JPH04148694A - ペプチド又は蛋白質の製造方法 - Google Patents
ペプチド又は蛋白質の製造方法Info
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- JPH04148694A JPH04148694A JP2271880A JP27188090A JPH04148694A JP H04148694 A JPH04148694 A JP H04148694A JP 2271880 A JP2271880 A JP 2271880A JP 27188090 A JP27188090 A JP 27188090A JP H04148694 A JPH04148694 A JP H04148694A
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- C07K14/57563—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、遺伝子組換え技術を利用して、宿主によりペ
プチド又は蛋白質を融合蛋白質として生産した後、特異
的なプロテアーゼなどを作用させて、ペプチド又は蛋白
質を生産するペプチド又は蛋白質の製造方法に関する。
プチド又は蛋白質を融合蛋白質として生産した後、特異
的なプロテアーゼなどを作用させて、ペプチド又は蛋白
質を生産するペプチド又は蛋白質の製造方法に関する。
［従来の技術と発明が解決しようとする課題］遺伝子組
換え技術を利用して、異種のペプチドや蛋白質を生産す
る場合、目的遺伝子産物を直接発現させても、大量生産
できない場合か多い。その理由として、開始コドン近傍
のｍＲＮＡの高次構造の影響により、目的遺伝子の翻訳
開始反応が阻害されること［Ｄ、 １ｓｅｒｅｎＬａｎ
Ｌ、 Ｅ、 Ｆｉｃｒｓ、 Ｇｅｎｅ９ 、 ｌ （１
９８Ｇ）］ 、目的遺伝子産物が低分子量である場合に
は、特に宿主由来のプロテアーゼにより分解され易いこ
となどが指摘されている。
換え技術を利用して、異種のペプチドや蛋白質を生産す
る場合、目的遺伝子産物を直接発現させても、大量生産
できない場合か多い。その理由として、開始コドン近傍
のｍＲＮＡの高次構造の影響により、目的遺伝子の翻訳
開始反応が阻害されること［Ｄ、 １ｓｅｒｅｎＬａｎ
Ｌ、 Ｅ、 Ｆｉｃｒｓ、 Ｇｅｎｅ９ 、 ｌ （１
９８Ｇ）］ 、目的遺伝子産物が低分子量である場合に
は、特に宿主由来のプロテアーゼにより分解され易いこ
となどが指摘されている。
これらの問題を解決する方法として融合蛋白質法が注目
されている。この融合蛋白質法では、宿主内で安定でか
つ多量に生産されるペプチド又は蛋白質などのキャリア
ーと、目的とするペプチド又は蛋白質とを融合させて生
産する。なお、この融合蛋白質法には、一般的な蛋白質
の範喘、すなわちアミノ酸数が５０未満のキャリアーを
用いる場合も含まれる。しかしながら、融合蛋白質とし
て直接発現させる場合にも、宿主内のメチオニンアミノ
ペプチダーゼによるプロセシングが不完全であるため、
開始コドンに由来するメチオニンが、完全には除去され
ずに残存し、Ｎ末端にメチオニンが付加した目的遺伝子
産物が得られる場合が多い。このメチオニンが付加した
遺伝子産物は、抗原性に問題が生じる可能性が指摘され
ている（特開昭６２−１７１６９９号公報）。従って、
このような融合蛋白質やメチオニンが付加した遺伝子産
物から［１的とするペプチド又は蛋白質を得るためには
、融合蛋白質等から［１的とする部分のみを切りだす必
要がある。この切りだし方法として、従来、化学的な方
法と、酵素的な方法が知られている。
されている。この融合蛋白質法では、宿主内で安定でか
つ多量に生産されるペプチド又は蛋白質などのキャリア
ーと、目的とするペプチド又は蛋白質とを融合させて生
産する。なお、この融合蛋白質法には、一般的な蛋白質
の範喘、すなわちアミノ酸数が５０未満のキャリアーを
用いる場合も含まれる。しかしながら、融合蛋白質とし
て直接発現させる場合にも、宿主内のメチオニンアミノ
ペプチダーゼによるプロセシングが不完全であるため、
開始コドンに由来するメチオニンが、完全には除去され
ずに残存し、Ｎ末端にメチオニンが付加した目的遺伝子
産物が得られる場合が多い。このメチオニンが付加した
遺伝子産物は、抗原性に問題が生じる可能性が指摘され
ている（特開昭６２−１７１６９９号公報）。従って、
このような融合蛋白質やメチオニンが付加した遺伝子産
物から［１的とするペプチド又は蛋白質を得るためには
、融合蛋白質等から［１的とする部分のみを切りだす必
要がある。この切りだし方法として、従来、化学的な方
法と、酵素的な方法が知られている。
化学的な方法としては、例えば、臭化シアンによるＭｅ
ｔのＣ末端側の切断［Ｄ、 Ｖ、 Ｇｏａｄｄｅｌ、
ｅｔ ａｔ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１１． Ａｃａｄ、
Ｓｃ１．ＵＳＡ ７Ｌ ＪＯＢ−１１０（１９７９）
］ 、Ｂ Ｎ Ｆ Ｓ−スカトール（ＳｋａＬｏｌ）や
Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣ３）によるＴｒｐのＣ
末端側の切断［Ｙ、 ５ａｌｔｏ、 ｅｔ ａｌ、、
Ｊ、 Ｂ［ｏｃｈｅｍ、ｌｏｌ、 １２３−１３４ （
１９８７）］ 、７０％ギ酸などの酸によるＡｓｐ
Ｐｒｏ間の切断［Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｌｏｐｈｙｓ、
Ｒｅｓ、 Ｃｏｗｖｕｎ、、 ４０． ＩＩＬＩ
（１９７０） ］ 、ヒドロキシアミンによるＡｓｎ−
Ｇｌ）’間の切断などが知られている。しかしながら、
基質融合蛋白質の構造依存性が強いため、臭化シアンに
よる切断を除いて、切断反応による収率は低く、副反応
も生じ易い。臭化シアンによる切断は広く利用されてい
るが一目的とする遺伝子産物中にＭｅｔが存在する場合
には、利用できないだけでな（、Ｍｅｔの次のアミノ酸
が５ｅｒＳＴｈｒである場合には、殆ど切断反応が起ら
ない場合がある。また、Ａｓｐ−Ｐｒｏ間、Ａｓｎ−Ｇ
ｌｙ間を切断する場合には、切断後に生成するペプチド
又は蛋白質のＮ末端側及びＣ末端側の双方にアミノ酸が
残存するため、切断により、Ｎ末端、Ｃ末端に目的とす
るアミノ酸配列を有する遺伝子産物を得るのが困難であ
る。
ｔのＣ末端側の切断［Ｄ、 Ｖ、 Ｇｏａｄｄｅｌ、
ｅｔ ａｔ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａ１１． Ａｃａｄ、
Ｓｃ１．ＵＳＡ ７Ｌ ＪＯＢ−１１０（１９７９）
］ 、Ｂ Ｎ Ｆ Ｓ−スカトール（ＳｋａＬｏｌ）や
Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣ３）によるＴｒｐのＣ
末端側の切断［Ｙ、 ５ａｌｔｏ、 ｅｔ ａｌ、、
Ｊ、 Ｂ［ｏｃｈｅｍ、ｌｏｌ、 １２３−１３４ （
１９８７）］ 、７０％ギ酸などの酸によるＡｓｐ
Ｐｒｏ間の切断［Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｌｏｐｈｙｓ、
Ｒｅｓ、 Ｃｏｗｖｕｎ、、 ４０． ＩＩＬＩ
（１９７０） ］ 、ヒドロキシアミンによるＡｓｎ−
Ｇｌ）’間の切断などが知られている。しかしながら、
基質融合蛋白質の構造依存性が強いため、臭化シアンに
よる切断を除いて、切断反応による収率は低く、副反応
も生じ易い。臭化シアンによる切断は広く利用されてい
るが一目的とする遺伝子産物中にＭｅｔが存在する場合
には、利用できないだけでな（、Ｍｅｔの次のアミノ酸
が５ｅｒＳＴｈｒである場合には、殆ど切断反応が起ら
ない場合がある。また、Ａｓｐ−Ｐｒｏ間、Ａｓｎ−Ｇ
ｌｙ間を切断する場合には、切断後に生成するペプチド
又は蛋白質のＮ末端側及びＣ末端側の双方にアミノ酸が
残存するため、切断により、Ｎ末端、Ｃ末端に目的とす
るアミノ酸配列を有する遺伝子産物を得るのが困難であ
る。
酵素的な方法として、切断されるペプチド結合の前（Ｐ
ｉ位）又は後（ＰＩ’位）のアミノ酸に対する特異性、
すなわち、１次特異性の厳密なプロテアーゼを利用した
切断方法、例えば、トリプシン、エンドブロティナーゼ
などのトリプシン様酵素によるＡｒｇ、ＬｙｓのＣ末端
側の切断［Ｊ、 ５ｈｌｎｅ。
ｉ位）又は後（ＰＩ’位）のアミノ酸に対する特異性、
すなわち、１次特異性の厳密なプロテアーゼを利用した
切断方法、例えば、トリプシン、エンドブロティナーゼ
などのトリプシン様酵素によるＡｒｇ、ＬｙｓのＣ末端
側の切断［Ｊ、 ５ｈｌｎｅ。
ｅｔ ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ、２８５．４５６−４８
１ （Ｊ９８０）コ、リジルエンドペプチダーゼ、エン
ドブロテイナーゼＬｙｓ−ＣなどによるＬｙｓのＣ末端
側の切断（特開昭（ｉｔ−２７５２２２号公報）、酸性
アミノ酸に特異的なり８プロテアーゼなどの酵素にょる
Ｇｌｕ％ＡｓｐのＣ末端側の切断（特公表昭８０−５０
１！１９１号公報）などが知られている。しかしながら
、これらのプロテアーゼは、一般に、その認識アミノ酸
が目的遺伝子産物に含まれていない場合にのみ有効であ
り、非常に限定された遺伝子産物にしが適用できない。
１ （Ｊ９８０）コ、リジルエンドペプチダーゼ、エン
ドブロテイナーゼＬｙｓ−ＣなどによるＬｙｓのＣ末端
側の切断（特開昭（ｉｔ−２７５２２２号公報）、酸性
アミノ酸に特異的なり８プロテアーゼなどの酵素にょる
Ｇｌｕ％ＡｓｐのＣ末端側の切断（特公表昭８０−５０
１！１９１号公報）などが知られている。しかしながら
、これらのプロテアーゼは、一般に、その認識アミノ酸
が目的遺伝子産物に含まれていない場合にのみ有効であ
り、非常に限定された遺伝子産物にしが適用できない。
１次特異性だけでなく、切断されるペプド結合周辺の配
列に対する特異性、すなわち２次特異性が厳密な酵素も
利用されている。例えば、コラゲナーゼによるチッケン
ブｏ （ｃｈｌｃｋｅｎ ｐｒｏ） ａ −２コラーゲ
ン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）やＰｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
のＸ−Ｇ Ｉ Ｖ間の切断［特公昭６２−４４９２０号
公報、Ｊ、 Ｇｅｒｍｊｎｏ、 ｅｔ ａｔ、、 Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａ１１． Ａｃａｄ、 Ｓｃ１、 ＵＳＡ、
８１．４６９２−４１１９６ （１９８４）］ 、血
血液凝固壬子ａによるＩ ｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇのＣ末端側の切断（特開昭６１−１３５５９１号公報
）、トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）ｌこよるＧｌｙ−
Ｐｒｏ−ＡｒｇなどのＣ末端側の切断（特開昭［１２−
１３５５００号公報）カリクレイン（Ｋａｌ Ｉ １ｋ
ｒｏｉｎ）にょるＰｈｅ−ＡｒｇのＣ末端側の切断（特
開昭６２−２４８４８９１１号公報）、エンテロペプチ
ダーゼ（Ｅｎｔｅｒｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）にょるＶａ
１−Ａｓ ｐ−Ａｓ ｐ−Ａｓ ｐ−Ａｓ ｐ−Ｌｙ
ＳのＣ末端側の切断［Ｔ、 Ｐ、 ｌ１ｏｐｐ、 、ｃ
ｔ ａｌ 、 、 ＢｉｏＬｏｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ６
、１２０４−１２１０ （１９８ｇ）及び特開昭５６
−１６６２００号公報１、レニン（ｒｅｎｉｎ）による
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ １−
Ｔｙ「のＬｅｕ−Ｌｅｕ間の切断（特開昭６０−２６２
５９５号公報）、リゾスタフィン（Ｌｙｓｏｓｔａｐｈ
ｌｎ） ニよルポリ（ｐｏｌｙ） −Ｇ ｌ ｙのＣ末
端側の切断（特開平ｌ−１６０４９６号公報）、ユビキ
チン（Ｕｂｌｑｕｌｔｌｎ） −Ｎ ａ−プロティンヒ
ドロラーゼ（ｐｒｏｔａｌｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）に
よるユビキチン（Ｕｂｉｑｕｌｔｌｎ）のＣ末端側の切
断（Ｔ、 Ｒ，Ｂｕｔｔ、 ａｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｆ。
列に対する特異性、すなわち２次特異性が厳密な酵素も
利用されている。例えば、コラゲナーゼによるチッケン
ブｏ （ｃｈｌｃｋｅｎ ｐｒｏ） ａ −２コラーゲ
ン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）やＰｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
のＸ−Ｇ Ｉ Ｖ間の切断［特公昭６２−４４９２０号
公報、Ｊ、 Ｇｅｒｍｊｎｏ、 ｅｔ ａｔ、、 Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａ１１． Ａｃａｄ、 Ｓｃ１、 ＵＳＡ、
８１．４６９２−４１１９６ （１９８４）］ 、血
血液凝固壬子ａによるＩ ｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇのＣ末端側の切断（特開昭６１−１３５５９１号公報
）、トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）ｌこよるＧｌｙ−
Ｐｒｏ−ＡｒｇなどのＣ末端側の切断（特開昭［１２−
１３５５００号公報）カリクレイン（Ｋａｌ Ｉ １ｋ
ｒｏｉｎ）にょるＰｈｅ−ＡｒｇのＣ末端側の切断（特
開昭６２−２４８４８９１１号公報）、エンテロペプチ
ダーゼ（Ｅｎｔｅｒｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）にょるＶａ
１−Ａｓ ｐ−Ａｓ ｐ−Ａｓ ｐ−Ａｓ ｐ−Ｌｙ
ＳのＣ末端側の切断［Ｔ、 Ｐ、 ｌ１ｏｐｐ、 、ｃ
ｔ ａｌ 、 、 ＢｉｏＬｏｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ６
、１２０４−１２１０ （１９８ｇ）及び特開昭５６
−１６６２００号公報１、レニン（ｒｅｎｉｎ）による
Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ １−
Ｔｙ「のＬｅｕ−Ｌｅｕ間の切断（特開昭６０−２６２
５９５号公報）、リゾスタフィン（Ｌｙｓｏｓｔａｐｈ
ｌｎ） ニよルポリ（ｐｏｌｙ） −Ｇ ｌ ｙのＣ末
端側の切断（特開平ｌ−１６０４９６号公報）、ユビキ
チン（Ｕｂｌｑｕｌｔｌｎ） −Ｎ ａ−プロティンヒ
ドロラーゼ（ｐｒｏｔａｌｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）に
よるユビキチン（Ｕｂｉｑｕｌｔｌｎ）のＣ末端側の切
断（Ｔ、 Ｒ，Ｂｕｔｔ、 ａｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｆ。
ＵＳＡ、 ８６．２５４０−２５４４ （ｌＨ９）］
、ウロキナーゼ（Ｕｒｏｋｌｎａｓａ）によるＧｌｕ
−Ｇｌｙ−ＡｒｇのＣ末端側の切断（特開平２−１００
６８５号公報）などが報告されている。しかしながら、
コラゲナーゼ、レニンによる分解では、切断部位のＮ末
端側及びＣ末端側の双方にペプチドが残存するため、目
的とするアミノ酸配列を有する遺伝子産物を得るのが困
難である。トロンビンを始めとする多くの酵素は、その
認識配列以外の部位をも切断することが報告され、特異
性が低いので汎用性に欠ける［Ｊ、 Ｙ。
、ウロキナーゼ（Ｕｒｏｋｌｎａｓａ）によるＧｌｕ
−Ｇｌｙ−ＡｒｇのＣ末端側の切断（特開平２−１００
６８５号公報）などが報告されている。しかしながら、
コラゲナーゼ、レニンによる分解では、切断部位のＮ末
端側及びＣ末端側の双方にペプチドが残存するため、目
的とするアミノ酸配列を有する遺伝子産物を得るのが困
難である。トロンビンを始めとする多くの酵素は、その
認識配列以外の部位をも切断することが報告され、特異
性が低いので汎用性に欠ける［Ｊ、 Ｙ。
Ｃｈａｎｇ、 Ｐ、ｕｒ、 Ｊ、旧ｏｃｈｅ＋ｗ、 ｌ
ｉ弓、 ２１７−２２４ （１９１１５）などコ。融
合蛋白質から目的遺伝子産物を切りだすため、血液凝固
因子Ｘａは、現在量も広く利用されているが、特異的認
識配列以外の部位をも分解するため、目的遺伝子産物が
得られない例が報告されており［Ｓ、 Ｎ１５ｈｌｋａ
ｖａ、 ａｔ ａｌ、、 Ｉ’ｒｏｔｏｌｎＥｎｇｉｎ
ｅｅｒ、 １ 、４８７−４９２ （ｌＨ７）など］
、汎用性に欠ける。例えば、血液凝固因子Ｘａ、カリク
レインを用いて、融合蛋白質から、目的遺伝子産物とし
て、バソアクティブ・インテステイナル・ポリペプチド
［Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｐｏ
１ｙｐｃｐＬｉｄｅ（以下、ＶＩＰと略称する）］誘導
体を切りだす場合には、ＶＩＰ内部、例えば、Ａｒｇ１
４−Ｌｙｓ間などで切断が生じるため、ＶＩＰ誘導体は
得られない。さらに、これらのプロテアーゼの使用量は
、基質融合蛋白質１モルに対して、０．１〜０．００１
モル、通常０．０１モル程度であり、かなりの酵素量を
必要とする。
ｉ弓、 ２１７−２２４ （１９１１５）などコ。融
合蛋白質から目的遺伝子産物を切りだすため、血液凝固
因子Ｘａは、現在量も広く利用されているが、特異的認
識配列以外の部位をも分解するため、目的遺伝子産物が
得られない例が報告されており［Ｓ、 Ｎ１５ｈｌｋａ
ｖａ、 ａｔ ａｌ、、 Ｉ’ｒｏｔｏｌｎＥｎｇｉｎ
ｅｅｒ、 １ 、４８７−４９２ （ｌＨ７）など］
、汎用性に欠ける。例えば、血液凝固因子Ｘａ、カリク
レインを用いて、融合蛋白質から、目的遺伝子産物とし
て、バソアクティブ・インテステイナル・ポリペプチド
［Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｐｏ
１ｙｐｃｐＬｉｄｅ（以下、ＶＩＰと略称する）］誘導
体を切りだす場合には、ＶＩＰ内部、例えば、Ａｒｇ１
４−Ｌｙｓ間などで切断が生じるため、ＶＩＰ誘導体は
得られない。さらに、これらのプロテアーゼの使用量は
、基質融合蛋白質１モルに対して、０．１〜０．００１
モル、通常０．０１モル程度であり、かなりの酵素量を
必要とする。
一方、キャリアー配列と、目的遺伝子コードするＤＮＡ
配列とを、ジペプチドからなるプロセシングシグナルを
介して連結し、融合蛋白質を生産し、前記ジペプチドを
酵素的に切断することにより、目的遺伝子産物を取得す
る方法も知られている。例えば、前記ジペプチド、特に
塩基性アミノ酸残基対を利用した目的遺伝子産物の取得
方法として、酵母サツカロマイセス・セレビシェ（Ｓａ
ｅｃｈａｒｏｍｙｃｏｓ ｃｅｒｏｖｌｓｆａｅ）の
生産するａ−接合因子のプレプロリーダー配列（Ｌ ｙ
ｓ −Ａ ｒ ｇを含む）を利用して目的遺伝子産物
を分泌生産する方法（特開昭５９−１３２８９２号公報
）やフライベロマイセス・ラクテイス（Ｋｌｕｙｖｅｒ
ｏｓｙｃｅｓ １ａｅｔｌｓ）のα−接合因子のプレ
プロリーダー配列を利用して目的遺伝子産物を分泌生産
する方法（特開平！−１２４３９０号公報）などが報告
されている。これらの方法では、融合蛋白質がインビボ
（ｉｎ ｖｌｖｏ）で限定分解された後、目的遺伝子産
物が菌体外に分泌生産される。しかしながら、これらの
方法は、特殊な宿主、例えば、塩基性アミノ酸残基対に
おける切断、分泌、糖鎖の付加などのプロセシングシス
テムを有するサツカロマイセス・セレビシェ、フライベ
ロマイセス・ラクティスや動物細胞Ａｔ７２０ｃｃ目１
ｉｎｅなどを用いた場合にのみ利用可能であり、一般的
な方法ではない。また、これらの系を用いる場合には、
プロセシングが不完全な遺伝子産物、すなわち、プレプ
ロリーダー配列に由来するＧｌｕ−Ａｌａ配列などが付
加された遺伝子産物が生成すること（特開昭５９−１３
２８９２号公報、特公表昭１ｉ２−５０２ｆｉ６１号公
報など）、各種のプロテオリシス、グリコシレージョン
などのプロセシングの様々なステップが律速となるため
、生産効率が一般に低く、生産量が少ないなどの問題が
ある。
配列とを、ジペプチドからなるプロセシングシグナルを
介して連結し、融合蛋白質を生産し、前記ジペプチドを
酵素的に切断することにより、目的遺伝子産物を取得す
る方法も知られている。例えば、前記ジペプチド、特に
塩基性アミノ酸残基対を利用した目的遺伝子産物の取得
方法として、酵母サツカロマイセス・セレビシェ（Ｓａ
ｅｃｈａｒｏｍｙｃｏｓ ｃｅｒｏｖｌｓｆａｅ）の
生産するａ−接合因子のプレプロリーダー配列（Ｌ ｙ
ｓ −Ａ ｒ ｇを含む）を利用して目的遺伝子産物
を分泌生産する方法（特開昭５９−１３２８９２号公報
）やフライベロマイセス・ラクテイス（Ｋｌｕｙｖｅｒ
ｏｓｙｃｅｓ １ａｅｔｌｓ）のα−接合因子のプレ
プロリーダー配列を利用して目的遺伝子産物を分泌生産
する方法（特開平！−１２４３９０号公報）などが報告
されている。これらの方法では、融合蛋白質がインビボ
（ｉｎ ｖｌｖｏ）で限定分解された後、目的遺伝子産
物が菌体外に分泌生産される。しかしながら、これらの
方法は、特殊な宿主、例えば、塩基性アミノ酸残基対に
おける切断、分泌、糖鎖の付加などのプロセシングシス
テムを有するサツカロマイセス・セレビシェ、フライベ
ロマイセス・ラクティスや動物細胞Ａｔ７２０ｃｃ目１
ｉｎｅなどを用いた場合にのみ利用可能であり、一般的
な方法ではない。また、これらの系を用いる場合には、
プロセシングが不完全な遺伝子産物、すなわち、プレプ
ロリーダー配列に由来するＧｌｕ−Ａｌａ配列などが付
加された遺伝子産物が生成すること（特開昭５９−１３
２８９２号公報、特公表昭１ｉ２−５０２ｆｉ６１号公
報など）、各種のプロテオリシス、グリコシレージョン
などのプロセシングの様々なステップが律速となるため
、生産効率が一般に低く、生産量が少ないなどの問題が
ある。
従って、本発明の目的は、汎用性があり、大量処理が可
能なペプチド又は蛋白質の製造方法を提供することにあ
る。
能なペプチド又は蛋白質の製造方法を提供することにあ
る。
本発明の他の目的は、広い範囲の宿主微生物により異種
の融合蛋白質を生産させ、特異性の強い酵素により、融
合蛋白質から目的遺伝子産物を効率よく切りだすことが
できるペプチド又は蛋白質の製造方法を提供することに
ある。
の融合蛋白質を生産させ、特異性の強い酵素により、融
合蛋白質から目的遺伝子産物を効率よく切りだすことが
できるペプチド又は蛋白質の製造方法を提供することに
ある。
本発明のさらに他の目的は、融合蛋白質を生産した後、
インビトロ（ｉｎ ｖＩｔｒｏ）で分解するペプチド又
は蛋白質の製造方法を提供することにある。
インビトロ（ｉｎ ｖＩｔｒｏ）で分解するペプチド又
は蛋白質の製造方法を提供することにある。
［発明の構成］
本発明は、多くの生理活性ペプチドや蛋白質が、Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−ＬｙｓＳＬｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−
Ａｒｇなどのジペプチドをプロセシングシグナルとし、
前駆体からペプチド又は成熟型蛋白質へとプロセシング
されることから、多くの生理活性ペプチド及び成熟型の
蛋白質内には、これらのジペプチドが存在しない場合が
多い点に着目してなされたものである。本発明では、こ
れらのプロセシングシグナルであるジペプチドをコード
する塩基配列を、キャリアーと、目的遺伝子産物をコー
ドするＤＮＡ断片との間に挿入し、宿主微生物により、
目的遺伝子産物を融合蛋白質として生産する。融合蛋白
質に、前記ジペプチドを特異的に認識し、かつジペプチ
ドのＣ末端側、Ｎ末端側、またはジペプチド間を特異的
に加水分解するプロテアーゼ：または前記プロテアーゼ
と、Ｎ末端側から特異的に塩基性アミノ酸残基を遊離す
るアミノペプチダーゼや、Ｃ末端側から特異的に塩基性
アミノ酸残基を遊離するカルボキシペプチダーゼとを適
当に組合わせて作用させる場合には、目的とするペプチ
ド又は蛋白質が成熟型で得られることを見いだした。す
なわち、本発明は、下記式［１ａ］又は［１ｂ］ Ａ−Ｂ−Ｃ［Ｉａｌ Ｃ−Ｂ−Ａ ［１ｂ］［式中、Ａは
キャリアーを示し、Ｂは酵素的に切断可能なＸ＋ −Ｘ
２ （Ｘ＋は、ＡのＣ末端に結合したＬｙｓ、Ａｒｇ
又はＰｒｏを示し、Ｘ２は、ＣのＮ末端に結合したＬｙ
ｓ又はＡｒｇを示す。
−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−ＬｙｓＳＬｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−
Ａｒｇなどのジペプチドをプロセシングシグナルとし、
前駆体からペプチド又は成熟型蛋白質へとプロセシング
されることから、多くの生理活性ペプチド及び成熟型の
蛋白質内には、これらのジペプチドが存在しない場合が
多い点に着目してなされたものである。本発明では、こ
れらのプロセシングシグナルであるジペプチドをコード
する塩基配列を、キャリアーと、目的遺伝子産物をコー
ドするＤＮＡ断片との間に挿入し、宿主微生物により、
目的遺伝子産物を融合蛋白質として生産する。融合蛋白
質に、前記ジペプチドを特異的に認識し、かつジペプチ
ドのＣ末端側、Ｎ末端側、またはジペプチド間を特異的
に加水分解するプロテアーゼ：または前記プロテアーゼ
と、Ｎ末端側から特異的に塩基性アミノ酸残基を遊離す
るアミノペプチダーゼや、Ｃ末端側から特異的に塩基性
アミノ酸残基を遊離するカルボキシペプチダーゼとを適
当に組合わせて作用させる場合には、目的とするペプチ
ド又は蛋白質が成熟型で得られることを見いだした。す
なわち、本発明は、下記式［１ａ］又は［１ｂ］ Ａ−Ｂ−Ｃ［Ｉａｌ Ｃ−Ｂ−Ａ ［１ｂ］［式中、Ａは
キャリアーを示し、Ｂは酵素的に切断可能なＸ＋ −Ｘ
２ （Ｘ＋は、ＡのＣ末端に結合したＬｙｓ、Ａｒｇ
又はＰｒｏを示し、Ｘ２は、ＣのＮ末端に結合したＬｙ
ｓ又はＡｒｇを示す。
但し、ＸｌがＰｒｏであるとき、Ｘ２はＡｒｇである）
で表されるジペプチドを示す。Ｃは目的とするペプチド
又は蛋白質を示す〕で表される融合蛋白質を宿主微生物
により生産した後、少なくとも、前記ジペプチドを特異
的に認識し、かつジペプチドのペプチド結合を特異的に
加水分解するプロテアーゼで処理するペプチド又は蛋白
質の製造方法を提供する。
で表されるジペプチドを示す。Ｃは目的とするペプチド
又は蛋白質を示す〕で表される融合蛋白質を宿主微生物
により生産した後、少なくとも、前記ジペプチドを特異
的に認識し、かつジペプチドのペプチド結合を特異的に
加水分解するプロテアーゼで処理するペプチド又は蛋白
質の製造方法を提供する。
また、本発明は、少なくとも、下記式［ＩＩ］又［］
％式％［ＩＩ］
［］
［式中、Ｂは酵素的に切断可能なｘ、−ｘ２（Ｘ＋ は
、Ｌｙｓ％Ａｒｇ又はＰｒｏを示し、Ｘ２は、Ｌｙｓ又
はＡｒｇを示す。但し、Ｘ盲がＰｒｏであるとき、Ｘ２
はＡｒｇである）で表されるジペプチドを示す。Ｃは目
的とするペプチド又は蛋白質、ｎは２以上の整数を示す
］で表される単位を含む融合蛋白質を宿主微生物により
生産した後、少なくとも、前記ジペプチドを特異的に認
識し、かつジペプチドのペプチド結合を特異的に加水分
解するプロテアーゼで処理するペプチド又は蛋白質の製
造方法を提供する。
、Ｌｙｓ％Ａｒｇ又はＰｒｏを示し、Ｘ２は、Ｌｙｓ又
はＡｒｇを示す。但し、Ｘ盲がＰｒｏであるとき、Ｘ２
はＡｒｇである）で表されるジペプチドを示す。Ｃは目
的とするペプチド又は蛋白質、ｎは２以上の整数を示す
］で表される単位を含む融合蛋白質を宿主微生物により
生産した後、少なくとも、前記ジペプチドを特異的に認
識し、かつジペプチドのペプチド結合を特異的に加水分
解するプロテアーゼで処理するペプチド又は蛋白質の製
造方法を提供する。
なお、従来、塩基性アミノ酸残基対に特異的なプロテア
ーゼを、異種の宿主により生産した融合蛋白質に作用さ
せて、目的とする遺伝子産物を得た報告は存在しない。
ーゼを、異種の宿主により生産した融合蛋白質に作用さ
せて、目的とする遺伝子産物を得た報告は存在しない。
また、本発明には、適当な化学修飾法、例えばＬｙｓの
無水シトラコン酸による可逆的修飾などとの組合せによ
るペプチド又は蛋白質の製造方法も含まれる。
無水シトラコン酸による可逆的修飾などとの組合せによ
るペプチド又は蛋白質の製造方法も含まれる。
本明細書においては、ペプチドは、通常の配列記載方法
に従って、左側をＮ末端側、右側をＣ末端側とする。
に従って、左側をＮ末端側、右側をＣ末端側とする。
以下に、本発明の詳細な説明する。
キャリアーＡは、宿主微生物により菌体内、菌体外、ペ
リプラズム内に生産されるペプチド又は蛋白質である限
り、制限されないが、ジペプチドｘ、−ｘ２が存在しな
いのが好ましい。このようなキャリアーＡとしては、例
えば、α−アミラーゼ、中性又はアルカリ性プロテアー
ゼ、セルラーゼ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ、ＲｅｃＡ蛋白質、ｔｒｐＥ、ヒトインターロイキン
−２、ヒト成長ホルモン、ジヒドロ葉酸還元酵素、プロ
ティンＡ、λｃｌｌ、アルカリフォスファターゼ、ベニ
シリナーゼなどの全部又はその一部；これらの誘導体が
挙げられる。前記誘導体には、Ｃｙｓが除去又は置換さ
れたもの、ＣｙＳを付加したもの、ジペプチドＸ１．−
Ｘ２などの内在配列を除去したものなどが含まれる。
リプラズム内に生産されるペプチド又は蛋白質である限
り、制限されないが、ジペプチドｘ、−ｘ２が存在しな
いのが好ましい。このようなキャリアーＡとしては、例
えば、α−アミラーゼ、中性又はアルカリ性プロテアー
ゼ、セルラーゼ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ、ＲｅｃＡ蛋白質、ｔｒｐＥ、ヒトインターロイキン
−２、ヒト成長ホルモン、ジヒドロ葉酸還元酵素、プロ
ティンＡ、λｃｌｌ、アルカリフォスファターゼ、ベニ
シリナーゼなどの全部又はその一部；これらの誘導体が
挙げられる。前記誘導体には、Ｃｙｓが除去又は置換さ
れたもの、ＣｙＳを付加したもの、ジペプチドＸ１．−
Ｘ２などの内在配列を除去したものなどが含まれる。
キャリアーＡは、場合によっては、アミノ酸であっても
よい。また、キャリアーＡには、開始コドンに由来する
Ｍｅｔのみを目的遺伝子産物の直前、又は１〜数十のア
ミノ酸を介して、プロセシングシグナルのＮ末端側に結
合した融合蛋白質をコードする配列も含まれる。
よい。また、キャリアーＡには、開始コドンに由来する
Ｍｅｔのみを目的遺伝子産物の直前、又は１〜数十のア
ミノ酸を介して、プロセシングシグナルのＮ末端側に結
合した融合蛋白質をコードする配列も含まれる。
好ましいキャリアーには、黄色ブドウ状球菌［スタフィ
ロコッカス・アウレウス（ＳｔａｐｈｙｌｏｅｏｃＣｕ
ｓ ａｕｒｃｕｓ） ］由来のプロティンＡなどが含ま
れる。このプロティンＡは、遺伝子の発現に関与するプ
ロモーター領域とリポソーム結合部位とを有している。
ロコッカス・アウレウス（ＳｔａｐｈｙｌｏｅｏｃＣｕ
ｓ ａｕｒｃｕｓ） ］由来のプロティンＡなどが含ま
れる。このプロティンＡは、遺伝子の発現に関与するプ
ロモーター領域とリポソーム結合部位とを有している。
プロモーター領域は、例えば、黄色ブドウ状球菌８３２
５−４株［ウーレンら、Ｊ、 Ｂｌ。
５−４株［ウーレンら、Ｊ、 Ｂｌ。
１、 Ｃｈｅｗ、、 ２５９．１６９５ （１９ｇ４）
］に由来し、−１３１〜−１２０番目のヘアピン構造と
−１５１〜−１３８番目のパリンドローム配列とを有す
るプロモーターであってもよいが、好ましいプロモータ
ー領域は、本出願人が特開昭（１３−２４５６７７号公
報において提案した塩基配列で表される領域である。
］に由来し、−１３１〜−１２０番目のヘアピン構造と
−１５１〜−１３８番目のパリンドローム配列とを有す
るプロモーターであってもよいが、好ましいプロモータ
ー領域は、本出願人が特開昭（１３−２４５６７７号公
報において提案した塩基配列で表される領域である。
このプロモーター領域は、−３００〜−１番目の配列に
対応し、その特徴は、前記黄色ブドウ状球菌８３２５−
４株に由来するプロモーター領域と異なり、前記ヘアピ
ン構造及びパリンドローム配列が存在しない点にある。
対応し、その特徴は、前記黄色ブドウ状球菌８３２５−
４株に由来するプロモーター領域と異なり、前記ヘアピ
ン構造及びパリンドローム配列が存在しない点にある。
プロモーター領域の下流（１〜１０８番目の塩基配列）
には、分泌に関与するＳ領域をコードする遺伝子が存在
し、この分泌シグナル領域の下流（１０９〜１５２４番
目の塩基配列）には構造遺伝子が存在する。構造遺伝子
は、Ｅ （１０９〜２７６番目の塩基配列） 、Ｄ （
２７７〜４５９番目の塩基配列）、Ａ（４６０〜６３３
番目の塩基配列） 、Ｂ （６３４〜８０７番目の塩基
配列）、Ｃ（８０８〜９８１番目の塩基配列）、および
Ｘ（９８２〜１５２４番目の塩基配列）からなる６つの
ユニットで構成され、Ｎ末端から、上記の順序に結合し
ている。また、１５２５〜１５５２番目の塩基配列はノ
ンコーディング部分であり、１５２５〜１５２７番目に
は終始コドンＴＡＡが存在する。Ｅ領域は、プロティン
ＡのＮ末端に存在するユニットであり、免疫グロブリン
Ｇ（ＩｇＧ）との結合能力が比較的小さい。ＤＳＡＳＢ
、及びＣ領域は、それぞれＩｇＧのＦｃ部分との強い結
合能力を有し、Ｘ領域は、プロティン八分子を黄色ブド
ウ状球菌の細胞壁に結合させる機能を有するユニットで
ある。
には、分泌に関与するＳ領域をコードする遺伝子が存在
し、この分泌シグナル領域の下流（１０９〜１５２４番
目の塩基配列）には構造遺伝子が存在する。構造遺伝子
は、Ｅ （１０９〜２７６番目の塩基配列） 、Ｄ （
２７７〜４５９番目の塩基配列）、Ａ（４６０〜６３３
番目の塩基配列） 、Ｂ （６３４〜８０７番目の塩基
配列）、Ｃ（８０８〜９８１番目の塩基配列）、および
Ｘ（９８２〜１５２４番目の塩基配列）からなる６つの
ユニットで構成され、Ｎ末端から、上記の順序に結合し
ている。また、１５２５〜１５５２番目の塩基配列はノ
ンコーディング部分であり、１５２５〜１５２７番目に
は終始コドンＴＡＡが存在する。Ｅ領域は、プロティン
ＡのＮ末端に存在するユニットであり、免疫グロブリン
Ｇ（ＩｇＧ）との結合能力が比較的小さい。ＤＳＡＳＢ
、及びＣ領域は、それぞれＩｇＧのＦｃ部分との強い結
合能力を有し、Ｘ領域は、プロティン八分子を黄色ブド
ウ状球菌の細胞壁に結合させる機能を有するユニットで
ある。
このように、プロティンＡは、ＩｇＧのＦｃ領域と特異
的に結合する５つの繰返し領域と、細胞壁と結合する領
域とを有している。このことを利用して、Ｆｃ領域と特
異的に結合する領域の後に、目的とするペプチド又は蛋
白質を連結し、融合蛋白質質として発現させた後、アフ
ィニティークロマトグラフィーで簡単に精製することが
できる。
的に結合する５つの繰返し領域と、細胞壁と結合する領
域とを有している。このことを利用して、Ｆｃ領域と特
異的に結合する領域の後に、目的とするペプチド又は蛋
白質を連結し、融合蛋白質質として発現させた後、アフ
ィニティークロマトグラフィーで簡単に精製することが
できる。
従って、タンパク質をコードする遺伝子は、前記プロテ
ィンＡ中のＩｇＧのＦｃ部分に対して結合能を有する領
域、特に、プロティンＡの成熟タンパク質中の４４０番
目のアミノ酸まで、すなわち、プロティンＡの構造遺伝
子中の４４０番目のアミノ酸（シグナルペプチドを除い
て）であるＡｓｐまでの領域が好ましい。また、タンパ
ク質は、プロティンＡの成熟タンパク質中の１８７番目
のアミノ酸まで、すなわち、プロティンＡの構造遺伝子
中の１８７番目のアミノ酸（シグナルペプチドを除いて
）であるＬｅｕまでの領域が好ましい。
ィンＡ中のＩｇＧのＦｃ部分に対して結合能を有する領
域、特に、プロティンＡの成熟タンパク質中の４４０番
目のアミノ酸まで、すなわち、プロティンＡの構造遺伝
子中の４４０番目のアミノ酸（シグナルペプチドを除い
て）であるＡｓｐまでの領域が好ましい。また、タンパ
ク質は、プロティンＡの成熟タンパク質中の１８７番目
のアミノ酸まで、すなわち、プロティンＡの構造遺伝子
中の１８７番目のアミノ酸（シグナルペプチドを除いて
）であるＬｅｕまでの領域が好ましい。
黄色ブドウ状球菌のプロティンＡには、前記のように、
遺伝子の発現に関与するプロモーターリポソーム結合部
位、分泌シグナル及びタンパク質をコードする領域が含
まれている。従って、プロティンＡを導入したプラスミ
ドは、分泌発現能を有し、タンパク質をコードする領域
の後に、ペブ、チド又は蛋白質をコードする遺伝子を連
結すると、タンパク質とペプチド前駆体とからなる融合
蛋白質を分泌発現する。
遺伝子の発現に関与するプロモーターリポソーム結合部
位、分泌シグナル及びタンパク質をコードする領域が含
まれている。従って、プロティンＡを導入したプラスミ
ドは、分泌発現能を有し、タンパク質をコードする領域
の後に、ペブ、チド又は蛋白質をコードする遺伝子を連
結すると、タンパク質とペプチド前駆体とからなる融合
蛋白質を分泌発現する。
プロテアーゼとしては、ジペプチドｘ、−Ｘ２、すなわ
ち、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ
％Ａｒｇ−Ａｒｇ又はＰｒｏ−Ａｒｇを特異的に認識し
、かつ、ジペプチドのＣ末端側、Ｎ末端側またはジペプ
チド間における特異的な加水分解を触媒するプロテアー
ゼである限り、その起源を問わず使用できる。
ち、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ
％Ａｒｇ−Ａｒｇ又はＰｒｏ−Ａｒｇを特異的に認識し
、かつ、ジペプチドのＣ末端側、Ｎ末端側またはジペプ
チド間における特異的な加水分解を触媒するプロテアー
ゼである限り、その起源を問わず使用できる。
Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−ＬＦＳ％
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ間を特異的に加水分解するプロテアーゼ
としては、大腸菌（Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｌａｃｏｉｌ）
由来のＯｍｐＴプロテアーゼ［プロテアーゼ■、 Ｋ、
ＳｕｇＪｍｏｔｏ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｂａｃ
ｔｅｒｌｏｌ、１７０、５６２５−５８３２ （１９８
８）Ｊ 、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌａ＋
ｏｎｃｌｌａ Ｌｙｐｈｉｓｕｒｉｕｓ＋ ）由来の
Ｅ−１’ｒｏｔｃｌｎ ［Ｊ、 Ｇｒｏｄｂａｒｇ
ａｎｄ Ｊ、 Ｊ、 Ｄｕｎｎ、 Ｊ、 Ｂａｃｌｅｒ
ｉｏｌ 、すＩ、 ２９０３−２９０５ （３９８９）
］ 、鎮痛ペプチドの生合成に関与するプロテアーゼＥ
ｖ、 Ｄａｎｇｅｒａｎｄ Ｋ、 １３ｒａｎｄ、 Ｂ
ｉｏｅｈｅｍ、 Ｂｌｏｐｈｙｓ、 Ｒｃｓ、 Ｃｏｔ
ａｔａｕｎ。
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ間を特異的に加水分解するプロテアーゼ
としては、大腸菌（Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｌａｃｏｉｌ）
由来のＯｍｐＴプロテアーゼ［プロテアーゼ■、 Ｋ、
ＳｕｇＪｍｏｔｏ、 ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、 Ｂａｃ
ｔｅｒｌｏｌ、１７０、５６２５−５８３２ （１９８
８）Ｊ 、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌａ＋
ｏｎｃｌｌａ Ｌｙｐｈｉｓｕｒｉｕｓ＋ ）由来の
Ｅ−１’ｒｏｔｃｌｎ ［Ｊ、 Ｇｒｏｄｂａｒｇ
ａｎｄ Ｊ、 Ｊ、 Ｄｕｎｎ、 Ｊ、 Ｂａｃｌｅｒ
ｉｏｌ 、すＩ、 ２９０３−２９０５ （３９８９）
］ 、鎮痛ペプチドの生合成に関与するプロテアーゼＥ
ｖ、 Ｄａｎｇｅｒａｎｄ Ｋ、 １３ｒａｎｄ、 Ｂ
ｉｏｅｈｅｍ、 Ｂｌｏｐｈｙｓ、 Ｒｃｓ、 Ｃｏｔ
ａｔａｕｎ。
す８．３５Ｂ−３８２（１９８Ｂ）］などが挙げられる
。
。
Ａｒｇ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−ＡｒｇのＮ末端側を特異的に
加水分解するプロテアーゼとしては、例えば、ソマトス
タチンの成熟に関与するプロテアーゼ［Ｐ、 Ｇｌｕｓ
ｃｈａｎｋｏｆ、 ａｔ ａｔ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｗ。
加水分解するプロテアーゼとしては、例えば、ソマトス
タチンの成熟に関与するプロテアーゼ［Ｐ、 Ｇｌｕｓ
ｃｈａｎｋｏｆ、 ａｔ ａｔ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｗ。
υす、 ９６１５−９６２０ （１９８７）］などが挙
げられる。
げられる。
Ｌｙｓ−Ａｒｇ％Ａｒｇ−ＡｒｇのＣ末端側を特異的に
加水分解するプロテアーゼとしては、例えば、ＩＲＣＭ
−セリンプロテアーゼ（Ｓｅｒｉｎｅ ＰｒｏＬｅａｓ
ａ） １ ［Ｊ、 Ａ、 Ｃｒｏｍｌｉｓｈ、 ａｔ
ａｌ、、 Ｊ、 Ｂｌｏｌ。
加水分解するプロテアーゼとしては、例えば、ＩＲＣＭ
−セリンプロテアーゼ（Ｓｅｒｉｎｅ ＰｒｏＬｅａｓ
ａ） １ ［Ｊ、 Ａ、 Ｃｒｏｍｌｉｓｈ、 ａｔ
ａｌ、、 Ｊ、 Ｂｌｏｌ。
Ｃｈｅｗ、 ２６１ 、１０８５０−１０８５８ （１
９８Ｂ）］ 、Ｐ ＯＭ Ｃ−：ｌ ンｔ＜−７−イン
９”：Ｌ＞す４ ム（ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙ
ｙａｅ） ［Ｙ、 Ｐ、 Ｌｏｈ、 ｅｔ ａｌ、、
Ｊ、 Ｂｌｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 ２８０゜７］９４−
７２０５ （１９８５）コ、酵母す・ノカロマイセス属
［Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、 Ｋ、旧ｚｕｎｏ、
ａｔ ａｌ、、 １３ｊｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｉｍｕｎ、 川、 ８０
７−８１４ （１９８７）コクライペロマイセス属（
ＫｌｕｙｖｃｒｏＩｌｌｙｃｅｓ） 、スポロポロマイ
セス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｉｙｃｅｓ） 、フイロバ
ジジウム属（Ｐｉｌｏｂａｓｌｄｌｕｍ） 、／％ンゼ
ヌラ属（ｌｌａｎｓｅｎｕｌａ） 、イサチェンキア属
（１ｓｓａｔｃｈｃｎｋｉａ） 、ピキア属（Ｐｉｃｈ
ｉａ） 、ロドスポリジウム属１９１６８３号公報、特
開平２−４９５８５号公報）などが挙げられる。
９８Ｂ）］ 、Ｐ ＯＭ Ｃ−：ｌ ンｔ＜−７−イン
９”：Ｌ＞す４ ム（ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙ
ｙａｅ） ［Ｙ、 Ｐ、 Ｌｏｈ、 ｅｔ ａｌ、、
Ｊ、 Ｂｌｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 ２８０゜７］９４−
７２０５ （１９８５）コ、酵母す・ノカロマイセス属
［Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、 Ｋ、旧ｚｕｎｏ、
ａｔ ａｌ、、 １３ｊｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｉｍｕｎ、 川、 ８０
７−８１４ （１９８７）コクライペロマイセス属（
ＫｌｕｙｖｃｒｏＩｌｌｙｃｅｓ） 、スポロポロマイ
セス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｉｙｃｅｓ） 、フイロバ
ジジウム属（Ｐｉｌｏｂａｓｌｄｌｕｍ） 、／％ンゼ
ヌラ属（ｌｌａｎｓｅｎｕｌａ） 、イサチェンキア属
（１ｓｓａｔｃｈｃｎｋｉａ） 、ピキア属（Ｐｉｃｈ
ｉａ） 、ロドスポリジウム属１９１６８３号公報、特
開平２−４９５８５号公報）などが挙げられる。
多くノ生理活性ペプチドや蛋白質がＬｙｓ−Ａｒｇ、Ａ
ｒｇ−ＡｒｇのＣ末端側における加水分解を受けて成熟
型にプロセシングされる。従って、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａ
ｒｇ−Ａｒｇを特異的に認識し、かつそのＣ末端側にお
ける加水分解を触媒するプロテアーゼが特に好ましい。
ｒｇ−ＡｒｇのＣ末端側における加水分解を受けて成熟
型にプロセシングされる。従って、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａ
ｒｇ−Ａｒｇを特異的に認識し、かつそのＣ末端側にお
ける加水分解を触媒するプロテアーゼが特に好ましい。
さらに好ましく為プロテアーゼは、酵母由来の塩基性ア
ミノ酸残基対特異的プロテアーゼであり、このプロテア
ーゼは、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ （又はＰｒ
□−Ａｒｇ）のＣ末端側を特異的に加水分解し、Ａｒｇ
−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ配列を切断しないこと、酵母
起源であるため大量に調製することが比較的容易である
こと、一般に安全性が高いことなどの理由から、特に好
ましい。
ミノ酸残基対特異的プロテアーゼであり、このプロテア
ーゼは、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ （又はＰｒ
□−Ａｒｇ）のＣ末端側を特異的に加水分解し、Ａｒｇ
−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ配列を切断しないこと、酵母
起源であるため大量に調製することが比較的容易である
こと、一般に安全性が高いことなどの理由から、特に好
ましい。
プロテアーゼが、ジペプチドを特異的に認識し、かつジ
プチドのＣ末端を特異的に加水分解する場合には単独で
使用できる。
プチドのＣ末端を特異的に加水分解する場合には単独で
使用できる。
また、（ａ）プロテアーゼが、ジペプチドを特異的に認
識し、かつジペプチドのＮ末端又はジペプチド間を特異
的に加水分解する場合には、（ｂ）ジペプチドのＮ末端
から塩基性アミノ酸を遊離するアミノペプチダーゼ及び
／又はＣ末端から塩基性アミノ酸を遊離するカルボキシ
ペプチダーゼと組合せて、前記融合蛋白質を処理するこ
とにより、ペプチド又は蛋白質を得ることができる。
識し、かつジペプチドのＮ末端又はジペプチド間を特異
的に加水分解する場合には、（ｂ）ジペプチドのＮ末端
から塩基性アミノ酸を遊離するアミノペプチダーゼ及び
／又はＣ末端から塩基性アミノ酸を遊離するカルボキシ
ペプチダーゼと組合せて、前記融合蛋白質を処理するこ
とにより、ペプチド又は蛋白質を得ることができる。
塩基性アミノ酸を特異的に認識し、ジペプチドのＣ末端
側又はＮ末端側から塩基性アミノ酸を遊離するカルボキ
シペプチダーゼ又はアミノペプチダーゼは、このような
特異性を有する酵素であれば、その起源を問わず使用可
能である。カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダー
ゼとしては、例えば、カルボキシペプチダーゼＢ （Ｅ
、 Ｃ，３，４，１７，２）、カルボキシペプチダーゼ
Ｅ（エンケファリン・コンベルターゼ）、カルボキシペ
プチダーゼＮ（Ｅ、 Ｃ，３，４，１７，３）、ｙｓｃ
α［サツカロマイセス・セレビジアエ由来のにＥＸＩ遺
伝子産物； Ａ、 Ｄｏ＋ｏｃｈｏｗｓｋａ、 ａｔ
ａｌ、、 Ｃｅ１１．５０．５７３−５８４ （１９８
７）］ 、アミノペプチダーゼＢ （Ｅ、 Ｃ，３，４
，１＋、６）などが挙げられる。
側又はＮ末端側から塩基性アミノ酸を遊離するカルボキ
シペプチダーゼ又はアミノペプチダーゼは、このような
特異性を有する酵素であれば、その起源を問わず使用可
能である。カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダー
ゼとしては、例えば、カルボキシペプチダーゼＢ （Ｅ
、 Ｃ，３，４，１７，２）、カルボキシペプチダーゼ
Ｅ（エンケファリン・コンベルターゼ）、カルボキシペ
プチダーゼＮ（Ｅ、 Ｃ，３，４，１７，３）、ｙｓｃ
α［サツカロマイセス・セレビジアエ由来のにＥＸＩ遺
伝子産物； Ａ、 Ｄｏ＋ｏｃｈｏｗｓｋａ、 ａｔ
ａｌ、、 Ｃｅ１１．５０．５７３−５８４ （１９８
７）］ 、アミノペプチダーゼＢ （Ｅ、 Ｃ，３，４
，１＋、６）などが挙げられる。
目的とするペプチド及び蛋白質Ｃは、特に限定されない
。ペプチド及び蛋白質Ｃには、例えば、インスリン、ガ
ストリン、各種オピオノイドペブチド、上皮細胞成長因
子、エンドセリン、ＶＩＰ。
。ペプチド及び蛋白質Ｃには、例えば、インスリン、ガ
ストリン、各種オピオノイドペブチド、上皮細胞成長因
子、エンドセリン、ＶＩＰ。
心房性利尿ホルモン（ＡＮＰ） 、サブスタンスＰ１カ
ルシトニン、インシュリン様成長因子Ｉ、１■、ガラニ
ン、モチリン、パップレシンなどの各種の生理活性ペプ
チド；ヒルジン、ニグリンＣ１分泌性白血球由来プロテ
アーゼインヒビターなどの阻害剤、ヒトアルブミン、血
液凝固因子、リンフ才力イン、押杆成長因子、肝細胞再
生因子などの各種の分化誘導因子、成長因子などの蛋白
質が含まれる。
ルシトニン、インシュリン様成長因子Ｉ、１■、ガラニ
ン、モチリン、パップレシンなどの各種の生理活性ペプ
チド；ヒルジン、ニグリンＣ１分泌性白血球由来プロテ
アーゼインヒビターなどの阻害剤、ヒトアルブミン、血
液凝固因子、リンフ才力イン、押杆成長因子、肝細胞再
生因子などの各種の分化誘導因子、成長因子などの蛋白
質が含まれる。
好ましいペプチドには、ＶＩＰが含まれ、このＶＩＰは
２８個のアミノ酸残基からなり、血管拡張作用や血流増
加作用などの薬理作用を有する［５ｃｉｅｎｃｅ １６
９．１２１７ （１９７０）］ 、 Ｖ Ｉ Ｐは、下
記のアミノ酸配列で表される。
２８個のアミノ酸残基からなり、血管拡張作用や血流増
加作用などの薬理作用を有する［５ｃｉｅｎｃｅ １６
９．１２１７ （１９７０）］ 、 Ｖ Ｉ Ｐは、下
記のアミノ酸配列で表される。
Ｉｆ−１１ｉｓ−３ｅｒ−＾ｓｐ−＾１ ａ−Ｖａ Ｉ
−Ｐｈｅ−Ｔｈ ｒ−＾ｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈ
ｒ−Ａｒｇ−Ｌｃｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−ＭｅＬ
−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｉ、ｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ
−＾５ｎ−８ｅｒ−１１ｃｍ１．ｅｕ−Ａｓｎ−０１１
このアミノ酸配列で表されるＶＩＰは、１７番目のアミ
ノ酸がＬｅｕではな（Ｍ ｅ ｔである点で、先行技術
文献［特開平１−２９Ｈ９６号公報およびＦｕｒ。
−Ｐｈｅ−Ｔｈ ｒ−＾ｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈ
ｒ−Ａｒｇ−Ｌｃｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−ＭｅＬ
−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｉ、ｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ
−＾５ｎ−８ｅｒ−１１ｃｍ１．ｅｕ−Ａｓｎ−０１１
このアミノ酸配列で表されるＶＩＰは、１７番目のアミ
ノ酸がＬｅｕではな（Ｍ ｅ ｔである点で、先行技術
文献［特開平１−２９Ｈ９６号公報およびＦｕｒ。
Ｊ、 Ｂｌｏｃｈｅｍ、 １７８．３４３−３５０ （
１９８Ｂ）コに記載のＶＩＰと異なる。
１９８Ｂ）コに記載のＶＩＰと異なる。
また、ＶＩＰは、Ｃ末端１．：Ｇｌｙ−Ｘ（式中、Ｘは
、０１１．１、ｙｓ−Ｏｌｌ、Ａｒｇ−０１１ＳＬｙｓ
−＾ｒｇ−Ｏｉｌ、または＾ｒ ｇ −Ｌ ｙ ｓ −
ＯＩｆを示す）が付加したＶＩＰ前駆体として使用する
のが好ましい。
、０１１．１、ｙｓ−Ｏｌｌ、Ａｒｇ−０１１ＳＬｙｓ
−＾ｒｇ−Ｏｉｌ、または＾ｒ ｇ −Ｌ ｙ ｓ −
ＯＩｆを示す）が付加したＶＩＰ前駆体として使用する
のが好ましい。
本発明の１つの態様において、融合蛋白質は、下記式［
１ａｌ又は［ｌｂｌで表されるように、前記キャリアー
Ａと、目的とするペプチド又は蛋白質Ｃとが、酵素的に
切断可能なスペーサー配列Ｂ１すなわちジペプチドｘ、
−ｘ２を介して結合し、かつ宿主微生物により生産可能
であればよい。
１ａｌ又は［ｌｂｌで表されるように、前記キャリアー
Ａと、目的とするペプチド又は蛋白質Ｃとが、酵素的に
切断可能なスペーサー配列Ｂ１すなわちジペプチドｘ、
−ｘ２を介して結合し、かつ宿主微生物により生産可能
であればよい。
Ａ−Ｂ−Ｃ［１ａｌ
Ｃ−Ｂ−Ａ ［ｌｂｌ
融合蛋白質の構造がＡ−Ｂ−Ｃ［１ａ］である場合には
、Ｂを認識してそのＮ末端側を特異的に加水分解するプ
ロテアーゼを、Ｃ−Ｂ−Ａ Ｎ ｂｌである場合には、
Ｂを認識してそのＮ末端側を特異的に加水分解するプロ
テアーゼを作用させ、目的とするペプチド又蛋白質を得
ることが好ましい。
、Ｂを認識してそのＮ末端側を特異的に加水分解するプ
ロテアーゼを、Ｃ−Ｂ−Ａ Ｎ ｂｌである場合には、
Ｂを認識してそのＮ末端側を特異的に加水分解するプロ
テアーゼを作用させ、目的とするペプチド又蛋白質を得
ることが好ましい。
また、塩基性アミノ酸残基対を特異的に認識し、そのＮ
末端側、Ｃ末端側、又はその間を加水分解する適当なプ
ロテアーゼと、適当なエキソペプチダーゼとを組合せて
目的物を得ることもできる。
末端側、Ｃ末端側、又はその間を加水分解する適当なプ
ロテアーゼと、適当なエキソペプチダーゼとを組合せて
目的物を得ることもできる。
例えば、Ａ−Ｂ−Ｃ［Ｉａ］の構造を有する融合蛋白質
に、Ｂを認識し、そのＮ末端側又はその間で特異的に加
水分解するプロテアーゼと、ペプチドのＮ末端側から塩
基性アミノ酸のみを特異的に遊離するアミノペプチダー
ゼとの共同作用により、目的物を得ることもできる。ま
た、Ｃ−Ｂ−Ａ［１ｂｌの構造を有する融合蛋白質に、
Ｂを認識し、そのＣ末端側、またはその間で特異的に加
水分解するプロテアーゼと、ペプチド鎖のＣ末端側から
特異的に塩基性アミノ酸を有するカルボキシペプチダー
ゼとの共同作用により、目的物を得ることもである。
に、Ｂを認識し、そのＮ末端側又はその間で特異的に加
水分解するプロテアーゼと、ペプチドのＮ末端側から塩
基性アミノ酸のみを特異的に遊離するアミノペプチダー
ゼとの共同作用により、目的物を得ることもできる。ま
た、Ｃ−Ｂ−Ａ［１ｂｌの構造を有する融合蛋白質に、
Ｂを認識し、そのＣ末端側、またはその間で特異的に加
水分解するプロテアーゼと、ペプチド鎖のＣ末端側から
特異的に塩基性アミノ酸を有するカルボキシペプチダー
ゼとの共同作用により、目的物を得ることもである。
さらに、目的遺伝子産物が、例えばアミノ酸数が１００
個以下の比較的低分子量のペプチドである場合には、そ
の生産量、生産性を高めるため、キャリアーに、目的ペ
プチドが複数連結したタンデム型融合蛋白質として生産
する試みがなされている。しかしながら、タンデム型融
合蛋白質法により目的遺伝子産物を得るには、目的ペプ
チドを適当なスペーサを介して結合させ、融合蛋白質か
らスペーサーを完全に除去しなければならない。
個以下の比較的低分子量のペプチドである場合には、そ
の生産量、生産性を高めるため、キャリアーに、目的ペ
プチドが複数連結したタンデム型融合蛋白質として生産
する試みがなされている。しかしながら、タンデム型融
合蛋白質法により目的遺伝子産物を得るには、目的ペプ
チドを適当なスペーサを介して結合させ、融合蛋白質か
らスペーサーを完全に除去しなければならない。
このタンデム型融合蛋白質法に関して、例えば、Ｌｙｓ
を含まないペプチド（心房性ナトリウム利尿ペプチド、
ＡＮＰ）を、Ｌｙｓ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｌｙｓを介して
結合したタンデム型融合蛋白質を生産した後、リジルエ
ンドペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＢの作用に
より、目的ペプチドを得ることが報告されている［Ｍ、
Ｌｅｎｎｌｅｋ。
を含まないペプチド（心房性ナトリウム利尿ペプチド、
ＡＮＰ）を、Ｌｙｓ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｌｙｓを介して
結合したタンデム型融合蛋白質を生産した後、リジルエ
ンドペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＢの作用に
より、目的ペプチドを得ることが報告されている［Ｍ、
Ｌｅｎｎｌｅｋ。
ｅｔ ａｌ、、 Ｇｅｎｅ、 ６１．１０３−１１２
（１９８７）］ 、しかしながら、このような方法は、
Ｌｙｓを含有しない目的ペプチドにしか適用できず、汎
用性に欠ける。
（１９８７）］ 、しかしながら、このような方法は、
Ｌｙｓを含有しない目的ペプチドにしか適用できず、汎
用性に欠ける。
また、同様ないくつかの方法が報告されているが（特開
昭６２−２２６９９８号公報、特開昭１３３−７１１９
５号公報など）、これらの方法は、前記と同様に、汎用
性に欠けること、多段階の反応を必要とすること、スペ
ーサーの長さが大きいことなどの種々の問題がある。
昭６２−２２６９９８号公報、特開昭１３３−７１１９
５号公報など）、これらの方法は、前記と同様に、汎用
性に欠けること、多段階の反応を必要とすること、スペ
ーサーの長さが大きいことなどの種々の問題がある。
本発明の方法は、このようなタンデム型融合蛋白質法に
より、目的ペプチドを生産する場合にも、極めて有用で
ある。すなわち、Ｘｔ−ｘ２で表されるジペプチドＢを
目的ペプチド間に挿入したタンデム型融合蛋白質を生産
した後、ジペプチドに特異的なプロテアーゼと、塩基性
アミノ酸に特異的なアミノペプチダーゼ、カルボキシペ
プチダーゼとを組合せて作用させることにより、成熟型
のペプチドを効率よく多量に得ることができる。
より、目的ペプチドを生産する場合にも、極めて有用で
ある。すなわち、Ｘｔ−ｘ２で表されるジペプチドＢを
目的ペプチド間に挿入したタンデム型融合蛋白質を生産
した後、ジペプチドに特異的なプロテアーゼと、塩基性
アミノ酸に特異的なアミノペプチダーゼ、カルボキシペ
プチダーゼとを組合せて作用させることにより、成熟型
のペプチドを効率よく多量に得ることができる。
なお、特殊な場合として、目的とするペプチド又は蛋白
質のＣ末端アミノ酸がＰｒｏである場合には、スペーサ
としてＡｒｇを挿入すると、フライベロマイセス・ラク
ティス、スポロボロマイセス・オドラスなどの酵母由来
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼが、Ｐ ｒ
ｏ−Ａ ｒ ｇ配列のＣ末端側も効率的に加水分解す
る。このことを利用して、Ｐｒｏ−ＡｒｇのＣ末端側を
前記プロテアーゼにより特異的に加水分解した後、ブロ
リン力ルポキシペブチダーゼ（Ｅ、 Ｃ，３，４，１６
，２）を作用させることにより、目的とするペプチド又
は蛋白質を得ることができる。
質のＣ末端アミノ酸がＰｒｏである場合には、スペーサ
としてＡｒｇを挿入すると、フライベロマイセス・ラク
ティス、スポロボロマイセス・オドラスなどの酵母由来
の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼが、Ｐ ｒ
ｏ−Ａ ｒ ｇ配列のＣ末端側も効率的に加水分解す
る。このことを利用して、Ｐｒｏ−ＡｒｇのＣ末端側を
前記プロテアーゼにより特異的に加水分解した後、ブロ
リン力ルポキシペブチダーゼ（Ｅ、 Ｃ，３，４，１６
，２）を作用させることにより、目的とするペプチド又
は蛋白質を得ることができる。
タンデム型融合蛋白質は、下記式［１］又は［Ｉ［［］
で表される単位を少なくとも含み、かつ宿主微生物によ
り生産可能であればよい。なお、微生物により生産可能
である限り、タンデム型融合蛋白質には、キャリアーＡ
が存在しなくてもよい。
で表される単位を少なくとも含み、かつ宿主微生物によ
り生産可能であればよい。なお、微生物により生産可能
である限り、タンデム型融合蛋白質には、キャリアーＡ
が存在しなくてもよい。
−（−Ｂ−Ｃ＋ ［■］
＋Ｃ−Ｂ＋ 、［Ｉ［Ｉ］
［式中、Ｂは酵素的に切断可能なＸ＋ −ｘ２（Ｘ＋
は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ又はＰｒｏを示し、Ｘ２は、Ｌｙｓ
又はＡｒｇを示す。但し、ＸｌがＰｒｏであるとき、Ｘ
２はＡｒｇである）で表されるジペプチドを示す。Ｃは
目的とするペプチド又は蛋白質、ｎは２以上の整数を示
す］なお、前記式［ＩＩ］ ［ｎｌ］中、Ｎ末端又は
Ｃ末端にキャリアーＡ、ジペプチドＢ又は目的ペプチド
Ｃが結合していない場合には、Ｎ末端にはアミノ酸のＨ
，Ｃ末端にはアミノ酸のＯＨが結合している。
は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ又はＰｒｏを示し、Ｘ２は、Ｌｙｓ
又はＡｒｇを示す。但し、ＸｌがＰｒｏであるとき、Ｘ
２はＡｒｇである）で表されるジペプチドを示す。Ｃは
目的とするペプチド又は蛋白質、ｎは２以上の整数を示
す］なお、前記式［ＩＩ］ ［ｎｌ］中、Ｎ末端又は
Ｃ末端にキャリアーＡ、ジペプチドＢ又は目的ペプチド
Ｃが結合していない場合には、Ｎ末端にはアミノ酸のＨ
，Ｃ末端にはアミノ酸のＯＨが結合している。
前記単位［ＩＩ］を含むタンデム型融合蛋白質の構造と
しては、例えば、 Ａ−＋Ｂ−Ｃ升。 ［ＩＩａ］ Ｃ＋Ｂ−Ｃ→−Ｂ−Ａ ［ＩＩｂ］Ｃ＋Ｂ−Ｃ→−
Ａ ［ＩＩｃ］ Ｃ＋Ｂ−Ｃ） ｎ ［Ｏｄｌ などが挙げられる。また、前記単位［Ｉ１１］を含むタ
ンデム型融合蛋白質の構造としては、例えば、（Ｃ−Ｂ
→−Ａ ［Ｉ［Ｉａ］ Ａ −Ｂ−＋Ｃ−Ｂ→−Ｃ［ｌｌＩｂ］Ａ＋Ｃ−Ｂ＋−
Ｃ［■Ｃ］ （Ｃ−Ｂ→−Ｃ［ＩＩＩｄ］ などが挙げられる。
しては、例えば、 Ａ−＋Ｂ−Ｃ升。 ［ＩＩａ］ Ｃ＋Ｂ−Ｃ→−Ｂ−Ａ ［ＩＩｂ］Ｃ＋Ｂ−Ｃ→−
Ａ ［ＩＩｃ］ Ｃ＋Ｂ−Ｃ） ｎ ［Ｏｄｌ などが挙げられる。また、前記単位［Ｉ１１］を含むタ
ンデム型融合蛋白質の構造としては、例えば、（Ｃ−Ｂ
→−Ａ ［Ｉ［Ｉａ］ Ａ −Ｂ−＋Ｃ−Ｂ→−Ｃ［ｌｌＩｂ］Ａ＋Ｃ−Ｂ＋−
Ｃ［■Ｃ］ （Ｃ−Ｂ→−Ｃ［ＩＩＩｄ］ などが挙げられる。
前記タンデム型融合蛋白質の構造の中で、キャリアーＡ
とジペプチドＢとが結合した構造［ＩＩａ］［Ｉ［ｂｌ
［Ｉ［Ｉａｌ ［ｌｌＩｂ］や、キャリアーＡと
、タンデム化した目的ペプチドＣ及びジペプチドＢとが
結合した構造［ＩＩｃｌ ［ｍｃｌ、特に構造［ＩＩ
ａｌ ［ＩＩｂ］ ［ＩＩｃ］が好ましい。
とジペプチドＢとが結合した構造［ＩＩａ］［Ｉ［ｂｌ
［Ｉ［Ｉａｌ ［ｌｌＩｂ］や、キャリアーＡと
、タンデム化した目的ペプチドＣ及びジペプチドＢとが
結合した構造［ＩＩｃｌ ［ｍｃｌ、特に構造［ＩＩ
ａｌ ［ＩＩｂ］ ［ＩＩｃ］が好ましい。
タンデム型融合蛋白質から目的ペプチド又は蛋白質を得
るには、融合蛋白質の結合様式に応じて、Ｂを特異的に
認識し、ジペプチドを特異的に加水分解するプロテアー
ゼと、必要に応じて、ペプチド鎖のＣ末端側又はＮ末端
側から塩基性アミノ酸を特異的に遊離するエンドペプチ
ダーゼとを同時にまたは順次作用させればよい。より具
体的には、タンデム型融合蛋白質に、Ｂを特異的に認識
し、ジペプチドのＣ末端側で特異的にペプチド結合を加
水分解するプロテアーゼと、ペプチド鎖のＣ末端側から
塩基性アミノ酸を特異的に遊離するカルボキシペプチダ
ーゼとを同時にまたは順次作用させることにより、目的
とするペプチド又は蛋白質を得ることができる。また、
同様にＢを特異的に認識し、ジペプチドのＮ末端側を特
異的に加水分解するプロテアーゼと、ペプチド鎖のＮ末
端側から塩基性アミノ酸を特異的に遊離するアミノペプ
チダーゼを同時又は順次作用させることにより、目的と
するペプチド又は蛋白質を得ることができる。さらに、
Ｂを特異的に認識し、ジペプチド間を特異的に加水分解
するプロテアーゼと、ペプチド鎖のＮ末端側及びＣ末端
側から塩基性アミノ酸を特異的に遊離するアミノペプチ
ダーゼ及びカルボキシペプチダーゼを同時又は順次作用
させることによっても、目的とするペプチド又は蛋白質
を得ることができる。
るには、融合蛋白質の結合様式に応じて、Ｂを特異的に
認識し、ジペプチドを特異的に加水分解するプロテアー
ゼと、必要に応じて、ペプチド鎖のＣ末端側又はＮ末端
側から塩基性アミノ酸を特異的に遊離するエンドペプチ
ダーゼとを同時にまたは順次作用させればよい。より具
体的には、タンデム型融合蛋白質に、Ｂを特異的に認識
し、ジペプチドのＣ末端側で特異的にペプチド結合を加
水分解するプロテアーゼと、ペプチド鎖のＣ末端側から
塩基性アミノ酸を特異的に遊離するカルボキシペプチダ
ーゼとを同時にまたは順次作用させることにより、目的
とするペプチド又は蛋白質を得ることができる。また、
同様にＢを特異的に認識し、ジペプチドのＮ末端側を特
異的に加水分解するプロテアーゼと、ペプチド鎖のＮ末
端側から塩基性アミノ酸を特異的に遊離するアミノペプ
チダーゼを同時又は順次作用させることにより、目的と
するペプチド又は蛋白質を得ることができる。さらに、
Ｂを特異的に認識し、ジペプチド間を特異的に加水分解
するプロテアーゼと、ペプチド鎖のＮ末端側及びＣ末端
側から塩基性アミノ酸を特異的に遊離するアミノペプチ
ダーゼ及びカルボキシペプチダーゼを同時又は順次作用
させることによっても、目的とするペプチド又は蛋白質
を得ることができる。
特に好ましい方法は、目的ペプチド間に、Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇ又はＡｒｇ−Ａｒｇ配列を挿入したタンデム型融合蛋
白質を生産した後、Ｌｙｓ−Ａｒｇ又はＡｒｇ−Ａｒｇ
を特異的に認識し、ジペプチドのＣ末端側で加水分解を
触媒するプロテアーゼと、塩基性アミノ酸に特異的なカ
ルボキシペプチダーゼとを作用させて目的ペプチドを得
る方法である。この方法は、目的ペプチド間に挿入する
配列が２アミノ酸と極めて短いこと、挿入するジペプチ
ドＸ＋−ｘ２がペプチド中に殆ど存在しないため汎用性
が極めて高いこと、２種類又は３種類の酵素を同時に作
用させることが可能であるため、操作が容易であり、ス
テップ数が少ないなどの多くの利点を有する。
ｇ又はＡｒｇ−Ａｒｇ配列を挿入したタンデム型融合蛋
白質を生産した後、Ｌｙｓ−Ａｒｇ又はＡｒｇ−Ａｒｇ
を特異的に認識し、ジペプチドのＣ末端側で加水分解を
触媒するプロテアーゼと、塩基性アミノ酸に特異的なカ
ルボキシペプチダーゼとを作用させて目的ペプチドを得
る方法である。この方法は、目的ペプチド間に挿入する
配列が２アミノ酸と極めて短いこと、挿入するジペプチ
ドＸ＋−ｘ２がペプチド中に殆ど存在しないため汎用性
が極めて高いこと、２種類又は３種類の酵素を同時に作
用させることが可能であるため、操作が容易であり、ス
テップ数が少ないなどの多くの利点を有する。
目的とするペプチド又は蛋白質のＮ末端側やＣ末端側に
ＬｙｓやＡｒｇが存在する場合には、その構造を十分に
活かした融合蛋白質の構造を設計し、目的とするペプチ
ド又は蛋白質の構造に応じた切断方法が選択される。よ
り詳細には、いくつかのＣ末端アミド化ペプチドにおい
て、その生合成前駆体であるＣ末端Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ延長ペプチドが、成熟型のペプチドよりも活性が強
い例が報告されている（特開昭６２−２４８５９５号公
報）このようなペプチドを生産する場合には、ペプチド
間にＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇをスペーサーとして挿入し
たタンデム型融蛋白質を生産し、Ｌｙｓ−Ａ ｒ ｇを
特異的に認識し、そのＣ末端側を特異的に加水分解する
プロテアーゼを作用させることにより、目的とするＧｌ
ｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ延長ペプチドを得ることができる。
ＬｙｓやＡｒｇが存在する場合には、その構造を十分に
活かした融合蛋白質の構造を設計し、目的とするペプチ
ド又は蛋白質の構造に応じた切断方法が選択される。よ
り詳細には、いくつかのＣ末端アミド化ペプチドにおい
て、その生合成前駆体であるＣ末端Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ延長ペプチドが、成熟型のペプチドよりも活性が強
い例が報告されている（特開昭６２−２４８５９５号公
報）このようなペプチドを生産する場合には、ペプチド
間にＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇをスペーサーとして挿入し
たタンデム型融蛋白質を生産し、Ｌｙｓ−Ａ ｒ ｇを
特異的に認識し、そのＣ末端側を特異的に加水分解する
プロテアーゼを作用させることにより、目的とするＧｌ
ｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ延長ペプチドを得ることができる。
また、Ｌｙｓ−Ａｒｇを特異的に認識し、その間を特異
的に加水分解するプロテアーゼと、Ｎ末端側から塩基性
アミノ酸を特異的に遊離するアミノペプチダーゼとを同
時に又は順次作用させることにより、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ延
長ペプチドを得ることができる。同様なＧｌｙ−Ｌｙｓ
延長ペプチドは、Ｌ ｙ ｓ −Ａ ｒｇを特異的に認
識し、そのＣ末端側において特異的に加水分解するプロ
テアーゼと、Ｃ末端側からＡｒｇのみを特異的に遊離す
るカルボキシペプチダーゼとを同時に又は順次作用させ
ることによっても得ることができる。
的に加水分解するプロテアーゼと、Ｎ末端側から塩基性
アミノ酸を特異的に遊離するアミノペプチダーゼとを同
時に又は順次作用させることにより、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ延
長ペプチドを得ることができる。同様なＧｌｙ−Ｌｙｓ
延長ペプチドは、Ｌ ｙ ｓ −Ａ ｒｇを特異的に認
識し、そのＣ末端側において特異的に加水分解するプロ
テアーゼと、Ｃ末端側からＡｒｇのみを特異的に遊離す
るカルボキシペプチダーゼとを同時に又は順次作用させ
ることによっても得ることができる。
本発明の製造方法の利点を、前記ＶＩＰを例にとって、
より具体的に説明する。ＶＩＰの内部には、前記のよう
に、Ｍｅｔ 、 Ａｒｇ ＳＡｒｇ−Ｌｙｓ 、 Ｌｙ
ｓ−Ｌｙｓ ｓ Ａｓｐなどのプロセシングシグナルと
なりうる配列が含まれているため、従来報告されている
方法により、融合蛋白質からＶＩＰを切りだすのは困難
である。しかしながら、酵母由来の塩基性アミノ酸残基
対特異的プロテアーゼは、Ｘ−Ａｒｇ（Ｘは、Ｌｙｓ
、 Ａｒｇ又はＰｒｏを示す）配列を特異的に認識し、
ジペプチドのＣ末端を優先的に加水分解する特性を有し
ている。このことを利用して、ＶＩＰの生産が可能とな
る。すなわち、例えば、キャリアーとして、プロティン
Ａの１位から４０２位、スペーサーとして、＾ｒｇ−Ｇ
ｌｙ−３ａｒ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ −Ａｓｐ−Ｖ
ａ Ｉ−１ｌ ｅ−Ｇ ｌ ｕ−Ｇ Ｉ ｙ−Ａ ｒｇ
−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−１１ｃ−１’ｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ
−Ａｒｇ、目的ペプチドとして、５分子のＶＩＰの生合
成前駆体Ｖ Ｉ Ｐ−Ｇ ｌ ｙをＬｙｓ−Ａｒｇを介
して結合したペプチドを用い、前記キャリアーとスペー
サーとペプチドとが結合したタンデム型融合蛋白質（以
下、ＰＡＶ Ｉ ＰＧ （Ｐ）Ｒ５と略称する）を枯草
菌を宿主として菌体外に分泌生産する。
より具体的に説明する。ＶＩＰの内部には、前記のよう
に、Ｍｅｔ 、 Ａｒｇ ＳＡｒｇ−Ｌｙｓ 、 Ｌｙ
ｓ−Ｌｙｓ ｓ Ａｓｐなどのプロセシングシグナルと
なりうる配列が含まれているため、従来報告されている
方法により、融合蛋白質からＶＩＰを切りだすのは困難
である。しかしながら、酵母由来の塩基性アミノ酸残基
対特異的プロテアーゼは、Ｘ−Ａｒｇ（Ｘは、Ｌｙｓ
、 Ａｒｇ又はＰｒｏを示す）配列を特異的に認識し、
ジペプチドのＣ末端を優先的に加水分解する特性を有し
ている。このことを利用して、ＶＩＰの生産が可能とな
る。すなわち、例えば、キャリアーとして、プロティン
Ａの１位から４０２位、スペーサーとして、＾ｒｇ−Ｇ
ｌｙ−３ａｒ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ −Ａｓｐ−Ｖ
ａ Ｉ−１ｌ ｅ−Ｇ ｌ ｕ−Ｇ Ｉ ｙ−Ａ ｒｇ
−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−１１ｃ−１’ｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ
−Ａｒｇ、目的ペプチドとして、５分子のＶＩＰの生合
成前駆体Ｖ Ｉ Ｐ−Ｇ ｌ ｙをＬｙｓ−Ａｒｇを介
して結合したペプチドを用い、前記キャリアーとスペー
サーとペプチドとが結合したタンデム型融合蛋白質（以
下、ＰＡＶ Ｉ ＰＧ （Ｐ）Ｒ５と略称する）を枯草
菌を宿主として菌体外に分泌生産する。
前記ＰＡＶ Ｉ ＰＧ （Ｐ）Ｒ５には、血液凝固因子
Ｘａの認識配列であるＩ ｌ ｕ−Ｇ Ｉ ｕ−Ｇ Ｉ
ｙ−Ａｒｇ ｓカリクレインの認識配列であるＰｈｅ
−＾「ｇ１酵母クライベロマイセス・ラクティス由来の
塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの認識配列で
あるＬｙｓ−Ａ ｒｇが含まれている。ＰＡＶＩＰＧ
（Ｐ）Ｒ５を精製した後、酵母フライベロマイセス・ラ
クティス由来の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアー
ゼ（特開平２−４９５８５号公報；以下、ＰＢＲ３−Ｐ
ｒｏＬｅａｓｅと略称する）により単独で限定分解する
ことにより、Ｌｙｓ−ＡｒｇのＣ末端側の分解が生じ、
ＶＩＰ−Ｇｌｙ−ＬｙＳ−Ａｒｇ及びＶ Ｉ Ｐ−Ｇ
ｌ ｙが生成する。また、ＰＡＶＩ ＰＧ （Ｐ）Ｒ５
に、ＰＢＲ８−ｐｒｏｔｅａｓｅとカルボキシペプチダ
ーゼとを同時に又は順次作用させることにより、ＶＩＰ
−ＧＩｙのみを得ることができる。
Ｘａの認識配列であるＩ ｌ ｕ−Ｇ Ｉ ｕ−Ｇ Ｉ
ｙ−Ａｒｇ ｓカリクレインの認識配列であるＰｈｅ
−＾「ｇ１酵母クライベロマイセス・ラクティス由来の
塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの認識配列で
あるＬｙｓ−Ａ ｒｇが含まれている。ＰＡＶＩＰＧ
（Ｐ）Ｒ５を精製した後、酵母フライベロマイセス・ラ
クティス由来の塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアー
ゼ（特開平２−４９５８５号公報；以下、ＰＢＲ３−Ｐ
ｒｏＬｅａｓｅと略称する）により単独で限定分解する
ことにより、Ｌｙｓ−ＡｒｇのＣ末端側の分解が生じ、
ＶＩＰ−Ｇｌｙ−ＬｙＳ−Ａｒｇ及びＶ Ｉ Ｐ−Ｇ
ｌ ｙが生成する。また、ＰＡＶＩ ＰＧ （Ｐ）Ｒ５
に、ＰＢＲ８−ｐｒｏｔｅａｓｅとカルボキシペプチダ
ーゼとを同時に又は順次作用させることにより、ＶＩＰ
−ＧＩｙのみを得ることができる。
前記融合蛋白質を生産する宿主微生物は、例えば酵母、
カビなどであってもよいが、エシリヒア（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ））属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、
又はスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ）酸量生物であるのが好ましい。バチルス属の微生物
、特にバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５
ｕｂｔ１１１ｓ）は、安全性が高く、菌体外に蛋白質を
多量に分泌する。さらに、バチルス・ズブチリスの中で
、菌体外へのプロテアーゼ生産性を突然変異などの手法
により低下させた菌株が好ましい。このような菌株をプ
ラスミドにより形質転換する場合には、宿主に由来する
プロテアーゼによる融合蛋白質の分解を著しく抑制でき
、ＶＩＰ前駆体を効率よく多量に得ることができる。
カビなどであってもよいが、エシリヒア（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ））属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、
又はスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ）酸量生物であるのが好ましい。バチルス属の微生物
、特にバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５
ｕｂｔ１１１ｓ）は、安全性が高く、菌体外に蛋白質を
多量に分泌する。さらに、バチルス・ズブチリスの中で
、菌体外へのプロテアーゼ生産性を突然変異などの手法
により低下させた菌株が好ましい。このような菌株をプ
ラスミドにより形質転換する場合には、宿主に由来する
プロテアーゼによる融合蛋白質の分解を著しく抑制でき
、ＶＩＰ前駆体を効率よく多量に得ることができる。
プロテアーゼ生産性の低い枯葦菌としては、例えば、（
１）バチルス・サブチリス（ＢａＣＩ Ｉ ｌ ｕｓ
駐ｂｔｔ口５）ＤＢ１０４株［Ｊ、 Ｂａｅｔｅｒｌ
ｏｌ、、 １６０； ４４２−４４４． （１９８４）
］及びバチルス・サブチリス１０４ＨＬ株［Ｂｌｏｃ
ｈｅ＋＊、 Ｂｌｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕ
ｎ、、 １２８； ６ｏｔ−ｅｏｓ、 （１９８５）］
； （２）本出願人が特開昭６４−３７２８４号公
報において提案したバチルス・サブチリスＤＹ−１６株
（微工研菌寄第９４８８号）；（３）アルカリプロテア
ーゼ及び中性プロテアーゼの生産能を欠き、かつプロテ
アーゼ活性が野生株の３％以下である枯草菌に、ｓ ｐ
ｏＯＡ△６７７変異遺伝子を導入した菌株などが挙げ
られる。特に好ましい菌株は上記（３）に属する菌株で
あり、このような菌株には、例えば、特願平１−２８１
４４０号において、本発明者らが提案したように、バチ
ルス・サブチリス１０４ＨＬ株にｓｐｏ ＯＡΔ６７７
変異遺伝子を導入したバチルス・サブチリス５Ｐ０１１
株（微工研菌寄第１０９８７号）、バチルス・サブチリ
スＤＹ＝１６株に５ｐｏＯ＾△６７７変異遺伝子を導入
したバチルス・サブチリス５ＰＬ１４株（微工研菌寄第
１０９８８号）などが含まれる。
１）バチルス・サブチリス（ＢａＣＩ Ｉ ｌ ｕｓ
駐ｂｔｔ口５）ＤＢ１０４株［Ｊ、 Ｂａｅｔｅｒｌ
ｏｌ、、 １６０； ４４２−４４４． （１９８４）
］及びバチルス・サブチリス１０４ＨＬ株［Ｂｌｏｃ
ｈｅ＋＊、 Ｂｌｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕ
ｎ、、 １２８； ６ｏｔ−ｅｏｓ、 （１９８５）］
； （２）本出願人が特開昭６４−３７２８４号公
報において提案したバチルス・サブチリスＤＹ−１６株
（微工研菌寄第９４８８号）；（３）アルカリプロテア
ーゼ及び中性プロテアーゼの生産能を欠き、かつプロテ
アーゼ活性が野生株の３％以下である枯草菌に、ｓ ｐ
ｏＯＡ△６７７変異遺伝子を導入した菌株などが挙げ
られる。特に好ましい菌株は上記（３）に属する菌株で
あり、このような菌株には、例えば、特願平１−２８１
４４０号において、本発明者らが提案したように、バチ
ルス・サブチリス１０４ＨＬ株にｓｐｏ ＯＡΔ６７７
変異遺伝子を導入したバチルス・サブチリス５Ｐ０１１
株（微工研菌寄第１０９８７号）、バチルス・サブチリ
スＤＹ＝１６株に５ｐｏＯ＾△６７７変異遺伝子を導入
したバチルス・サブチリス５ＰＬ１４株（微工研菌寄第
１０９８８号）などが含まれる。
融合蛋白質にプロテアーゼを作用させる条件は、使用す
るプロテアーゼに適合した緩衝液、ｐＨ１添加物の共存
下で行なうことができる。前記添加物としては、例えば
、尿素、塩酸グアニジン、塩化カルシウム；ラウリル硫
酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと略称する）、トリトン（
Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ −Ｚ ００、ルブロール（Ｌｕｂｒ
ｏｌ）Ｐ Ｘなどのイオン性、非イオン性又は両性界面
活性剤；メタノール、エタノール、イソプロパツール、
アセトニトリルなどの有機溶媒；ジイソプロピルフルオ
ロフォスフエイト（ＤＦＰ）、フェニルメタンスルホン
酸フルオリド（ＰＭＳＦ） 、パラクロロ水銀安息香酸
（ＰＣＭＢ） 、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）、エチ
レンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、０−フェ
ナントロリン、ロイペプチン、ペプスタチンＡなどの阻
害剤などが挙げられる。より具体的には、酵母フライベ
ロマイセス・ラクティス由来の塩基性アミノ酸残基対特
異的プロテアーゼＰＢＲ３−Ｐｒｏｔｅａｓｅを用いる
場合には、ｐＨ６〜１０、好ましくは６〜８程度、温度
１５〜６０℃、好ましくは２５〜５０℃程度の反応条件
で行なうことができる。また、添加物の濃度は、適宜選
択でき、例えば、塩化カルシウムの好ましい濃度は０．
０１〜１０ｍＭ程度、尿素の好ましい濃度は０．１〜６
Ｍ程度、ＳＤＳの好ましい濃度は０．００１〜０．１％
程度、ルブロールＰＸの好ましい濃度は０．０１〜１０
％程度である。ｐＨは、適当な酸や塩基の添加により調
整してもよく、適当な緩衝液、例えば、トリス−塩酸、
リン酸、コハク酸、酢酸、３，３−ジメチルグルタル酸
、フマル酸なとを含む緩衝液により調整してもよい。
るプロテアーゼに適合した緩衝液、ｐＨ１添加物の共存
下で行なうことができる。前記添加物としては、例えば
、尿素、塩酸グアニジン、塩化カルシウム；ラウリル硫
酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと略称する）、トリトン（
Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ −Ｚ ００、ルブロール（Ｌｕｂｒ
ｏｌ）Ｐ Ｘなどのイオン性、非イオン性又は両性界面
活性剤；メタノール、エタノール、イソプロパツール、
アセトニトリルなどの有機溶媒；ジイソプロピルフルオ
ロフォスフエイト（ＤＦＰ）、フェニルメタンスルホン
酸フルオリド（ＰＭＳＦ） 、パラクロロ水銀安息香酸
（ＰＣＭＢ） 、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）、エチ
レンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、０−フェ
ナントロリン、ロイペプチン、ペプスタチンＡなどの阻
害剤などが挙げられる。より具体的には、酵母フライベ
ロマイセス・ラクティス由来の塩基性アミノ酸残基対特
異的プロテアーゼＰＢＲ３−Ｐｒｏｔｅａｓｅを用いる
場合には、ｐＨ６〜１０、好ましくは６〜８程度、温度
１５〜６０℃、好ましくは２５〜５０℃程度の反応条件
で行なうことができる。また、添加物の濃度は、適宜選
択でき、例えば、塩化カルシウムの好ましい濃度は０．
０１〜１０ｍＭ程度、尿素の好ましい濃度は０．１〜６
Ｍ程度、ＳＤＳの好ましい濃度は０．００１〜０．１％
程度、ルブロールＰＸの好ましい濃度は０．０１〜１０
％程度である。ｐＨは、適当な酸や塩基の添加により調
整してもよく、適当な緩衝液、例えば、トリス−塩酸、
リン酸、コハク酸、酢酸、３，３−ジメチルグルタル酸
、フマル酸なとを含む緩衝液により調整してもよい。
酵素は、高純度のものを使用するのが好ましいが、基質
融合蛋白質の目的とする部位以外で加水分解が生じない
程度であれば、純度は問わない。
融合蛋白質の目的とする部位以外で加水分解が生じない
程度であれば、純度は問わない。
また、純度の低い酵素と阻害剤とを共存させて反応させ
てもよい。この場合、阻害剤として、利用するプロテア
ーゼを阻害せず、かつ目的とする部位以外で加水分解す
る夾雑プロテアーゼの作用を阻害する阻害剤を用いると
、目的とする部位以外でのプロテアーゼによる分解を抑
制することも可能である。
てもよい。この場合、阻害剤として、利用するプロテア
ーゼを阻害せず、かつ目的とする部位以外で加水分解す
る夾雑プロテアーゼの作用を阻害する阻害剤を用いると
、目的とする部位以外でのプロテアーゼによる分解を抑
制することも可能である。
酵素量は、基質融合蛋白質１μモルを限定分解するため
には、酵素０．００１〜１００Ｕ、好ましくは０．０１
〜１０Ｕ程度である。なお、ＩＵは、低分子の合成基質
、例えばＢｏｃ−ＧｉｎＡ ｒ ｇ−Ａ ｒ ｇ−ＭＣ
Ａ （Ｂｏ ｃはｔ−ブトキシカルボニル基、ＭＣＡは
４−メチルクマリル−７アミドを示す）を用いて目的と
する部位において１分間に２μモルの基質の加水分解を
触媒する酵素量である。アミノペプチダーゼ、カルボキ
シペプチダーゼを共存又は独立して反応させる場合、ア
ミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼの使用量は
、エンド型プロテアーゼに対して、０゜０１〜１０００
０倍程度１好ましくは１０〜１０００倍程度の活性を有
する量である。
には、酵素０．００１〜１００Ｕ、好ましくは０．０１
〜１０Ｕ程度である。なお、ＩＵは、低分子の合成基質
、例えばＢｏｃ−ＧｉｎＡ ｒ ｇ−Ａ ｒ ｇ−ＭＣ
Ａ （Ｂｏ ｃはｔ−ブトキシカルボニル基、ＭＣＡは
４−メチルクマリル−７アミドを示す）を用いて目的と
する部位において１分間に２μモルの基質の加水分解を
触媒する酵素量である。アミノペプチダーゼ、カルボキ
シペプチダーゼを共存又は独立して反応させる場合、ア
ミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼの使用量は
、エンド型プロテアーゼに対して、０゜０１〜１０００
０倍程度１好ましくは１０〜１０００倍程度の活性を有
する量である。
基質融合蛋白質と酵素との反応は、遊離の酵素、または
担体に酵素を固定化した固定化酵素を用いてバッチ式で
行なってもよい。固定化酵素の担体としては、慣用の担
体、例えば、ポリアクリルアミド、キチン、デキストラ
ン、に−゛カラギーナン、セライト、セルロースなどが
挙げられる。また、反応は、遊離の酵素と膜型のバイオ
リアクターとを組合せて行なってもよく、固定化酵素を
用いて連続式バイオリアクターなどを用いて行なっても
よい。
担体に酵素を固定化した固定化酵素を用いてバッチ式で
行なってもよい。固定化酵素の担体としては、慣用の担
体、例えば、ポリアクリルアミド、キチン、デキストラ
ン、に−゛カラギーナン、セライト、セルロースなどが
挙げられる。また、反応は、遊離の酵素と膜型のバイオ
リアクターとを組合せて行なってもよく、固定化酵素を
用いて連続式バイオリアクターなどを用いて行なっても
よい。
前記融合蛋白質を生産する宿主微生物は、慣用の遺伝子
操作技術により調製できる。例えば、キャリアーＡが連
結された融合蛋白質を生産する宿主微生物を例にとって
説明すると、次の通りである。
操作技術により調製できる。例えば、キャリアーＡが連
結された融合蛋白質を生産する宿主微生物を例にとって
説明すると、次の通りである。
先ず、前記融合蛋白質の構造に対応させて、キャリアー
Ａをコードする遺伝子と、ペプチド又は蛋白質Ｃをコー
ドする遺伝子とを、前記ジペプチドＢをコードする遺伝
子を介して連結する。得られた遺伝子断片に、発現のた
めの制御部位であるプロモーター リポソーム結合部位
及び分泌シグナルを連結し、得られたＤＮＡ断片を、ベ
クターＤＮＡに連結することにより、プラスミドを構築
できる。なお、キャリアーとして前記プロティンＡなど
を用いる場合には、プロモーター リポソーム結合部位
、分泌シグナル及び蛋白質をコードする遺伝子を、ベク
ターに導入する必要はない。
Ａをコードする遺伝子と、ペプチド又は蛋白質Ｃをコー
ドする遺伝子とを、前記ジペプチドＢをコードする遺伝
子を介して連結する。得られた遺伝子断片に、発現のた
めの制御部位であるプロモーター リポソーム結合部位
及び分泌シグナルを連結し、得られたＤＮＡ断片を、ベ
クターＤＮＡに連結することにより、プラスミドを構築
できる。なお、キャリアーとして前記プロティンＡなど
を用いる場合には、プロモーター リポソーム結合部位
、分泌シグナル及び蛋白質をコードする遺伝子を、ベク
ターに導入する必要はない。
ＤＮＡの連結には、通常の連結技術、例えば制限酵素を
用いて切断したＤＮＡとベクターＤＮＡとをリガーゼを
用いて連結する制限酵素法、リンカ−法などにより構築
できる。
用いて切断したＤＮＡとベクターＤＮＡとをリガーゼを
用いて連結する制限酵素法、リンカ−法などにより構築
できる。
なお、ベクターＤＮＡは、宿主微生物により複製可能な
りＮＡであればよいが、前記のバチルス属細菌で複製可
能なプラスミドのＤＮＡであるのが好ましい。このよう
なベクターとしては、例えば、スタフィロコッカス属由
来のプラスミドｐＵＢ１１０、ｐｃ１９４、ｐＢＤ６４
、ｐＥ１９４、ｐｓＡＯ５０１、ｐＴ１２７およびこれ
らの誘導体が挙げられる。好ましいベクターＤＮＡは、
プラスミドｐＵＢ１１０のＤＮＡである。これらのプラ
スミドを有するバチルス・ズブチリスは、いずれもオハ
イオ大学バチルスストックセンター（住所： ４８４．
Ｖｅｓｔ １２ｔｈ Ａｖｅｎｕｅ、 Ｃｏ１ｕｓｕ
ｓ ０ｈａｉ。
りＮＡであればよいが、前記のバチルス属細菌で複製可
能なプラスミドのＤＮＡであるのが好ましい。このよう
なベクターとしては、例えば、スタフィロコッカス属由
来のプラスミドｐＵＢ１１０、ｐｃ１９４、ｐＢＤ６４
、ｐＥ１９４、ｐｓＡＯ５０１、ｐＴ１２７およびこれ
らの誘導体が挙げられる。好ましいベクターＤＮＡは、
プラスミドｐＵＢ１１０のＤＮＡである。これらのプラ
スミドを有するバチルス・ズブチリスは、いずれもオハ
イオ大学バチルスストックセンター（住所： ４８４．
Ｖｅｓｔ １２ｔｈ Ａｖｅｎｕｅ、 Ｃｏ１ｕｓｕ
ｓ ０ｈａｉ。
、 ４３２１０ Ｕ、Ｓ、Ａ、）から入手できる。
また、タンデム型融合蛋白質を生産させる場合、複数の
ペプチドをコードする遺伝子の構築、各遺伝子断片の連
結には、慣用の遺伝子操作法が利用できる。その際、大
腸菌の宿主ベクターなどを利用することもできる。例え
ば、タンデム型遺伝子の構築をＶＩＰを例にとって説明
すると、次の通りである。複数のＶＩＰをコードする遺
伝子の構築には、ＶＩＰ遺伝子の５′側に、制限酵素Ｔ
ｔｈｌｌｌｌの切断認識塩基配列であるＧＡＣＮＮＮＧ
ＴＣが存在することを利用できる。前記制限酵素Ｔｔｈ
ｌｌｌｌによる切断片は、突出末端であるが対称構造を
有していないので、制限酵素Ｔｔｈｌｌｌ Ｉによる切
断部位を利用して、ペプチドをコードする複数の遺伝子
を目的の方向に導入する切断点として極めて有用である
。すなわち、挿入するＶＩＰ遺伝子として、５′側に制
限酵素Ｔｔｈｌｌｌｌの切断部位を有し、３′側に前記
制限酵素の切断部位を有しない遺伝子を合成する。
ペプチドをコードする遺伝子の構築、各遺伝子断片の連
結には、慣用の遺伝子操作法が利用できる。その際、大
腸菌の宿主ベクターなどを利用することもできる。例え
ば、タンデム型遺伝子の構築をＶＩＰを例にとって説明
すると、次の通りである。複数のＶＩＰをコードする遺
伝子の構築には、ＶＩＰ遺伝子の５′側に、制限酵素Ｔ
ｔｈｌｌｌｌの切断認識塩基配列であるＧＡＣＮＮＮＧ
ＴＣが存在することを利用できる。前記制限酵素Ｔｔｈ
ｌｌｌｌによる切断片は、突出末端であるが対称構造を
有していないので、制限酵素Ｔｔｈｌｌｌ Ｉによる切
断部位を利用して、ペプチドをコードする複数の遺伝子
を目的の方向に導入する切断点として極めて有用である
。すなわち、挿入するＶＩＰ遺伝子として、５′側に制
限酵素Ｔｔｈｌｌｌｌの切断部位を有し、３′側に前記
制限酵素の切断部位を有しない遺伝子を合成する。
一方、ＶＩＰ遺伝子が導入されたプラスミドを制限酵素
Ｔｔｈｌｌｌｌで切断すると共に、５′側のリン酸残基
をアルカリホスファターゼにより除去し、前記挿入する
ＶＩＰ遺伝子をＤＮＡリガーゼにより連結する。得られ
たベクターにより大腸菌を形質転換すると共に、形質転
換株を培養し、２つのＶＩＰ遺伝子が導入されたプラス
ミドを調製する。上記操作を繰返し行なうことにより、
このＴｔｈｌｌｌｌ切断部位を利用して、理論的には、
何回でも、ＶＩＰ遺伝子のタンデム化が可能であり、複
数のＶＩＰ遺伝子が連結されたプラスミドを調製できる
。
Ｔｔｈｌｌｌｌで切断すると共に、５′側のリン酸残基
をアルカリホスファターゼにより除去し、前記挿入する
ＶＩＰ遺伝子をＤＮＡリガーゼにより連結する。得られ
たベクターにより大腸菌を形質転換すると共に、形質転
換株を培養し、２つのＶＩＰ遺伝子が導入されたプラス
ミドを調製する。上記操作を繰返し行なうことにより、
このＴｔｈｌｌｌｌ切断部位を利用して、理論的には、
何回でも、ＶＩＰ遺伝子のタンデム化が可能であり、複
数のＶＩＰ遺伝子が連結されたプラスミドを調製できる
。
なお、制限酵素Ｔｔｈｌｌｌｌが認識する切断部位を、
ＶＩＰ以外の他のペプチドをコードする遺伝子の５′側
に付加し、前記と同様にして順次連結することにより、
他のペプチドをコードする遺伝子をタンデム化できる。
ＶＩＰ以外の他のペプチドをコードする遺伝子の５′側
に付加し、前記と同様にして順次連結することにより、
他のペプチドをコードする遺伝子をタンデム化できる。
前記ペプチドをコードする遺伝子の数は、２以上であれ
ばよいが、通常、２〜２０程度である。
ばよいが、通常、２〜２０程度である。
複数のペプチドをコードする遺伝子は、生物から抽出し
てもよく、化学合成してもよい。なお、同種のペプチド
を連続した配列で、複数コードするような遺伝子は、一
般に知られていない。従って、複数個のペプチドをコー
ドする遺伝子として、化学合成した遺伝子を複数用いる
のが好ましい。
てもよく、化学合成してもよい。なお、同種のペプチド
を連続した配列で、複数コードするような遺伝子は、一
般に知られていない。従って、複数個のペプチドをコー
ドする遺伝子として、化学合成した遺伝子を複数用いる
のが好ましい。
また、複数のペプチドは、同種の複数のペプチドで構成
されていてもよく、異種の複数のペプチドで構成されて
いてもよい。
されていてもよく、異種の複数のペプチドで構成されて
いてもよい。
前記のようにして得られたプラスミドにより、宿主微生
物を形質転換することにより、融合蛋白質を生産する微
生物が得られる。前記プラスミドによる宿主微生物の形
質転換は、慣用の方法、例えば、チャン（Ｃｈａｎｇ）
らのプロトプラスト化法［Ｃｈａｎｇ、 Ｓ、、 ｅｔ
ａｔ、、 Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、、 １
６８．１１１−１１５ （１９７９）］などを利用して
行なうことができる。
物を形質転換することにより、融合蛋白質を生産する微
生物が得られる。前記プラスミドによる宿主微生物の形
質転換は、慣用の方法、例えば、チャン（Ｃｈａｎｇ）
らのプロトプラスト化法［Ｃｈａｎｇ、 Ｓ、、 ｅｔ
ａｔ、、 Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、、 １
６８．１１１−１１５ （１９７９）］などを利用して
行なうことができる。
前記融合蛋白質は、前記形質転換された宿主微生物を培
養することにより得られる。なお、融合蛋白質が菌体内
やペリプラズムに蓄積される場合には、慣用の方法、例
えば、菌体を破砕することにより、融合蛋白質を得るこ
とができる。宿主微生物の培養は、慣用の液体培養に準
じて行なうことができる。すなわち、形質転換株の培養
は、慣用の成分、例えば、無機塩、炭素源、窒素源、増
殖因子成分などを含む液体培地で、振盪培養又は通気撹
拌培養法により行なうことができる。培地のｐＨは、例
えば、７〜８程度である。培養は、微生物の培養に採用
される通常の条件、例えば、温度１５〜４５℃、好まし
くは２５〜４０℃、培養時間６〜６０時間程度の条件で
行なうことができる。
養することにより得られる。なお、融合蛋白質が菌体内
やペリプラズムに蓄積される場合には、慣用の方法、例
えば、菌体を破砕することにより、融合蛋白質を得るこ
とができる。宿主微生物の培養は、慣用の液体培養に準
じて行なうことができる。すなわち、形質転換株の培養
は、慣用の成分、例えば、無機塩、炭素源、窒素源、増
殖因子成分などを含む液体培地で、振盪培養又は通気撹
拌培養法により行なうことができる。培地のｐＨは、例
えば、７〜８程度である。培養は、微生物の培養に採用
される通常の条件、例えば、温度１５〜４５℃、好まし
くは２５〜４０℃、培養時間６〜６０時間程度の条件で
行なうことができる。
［発明の効果］
本発明のペプチド又は蛋白質の製造方法は、特定のプロ
セシングシグナルであるジペプチドを、特異的な酵素に
より切断するので、汎用性があり、大量処理が可能であ
る。
セシングシグナルであるジペプチドを、特異的な酵素に
より切断するので、汎用性があり、大量処理が可能であ
る。
また、広い範囲の宿主微生物により異種の融合蛋白質を
生産させ、融合蛋白質から目的遺伝子産物であるペプチ
ド又は蛋白質を切りだすことができる。
生産させ、融合蛋白質から目的遺伝子産物であるペプチ
ド又は蛋白質を切りだすことができる。
さらには、融合蛋白質を生産した後、インビトロ（Ｉｎ
ｖｌｔｒｏ）で分解し、ペプチド又は蛋白質を製造で
きる。
ｖｌｔｒｏ）で分解し、ペプチド又は蛋白質を製造で
きる。
［実施例］
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない
。なお、実施例で用いた酵素は、いずれも寅酒造■製の
酵素であり、それらの仕様に記載されている条件で反応
を行った。
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない
。なお、実施例で用いた酵素は、いずれも寅酒造■製の
酵素であり、それらの仕様に記載されている条件で反応
を行った。
実施例１
切りだし
く１）塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの調製
フライベロマイセス・ラクティス（ＩＦＯ１９０３）を
ＹＭ培地３０ｊ？中で２日間培養し、培養液を遠心分離
して湿重量３１４ｇの菌体を回収した。この菌体を３０
０ ｍｌの緩衝液１ ［１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，０） 、０．５ｍＭの塩化カルシウム］に懸
濁し、ダイノーミルで菌体を破砕し、破砕液を、１７０
０ｇ、１０分間の遠心分離に供し菌体残渣を除去し、得
られた上清を、１５００００ｇ、６０分の超遠心分離に
供し、沈澱として膜画分７９．４ｇを調整した。この膜
画分を６００ ｍｌの抽出用緩衝液［１０ｍＭのトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０） 、３％のルブロールＰＸ
、０．１Ｍの塩化ナトリウム］に懸濁し、−晩撹拌して
酵素を抽出し、超遠心分離に供し、上清として膜抽出液
を得た。
ＹＭ培地３０ｊ？中で２日間培養し、培養液を遠心分離
して湿重量３１４ｇの菌体を回収した。この菌体を３０
０ ｍｌの緩衝液１ ［１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，０） 、０．５ｍＭの塩化カルシウム］に懸
濁し、ダイノーミルで菌体を破砕し、破砕液を、１７０
０ｇ、１０分間の遠心分離に供し菌体残渣を除去し、得
られた上清を、１５００００ｇ、６０分の超遠心分離に
供し、沈澱として膜画分７９．４ｇを調整した。この膜
画分を６００ ｍｌの抽出用緩衝液［１０ｍＭのトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０） 、３％のルブロールＰＸ
、０．１Ｍの塩化ナトリウム］に懸濁し、−晩撹拌して
酵素を抽出し、超遠心分離に供し、上清として膜抽出液
を得た。
この抽出液を５０℃で３０分間熱処理し、生成した沈澱
を、３９０００ｇ、２０分間の遠心分離により除去し、
限外濾過により濃縮した後、緩衝液２ ［１０ｍＭのト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７゜０） 、０．５ｍＭの塩化
カルシウム、０．２％のルブロールＰＸ］に透析して得
られた両分を熱処理膜抽出液とした。
を、３９０００ｇ、２０分間の遠心分離により除去し、
限外濾過により濃縮した後、緩衝液２ ［１０ｍＭのト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７゜０） 、０．５ｍＭの塩化
カルシウム、０．２％のルブロールＰＸ］に透析して得
られた両分を熱処理膜抽出液とした。
この両分を緩衝液２で予め平衡化したＤＥＡＥ−トヨパ
ール６５０Ｍ （２，５Ｘ４０ａａ）に注入し、同緩衝
液で十分に洗浄した後、０〜０．６Ｍ塩化ナトリウムの
勾配溶出法により酵素を溶出し活性画分を得た。
ール６５０Ｍ （２，５Ｘ４０ａａ）に注入し、同緩衝
液で十分に洗浄した後、０〜０．６Ｍ塩化ナトリウムの
勾配溶出法により酵素を溶出し活性画分を得た。
活性画分を限外濾過により濃縮した後、０．５Ｍの塩化
ナトリウムを含む緩衝液２を、予め平衡化したコンカナ
バリンＡ （Ｃｏｎ Ａ）−セファロース（１，６Ｘ２
５ｃｍ）に注入し、同緩衝液で十分洗浄した後、０．５
Ｍの塩化ナトリウム、０．６７Ｍのα−メチル−Ｄ−マ
ンノシドを含む緩衝液２で溶出した。活性画分を濃縮し
、Ｃｏｎ Ａ−セファロース画分とした。
ナトリウムを含む緩衝液２を、予め平衡化したコンカナ
バリンＡ （Ｃｏｎ Ａ）−セファロース（１，６Ｘ２
５ｃｍ）に注入し、同緩衝液で十分洗浄した後、０．５
Ｍの塩化ナトリウム、０．６７Ｍのα−メチル−Ｄ−マ
ンノシドを含む緩衝液２で溶出した。活性画分を濃縮し
、Ｃｏｎ Ａ−セファロース画分とした。
Ｃｏｎ Ａ−セファロース画分を緩衝液２に透析し、同
緩衝液で予め平衡化したアルギニンーセファロ−ス（１
，６Ｘ５０ｃｍ）に注入し、十分に平衡化した後、０〜
０．５Ｍ塩化ナトリウム勾配溶出法により溶出し、活性
画分を限外濾過により濃縮し、アルギニン−セファロー
ス画分とした。
緩衝液で予め平衡化したアルギニンーセファロ−ス（１
，６Ｘ５０ｃｍ）に注入し、十分に平衡化した後、０〜
０．５Ｍ塩化ナトリウム勾配溶出法により溶出し、活性
画分を限外濾過により濃縮し、アルギニン−セファロー
ス画分とした。
アルギニン−セファロース画分を緩衝液２に透析し、同
緩衝液で予め平衡化したモノＱ （Ｍｏｎ。
緩衝液で予め平衡化したモノＱ （Ｍｏｎ。
Ｑ、０．５Ｘ５．Ｏｃ＋ｎ）に注入し、同緩衝液で十分
に洗浄した後、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウム勾配溶出法
により溶出したところ、活性画分として２つのピーク得
られた。これらの両分を別個に回収して濃縮し、それぞ
れＭｏｎｏ Ｑ −１、Ｍｏｎｏ Ｑ−■画分とし
た。これらの両分を別個に緩衝液２に透析し、予め同緩
衝液で平衡化したベンズアミジン−セファロース（１，
６Ｘ５、Ｏａｍ ）に注入し、同緩衝液で十分に洗浄し
た後、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウム勾配溶出法により酵
素を溶出した。得られた活性画分をそれぞれＢｅｎｚ
−Ｉ 、 Ｂｅｎｚ−■画分とした。
に洗浄した後、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウム勾配溶出法
により溶出したところ、活性画分として２つのピーク得
られた。これらの両分を別個に回収して濃縮し、それぞ
れＭｏｎｏ Ｑ −１、Ｍｏｎｏ Ｑ−■画分とし
た。これらの両分を別個に緩衝液２に透析し、予め同緩
衝液で平衡化したベンズアミジン−セファロース（１，
６Ｘ５、Ｏａｍ ）に注入し、同緩衝液で十分に洗浄し
た後、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウム勾配溶出法により酵
素を溶出した。得られた活性画分をそれぞれＢｅｎｚ
−Ｉ 、 Ｂｅｎｚ−■画分とした。
塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼの精製工程の
要約を表に示す。
要約を表に示す。
（２）プラスミドｐＭＤ２００の構築
バチルス・ズブチリスを宿主とし、スタフィロコッカス
・アウレウスのプロティンＡ遺伝子を発現し、培養上清
中にプロティンＡを分泌生産するプラスミドｐＭＤ２０
０の構築図を第１図に示す。
・アウレウスのプロティンＡ遺伝子を発現し、培養上清
中にプロティンＡを分泌生産するプラスミドｐＭＤ２０
０の構築図を第１図に示す。
プロティンＡ遺伝子を含むプラスミドｐＤＣＰ２４１１
（特開昭６３−２４５６７７号公報参照）は、スタフィ
ロコッカス・アウレウスの１菌株からクロニッグしたプ
ロティンＡ遺伝子を、大腸菌で複製可能なプラスミドｐ
Ｕｃ１１８に連結したプラスミドである。ｐＤｃＰ２４
１１の取得法、およびｐＤｃＰ２４１１に含まれるプロ
ティンＡ遺伝子の全塩基配列は、前記特開昭１１ｉ３−
２４５６７７号公報に詳細に記載されている。このプラ
スミドを含む大腸菌形質転換株から、アルカリ法［Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ、 。
（特開昭６３−２４５６７７号公報参照）は、スタフィ
ロコッカス・アウレウスの１菌株からクロニッグしたプ
ロティンＡ遺伝子を、大腸菌で複製可能なプラスミドｐ
Ｕｃ１１８に連結したプラスミドである。ｐＤｃＰ２４
１１の取得法、およびｐＤｃＰ２４１１に含まれるプロ
ティンＡ遺伝子の全塩基配列は、前記特開昭１１ｉ３−
２４５６７７号公報に詳細に記載されている。このプラ
スミドを含む大腸菌形質転換株から、アルカリ法［Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ、 。
ｅｔ ａｔ、、 Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
、、 １．３３ （１９８９）］によりｐＤｃＰ２４１
１を調製した。
、、 １．３３ （１９８９）］によりｐＤｃＰ２４１
１を調製した。
ｐＤＣＰ２４１１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨａｍＨｌと
で切断し、生成したプロティンＡ遺伝子を含む約１．９
ｋｂのＤＮＡ断片（以下、プロティンＡ遺伝子断片とい
う）をアガロースゲル電気泳動法を用いて分離した後、
電気溶出法を用いて溶出し、精製した［５ａｓｂｒｏｏ
ｋ、 ｅｔ ａｌ、、 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ、 ６．２８ （１９８９）］ 、前記プロティン
Ａ遺遺伝子片は、プロティンＡ遺伝子のプロモーターリ
ポソーム結合部位、分泌のためのシグナル配列、および
プロティンＡの構造遺伝子を含んでいる。
で切断し、生成したプロティンＡ遺伝子を含む約１．９
ｋｂのＤＮＡ断片（以下、プロティンＡ遺伝子断片とい
う）をアガロースゲル電気泳動法を用いて分離した後、
電気溶出法を用いて溶出し、精製した［５ａｓｂｒｏｏ
ｋ、 ｅｔ ａｌ、、 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ、 ６．２８ （１９８９）］ 、前記プロティン
Ａ遺遺伝子片は、プロティンＡ遺伝子のプロモーターリ
ポソーム結合部位、分泌のためのシグナル配列、および
プロティンＡの構造遺伝子を含んでいる。
次いで、ベクターとなるｐＵＢｌｌｏを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩとＢａｍＨＩとで切断し、生じた約３．７Ｋｂｋｂ
のＤＮＡ断片（以下、ｐＵＢ１１０ベクター遺伝子断片
という）を、上記と同様にして、アガロースゲル電気泳
動法を用いて分離した後、電気溶出法を用いて溶出し、
精製した。
ＲＩとＢａｍＨＩとで切断し、生じた約３．７Ｋｂｋｂ
のＤＮＡ断片（以下、ｐＵＢ１１０ベクター遺伝子断片
という）を、上記と同様にして、アガロースゲル電気泳
動法を用いて分離した後、電気溶出法を用いて溶出し、
精製した。
プロティンＡ遺伝子断片と、ｐＵＢ１１０ベクター遺伝
子断片とを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、プ
ラスミドｐＭＤ２００を構築した。
子断片とを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、プ
ラスミドｐＭＤ２００を構築した。
（３） Ｖ Ｉ Ｐをコードする遺伝子を含むプラスミ
ドの構築 ＶＩＰ遺伝子を構築するため、ＶＩＰのアミノ酸配列に
従って、対応する遺伝子コドンを枯草菌のコドン使用開
度に合せ、下記の８種類の遺伝子を、ＡＢ１４３０Ａ
ＤＮＡ合成装置で作製した。
ドの構築 ＶＩＰ遺伝子を構築するため、ＶＩＰのアミノ酸配列に
従って、対応する遺伝子コドンを枯草菌のコドン使用開
度に合せ、下記の８種類の遺伝子を、ＡＢ１４３０Ａ
ＤＮＡ合成装置で作製した。
５°−ＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＴＣＡＴＴＧＡＡＧ
ＧＡＡＧＡＡＴＧ＾ＣＡＡＴＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＧ
ＧＣＡＴＡＧＣＧＡＣＧ−３゜３°−ＣＴＣＡＧＣＴＧ
ＣＡＧＴ＾＾ＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＡＣＴＧＴＴＡＡＡ
ＡＡＴにＴ＾＾ＧＴＣＣＧＴＡＴＣＧＣＴＧＣＧ−５゜
５−ＣＡＧＴＣＴＴＣＡＣＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＡＣＧ
ＣＧＴＴＴＡ＾ＧＡＡＡＧＣＡＡＡＴＧＧＣＴＧＴＧ−
３゜３−ＴＣＡＧ＾＾ＧＴＣＴＣＴＡＴＴＧＡＴＧＴＧ
ＣＧＣＡ＾＾ＴＴＣＴＴＴＣＧＴＴＴＡＣＣ−５゜ ５”−ＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＡＴＴＣ
ＴＴ＾＾ＣＧＧＣＴＡＡＴＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＡＧＡ
ＡＧＣＡＧＧ−３’−ＧＡＣＡＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡ
ＡＣＴＴＡＡＧＡＴＡＡＧ＾＾ＴＴＧＣＣＧＡＴＴＡＴ
ＣＴＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＴ−５”５°−ＴＴＣＣＴＣ
ＣＡＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＣＡ
ＧＣＡＴＣＣＴＧＡＴＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＧ−
３゜３−ＣにＴＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＡ
ＡＧ＾＾ＡＡＡＴ＾ＡＡＣＡＧＴＣＧＴＡＧＧＡＣＴＡ
ＣＡＡＣＣＴＡＧＧＣ−５゜Ｔ４−ＤＮＡキナーゼを用
いて、それぞれの合成りＮＡの５′末端にリン酸を付加
した。また、プラスミドｐＵｃ１９を制限酵素Ｘｂａｌ
とＳｐｈ夏とで切断し、ＤＮＡリガーゼにより、５′末
端にリン酸を付加したそれぞれの合成りＮＡを、ｐＵｃ
１９のＸｂａｌ−Ｓｐｈ１間に挿入し、ＶＩ Ｐ−ＣＩ
！遺伝子を含むプラスミドｐＭＤ３２１ａを構築した
。第２図にプラスミドｐＭＤ３２１ａの構築図を示す。
ＧＡＡＧＡＡＴＧ＾ＣＡＡＴＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＧ
ＧＣＡＴＡＧＣＧＡＣＧ−３゜３°−ＣＴＣＡＧＣＴＧ
ＣＡＧＴ＾＾ＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＡＣＴＧＴＴＡＡＡ
ＡＡＴにＴ＾＾ＧＴＣＣＧＴＡＴＣＧＣＴＧＣＧ−５゜
５−ＣＡＧＴＣＴＴＣＡＣＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＡＣＧ
ＣＧＴＴＴＡ＾ＧＡＡＡＧＣＡＡＡＴＧＧＣＴＧＴＧ−
３゜３−ＴＣＡＧ＾＾ＧＴＣＴＣＴＡＴＴＧＡＴＧＴＧ
ＣＧＣＡ＾＾ＴＴＣＴＴＴＣＧＴＴＴＡＣＣ−５゜ ５”−ＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＴＣＴＡＴＴＣ
ＴＴ＾＾ＣＧＧＣＴＡＡＴＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＡＧＡ
ＡＧＣＡＧＧ−３’−ＧＡＣＡＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡ
ＡＣＴＴＡＡＧＡＴＡＡＧ＾＾ＴＴＧＣＣＧＡＴＴＡＴ
ＣＴＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＴ−５”５°−ＴＴＣＣＴＣ
ＣＡＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＣＡ
ＧＣＡＴＣＣＴＧＡＴＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＧ−
３゜３−ＣにＴＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＡ
ＡＧ＾＾ＡＡＡＴ＾ＡＡＣＡＧＴＣＧＴＡＧＧＡＣＴＡ
ＣＡＡＣＣＴＡＧＧＣ−５゜Ｔ４−ＤＮＡキナーゼを用
いて、それぞれの合成りＮＡの５′末端にリン酸を付加
した。また、プラスミドｐＵｃ１９を制限酵素Ｘｂａｌ
とＳｐｈ夏とで切断し、ＤＮＡリガーゼにより、５′末
端にリン酸を付加したそれぞれの合成りＮＡを、ｐＵｃ
１９のＸｂａｌ−Ｓｐｈ１間に挿入し、ＶＩ Ｐ−ＣＩ
！遺伝子を含むプラスミドｐＭＤ３２１ａを構築した
。第２図にプラスミドｐＭＤ３２１ａの構築図を示す。
得られたｐＭＤ３２１ａにおける合成遺伝子部分の塩基
配列およびアミノ酸配列を°以下に示す。
配列およびアミノ酸配列を°以下に示す。
ＥｃｏＲＩ ５ａｃｌ Ｋｐｎｌ ＳｍａｌＢ
ａｓｌｌｌ ＸｂａｌＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴ
ＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡ１’ｈｅＧｌｕ
ＬｅｕＧＩｙＴｈｒＡｒｇＧＩｙＳｏｒＳｅｒＡｒｇ１
１ｉｃｌｌＡａｔｌｌ
８０ＧＴＣＧＡＣＧＴＣＡＴＴＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡ
ＴＧＡＣＡＡｔｔｈｔｔｔ＋ ＴＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＧＧＣＡＴＡＧＣＧＡＣＣＣ
ＡＧＴＣＴＴＣＰｈａＴｈｒＰｈｅ＾「ｇ旧５ｓｅｒ＾
５ｐＡｌａＶａｌＰｈｅプロティンＣづＶＩＰ ＡＣＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＡＣＧＣＧＴＴＴＡＡＧＡＡ
ＡＧＣＴｈｒＡｓｐＡｓｎＴｙｒＴｈｒＡｒｇＬｅｕＡ
ｒｇＬｙｓＧＩｎｅｏＲＩ ＡＡＡＴＧＧＣＴＧＴＧＡＡＡ＾＾＾ＴＡＴＴＴＧＡＡ
ＴＴＣＴＡＴＴＭｅＬＡ ＩａＶａ ＩＬｙｓＬｙｓＴ
ｙｒＬｅｕＡｓｎＳｅｒ Ｉ ｌ ｅＢｇｌｌ＋
１８０ ＣＴＴＡＡＣＧＧＣＴＡＡＴＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＡＧ
ＡＡＧＬｏｕＡｓｎＧｌｙネ＊本零本本 ＣＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴ
ＴＴＡＴＴＴＧＢａｍｌｌｌ ５ｐｈｒ ＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＡＴにＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡ
ＴＧＣ０Ｇ ＧＴＣＡＣＴＧＧＧＡＡ＾＾ＣＣＣＴＧＧＣＧＴＴＡＣ
ＣＣ＾この合成遺伝子部分は、ＶＩＰ−Ｇｌｙをコード
する塩基配列の前に存在する、血液凝固因子Ｘａの認識
配列１１ｅＧｌｕＧ１ｙＡｒｇ％ＢｒＣＮにより切断さ
れるＭｅ ｔ、およびプロティンＣの認識配列Ｔｈｒｌ
ｌｅＰｈｅＴｈｒＰｈｅＡｒｇをコードする遺伝子より
構築されている。
ａｓｌｌｌ ＸｂａｌＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴ
ＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡ１’ｈｅＧｌｕ
ＬｅｕＧＩｙＴｈｒＡｒｇＧＩｙＳｏｒＳｅｒＡｒｇ１
１ｉｃｌｌＡａｔｌｌ
８０ＧＴＣＧＡＣＧＴＣＡＴＴＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡ
ＴＧＡＣＡＡｔｔｈｔｔｔ＋ ＴＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＧＧＣＡＴＡＧＣＧＡＣＣＣ
ＡＧＴＣＴＴＣＰｈａＴｈｒＰｈｅ＾「ｇ旧５ｓｅｒ＾
５ｐＡｌａＶａｌＰｈｅプロティンＣづＶＩＰ ＡＣＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＡＣＧＣＧＴＴＴＡＡＧＡＡ
ＡＧＣＴｈｒＡｓｐＡｓｎＴｙｒＴｈｒＡｒｇＬｅｕＡ
ｒｇＬｙｓＧＩｎｅｏＲＩ ＡＡＡＴＧＧＣＴＧＴＧＡＡＡ＾＾＾ＴＡＴＴＴＧＡＡ
ＴＴＣＴＡＴＴＭｅＬＡ ＩａＶａ ＩＬｙｓＬｙｓＴ
ｙｒＬｅｕＡｓｎＳｅｒ Ｉ ｌ ｅＢｇｌｌ＋
１８０ ＣＴＴＡＡＣＧＧＣＴＡＡＴＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＡＧ
ＡＡＧＬｏｕＡｓｎＧｌｙネ＊本零本本 ＣＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣＡＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴ
ＴＴＡＴＴＴＧＢａｍｌｌｌ ５ｐｈｒ ＴＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＡＴにＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡ
ＴＧＣ０Ｇ ＧＴＣＡＣＴＧＧＧＡＡ＾＾ＣＣＣＴＧＧＣＧＴＴＡＣ
ＣＣ＾この合成遺伝子部分は、ＶＩＰ−Ｇｌｙをコード
する塩基配列の前に存在する、血液凝固因子Ｘａの認識
配列１１ｅＧｌｕＧ１ｙＡｒｇ％ＢｒＣＮにより切断さ
れるＭｅ ｔ、およびプロティンＣの認識配列Ｔｈｒｌ
ｌｅＰｈｅＴｈｒＰｈｅＡｒｇをコードする遺伝子より
構築されている。
また、Ｖ Ｉ Ｐ−Ｇ Ｉ Ｙ遺伝子の下流には、２つ
の終始コドン（ＴＡＡＴＡＧ）の後に、枯草菌のズブチ
リシンのターミネータ−［Ｍ、 １ｌｏｎｊｏ、 ｅｔ
ａｌ、、Ｊ、 Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ２．
７５−８５ （１９８５）］が存在する。
の終始コドン（ＴＡＡＴＡＧ）の後に、枯草菌のズブチ
リシンのターミネータ−［Ｍ、 １ｌｏｎｊｏ、 ｅｔ
ａｌ、、Ｊ、 Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ２．
７５−８５ （１９８５）］が存在する。
（４）５分子のＶＩＰをコードする遺伝子を含むプラス
ミドの構築 ５分子のＶＩＰをコードする遺伝子（以下、タンデム型
ＶＩＰ遺伝子という）を含むプラスミドｐ Ｍ Ｄ ３
２１ Ｒ５ａの構築図を第３図に示す。
ミドの構築 ５分子のＶＩＰをコードする遺伝子（以下、タンデム型
ＶＩＰ遺伝子という）を含むプラスミドｐ Ｍ Ｄ ３
２１ Ｒ５ａの構築図を第３図に示す。
ｐＭＤ３２１ａのＶＩＰ−Ｇｌｙ遺伝子の５′側には、
制限酵素Ｔｔｈｌｌｌｌの切断認識塩基配列であるＧＡ
ＣＧＣＡＧＴＣが存在する。一方、第３図に示されるよ
うに、挿入するＶＩＰ遺伝子の５′側にＴｔｈｌｌｌｌ
切断部位を残し、３′側が切断不能な遺伝子を合成した
。
制限酵素Ｔｔｈｌｌｌｌの切断認識塩基配列であるＧＡ
ＣＧＣＡＧＴＣが存在する。一方、第３図に示されるよ
うに、挿入するＶＩＰ遺伝子の５′側にＴｔｈｌｌｌｌ
切断部位を残し、３′側が切断不能な遺伝子を合成した
。
また、タンデム化したＶＩＰ−Ｇｌ）’を切断して回収
するため、塩基性残基対特異的プロテアーゼ（特開昭平
成２−４９５８５号公報）による切断の認識配列である
Ｌｙｓ−Ａｒｇに対応する遺伝子を導入し、第３図に示
すように、タンデム化のためのＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ！ｉ伝子を合転子た。
するため、塩基性残基対特異的プロテアーゼ（特開昭平
成２−４９５８５号公報）による切断の認識配列である
Ｌｙｓ−Ａｒｇに対応する遺伝子を導入し、第３図に示
すように、タンデム化のためのＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ！ｉ伝子を合転子た。
次いで、ｐＭＤ３２１ａをＴｔｈｌｌｌｌで完全に切断
し、アルカリホスファターゼにより、この５′側のリン
酸基を除去した。そして、作製したタンデム化のための
ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ −Ａｒｇ遺伝子と混合し、Ｄ
ＮＡリガーゼにより連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を
形質転換した。
し、アルカリホスファターゼにより、この５′側のリン
酸基を除去した。そして、作製したタンデム化のための
ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ −Ａｒｇ遺伝子と混合し、Ｄ
ＮＡリガーゼにより連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株を
形質転換した。
得られたアンピシリン耐性の形質転換株からプラスミド
遺伝子を調製し、目的通りＶ Ｉ Ｐ−Ｇ １ｙ遺伝子
が２個タンデムに連結されたプラスミドｐＭＤ３２１Ｒ
２ａを構築した。
遺伝子を調製し、目的通りＶ Ｉ Ｐ−Ｇ １ｙ遺伝子
が２個タンデムに連結されたプラスミドｐＭＤ３２１Ｒ
２ａを構築した。
得られたｐＭＤ３２１Ｒ２ａは、２個のタンデムに繋っ
たＶＩＰ−Ｇｕｙ遺伝子の５′領域付近にＴｔｈｌｌｌ
ｌによる゛切断点を唯−有している。
たＶＩＰ−Ｇｕｙ遺伝子の５′領域付近にＴｔｈｌｌｌ
ｌによる゛切断点を唯−有している。
そして、ｐＭＤ３２１Ｒ２ａをＴｔｈｌｌｌｌで切断し
、アルカリホスファターゼにより５′領域を脱リン酸化
した後、タンデム化のためのＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
Ａｒｇ遺伝子と混合し、ＤＮＡリガーゼにより連結した
後、大腸菌ＪＭＩＯ９株を形質転換した。得られたアン
ピシリン耐性形質転換株からプラスミドを調製し、目的
の遺伝子が３個タンデムに導入されたプラスミドｐＭＤ
３２１Ｒ３ａを得た。同様の操作をさらに繰返し、５個
のＶ Ｉ Ｐ−Ｇ Ｉ Ｙ遺伝子が、Ｌｙｓ−Ａｒｇを
介して、タンデムに連結されたｐＭＤ３２１Ｒ５ａを作
製した。
、アルカリホスファターゼにより５′領域を脱リン酸化
した後、タンデム化のためのＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
Ａｒｇ遺伝子と混合し、ＤＮＡリガーゼにより連結した
後、大腸菌ＪＭＩＯ９株を形質転換した。得られたアン
ピシリン耐性形質転換株からプラスミドを調製し、目的
の遺伝子が３個タンデムに導入されたプラスミドｐＭＤ
３２１Ｒ３ａを得た。同様の操作をさらに繰返し、５個
のＶ Ｉ Ｐ−Ｇ Ｉ Ｙ遺伝子が、Ｌｙｓ−Ａｒｇを
介して、タンデムに連結されたｐＭＤ３２１Ｒ５ａを作
製した。
（５）プラスミドｐＭＤ５００Ｒ５の構築バチルス・ズ
ブチリスを宿主とし、５分子のＶＩＰを含むペプチド前
駆体（以下、ペプチド前駆体という）を分泌するプラス
ミドｐＭＤ５００Ｒ５の構築を第４図に示す。
ブチリスを宿主とし、５分子のＶＩＰを含むペプチド前
駆体（以下、ペプチド前駆体という）を分泌するプラス
ミドｐＭＤ５００Ｒ５の構築を第４図に示す。
前記プラスミドｐＭＤ２００を制限酵素ＰｓｔＩで切断
した後、ＤＮＡブランチングキット（１３１ｕｎｔｌｎ
ｇ Ｋｉｔ）を用いて末端を平滑化し、さらに制限酵素
ｓｐｈ Ｉで切断し、約５．５Ｋｂの断片をアガロース
ゲル電気泳動法により精製し、タンデム型ＶＩＰ遺伝子
を組込むためのベクターとした。
した後、ＤＮＡブランチングキット（１３１ｕｎｔｌｎ
ｇ Ｋｉｔ）を用いて末端を平滑化し、さらに制限酵素
ｓｐｈ Ｉで切断し、約５．５Ｋｂの断片をアガロース
ゲル電気泳動法により精製し、タンデム型ＶＩＰ遺伝子
を組込むためのベクターとした。
ベクターに組込むタンデム型ＶＩＰ遺伝子は、前記プラ
スミドｐＭ Ｄ ３２１ Ｒ５ａを制限酵素Ｋｐｎｌで
切断した後、ＤＮＡブランチングキットを用いて末端を
平滑化し、さらに制限酵素５ｐｈＩで切断し、約０．５
Ｋｂの断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動法により
精製することにより取得した。このＤＮＡ断片は、血液
凝固因子Ｘａ。
スミドｐＭ Ｄ ３２１ Ｒ５ａを制限酵素Ｋｐｎｌで
切断した後、ＤＮＡブランチングキットを用いて末端を
平滑化し、さらに制限酵素５ｐｈＩで切断し、約０．５
Ｋｂの断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動法により
精製することにより取得した。このＤＮＡ断片は、血液
凝固因子Ｘａ。
及びプロティンＣの認識するアミノ酸配列をコードする
遺伝子の下流に、タンデム型ＶＩＰ遺伝子が連結した構
造を有している。また、各ＶＩＰ逍伝遺転子末端には、
ＶＩＰをアミド化するため、Ｇｌｙをコードする遺伝子
を連結している。さらに、ＶＩＰ−Ｇｌｙをコードする
遺伝子の間には、ペプチド前駆体タンパク質からＶＩＰ
−Ｇｕｙを切断して回収するため、塩基性アミノ酸残基
特異的プロテアーゼの一種であるＰＢＲ３−プロテアー
ゼの認識配列Ｌｙｓ−Ａｒｇをコードする遺伝子が挿入
されている。
遺伝子の下流に、タンデム型ＶＩＰ遺伝子が連結した構
造を有している。また、各ＶＩＰ逍伝遺転子末端には、
ＶＩＰをアミド化するため、Ｇｌｙをコードする遺伝子
を連結している。さらに、ＶＩＰ−Ｇｌｙをコードする
遺伝子の間には、ペプチド前駆体タンパク質からＶＩＰ
−Ｇｕｙを切断して回収するため、塩基性アミノ酸残基
特異的プロテアーゼの一種であるＰＢＲ３−プロテアー
ゼの認識配列Ｌｙｓ−Ａｒｇをコードする遺伝子が挿入
されている。
次いで、ベクターＤＮＡとタンデム型ＶＩＰ遺伝子断片
とをＴ４リガーゼを用いて連結し、ペプチド前躯体タン
パク質分泌プラスミドｐＭＤ５００Ｒ５を構築した。こ
のｐＭＤ５００Ｒ５は、バチルス・ズブチリスを宿主と
し、プロティンＡの１位から４０２位、スペーサーとし
て血液凝固因子Ｘａ及びプロティンＣの認識配列に相当
するアミノ酸配列を含むＡｒｇ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−５ｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ｖａ １−Ａ５ｐ−Ｖａ ｌ−１１ｅ −
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｔｈｅ−１１ｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ、 目的ペプチドとして
ＶＩＰの生合成前駆体ＶＩＰ−Ｇｌｙを、Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇを介して、５分子結合した構造を有するプラスミドで
ある。
とをＴ４リガーゼを用いて連結し、ペプチド前躯体タン
パク質分泌プラスミドｐＭＤ５００Ｒ５を構築した。こ
のｐＭＤ５００Ｒ５は、バチルス・ズブチリスを宿主と
し、プロティンＡの１位から４０２位、スペーサーとし
て血液凝固因子Ｘａ及びプロティンＣの認識配列に相当
するアミノ酸配列を含むＡｒｇ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−５ｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ｖａ １−Ａ５ｐ−Ｖａ ｌ−１１ｅ −
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｔｈｅ−１１ｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ、 目的ペプチドとして
ＶＩＰの生合成前駆体ＶＩＰ−Ｇｌｙを、Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇを介して、５分子結合した構造を有するプラスミドで
ある。
（６）バチルス・ズブチリスを宿主とした融合蛋白質Ｐ
ＡＶ Ｉ ＰＧ （Ｐ）Ｒ５（７）生産と精製チャン（
Ｃｈａｎｇ）らの方法［Ｃｈａｎｇ、 ｓ、、 Ｃｔ
ａ＋、。
ＡＶ Ｉ ＰＧ （Ｐ）Ｒ５（７）生産と精製チャン（
Ｃｈａｎｇ）らの方法［Ｃｈａｎｇ、 ｓ、、 Ｃｔ
ａ＋、。
Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｃｎｅｔ、、 ＩＨ，１１１−
１１５（１９７９）］に従って、ｐＭＤ５００Ｒ５によ
りバチルス・ズブチリス５ＰＬ１４ （ＦＥＲＭ Ｐ
−１０９８８）を形質転換した。得られた形質転換株バ
チルス・ズブチリス５ＰＬ１４ （ｐＭＤ５００Ｒ５）
（微工研菌寄第１１７４２号）により分泌される融合融
合蛋白質を以下のようにして精製した。
１１５（１９７９）］に従って、ｐＭＤ５００Ｒ５によ
りバチルス・ズブチリス５ＰＬ１４ （ＦＥＲＭ Ｐ
−１０９８８）を形質転換した。得られた形質転換株バ
チルス・ズブチリス５ＰＬ１４ （ｐＭＤ５００Ｒ５）
（微工研菌寄第１１７４２号）により分泌される融合融
合蛋白質を以下のようにして精製した。
先ず、０．５Ｍコハク酸を含むＭｅｄｉｕｓ Ａ培地
４ノを用いて、５ＰＬ１４ （ｐＭＤ５００Ｒ５）を３
７℃で１６時間浸透培養した。培養停止後、濃度を１０
ｍＭになるようにプロテアーゼ阻害剤であるフェニルメ
チルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ） 、ＥＤＴＡ
を添加し、４℃、５００Ｑｒｐｍの条件で、３０分間遠
心分離し、菌体を除いた。得られた培養上清を０．２２
μｍのフィルターで濾過した後、培養上清３．６１ｍ１
を、３００ｍ１のＩｇＧ−セファロースゲル（ファルマ
シア（株）製）を充填したカラムに約６ｍ１／分の流速
で注入し、融合蛋白質を精製した。さらに、カラムを、
ＴＳＴブアッファ−［５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，
６） 、１５０ｍＭのＮａＣｌ２．０゜０５９６のツイ
ーン（Ｔｖｅｅｎ） ２０ ］ ２ 、 ８８ Ｊを用
い、流速４ ｍｌ ／分の条件で洗浄した後、０．１Ｍ
酢酸（ｐＨ３，０）を用いて、流速４ ｍｌ ／分の条
件で融合蛋白質を溶出した。この時、溶出液は、１／２
倍量の０．２Ｍ重炭酸アンモニウム溶液を用いて直ちに
中和した。得られた融合蛋白質溶出液を、限外濾過（分
子量カット１００００）のフィルターを用いて濃縮した
後、融合蛋白質を以下の条件で分取した。
４ノを用いて、５ＰＬ１４ （ｐＭＤ５００Ｒ５）を３
７℃で１６時間浸透培養した。培養停止後、濃度を１０
ｍＭになるようにプロテアーゼ阻害剤であるフェニルメ
チルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ） 、ＥＤＴＡ
を添加し、４℃、５００Ｑｒｐｍの条件で、３０分間遠
心分離し、菌体を除いた。得られた培養上清を０．２２
μｍのフィルターで濾過した後、培養上清３．６１ｍ１
を、３００ｍ１のＩｇＧ−セファロースゲル（ファルマ
シア（株）製）を充填したカラムに約６ｍ１／分の流速
で注入し、融合蛋白質を精製した。さらに、カラムを、
ＴＳＴブアッファ−［５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，
６） 、１５０ｍＭのＮａＣｌ２．０゜０５９６のツイ
ーン（Ｔｖｅｅｎ） ２０ ］ ２ 、 ８８ Ｊを用
い、流速４ ｍｌ ／分の条件で洗浄した後、０．１Ｍ
酢酸（ｐＨ３，０）を用いて、流速４ ｍｌ ／分の条
件で融合蛋白質を溶出した。この時、溶出液は、１／２
倍量の０．２Ｍ重炭酸アンモニウム溶液を用いて直ちに
中和した。得られた融合蛋白質溶出液を、限外濾過（分
子量カット１００００）のフィルターを用いて濃縮した
後、融合蛋白質を以下の条件で分取した。
カラム Ｐｈｅｎｙｌ−５ｒ’ＷＲＰ
内径２１．５ｍ＋ｅＸ１５ｃ＋ｎ
流速 ６ ｍｌ ／分
溶媒 Ａ：０．０５％トリフルオロ酢酸Ｂ：０．０４
４％トリフルオロ酢酸／ ６０％アセトニトリル 傾斜 ２７．５〜３０％１５０分、 １２０ｍ１／％ そして、分取した成分を凍結乾燥することにより、目的
とする分子量６４０００の融合蛋白質を得た。
４％トリフルオロ酢酸／ ６０％アセトニトリル 傾斜 ２７．５〜３０％１５０分、 １２０ｍ１／％ そして、分取した成分を凍結乾燥することにより、目的
とする分子量６４０００の融合蛋白質を得た。
融合蛋白質中のＶＩＰ量を、「酵素免疫測定法」（石川
栄治他編集、医学書院）記載のＶＩＰ−Ｇｔｙの酵素免
疫測定法により、次に示す方法で測定した。
栄治他編集、医学書院）記載のＶＩＰ−Ｇｔｙの酵素免
疫測定法により、次に示す方法で測定した。
先ず、ＶＩＰを用いてウサギを免疫し、抗ＶＩＰ血清を
得た。この抗ＶＩＰ血清より「酵素免疫測定法」の第８
３−９２頁記載のマレイミド−ヒンジ法により抗ＶＩＰ
−１ｇＧ、抗ＶＩＰ−Ｆ（ａｂ’）ｚ、抗ＶＩＰ−ペル
オキシダーゼ標識Ｆａｂ’ を調製した。
得た。この抗ＶＩＰ血清より「酵素免疫測定法」の第８
３−９２頁記載のマレイミド−ヒンジ法により抗ＶＩＰ
−１ｇＧ、抗ＶＩＰ−Ｆ（ａｂ’）ｚ、抗ＶＩＰ−ペル
オキシダーゼ標識Ｆａｂ’ を調製した。
酵素免疫測定法によるＶＩＰ−Ｇｕｙの測定は、以下の
手順で行った。
手順で行った。
ＥＬＩＳＡプレート（９６穴）に抗Ｖ Ｉ Ｐ−Ｆ（ａ
ｂ’）ｚを吸着させ、１％牛血清アルブミンてブロッキ
ングした。このプレートに被試験液を添加したｖｔｐ−
Ｇｔｙを、固相に吸着した抗ＶＩＰ−Ｆ （ａｂ’ ）
２ ニ結合させた後、洗浄シ、更に抗ＶＩＰ−ペルオ
キシダーゼ標識−Ｆａｂ２を添加し、固相に結合したＶ
ＩＰ−Ｇｕｙをサンドイッチした。遊離の標識抗体を除
去した後、１０ｍＭオルト−フェニレンジアミン（ＯＰ
Ｄ）、０．０２５％過酸化水素、５０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ５，０）を含む反応液を添加し、ペル
オキシダーゼの反応により生成する色素を波長４９０ｎ
ｍの吸収で測定した。
ｂ’）ｚを吸着させ、１％牛血清アルブミンてブロッキ
ングした。このプレートに被試験液を添加したｖｔｐ−
Ｇｔｙを、固相に吸着した抗ＶＩＰ−Ｆ （ａｂ’ ）
２ ニ結合させた後、洗浄シ、更に抗ＶＩＰ−ペルオ
キシダーゼ標識−Ｆａｂ２を添加し、固相に結合したＶ
ＩＰ−Ｇｕｙをサンドイッチした。遊離の標識抗体を除
去した後、１０ｍＭオルト−フェニレンジアミン（ＯＰ
Ｄ）、０．０２５％過酸化水素、５０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ５，０）を含む反応液を添加し、ペル
オキシダーゼの反応により生成する色素を波長４９０ｎ
ｍの吸収で測定した。
標準物質として、アプライド・バイオシステムズ（ＡＢ
Ｉ）社製のペプチド合成装置により固相合成し、逆相高
速液体クロマトグラフィーにより精製し、アミノ酸組成
を確認したｖＩｐ−ｃｌｙを用いた。
Ｉ）社製のペプチド合成装置により固相合成し、逆相高
速液体クロマトグラフィーにより精製し、アミノ酸組成
を確認したｖＩｐ−ｃｌｙを用いた。
その結果、目的とする融合蛋白質が分泌生産されており
、ＥＬＩＳＡにおいて、ＶＩＰ活性を示したピークの波
長２１４ｎｍの吸収からタンパク質量を算出したところ
、４ノの培養液から、約３７ｇａｇの融合蛋白質が得ら
れた。
、ＥＬＩＳＡにおいて、ＶＩＰ活性を示したピークの波
長２１４ｎｍの吸収からタンパク質量を算出したところ
、４ノの培養液から、約３７ｇａｇの融合蛋白質が得ら
れた。
以下ニ、融合蛋白質ＰＡＶＩＰＧ （Ｐ）Ｒ５（７）構
造を模式的に示す。なお、目的とするペプチド（Ｖｌｒ
’−Ｇｌｙ）を、２重線のアンダーラインで示し、ファ
クターＸａ、カリクレイン、ＰＡＨ性アミノ酸残基対特
異的プロテアーゼの認識部位を、１重線のアンダーライ
ンで示す。
造を模式的に示す。なお、目的とするペプチド（Ｖｌｒ
’−Ｇｌｙ）を、２重線のアンダーラインで示し、ファ
クターＸａ、カリクレイン、ＰＡＨ性アミノ酸残基対特
異的プロテアーゼの認識部位を、１重線のアンダーライ
ンで示す。
Ｐｒｏｔｅｉｎ＾（１−４０２）−ＡｒｇＧＩｙＳｅｒ
ＳｅｒＡｒｇＶａｌ＾５ｐＶａｌ−（７）融合蛋白質Ｐ
ＡＶ Ｉ ＰＧ （Ｐ）Ｒ５からＶＩＰ−Ｇｌｙ 、
ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇの切りだし融合蛋白質
１００μｇ （１，５５ｎモル）を、前記ステップ（１
）で精製した塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼ
（Ｂａｎｚ−１画分）０．０５ｍＵ［ＩＵは、３０℃、
５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，０） 、０．１％のル
ブロール（Ｌｕｂｒｏｌ）ＰＸ、０．５ｍＭのＣａＣｊ
Ｊｚ中において、０．１ｍＭのＢｏｃ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニル基
、ＭＣＡは４−メチルクマリル−７−アミドを示す）と
反応させる条件において、１分間に１μモルのＡＭＣを
遊離する活性とした］と、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ
７，０） 、１ｍＭのＣａＣ，Ｑ２中、３７℃で反応さ
せた。反応時間０時間、６時間における逆相高速クロマ
トグラフィーのクロマトグラムを第５図（Ａ） （１３
）に示す。切断反応の進行に伴いピーク１、ピーク２が
主に出現した。このピーク１、ピーク２を逆相高速クロ
マトグラフィーにより分取し、プロティンシーケンサ−
によりそのアミノ酸配列を解析したところ、ピーク１は
ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、ピーク２はＶ Ｉ
Ｐ−Ｇ １ｙと完全に一致した。
ＳｅｒＡｒｇＶａｌ＾５ｐＶａｌ−（７）融合蛋白質Ｐ
ＡＶ Ｉ ＰＧ （Ｐ）Ｒ５からＶＩＰ−Ｇｌｙ 、
ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇの切りだし融合蛋白質
１００μｇ （１，５５ｎモル）を、前記ステップ（１
）で精製した塩基性アミノ酸残基対特異的プロテアーゼ
（Ｂａｎｚ−１画分）０．０５ｍＵ［ＩＵは、３０℃、
５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，０） 、０．１％のル
ブロール（Ｌｕｂｒｏｌ）ＰＸ、０．５ｍＭのＣａＣｊ
Ｊｚ中において、０．１ｍＭのＢｏｃ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ
−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニル基
、ＭＣＡは４−メチルクマリル−７−アミドを示す）と
反応させる条件において、１分間に１μモルのＡＭＣを
遊離する活性とした］と、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ
７，０） 、１ｍＭのＣａＣ，Ｑ２中、３７℃で反応さ
せた。反応時間０時間、６時間における逆相高速クロマ
トグラフィーのクロマトグラムを第５図（Ａ） （１３
）に示す。切断反応の進行に伴いピーク１、ピーク２が
主に出現した。このピーク１、ピーク２を逆相高速クロ
マトグラフィーにより分取し、プロティンシーケンサ−
によりそのアミノ酸配列を解析したところ、ピーク１は
ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、ピーク２はＶ Ｉ
Ｐ−Ｇ １ｙと完全に一致した。
実施例２
融合蛋白質１００μｇ （１，５５ｎモル）を実施例１
のステップ（１）で精製した塩基性アミノ酸残基対特異
的プロテアーゼ（Ｂｅｎｚ−１画分）０゜１ｍＵ（ＩＵ
は、前記と同様な活性を意味する）、及びカルボキシペ
プチダーゼＢ（シグマ社製）５０ｍＵ［ＩＵは、２５ｍ
Ｍ１−リス塩酸（ｐＨ８゜０）中において、１ｍＭのＢ
ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｂｚはベンジルオキシカルボニル
基を示す）と２５℃で反応させた条件下において、１分
間に１μモルのＡｒｇを遊離する酵素活性とした］と、
５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，０） 、１ｍＭのＣａ
Ｃｆ１ｚ中、３７℃で反応させた。反応時間０時間、４
時間における逆相高速クロマトグラフィーのクロマトグ
ラムを第６図（Ａ） （Ｂ）に示す。切断反応の進行に
伴い、前記実施例１においてＶＩＰ−ｃｉｙと同定され
た１つのピークが主に出現し、ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇは殆ど出現しなかった。
のステップ（１）で精製した塩基性アミノ酸残基対特異
的プロテアーゼ（Ｂｅｎｚ−１画分）０゜１ｍＵ（ＩＵ
は、前記と同様な活性を意味する）、及びカルボキシペ
プチダーゼＢ（シグマ社製）５０ｍＵ［ＩＵは、２５ｍ
Ｍ１−リス塩酸（ｐＨ８゜０）中において、１ｍＭのＢ
ｚ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｂｚはベンジルオキシカルボニル
基を示す）と２５℃で反応させた条件下において、１分
間に１μモルのＡｒｇを遊離する酵素活性とした］と、
５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，０） 、１ｍＭのＣａ
Ｃｆ１ｚ中、３７℃で反応させた。反応時間０時間、４
時間における逆相高速クロマトグラフィーのクロマトグ
ラムを第６図（Ａ） （Ｂ）に示す。切断反応の進行に
伴い、前記実施例１においてＶＩＰ−ｃｉｙと同定され
た１つのピークが主に出現し、ＶＩＰ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇは殆ど出現しなかった。
比較例１
１００μｇの融合蛋白質ＰＡＶＩＰＧ （Ｐ）Ｒ５と血
液凝固因子Ｘａ（ベーリンガー・マンハイム・山内社製
）１５．５ｐモルを、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８，
０） 、１ｍＭのＣａＣＪ２．０．１ＭのＮａＣ９中で
反応させたところ、目的とする１ｉｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−＾「ｇのＣ末端側だけではなくＶＩＰ内部のＡｒｇ”
−Ｌｙｓ間においても切断反応が生じ、目的とする蛋白
質［Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ
−＾ｒｇ−（ＶＩＰ−Ｇｌｙ） ４−ＶＩＰ−Ｇｌｙ］
ハ得うレナカッた。
液凝固因子Ｘａ（ベーリンガー・マンハイム・山内社製
）１５．５ｐモルを、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８，
０） 、１ｍＭのＣａＣＪ２．０．１ＭのＮａＣ９中で
反応させたところ、目的とする１ｉｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−＾「ｇのＣ末端側だけではなくＶＩＰ内部のＡｒｇ”
−Ｌｙｓ間においても切断反応が生じ、目的とする蛋白
質［Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ
−＾ｒｇ−（ＶＩＰ−Ｇｌｙ） ４−ＶＩＰ−Ｇｌｙ］
ハ得うレナカッた。
比較例２
１００μｇの融合蛋白質ＰＡＶＩＰＧ （Ｐ）Ｒ５とカ
リクレイン（ヒト血清、シグマ社製）１５゜５ｐモルを
、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８，０）１ｍＭのＣａＣ
ｌ２、ｏ、ＩＭのＮａＣｊＪ中で反応させたところ、Ｖ
ＩＰ内部のＡｒｇ”−Ｌｙｓ間、並び１．＝ ＶＩＰ−
Ｇｌｙ−（１４−２９）内において更に切断反応が生じ
たため、目的とする蛋白質［（ＶＩＰ−Ｇ；Ｉｙ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇ） ４−ＶＩＰ−ＧＩｙＥ は得られなカッ
タ。
リクレイン（ヒト血清、シグマ社製）１５゜５ｐモルを
、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８，０）１ｍＭのＣａＣ
ｌ２、ｏ、ＩＭのＮａＣｊＪ中で反応させたところ、Ｖ
ＩＰ内部のＡｒｇ”−Ｌｙｓ間、並び１．＝ ＶＩＰ−
Ｇｌｙ−（１４−２９）内において更に切断反応が生じ
たため、目的とする蛋白質［（ＶＩＰ−Ｇ；Ｉｙ−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇ） ４−ＶＩＰ−ＧＩｙＥ は得られなカッ
タ。
第１図はプラスミドｐＭＤ２００の構築図、第２図はプ
ラスミドｐＭＤ３２１ａの構築図、第３図はプラスミド
ｐＭＤ３２１Ｒ５Ｈの構築図、 第４図はプラスミドｐＭＤ５００Ｒ５の構築図である。 第５図（Ａ） （Ｂ）は実施例１における反応液の逆相
高速クロマトグラフィーによる溶出パターンを示すクロ
マトグラム、 第６図（Ａ） （１３）は実施例２における反応液の逆
相高速クロマトグラフィーによる溶出パターンを示すク
ロマトグラムである。 特許出願人 エム・デイ・リサーチ株式会社代 理
人 弁理士 鍬 ■ 充 土弟 図 第 図 第４図 第 ５図（Ａ） ＰＡＶＩＰＧ（Ｐ）Ｒ５ 第 図（Ｂ） 第６図（Ａ） 反応時間、０時間 ＰＡＶＩＰＧ（Ｐ）Ｒ５ 分（ｘ １０） 第６図（Ｂ） 手 続 補 正 書（自発） 平成 ４年 １月 ９日
ラスミドｐＭＤ３２１ａの構築図、第３図はプラスミド
ｐＭＤ３２１Ｒ５Ｈの構築図、 第４図はプラスミドｐＭＤ５００Ｒ５の構築図である。 第５図（Ａ） （Ｂ）は実施例１における反応液の逆相
高速クロマトグラフィーによる溶出パターンを示すクロ
マトグラム、 第６図（Ａ） （１３）は実施例２における反応液の逆
相高速クロマトグラフィーによる溶出パターンを示すク
ロマトグラムである。 特許出願人 エム・デイ・リサーチ株式会社代 理
人 弁理士 鍬 ■ 充 土弟 図 第 図 第４図 第 ５図（Ａ） ＰＡＶＩＰＧ（Ｐ）Ｒ５ 第 図（Ｂ） 第６図（Ａ） 反応時間、０時間 ＰＡＶＩＰＧ（Ｐ）Ｒ５ 分（ｘ １０） 第６図（Ｂ） 手 続 補 正 書（自発） 平成 ４年 １月 ９日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下記式［ I ａ］又は［ I ｂ］ Ａ−Ｂ−Ｃ［ I ａ］ Ｃ−Ｂ−Ａ［ I ｂ］ ［式中、Ａはキャリアーを示し、Ｂは酵素的に切断可能
なＸ＿１−Ｘ＿２（Ｘ＿１は、ＡのＣ末端に結合したＬ
ｙｓ、Ａｒｇ又はＰｒｏを示し、Ｘ＿２は、ＣのＮ末端
に結合したＬｙｓ又はＡｒｇを示す。但し、Ｘ＿１がＰ
ｒｏであるとき、Ｘ＿２はＡｒｇである）で表されるジ
ペプチドを示す。Ｃは目的とするペプチド又は蛋白質を
示す］ で表される融合蛋白質を宿主微生物により生産した後、
少なくとも、前記ジペプチドを特異的に認識し、かつジ
ペプチドのペプチド結合を特異的に加水分解するプロテ
アーゼで処理するペプチド又は蛋白質の製造方法。 ２、少なくとも、下記式［II］又は［III］ ▲数式、化学式、表等があります▼［II］ ▲数式、化学式、表等があります▼［III］ ［式中、Ｂは酵素的に切断可能なＸ＿１−Ｘ＿２（Ｘ＿
１は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ又はＰｒｏを示し、Ｘ＿２は、Ｌ
ｙｓ又はＡｒｇを示す。但し、Ｘ＿１がＰｒｏであると
き、Ｘ＿２はＡｒｇである）で表されるジペプチドを示
す。Ｃは目的とするペプチド又は蛋白質、ｎは２以上の
整数を示す］ で表される単位を含む融合蛋白質を宿主微生物により生
産した後、少なくとも、前記ジペプチドを特異的に認識
し、かつジペプチドのペプチド結合を特異的に加水分解
するプロテアーゼで処理するペプチド又は蛋白質の製造
方法。 ３、プロテアーゼが、ジペプチドを特異的に認識し、か
つジペプチドのＣ末端を特異的に加水分解する請求項１
又は請求項２記載のペプチド又は蛋白質の製造方法。 ４、融合蛋白質を、（ａ）ジペプチドを特異的に認識し
、かつジペプチドのＮ末端又はジペプチド間を特異的に
加水分解するプロテアーゼと、（ｂ）ジペプチドのＮ末
端又はＣ末端から塩基性アミノ酸を遊離するアミノペプ
チダーゼ又はカルボキシペプチダーゼとで処理する請求
項１又は請求項２記載のペプチド又は蛋白質の製造方法
。 ５、宿主微生物が、エシリヒア（￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ￥）属、バチルス（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）属、又
はスタフィロコッカス（￥Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ￥）属微生物である請求項１記載のペプチド又は蛋白
質の製造方法。 ６、プロテアーゼが、酵母サッカロマイセス（￥Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ￥）属、クライベロマイセス（￥
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ￥）属、スポロボロマイセ
ス（￥Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ￥）属、フィロバ
ジジウム（￥Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ￥）属、ハンゼ
ヌラ（￥Ｈａｎｓｅｎｕｌａ￥）属、イサチェンキア（
￥Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ￥）属、ピキア（￥Ｐｉｃ
ｈｉａ￥）属、ロドスポリジウム（￥Ｒｈｏｄｏｓｐｏ
ｒｉｄｉｕｍ￥）属、及びサッカロミコプシス（￥Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ￥）属由来の少なくとも
一種のプロテアーゼである請求項１〜請求項４のいずれ
かに記載のペプチド又は蛋白質の製造方法。 ７、Ｎ末端側から塩基性アミノ酸を特異的に遊離するア
ミノペプチダーゼが、アミノペプチダーゼＢ（Ｅ、Ｃ、
３、４、１１、６）である請求項４記載のペプチド又は
蛋白質の製造方法。 ８、Ｃ末端側から塩基性アミノ酸を特異的に遊離するカ
ルボキシペプチダーゼが、カルボキシペプチダーゼＢ（
Ｅ、Ｃ、３、４、１７、２）、カルボキシペプチダーゼ
Ｅ（エンケファリン・コンベルターゼ）、カルボキシペ
プチダーゼＮ（Ｅ、Ｃ、３、４、１７、３）、及びｙｓ
ｃαの少なくとも一種である請求項４記載のペプチド又
は蛋白質の製造方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2271880A JPH07108232B2 (ja) | 1990-10-09 | 1990-10-09 | ペプチド又は蛋白質の製造方法 |
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