸ２（Ｒ１）ｂを得た（第８図）。

ここで得られた４種のプラスミド及び実施例２で得られ
たｐＹＥ−ＫＥＸ２（５，０）を用いてｋｅｙ２−８変
異株に１６−５７Ｃを形質転換した。得られたＬＥＵ”
またはＴＲＰ”形質転換体のｋｅｘ２変異相補性を前記
のキラー産生能を指標として検討した。その結果を次の
第１表に示す。

第１表に示すごとく、ここで用いたプラスミド５種すべ
てｋｅｘ２変異を相補し、キラー因子産生能を有しテｌ
、Ｎた。ｐＹＥ−ＫＥＸ２（ＲＩ）ｂ、及びｐＹＥ−Ｋ
ＥＸ２（５，０）による形質転換体のキラー産生量は他
と比べ高いものであった。宿主のみではキラー産生能は
認められない。

次に、実施例３で示した方法により酵素活性を測定した
。第１表における活性は単位菌体あたりの値を示した。

宿主のみ（ＫＥＸ２遺伝子遺伝子界したもの）では０．
５であるのに対し、用いた５種のプラスミドはすべて１
０倍以上の値を示し、ＫＥＸ２エンドプロテアーゼ活性
を認めた。表中、Ｒ２７＝７Ｃは対照としてＫＥＸ２遺
伝子の野生型の結果を示した。

前記の２種のキラー活性の高いものは、酵素活性も高い
値を示した。ＹＥｐ型ベクターを用いた方が相対的にＹ
Ｃｐ型ベクターのものより高活性を示した。これはコピ
ー数が多いための遺伝子多重効果の結果であると考えら
れる。

前記のごと＜　ＫＥＸ２（Ｒ１）はＣ末端側が欠損して
いるにもかかわらず、両方向とも活性が生じることより
ＫＥＸ２遺伝子の活性を示すためにはＣ末端は重要でな
いことが強く示唆された。

１ｆｌｉｌＬ　Ｃｒ　　ＫＥＸ２’　云ノ”次に、各種
のＣ末端の欠損変異株の作製を行った。Ｃ末端欠損遺伝
子を作製するためには新たに終止コドンを付加しなけれ
ばならない。そこでまず、ｐ１１ｃ１８の旧ｎｄｌＩ［
，５ｐｌｒＩ部位に、化学合成法により作製した終止コ
ドン挿入リンカ−を組み入れたｐＵｃｌＢ−３ＴＯＰを
作製した。すなわち、化学合成法により、 ５’　　ＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣ＾　３”３’
　ＧＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＣＧＴＴＣＧＡ
　５’（ＳｐｈＩ）　　　　　　　　　（Ｈ４ｎｄＩ［
＋）のリンカ−を作製した。

一方、ｐＵｃｌＢを旧ｎｄＩＩＩとｓｐｈ　Ｉを用いて
分解後、前記リンカ−と混合しＴ４ＤＮＡ　リガーゼで
結合し、ｐｌＪｃ１８−５ＴＯＰを得た。次に、ｐｌＪ
ｃ１８−ＫＥＸ２（Ｒ１）をＥｃｏＲＩとＰｖｕ　Ｕで
分解し、３．１　ｋｂのＫＥＸ２遺伝子を分離した。さ
らに、ｐＵｃｌＢ−５ＴＯＰを５ＩＩｌａ■とＥｃｏＲ
Ｉで分解し、２．６ｋｂのＤＮＡ断片を得た。両ＤＮＡ
断片をＴ４ＯＮ八リガーゼで結合しｐＵＣ１８−ＫＥＸ
２（ＲＩ−Ｐｖｕ　Ｕ　）を得た。

ｐＵｃ１８−ＫＥＸ２を旧ｎｄｎＴで分解後、Ｔ４ＯＮ
Ａポリメラーゼ及び４ｄＮＴＰで粘着末端を満たした後
、Ｂｇｌ　Ｕで切断し、０．８ｋｂのＤＮＡ断片を分離
した。ｐＹＥ−ＫＥＸ２（ｌｉ！Ｉ）ｂを５ａｌｌで切
断後、粘着末端を前記と同様に満たした後、ＢｇｌＩＩ
で切断し、ＴＲＰＩ遺伝子を含む断片を得た。両ＤＮＡ
断片を結合し、ｐＹＥ−ＫＥＸ２（Ｒ１−Ｐｖｕ　Ｈ）
を得た（第９図）。このようにして得られたＫＥＸ２遺
伝子はＣ末端より０．６ｋｂ欠落し、Ｃ末端近くの疎水
性側域は除かれている。

次に、８ｇ１３１エキソヌクレアーゼを用いて各種のＣ
末端欠損変異株を作製した。ｐＵｃ１８−ＫＥＸ２（５
，０）ヲＢａｍＨＩで切断後、Ｂａ１３１エキソヌクレ
アーゼを用いて分解し、さらにＢｇｌＨで切断、寒天ゲ
ル電気泳動により分離し、０．５　ｋｂから１．４ｋｂ
のＤＮＡ断片を得た。また、ｐＵｃ１８−ＫＥＸ２（５
，０）をＥｃｏＲＴ　トＢｇｌ　ＩＩ　テ切断し、ＫＥ
Ｘ２ノＮ末端領域を含む２．３ｋｂのＤＮＡ断片を得た
。これらと、ｐＵｃ１８をＥｃｏＲＩとＳｍａ　Ｉで分
解したものとを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合し、
各種のＣ末端欠損遺伝子を含むｐＵｃ１８ＫＥＸ２Δ１
〜Δ６を得た。次に、各ｐＵｃ１８ＫＥＸ２Δ１〜Δ６
をＥｃｏＲｒ　と５ａｌＩで切断してＫＥＸ２遺伝子を
含む断片を得た（第１０図）。一方、ｐＹＥ−ＫＥＸ２
（Ｒ１−Ｐｖｕ　Ｉｌ、）をＥｃｏＲＴ　と５ａｌＩで
切断し、ＫＥＸ２遺伝子が除かれたＤＮＡ断片を得た。

この両者を混合し、ｐＹＥ−ＫＥＸ２Δ１、Δ２、Δ３
、Δ４、Δ５、Δ６を得た。各々のＣ末端側の欠損は１
．’Ｏｋｂ、０、８　ｋｂ、　０．２　ｋｂ、０．３ｋ
ｂ、０．６５ｋｂ、０．７５ｋｂであった。以上、ＫＥ
Ｘ２Δ１〜Δ６のＣ末端はｐＵｃ１８−５ＴＯＰ（第９
図参照）由来の終始コドンで翻訳は終了するようになっ
ている。

ｕ　　Ｃ−ｆ　　ＦＩＫＥＸ２の’ｌＬｕ１実施例５で
得たプラスミドでに１６−５７株（ｋｅｘ２−８）を形
質転換した各々の株について、ｋｅｘ２変異の相補性及
びＢｒ１ｊ５８による易透過性にした細胞を用いたＢｏ
ｃ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣ八を基質としたとき
の酵素活性を第２表に示す。

以下余白 酵素活性は単位細胞湿重量当たりの活性である。

第２表から明らかなように、Ｃ末端よりの欠損が０．６
５ｋｂまでのものには酵素活性は認められ、それ以上の
欠損を有するものは酵素活性は認められなかった。ｋｅ
ｙ２変異の相補性は酵素活性の有無に相関した。すなわ
ち、０．６５ｋｂ以上欠損する場合にはｋｅｘ２変異の
相補性を認めなかった。

ス１１モ［、■立　　゛　　への）　゛・　　の　　−
・次に、ＫＥＸ２　（５，０）　、　ＫＥＸ２Δ２．Ｋ
ＥＸ２Δ３．’ＫＥＸ２Δ５゜ＫＥＸ２（Ｒ１−Ｐｖｕ
　ＩＩ　）について培養液上清の活性について、膜結合
型の活性と比較検討した。ｐＹＥ−ＫＥＸ２（５，０）
、ｐＹＥ−ＫＥＸ２Δ２．ｐＹＥ−ＫＥＸ２Δ３．ｐＹ
Ｅ−ＫＥＸ２Δ５及びｐＹＥ−ＫＥＸ２（ＲＩ−Ｐｖｕ
　ＩＩ　）で形質転換した各に１６−５７Ｃ株を、実施
例２で示した方法で培養した後、遠心分離により細胞と
培養液上清に分けた。上清画分をセントリコン３０　（
アミコン社製）により１５倍に濃縮したものを上清画分
の活性測定用酵素標品として用いた。一方、細胞を０．
１　Ｍ　）リス塩酸に懸濁し、ガラスピーズを用いて細
胞を破砕した。

破砕物を２，０００ｒｐｍ　１分間で遠心分離し、ガラ
スビ−ズと未破砕細胞を沈澱させた上清を１５．００Ｏ
ｒｐｍ５分間で遠心分離して得られる沈澱を０．１％の
ルブロール（牛丼化学薬品製）で溶解したものを膜画分
の活性測定用酵素標品として用いた。その結果を第３表
に示す。

以下余白 第３表から明らかなごと＜　、ｐＹＥ−ＫＥＸ２Δ５．
及びｐＹＥ−ＫＥＸ２（Ｆ！Ｉ−Ｐｖｕ　ＩＩ　）によ
る形質転換体は膜画分にはほとんど活性は認められない
が培地（上清画分）中ニハ活性を認めた。一方、ｐＹＥ
−ＫＥＸ２（５，０）、及びｐＹＥ４ＥＸ２Δ３の場合
は逆に培地（上滑両分）中にはほとんど活性が認められ
ないのに対し膜画分に多く活性を認めた。ｐＹＥ−ＫＥ
Ｘ２Δ２の場合は第２表でも活性が認められず、第３表
の結果もやはり両国分の活性は認められなかった。

以上の結果よりＣ末端近くの疎水性域を除くことにより
、培地中へ分泌されるＫＥＸ２産物が得られることが示
された。また、Ｃ末端の疎水性域は細胞内の膜構造体（
例えば、ゴルジ体）に結合するのに重要な機能を有して
いることが考えられる。

実隻炭工　可泊生ＪＫＥｘ２　　　の　　特次に、可溶
性ＫＥＸ２産物の基質特異性について検討した。実施例
７で示したＫＥＸ２（［−Ｐｖｕ　ＩＩ　）　　。

ＫＥＸ２Δ５については培養上清の濃縮液、ＫＥＸ２（
５，０）については膜画分を用いて、各種基質の分解性
を検討した（試料の調製方法は実施例７と同し）。

その結果を第４表に示す。

Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ　　１００％
　　　　１００％　　　　１００％Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ　　１００％　　　　１２４％　
　　　１１２％Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−八ｒｇ−ＭＣ
Ａ　　　　　８２％へ　　　　　　　　　　８７％　　
　　　　　　　　　９４％Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇ−ＭＣＡ　　　　　３６％　　　　　　　　　４４
％　　　　　　　　　４１％Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−ＭＣＡ　　　　　　＜０．２％　　　　　　　
　　　〈０．３％　　　　　　　　　　く０．５％Ｚ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ　　　　　　　　　　＜０．２
％　　　　　　　　〈０．３％　　　　　　　　〈０．
５％本　破砕細胞からの不活性画分を使用した。

＊＊　培養上清を使用した。

Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを基質として
用いた場合を１００％として他の基質に対する活性を相
対的に示した。第４表より培地中に分泌された酵素の基
質特異性はＫＥＸ２（５，０）の膜画分のものと同様で
あった。すなわち、可溶性となったものも本来のＫＥＸ
２の基質特異性（ＢＢＲＣ，１４４，８０７−８１４，
１９８７）を有していた。

〔発明の効果〕

以上のように、本発明によれば、ＫＥＸ２エンドプロテ
アーゼを組換え体細胞により大量に発現、生産させるこ
とができる。また、Ｃ末端の疎水性領域を欠損したＫＥ
Ｘ２エンドプロテアーゼを製造することができ、この酵
素は培地上滑中に分泌され、可溶性であり精製が極めて
容易である。この酵素を工業的に製造し、有用な生理活
性物質の生産に用いれば、その製造が容易かつ効率的に
できる。

【図面の簡単な説明】

第１−１図〜第１−５図は、ＫＥＸ２エンドプロテアー
ゼ遺伝子のアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡを
示す。 第２−１図〜第２−２図はｐＹＥ２０の作製方法を示す
図である。 第３図は、ＹＣｐＬｅベクターの作製方法を示す図であ
る。 第４−１図〜第４−２図は、ｋｅｘ２遺伝子の分離方法
及びｐＵｃ１８−ＫＥＸ２（５，０）の作製方法を示す
図である。 第５Ａ図は、ＫＦ！Ｘ２（ＲＩ）及びＫＥＸ２（５，０
）の制限酵素地図を示す図である。 第５Ｂ図は、塩基配列決定の方法（ｓ　ｔｒａ　ｔｅｇ
ｙ）を示す図である。 第６図は、ＫＥＸ２エンドプロテアーゼとサブチリシン
のアミン酸配列比較を示す図である。図中の番号は、Ｎ
末端からのアミノ酸の数を示している。 第７図は、ＫＥＸＩ産物とＫＥＸ２産物の構造の比較を
示す図である。Ｋ口ｘ１はＣｅ１１，５０．５７３−５
８４（１９８７）の報告を引用した。 第８図は、ＹＣｐＬ、ｅ−ＫＥＸ２（ＲＥ）ａ、　ＹＣ
ｐＬｅ−ＫＥＸ２（Ｒ１）ｂ及びｐＹＥ−ＫＥＸ２（Ｒ
Ｉ）ａ　、　ｐＹＥ−ＫＥＸ２（Ｒ１）ｂの作製方法を
示す図である。図中、（ａ）及び（ｂ）はＫＥＸ２遺伝
子の挿入方向を示す 第９図は、Ｉ］ＹＥ４ＥＸ２（Ｒ１−Ｐｖｕ　ＩＩ　）
の作製方法を示す図である。。 第１０図は、ｐＹＥ−ＫＥＸ２Δ１〜Δ６の作製方法を
示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組換えＤＮＡ技術により生産されるＫＥＸ２エンド
   プロテアーゼ。 ２、第１図に記載するアミノ酸配列を有する請求項１に
   記載のＫＥＸ２エンドプロテアーゼ。 ３、Ｃ末端側の疎水性領域を含む領域が欠損している可
   溶性ＫＥＸ２エンドプロテアーゼ。 ４、第１図に記載するアミノ酸配列においてＣ末端より
   １３６〜２２０個のアミノ酸が欠損したアミノ酸配列を
   有する請求項３に記載の可溶性ＫＥＸ２エンドプロテア
   ーゼ。 ５、ＫＥＸ２（ＥｃｏＲ I −ＰｖｕII）で表される請
   求項３に記載のＫＥＸ２エンドプロテアーゼ。 ６、ＫＥＸ２Δ５で表される請求項３に記載のＫＥＸ２
   エンドプロテアーゼ。 ７、請求項１に記載のＫＥＸ２エンドプロテアーゼをコ
   ードするＤＮＡ。 ８、第１図におけるＤＮＡ配列番号が１から２４４２で
   ある請求項７に記載のＤＮＡ。 ９、請求項３に記載の可溶性ＫＥＸ２エンドプロテアー
   ゼをコードするＤＮＡ。 １０、第１図におけるＤＮＡ配列番号が１から２４４２
   であるＤＮＡ配列のうち３′末端から４０８〜６６０個
   の塩基対が欠損している請求項９に記載のＤＮＡ。 １１、請求項３に記載の可溶性ＫＥＸ２エンドプロテア
   ーゼをコードするＤＮＡを含有する発現プラスミド。 １２、ｐＹＥ−ＫＥＸ２（ＥｃｏＲ I −ＰｖｕII）又
   はｐＹＥ−ＫＥＸ２Δ５である請求項１１に記載の発現
   プラスミド。 １３、請求項３に記載の可溶性ＫＥＸ２エンドプロテア
   ーゼをコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドによ
   り形質転換された組換え体。 １４、請求項１に記載のＫＥＸ２エンドプロテアーゼを
   コードしているＤＮＡを含有し、これを発現させること
   ができるプラスミドにより形質転換された組換体を培養
   することにより該酵素を生成させ、これを採取すること
   を特徴とするＫＥＸ２エンドプロテアーゼの製造方法。 １５、請求項３に記載の可溶性ＫＥＸ２エンドプロテア
   ーゼをコードしているＤＮＡを含有し、これを発現させ
   ることができるプラスミドにより形質転換された組換体
   を培養することにより該酵素を生成させ、これを採取す
   ることを特徴とする可溶性ＫＥＸ２エンドプロテアーゼ
   の製造方法。 １６、可溶性ＫＥＸ２エンドプロテアーゼがＫＥＸ２（
   ＥｃｏＲ I −ＰｖｕII）またはＫＥＸ２Δ５である請
   求項１４に記載の製造方法。 １７、生理活性ペプチドまたは蛋白質（以下、生理活性
   物質）の製造方法において、該生理活性物質の両端また
   は片側に、ＫＥＸ２エンドプロテアーゼの基質となりえ
   るアミノ酸配列を有する前駆体または融合蛋白質に、水
   性媒体中で、請求項１に記載のＫＥＸ２エンドプロテア
   ーゼ又は請求項３に記載の可溶性ＫＥＸ２エンドプロテ
   アーゼを作用させることにより、該前駆体または融合蛋
   白質より目的とする該生理活性物質を生成せしめ、そし
   てこれを採取することを特徴とする生理活性物質の製造
   方法。 １８、ＫＥＸ２エンドプロテアーゼの基質となりえるア
   ミノ酸配列が、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、また
   はＰｒｏ−Ａｒｇである請求項１７に記載の製造方法。 １９、前記可溶性ＫＥＸ２エンドプロテアーゼがＫＥＸ
   ２（ＥｃｏＲ I −ＰｖｕII）またはＫＥＸ２Δ５であ
   る請求項１７に記載の製造方法。