JPH01199998A - 新規ポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents
新規ポリペプチド及びそれをコードするｄｎａInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、ヒト インターロイキン１ポリペプチド並び
にそのＮ末端部及びＣ末端部の部分欠失体のアミノ酸配
列中、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に変換させた
アミノ酸配列を有する新規ポリペプチド、それをコード
するＤＮＡ及びそれらの製造法に関する。 インターロイキン１は、単球／マクロファージ細胞をは
じめとする諸々の細胞から産生される生理活性物質であ
る。ヒト インターロイキン１には、大別してα型とβ
型の二種類の分子が存在することが知られている（Ｆｕ
ｒｕｔａｎｉ、Ｙ、ら、 ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓ、、 １４巻、 ３１６７頁、 １９８６年；
Ｃ１ａｒｋ、Ｂ、Ｄ、 。 ら＊ Ｎｕｃｌａｌｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、＋ １４
巻、 ７８９７頁、 １９８６年）、その代表的な作用
として、Ｔ細胞及びＢ細胞に対する分化増殖促進作用、
リンパ球活性化作用、マクロファージの活性化作用、発
熱惹起作用、プロスタグランジンＥ２の産生誘導作用及
び線維芽細胞の増殖促進作用等が知られており ［Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ、 Ｊ、Ｊ、ら、 Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、 ７巻。 ４５頁、 １９８６年； Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ、Ｃ，
Ａ、、 Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ、 ６巻、５１頁、 １９８４年］
、生体における免疫機構等の調節因子として、重要な役
割を担っており、医薬品としての臨床応用が期待されて
いる。 α型のヒト インターロイキン１ポリペプチドのＮ末端
側の１〜１４個のアミノ酸及び／又はＣ末端側の１〜４
個のアミノ酸の欠失体（ヨーロッパ公開特許第０１８８
９２０号）やα型のヒトインターロイキン１ポリペプチ
ドのＮ末端がら３６番目のＡｓｎが脱アミド化され、Ａ
ｓｐに変化したポリペプチドが知られている（Ｃａｍａ
ｒｏｎ、Ｐ、Ｍ、ら、Ｊ、Ｅｘｐ、 Ｍａｄ、 、＋−
１６４巻、２３７頁、 １９８６年； Ｗｉｎｇｆｉｅ
ｌｄ、Ｐ。 ら、 Ｅｕｒ、Ｊ、 Ｂｌｏｃｈｅｍ、、 １６５
巻、５３７頁、 １９Ｂ７．年）。 また、異なる遺伝子に由来し上記α型のヒト インター
ロイキン１ポリペプチドのＮ末端がら第２番目のＳｅｔ
がＡｌａにかわっているポリペプチドも知られている（
Ｍａｒｃｈ、Ｃ，Ｊ、ら、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３１５
巻。 ６４１頁、 １９８５年）、β型のヒト インターロイ
キン１ポリペプチドに関しては、そのＮ末端側の１〜３
個のアミノ酸及び／又はＣ末端側の１〜３個のアミノ酸
欠失体が知られている（Ｍｏｓｌｅｙ、Ｂ、ら。 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ＴＪＳＡ、
８４巻、 ４５７２頁、 １９８７年）。 本発明者等は、ヒトインターロイキン１の構造と生物活
性との関係について鋭意研究を重ね、該ポリペプチドの
アミノ酸配列の特定の部分を他のアミノ酸に変換したポ
リペプチドの特性を検索したところ、まったく意外にも
リンパ球活性化作用を示すが、プロスタグランジンＥ２
の産生誘導能を殆ど持たない特異な活性を示すことを見
い出し、本発明を完成するに至った。 本発明のポリペプチドとしては、α型ヒトインターロイ
キン１の部分的アミノ酸変換体、即ち第１表の式［１］
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド並びにそ
のＮ末端から１〜１４残基及び／又はＣ末端から１〜４
残基のアミノ酸又はペプチドが欠失したポリペプチドが
挙げられる。 第１表 Ｓｅｒ Ｗ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ａｓｎ ＶａｌＬｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｐ
ｈｅ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｉｌａ Ｉｌｅ Ｌｙ
ｓ ＴｙｒＧｌｕ Ｐｈｅ ＩＩｓ Ｌｅｕ Ａｓ
ｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇ１ｎ５ｅｒ
Ｉｌｅ ＩＩｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｘ Ａｓｐ
Ｇｉｎ Ｔｙｒ ＬｅｕＴｈｒ Ａｌａ Ａｌａ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｌｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ
Ａｓｐ ＧｌｕＡｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ａｓｐ Ｍａｔ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｙｒ ＬｙｓＳ
ｅｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｙ
ｓ ＩＩｓ Ｔｈｒ Ｖａｌｌｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ
ＩＩｓ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
ＴｙｒＶａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｉｎ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ ＶａｌＬｅｕ Ｌａ
ｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｕ
Ｉｌｅ Ｐｒｏ ＬｙｓＴｂｒ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ
Ｌｅｕ ＬｅｕＰｈｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｈｌｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ
ＡｓｎＴｙｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｌｓ Ｐｒｏ Ａｓｎ ＬｅｕＰｈ
ｅ ＩＩｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａ
ｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ ＶａｌＣｙｓ Ｌｅｕ Ａｌ
ａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ｉｌｅ ＴｈｒＹ Ｐｈｅ Ｇｉｎ Ｉｌｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｌａ式
［Ｉ］ 但し、上記式中ＷはＳｅｔ又はＡｌａを意味し、ＸはＡ
ｓｎ又はＡｓｐを意味し、ＹはＡｓｐ以外のアミノ酸を
意味する。 更に、本発明の他のポリペプチドとしては、β型のヒト
インターロイキン１の特定部位のアミノ酸変換体、即ち
第２表の式［１１で示されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド並びにそのＮ末端から１〜３残基及び／又はＣ
末端から１〜３残基のアミノ酸又はペプチドが欠失した
ポリペプチドが挙げられる。 第２表 Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａ
ｓｎ Ｃｙｓ Ｔｈｒ ＬｅｕＡｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ
Ｇｉｎ Ｇｉｎ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ
ＭｅｔＳｅｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｌｅ
ｕ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ ＨｌｓＬａｕ Ｇｉｎ
Ｇｌｙ Ｇｉｎ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇ
ｉｎ ＶａｌＶａｌ Ｐｈｅ Ｓａｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｉｎ Ｇｌｙ ＧｌｕＧｌｕ Ｓ
ｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｖａ
ｌ Ａｌａ ＬｅｕＧｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ ５ｅｒＣｙ
ｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ｔｈｒ ＬａｕＧｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｓ
ｅｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｙ
ｒＰｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ ＶａｌＰｈａ Ａｓｎ Ｌｙ
ｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ ＩＩｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ
ＬｅｕＧｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇ
ｉｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ ＴｒｐＴｙｒ ＩＩｓ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ａｓｎ ＭｅｔＰｒｏ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ＧｌｙＧｉｎ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｚ Ｐｈｅ Ｔｈｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｎ ＰｈｅＶａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ 式［■］ 但し、上記式中Ｚは、Ａｓｐ以外のアミノ酸を意味する
。 本発明の好ましいポリペプチドとしては、第１表の式［
Ｉ］に示したアミノ酸配列において、ＷがＳｅｔであり
、ＸがＡｓｎであり、かつＹがＴｙｒであるポリペプチ
ド及び第３表の式［ｍｌに示したアミノ酸配列を有する
ポリペプチドが挙げられる。 第３表 Ｍｅｔ Ａｒｇ ＩＩｓ ＩＩｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｇ
ｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ ＬａｕＡｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｉｎ Ｓｅｒ ＩＩｓ ＩＩｓ
ＡｒｇＡｌａ Ｘ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ ＡｌａＬｅｕ Ｈ３ｓ Ａｓ
ｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ
ＰｈｅＡｓｐ Ｍａｔ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌ
ｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ ＡｓｐＡｓｐ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ ＩＩｓ Ｌｓｕ
Ａｒｇ ｌ１ｅＳａｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｌｅ
ｕ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ ＧｉｎＡｓｐ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌ
ａｕ Ｌｙｓ ＧｌｕＭｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｕ
Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｔｈｒ ＩＩｓ Ｔ
ｈｒ ＧｌｙＳｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌａｕ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ ＧｌｕＴｈｒ
Ｈｌｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｙｒ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ ５ｅｒＶａｌ Ａｌａ Ｈｌｓ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ ＩＩｓ Ａｌ
ａ ＴｈｒＬｙｓ Ｇｉｎ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ
Ｖａｌ Ｃｙｇ Ｌｅｕ Ａｌａ ＧｌｙＧｌｙ Ｐｒ
ｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｙ
Ｐｈｅ Ｇｉｎ Ｉｌｅｅｕ 式［ｍｌ 但し、上記式中ＸはＡｓｎ又はＡｓｐを意味し、ＹはＴ
ｙｒを意味する。 本発明は、前記のポリペプチドの誘導体にも関する。該
ポリペプチドの誘導体とは、該ポリペプチドの値上の側
鎖官能基、Ｎ末端のアミノ基又はＣ末端のカルボキシル
基を利用して形成される誘導体を意味する０例えばカル
ボキシル基と脂肪族アルコールとのエステル類、第一も
しくは第二アミンとの酸アミド類、アミノ基のＮ−アシ
ル誘導体、ヒドロキシル基の０−アシル誘導体、カルバ
モイル基の水解体又はポリエチレングリコール等による
修飾体、更には該ポリペプチドのカルボキシル基又はア
ミノ基等とで形成される塩、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、アルギニン、カフェイン、プロ力イン
、塩酸、グルコン酸等との塩が挙げられる。 本発明のポリペプチドは、分子間Ｓ−８結合により、更
に高分子を形成する場合もあり、このような高分子体も
本発明のポリペプチドに包含される。また、本発明のポ
リペプチドは産生細胞或は産生条件により、Ｎ末端にＭ
ｅｔが付加したポリペプチドが得られる場合があり、こ
のようなポリペプチドも本発明のポリペプチドに包含さ
れる。 本発明は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに
ｂ関する。そのＤＮＡの例としては、第４表で掲げた式
［ＩＶ］で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（以下、ＴＮ−５５ポリペプチドという）をコードする
ＤＮＡとして、第５表で掲げた式［Ａ］で示される塩基
配列を有するＤＮＡ及びその縮重が挙げられる。 第４表 Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ ＶａｔＬｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ
Ｐｈａ Ｍｅｔ Ａｒｇ ＩＩｓ ＩＩｓ Ｌｙ
ｓ ＴｙｒＧｌｕ Ｐｈｅ ＩＩｓ Ｌｅｕ Ａｓ
ｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇ１ｎ５ｅｒ
Ｉｌｅ ＩＩｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｇｎ Ａｓ
ｐ Ｇｉｎ Ｔｙｒ ＬｅｕＴｈｒ Ａｌａ Ａｌａ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｌｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ
ＧｌｕＡｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｍ
ｅｔ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｙｒ ＬｙｓＳｅｒ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｉｌｅ
Ｔｈｒ Ｖａｌｌｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓ
ｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ ＴｙｒＶａｌ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｇｌｎ Ｐｒｏ ＶａｌＬｅｕ Ｌａｕ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｕ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ
ＬｙｓＴｈｒ ＩＩｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ ＬｅｕＰｈｅ Ｐｈｅ
Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ ）１１ｓ Ｇｌｙ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ ＡｓｎＴｙｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ｖａｌ Ａｌａ Ｈｌｓ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｌ
ｅｕＰｈｅ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｎ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ ＶａｌＣｙｓ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅ
ｒ Ｉｌｅ ＴｈｒＴｙｒ Ｐｈｅ Ｇｉｎ Ｉ
Ｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｉｎ Ａｌａ式［
ＩＶ］ 第５表 ＧＡＡＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＡＣＧＣＣＣＴＣＡ
ＡＴＣＡＡＡＧＴＡＴＡＡＴＴＣＧＡＧＣＣＡＡＴＧＡ
ＴＣＡＧＴＡＣＣＴＣ式［Ａ］ 本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、公知のヒ
ト インターロイキン１或はそのＮ末端及び／又はＣ末
端のアミノ酸又はペプチド欠失体をコードするＤＮＡを
公知の方法、例えば前記ヨーロッパ公開特許第０１８８
９２０号に記載の方法を用いて作製し、これを例えばソ
ングらの方法（Ｗａｎｇ、 Ａ、 Ｍ、ら、 ５ｃｉｅ
ｎｃｅ、 ２２４巻、 １４３１頁、 １９８４年）や
クンケルらの方法（Ｋｕｎｋｅ １ 、 Ｔ、 Ａ、ら
、 Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ、、 １５４
巻、３６７頁、 １９８７年）に準じて点変異させ目的
とする本発明のＤＮＡを作製するか、或は適当な制限酵
素によりＤＮＡ断片を単離し、目的とする箇所の塩基配
列を人為的に変えた合成オリゴデオキシヌクレオチドア
ダプターと結合させることにより、本発明のＤＮＡを製
造することができる。 これらのＤＮＡを当該技術分野で公知の技術により適当
な形質発現ベクターに適切な配列を有するように挿入し
、これを宿主に導入した形質転換体を培養することによ
り、本発明のポリペプチドを製造することができる０例
えば、本発明のポリペプチドそれ自身をコードする塩基
配列を有するＤＮＡの５゛末端に翻訳開始コドンＡＴＧ
を、かつ３゛末端には終止コドンを有するＤＮＡ断片を
作製し、これを適当なプロモーター及びＳＤ配列に続い
て結合させ、更にこれをベクターに組み込むことにより
本発明のポリペプチド生産用の形質発現ベクターを作製
することができる。プロモーターとしては、例えばｌａ
ｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ。 Ｌ二！ｓ、ｐｈｏＡ、ＰＬ、ＳＶ４０初期プロモーター
等が挙げられる。ベクターとしては、例えばプラスミド
（ｐＢＲ３２２等）、ファージ（λフアージ誘導体等）
、ウィルス（ＳＶ４０等）、ランナウェイプラスミド等
が挙げられる。この本発明のポリペプチド生産用の形質
発現ベクターを適当な宿主、例えば大腸菌にコーエンら
の方法（Ｃｏｈｅｎ、 Ｓ、 Ｎ、ら、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、 ｔＪｓＡ。 ６９巻、 ２１１０頁、 １９７２年）に準じて導入
することにより形質転換体を得ることができる１次いで
、この形質転換体をそれに応じた適当な培養条件、下で
培養することにより、目的とするポリペプチド或はその
Ｎ末端にＭｅｔが結合したポリペプチドを製造すること
ができる。この培養物を、例えばりゾチーム消化と凍結
融解、超音波破砕、フレンチプレス等により破壊したの
ち、遠心分離又は−過することにより本発明のポリペプ
チド含有抽出液を得ることができる。この抽出液を蛋白
質精製の一般的な精製法、例えば限外ｒ過、透析、電気
泳動、塩析分画、ゲルｒ過分面、イオン交換クロマトグ
ラフィー、抗体カラムを用いるアフィニティークロマト
グラフィー等に従い精製することにより、本発明のポリ
ペプチドを得ることができる。また、このようにして得
たポリペプチドを化学的に修飾することにより、本発明
のポリペプチドの誘導体を得ることができる。 以下に、本発明のポリペプチドの典型的な例として、第
４表に示したアミノ酸配列を有するＴＮ−５５ポリペプ
チドの諸性質について述べる。 試験例Ｉ ＴＮ−５５ポリペプチドの物理化学的性状ＴＮ−５５ポ
リペプチドの分子量、等電点及び部分アミノ酸配列の分
析結果は、次のとおりであった。 分子Ｉは、ＳＤＳを用いるポリアクリルアミドゲル電気
泳動法により測定し、１８±１ｋＤと求められた０等電
点は、等電点電気泳動法により分析した結果、５．７±
０．２であった０本ポリペブチドを、予め４−ビニルピ
リジンで処理し、尿素存在下でリジルエンドペプチダー
ゼ（和光純薬）を用いて３５℃で一夜酵素分解したのち
、シンクロパックＲＰ−Ｐ３００カラム（ＳｙｎＣｈｒ
ｏｍ社、米国）を用いた高速液体クロマトグラフィーに
より分取したペプチド断片及び蛋白分解酵素未処理の本
ポリペプチドについて、自動アミノ酸配列決定装置（４
７０Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅｒ、 Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂ１ｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）により、
それらのアミノ酸配列を決定した。 蛋白分解酵素未処理のＴＮ−５５ポリペプチドを用いて
決定した本ポリペプチドのＮ末端から第４０番目までの
アミノ酸配列は、次のとおりであり、第４表に示したア
ミノ酸配列と完全に一致した。 ＳｅｒＳｅｒＰｒｏＰｈｅＳｅｒＰｈｅＬｅｕＳｅｒＡ
ｓｎＶａｌＬｙｓＴｙｒＡｓｎＰｈｅＭａｔＡｒｇＩｌ
ｅｌｌｅＬｙｓＴｙｒＧｌｕＰｈｅｌｌｅＬｅｕＡｓｎ
ＡｓｐＡｌａＬｅｕＡｓｎＧｌｎＳｅ ｒ Ｉ ｌｅ
Ｉ １ｅＡｒｇＡｌａＡｓｎＡｓｐＧ１ｎＴｙｒＬｅｕ
一方、蛋白分解酵素分解により調製した二種類のペプチ
ド断片（ＬＰ−１０断片とＬＰ−１２断片と名付ける）
のアミノ酸配列は、次のとおりであった。 ＬＰ−１０断片のアミノ酸配列； ＴｈｒＩｌｅＴｈｒＧｌｙＳｅｒＧｌｕＴｈｒＡｓｎＬ
ｅｕＬｅｕＰｈｅＰｈｅＴｒｐＧｌｕＴｈｒＨｌｓＧｌ
ｙＴｈｒＬｙｓ ＬＰ−１２断片のアミノ酸配列： ＧｌｎＡｓｐＴｙｒＴｒｐＶａ １ＣｙｓＬｅｕＡ１ａ
Ｇ１ｙＧ１ｙＰｒｏＰｒｏＳｅ ｒ Ｉ １ｅＴｈｒＴ
ｙｒＰｈｅＧｌｎＩ １ｅＬｅｕＧｌｕＡｓｎＧｌｎＡ
ｌａこれらＬＰ−１０断片とＬＰ−１２μｌ片のアミノ
酸配列は、それぞれ第４表に示したアミノ酸配列のＮ末
端から第１０１〜１１９番目の領域及び第１３６〜１５
９番目の領域のアミノ酸配列と一致した。 試験例２ ＴＮ−５５ポリペプチドの生物活 （１）リンパ球活性化作用 リンパ球活性化作用を、下記の方法により測定した。即
ち、ＴＮ−５５ポリペプチド溶液を５％ウシ胎児血清を
含む組織培養用培地ＲＰＭＩ−１６４０（Ｆｌｏｗ Ｌ
ａｂｓ、 、米国）にて希釈した。各希釈液の５０μｌ
を９６穴平底型プレートの各ウェルに注入し、その各ウ
ェルに２０μｇ ／ ｍ ｌ濃度のフィトヘマグルチニ
ン−Ｐ （Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｓ、 、米国）の５０μ
ｌを添加し、更にＣ３Ｈ／ Ｈｅマウスの胸腺細胞懸濁
液（２００万個／ｍ１）の１００ｕｌを添加して、５％
炭酸ガス含有空気中３７℃で３日間培養した。培養終了
約１８時間前に、［３Ｈ］−チチミンの１μＣｉを添加
し、細胞内に取り込まれた
にそのＮ末端部及びＣ末端部の部分欠失体のアミノ酸配
列中、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に変換させた
アミノ酸配列を有する新規ポリペプチド、それをコード
するＤＮＡ及びそれらの製造法に関する。 インターロイキン１は、単球／マクロファージ細胞をは
じめとする諸々の細胞から産生される生理活性物質であ
る。ヒト インターロイキン１には、大別してα型とβ
型の二種類の分子が存在することが知られている（Ｆｕ
ｒｕｔａｎｉ、Ｙ、ら、 ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓ、、 １４巻、 ３１６７頁、 １９８６年；
Ｃ１ａｒｋ、Ｂ、Ｄ、 。 ら＊ Ｎｕｃｌａｌｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、＋ １４
巻、 ７８９７頁、 １９８６年）、その代表的な作用
として、Ｔ細胞及びＢ細胞に対する分化増殖促進作用、
リンパ球活性化作用、マクロファージの活性化作用、発
熱惹起作用、プロスタグランジンＥ２の産生誘導作用及
び線維芽細胞の増殖促進作用等が知られており ［Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ、 Ｊ、Ｊ、ら、 Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、 ７巻。 ４５頁、 １９８６年； Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ、Ｃ，
Ａ、、 Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ、 ６巻、５１頁、 １９８４年］
、生体における免疫機構等の調節因子として、重要な役
割を担っており、医薬品としての臨床応用が期待されて
いる。 α型のヒト インターロイキン１ポリペプチドのＮ末端
側の１〜１４個のアミノ酸及び／又はＣ末端側の１〜４
個のアミノ酸の欠失体（ヨーロッパ公開特許第０１８８
９２０号）やα型のヒトインターロイキン１ポリペプチ
ドのＮ末端がら３６番目のＡｓｎが脱アミド化され、Ａ
ｓｐに変化したポリペプチドが知られている（Ｃａｍａ
ｒｏｎ、Ｐ、Ｍ、ら、Ｊ、Ｅｘｐ、 Ｍａｄ、 、＋−
１６４巻、２３７頁、 １９８６年； Ｗｉｎｇｆｉｅ
ｌｄ、Ｐ。 ら、 Ｅｕｒ、Ｊ、 Ｂｌｏｃｈｅｍ、、 １６５
巻、５３７頁、 １９Ｂ７．年）。 また、異なる遺伝子に由来し上記α型のヒト インター
ロイキン１ポリペプチドのＮ末端がら第２番目のＳｅｔ
がＡｌａにかわっているポリペプチドも知られている（
Ｍａｒｃｈ、Ｃ，Ｊ、ら、 Ｎａｔｕｒｅ、 ３１５
巻。 ６４１頁、 １９８５年）、β型のヒト インターロイ
キン１ポリペプチドに関しては、そのＮ末端側の１〜３
個のアミノ酸及び／又はＣ末端側の１〜３個のアミノ酸
欠失体が知られている（Ｍｏｓｌｅｙ、Ｂ、ら。 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ＴＪＳＡ、
８４巻、 ４５７２頁、 １９８７年）。 本発明者等は、ヒトインターロイキン１の構造と生物活
性との関係について鋭意研究を重ね、該ポリペプチドの
アミノ酸配列の特定の部分を他のアミノ酸に変換したポ
リペプチドの特性を検索したところ、まったく意外にも
リンパ球活性化作用を示すが、プロスタグランジンＥ２
の産生誘導能を殆ど持たない特異な活性を示すことを見
い出し、本発明を完成するに至った。 本発明のポリペプチドとしては、α型ヒトインターロイ
キン１の部分的アミノ酸変換体、即ち第１表の式［１］
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド並びにそ
のＮ末端から１〜１４残基及び／又はＣ末端から１〜４
残基のアミノ酸又はペプチドが欠失したポリペプチドが
挙げられる。 第１表 Ｓｅｒ Ｗ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ａｓｎ ＶａｌＬｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｐ
ｈｅ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｉｌａ Ｉｌｅ Ｌｙ
ｓ ＴｙｒＧｌｕ Ｐｈｅ ＩＩｓ Ｌｅｕ Ａｓ
ｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇ１ｎ５ｅｒ
Ｉｌｅ ＩＩｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｘ Ａｓｐ
Ｇｉｎ Ｔｙｒ ＬｅｕＴｈｒ Ａｌａ Ａｌａ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｌｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ
Ａｓｐ ＧｌｕＡｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ａｓｐ Ｍａｔ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｙｒ ＬｙｓＳ
ｅｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｙ
ｓ ＩＩｓ Ｔｈｒ Ｖａｌｌｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ
ＩＩｓ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
ＴｙｒＶａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｉｎ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ ＶａｌＬｅｕ Ｌａ
ｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｕ
Ｉｌｅ Ｐｒｏ ＬｙｓＴｂｒ Ｉｌｅ Ｔｈ
ｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ
Ｌｅｕ ＬｅｕＰｈｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｈｌｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ
ＡｓｎＴｙｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｌｓ Ｐｒｏ Ａｓｎ ＬｅｕＰｈ
ｅ ＩＩｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａ
ｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ ＶａｌＣｙｓ Ｌｅｕ Ａｌ
ａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ｉｌｅ ＴｈｒＹ Ｐｈｅ Ｇｉｎ Ｉｌｅ
Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｌａ式
［Ｉ］ 但し、上記式中ＷはＳｅｔ又はＡｌａを意味し、ＸはＡ
ｓｎ又はＡｓｐを意味し、ＹはＡｓｐ以外のアミノ酸を
意味する。 更に、本発明の他のポリペプチドとしては、β型のヒト
インターロイキン１の特定部位のアミノ酸変換体、即ち
第２表の式［１１で示されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド並びにそのＮ末端から１〜３残基及び／又はＣ
末端から１〜３残基のアミノ酸又はペプチドが欠失した
ポリペプチドが挙げられる。 第２表 Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａ
ｓｎ Ｃｙｓ Ｔｈｒ ＬｅｕＡｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ
Ｇｉｎ Ｇｉｎ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ
ＭｅｔＳｅｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｌｅ
ｕ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ ＨｌｓＬａｕ Ｇｉｎ
Ｇｌｙ Ｇｉｎ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇ
ｉｎ ＶａｌＶａｌ Ｐｈｅ Ｓａｒ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｉｎ Ｇｌｙ ＧｌｕＧｌｕ Ｓ
ｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｖａ
ｌ Ａｌａ ＬｅｕＧｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ ５ｅｒＣｙ
ｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ｔｈｒ ＬａｕＧｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｓ
ｅｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｙ
ｒＰｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ ＶａｌＰｈａ Ａｓｎ Ｌｙ
ｓ Ｉｌｅ Ｇｌｕ ＩＩｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ
ＬｅｕＧｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇ
ｉｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ ＴｒｐＴｙｒ ＩＩｓ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ａｓｎ ＭｅｔＰｒｏ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ＧｌｙＧｉｎ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｚ Ｐｈｅ Ｔｈｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｎ ＰｈｅＶａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ 式［■］ 但し、上記式中Ｚは、Ａｓｐ以外のアミノ酸を意味する
。 本発明の好ましいポリペプチドとしては、第１表の式［
Ｉ］に示したアミノ酸配列において、ＷがＳｅｔであり
、ＸがＡｓｎであり、かつＹがＴｙｒであるポリペプチ
ド及び第３表の式［ｍｌに示したアミノ酸配列を有する
ポリペプチドが挙げられる。 第３表 Ｍｅｔ Ａｒｇ ＩＩｓ ＩＩｓ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｇ
ｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ ＬａｕＡｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｉｎ Ｓｅｒ ＩＩｓ ＩＩｓ
ＡｒｇＡｌａ Ｘ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ ＡｌａＬｅｕ Ｈ３ｓ Ａｓ
ｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ
ＰｈｅＡｓｐ Ｍａｔ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌ
ｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ ＡｓｐＡｓｐ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ ＩＩｓ Ｌｓｕ
Ａｒｇ ｌ１ｅＳａｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｌｅ
ｕ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ ＧｉｎＡｓｐ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌ
ａｕ Ｌｙｓ ＧｌｕＭｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｕ
Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｔｈｒ ＩＩｓ Ｔ
ｈｒ ＧｌｙＳｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌａｕ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ ＧｌｕＴｈｒ
Ｈｌｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｙｒ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ ５ｅｒＶａｌ Ａｌａ Ｈｌｓ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ ＩＩｓ Ａｌ
ａ ＴｈｒＬｙｓ Ｇｉｎ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ
Ｖａｌ Ｃｙｇ Ｌｅｕ Ａｌａ ＧｌｙＧｌｙ Ｐｒ
ｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｙ
Ｐｈｅ Ｇｉｎ Ｉｌｅｅｕ 式［ｍｌ 但し、上記式中ＸはＡｓｎ又はＡｓｐを意味し、ＹはＴ
ｙｒを意味する。 本発明は、前記のポリペプチドの誘導体にも関する。該
ポリペプチドの誘導体とは、該ポリペプチドの値上の側
鎖官能基、Ｎ末端のアミノ基又はＣ末端のカルボキシル
基を利用して形成される誘導体を意味する０例えばカル
ボキシル基と脂肪族アルコールとのエステル類、第一も
しくは第二アミンとの酸アミド類、アミノ基のＮ−アシ
ル誘導体、ヒドロキシル基の０−アシル誘導体、カルバ
モイル基の水解体又はポリエチレングリコール等による
修飾体、更には該ポリペプチドのカルボキシル基又はア
ミノ基等とで形成される塩、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、アルギニン、カフェイン、プロ力イン
、塩酸、グルコン酸等との塩が挙げられる。 本発明のポリペプチドは、分子間Ｓ−８結合により、更
に高分子を形成する場合もあり、このような高分子体も
本発明のポリペプチドに包含される。また、本発明のポ
リペプチドは産生細胞或は産生条件により、Ｎ末端にＭ
ｅｔが付加したポリペプチドが得られる場合があり、こ
のようなポリペプチドも本発明のポリペプチドに包含さ
れる。 本発明は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに
ｂ関する。そのＤＮＡの例としては、第４表で掲げた式
［ＩＶ］で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（以下、ＴＮ−５５ポリペプチドという）をコードする
ＤＮＡとして、第５表で掲げた式［Ａ］で示される塩基
配列を有するＤＮＡ及びその縮重が挙げられる。 第４表 Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ ＶａｔＬｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ
Ｐｈａ Ｍｅｔ Ａｒｇ ＩＩｓ ＩＩｓ Ｌｙ
ｓ ＴｙｒＧｌｕ Ｐｈｅ ＩＩｓ Ｌｅｕ Ａｓ
ｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇ１ｎ５ｅｒ
Ｉｌｅ ＩＩｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｇｎ Ａｓ
ｐ Ｇｉｎ Ｔｙｒ ＬｅｕＴｈｒ Ａｌａ Ａｌａ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ｈｌｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ
ＧｌｕＡｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｍ
ｅｔ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｙｒ ＬｙｓＳｅｒ Ｓｅｒ
Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｉｌｅ
Ｔｈｒ Ｖａｌｌｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓ
ｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ ＴｙｒＶａｌ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｇｌｎ Ｐｒｏ ＶａｌＬｅｕ Ｌａｕ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｕ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｐｒｏ
ＬｙｓＴｈｒ ＩＩｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ ＬｅｕＰｈｅ Ｐｈｅ
Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ ）１１ｓ Ｇｌｙ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ ＡｓｎＴｙｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ｖａｌ Ａｌａ Ｈｌｓ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｌ
ｅｕＰｈｅ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｎ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ ＶａｌＣｙｓ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅ
ｒ Ｉｌｅ ＴｈｒＴｙｒ Ｐｈｅ Ｇｉｎ Ｉ
Ｉｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｉｎ Ａｌａ式［
ＩＶ］ 第５表 ＧＡＡＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＡＣＧＣＣＣＴＣＡ
ＡＴＣＡＡＡＧＴＡＴＡＡＴＴＣＧＡＧＣＣＡＡＴＧＡ
ＴＣＡＧＴＡＣＣＴＣ式［Ａ］ 本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、公知のヒ
ト インターロイキン１或はそのＮ末端及び／又はＣ末
端のアミノ酸又はペプチド欠失体をコードするＤＮＡを
公知の方法、例えば前記ヨーロッパ公開特許第０１８８
９２０号に記載の方法を用いて作製し、これを例えばソ
ングらの方法（Ｗａｎｇ、 Ａ、 Ｍ、ら、 ５ｃｉｅ
ｎｃｅ、 ２２４巻、 １４３１頁、 １９８４年）や
クンケルらの方法（Ｋｕｎｋｅ １ 、 Ｔ、 Ａ、ら
、 Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ、、 １５４
巻、３６７頁、 １９８７年）に準じて点変異させ目的
とする本発明のＤＮＡを作製するか、或は適当な制限酵
素によりＤＮＡ断片を単離し、目的とする箇所の塩基配
列を人為的に変えた合成オリゴデオキシヌクレオチドア
ダプターと結合させることにより、本発明のＤＮＡを製
造することができる。 これらのＤＮＡを当該技術分野で公知の技術により適当
な形質発現ベクターに適切な配列を有するように挿入し
、これを宿主に導入した形質転換体を培養することによ
り、本発明のポリペプチドを製造することができる０例
えば、本発明のポリペプチドそれ自身をコードする塩基
配列を有するＤＮＡの５゛末端に翻訳開始コドンＡＴＧ
を、かつ３゛末端には終止コドンを有するＤＮＡ断片を
作製し、これを適当なプロモーター及びＳＤ配列に続い
て結合させ、更にこれをベクターに組み込むことにより
本発明のポリペプチド生産用の形質発現ベクターを作製
することができる。プロモーターとしては、例えばｌａ
ｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ。 Ｌ二！ｓ、ｐｈｏＡ、ＰＬ、ＳＶ４０初期プロモーター
等が挙げられる。ベクターとしては、例えばプラスミド
（ｐＢＲ３２２等）、ファージ（λフアージ誘導体等）
、ウィルス（ＳＶ４０等）、ランナウェイプラスミド等
が挙げられる。この本発明のポリペプチド生産用の形質
発現ベクターを適当な宿主、例えば大腸菌にコーエンら
の方法（Ｃｏｈｅｎ、 Ｓ、 Ｎ、ら、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、 ｔＪｓＡ。 ６９巻、 ２１１０頁、 １９７２年）に準じて導入
することにより形質転換体を得ることができる１次いで
、この形質転換体をそれに応じた適当な培養条件、下で
培養することにより、目的とするポリペプチド或はその
Ｎ末端にＭｅｔが結合したポリペプチドを製造すること
ができる。この培養物を、例えばりゾチーム消化と凍結
融解、超音波破砕、フレンチプレス等により破壊したの
ち、遠心分離又は−過することにより本発明のポリペプ
チド含有抽出液を得ることができる。この抽出液を蛋白
質精製の一般的な精製法、例えば限外ｒ過、透析、電気
泳動、塩析分画、ゲルｒ過分面、イオン交換クロマトグ
ラフィー、抗体カラムを用いるアフィニティークロマト
グラフィー等に従い精製することにより、本発明のポリ
ペプチドを得ることができる。また、このようにして得
たポリペプチドを化学的に修飾することにより、本発明
のポリペプチドの誘導体を得ることができる。 以下に、本発明のポリペプチドの典型的な例として、第
４表に示したアミノ酸配列を有するＴＮ−５５ポリペプ
チドの諸性質について述べる。 試験例Ｉ ＴＮ−５５ポリペプチドの物理化学的性状ＴＮ−５５ポ
リペプチドの分子量、等電点及び部分アミノ酸配列の分
析結果は、次のとおりであった。 分子Ｉは、ＳＤＳを用いるポリアクリルアミドゲル電気
泳動法により測定し、１８±１ｋＤと求められた０等電
点は、等電点電気泳動法により分析した結果、５．７±
０．２であった０本ポリペブチドを、予め４−ビニルピ
リジンで処理し、尿素存在下でリジルエンドペプチダー
ゼ（和光純薬）を用いて３５℃で一夜酵素分解したのち
、シンクロパックＲＰ−Ｐ３００カラム（ＳｙｎＣｈｒ
ｏｍ社、米国）を用いた高速液体クロマトグラフィーに
より分取したペプチド断片及び蛋白分解酵素未処理の本
ポリペプチドについて、自動アミノ酸配列決定装置（４
７０Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅｒ、 Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂ１ｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）により、
それらのアミノ酸配列を決定した。 蛋白分解酵素未処理のＴＮ−５５ポリペプチドを用いて
決定した本ポリペプチドのＮ末端から第４０番目までの
アミノ酸配列は、次のとおりであり、第４表に示したア
ミノ酸配列と完全に一致した。 ＳｅｒＳｅｒＰｒｏＰｈｅＳｅｒＰｈｅＬｅｕＳｅｒＡ
ｓｎＶａｌＬｙｓＴｙｒＡｓｎＰｈｅＭａｔＡｒｇＩｌ
ｅｌｌｅＬｙｓＴｙｒＧｌｕＰｈｅｌｌｅＬｅｕＡｓｎ
ＡｓｐＡｌａＬｅｕＡｓｎＧｌｎＳｅ ｒ Ｉ ｌｅ
Ｉ １ｅＡｒｇＡｌａＡｓｎＡｓｐＧ１ｎＴｙｒＬｅｕ
一方、蛋白分解酵素分解により調製した二種類のペプチ
ド断片（ＬＰ−１０断片とＬＰ−１２断片と名付ける）
のアミノ酸配列は、次のとおりであった。 ＬＰ−１０断片のアミノ酸配列； ＴｈｒＩｌｅＴｈｒＧｌｙＳｅｒＧｌｕＴｈｒＡｓｎＬ
ｅｕＬｅｕＰｈｅＰｈｅＴｒｐＧｌｕＴｈｒＨｌｓＧｌ
ｙＴｈｒＬｙｓ ＬＰ−１２断片のアミノ酸配列： ＧｌｎＡｓｐＴｙｒＴｒｐＶａ １ＣｙｓＬｅｕＡ１ａ
Ｇ１ｙＧ１ｙＰｒｏＰｒｏＳｅ ｒ Ｉ １ｅＴｈｒＴ
ｙｒＰｈｅＧｌｎＩ １ｅＬｅｕＧｌｕＡｓｎＧｌｎＡ
ｌａこれらＬＰ−１０断片とＬＰ−１２μｌ片のアミノ
酸配列は、それぞれ第４表に示したアミノ酸配列のＮ末
端から第１０１〜１１９番目の領域及び第１３６〜１５
９番目の領域のアミノ酸配列と一致した。 試験例２ ＴＮ−５５ポリペプチドの生物活 （１）リンパ球活性化作用 リンパ球活性化作用を、下記の方法により測定した。即
ち、ＴＮ−５５ポリペプチド溶液を５％ウシ胎児血清を
含む組織培養用培地ＲＰＭＩ−１６４０（Ｆｌｏｗ Ｌ
ａｂｓ、 、米国）にて希釈した。各希釈液の５０μｌ
を９６穴平底型プレートの各ウェルに注入し、その各ウ
ェルに２０μｇ ／ ｍ ｌ濃度のフィトヘマグルチニ
ン−Ｐ （Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｓ、 、米国）の５０μ
ｌを添加し、更にＣ３Ｈ／ Ｈｅマウスの胸腺細胞懸濁
液（２００万個／ｍ１）の１００ｕｌを添加して、５％
炭酸ガス含有空気中３７℃で３日間培養した。培養終了
約１８時間前に、［３Ｈ］−チチミンの１μＣｉを添加
し、細胞内に取り込まれた
【３Ｈ】−チミジン量を計測
した。陰性対照には、供試試料のかわりに５％ウシ胎児
血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を添加した系におけ
るマウスの胸！！細胞培養時の［３Ｈ］−チミジン取り
込み量を示した。第６表に示すごとく、強いリンパ球活
性化作用を認めた。 （以下余白） 第６表 陰性対照 ６．７４０ （２）プロスタグランジンＥ２産生誘導能ＴＮ−５５ポ
リペプチドのヒト骨肉腫細胞ＭＧ−６３細胞（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃａ１ｌ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
ＣＲＬ１４２７）を標的細胞とするプロスタグランジ
ンＥ２産生誘導能を、前記のリンパ球活性化作用の測定
に用いた同じ試料原液を用い、以下の方法に従って測定
した。即ち、ＴＮ−５５ポリペプチド溶液を１０％０％
ウシ胎清、非必須アミノ酸及びピルビン酸ナトリウムを
含む組織培養用培地ＭＥＭア−ル液（Ｆｌｏｗ Ｌａｂ
ｓ、）にて希釈した。 各希釈液の１００μｍを２４穴
平底型プレートの各ウェルに注入し、更に各ウェル当り
約２万個のＭＧ−６３細胞を含む細胞懸濁液の４００μ
ｌを添加して、５％炭酸ガス含有空気中３７℃で４８時
間培培養た。培養終了後、培養上清を採取しその上清中
のプロスタグランジンＥ２含量を、ＲＩＡキット（Ｅ、
１．ｄｕＰｏｎｔ ｄａ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏ
、 、 米国）を用いて測定した。陰性対照には、供
試試料のかわりに上記の培養液を添加した系におけるＭ
Ｇ−６３細胞の培養上清中のプロスタグランジンＥ２ｆ
ｆｉを示した。 第７表に示すごとく、プロスタグランジンＥ２産生誘導
能は殆ど認められなかった。 第７表 の最終希釈倍数 産生遊離量（ｎｇ／ｍ１）５００
０、３６ ５、８００ ０．３０ ５０、０００ ０．１Ｂ ５００、０００ ０．１Ｂ ５、０００．８００ ０．２１５０、０００
．０００ ０．１Ｂ陰性対照
０．１８ 以上の結果から、ＴＮ−５５ポリペプチドは、強いリン
パ球活性化作用を発揮する量においても、有意なプロス
タグランジンＥ２産生誘導能は認められず、極めて特徴
的な特性を有するポリペプチドであることが証明された
。 尚、本明細書では記載の簡略化のなめに以下の略号を使
用する。 Ａ アデニン Ｃシトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン ＤＮＡ デオキシリボ核酸 ＣＤＮＡ 相補ｃＤＮＡ ＲＮＡ リボ核酸 ｍＲＮＡ 伝令ＲＮＡ ＡＴＰ アデノシン三リン酸 ｄＡＴＰ デオキシアデノシン三リン酸ｄＣＴＰ
デオキシシチジン三リン酸ｄＧＴＰ デオキシ
グアノシン三リン酸ｄＴＴＰ デオキシチミジン三
リン酸ｂｐ 塩基対 ｋｂｐ キロ塩基対 ｋＤ キロダルトン ＳＤＳ ラウリル硫酸ナトリウム以下に実施例を
挙げて本発明を更に具体的に説明する。。 （以下余白） 実施例Ｉ ＴＮ−５５ボ１ペプ ドの 口 前記第４表の式［ＩＶ］で示されるアミノ酸配列を有す
るＴＮ−５５ポリペプチドを以下の方法で製造した。 （１）形質発現プラスミドの構築 参考例２に記載の組み換え体プラスミドｐＨＩＰ３１２
ＥＣを出発材５料として用い、このプラスミドＤＮＡ中
のヒトインターロイキン１ポリペプチドのＣ末端から第
９番目のアミノ酸（Ａｓｐ）をコードするコドン（Ｇ
Ａ Ｃ）を、クンケルらの方法（Ｋｕｎｋｅ ｌ 、
Ｔ、 Ａ、ら、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、、 １５４巻。 ３６７頁、 １９８７年）に準じた部位特異的変異誘導
法によりチロシンに対応するコドンＴＡＣに変換するこ
とにより、ＴＮ−５５ポリペプチド生産用の形質発現プ
ラスミド（ｐＨＴＮ５５）を構築した。 その構築方法は以下のとおりであり、部位特異的変異誘
導には、ＭｔｌＴＡ−ＧＥＮＥインビトロムタジェネシ
スキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｓ、 、米国）を用
いた。 即ち、プラスミドｐＨＩＰ３１２Ｅｃを制限酵素ｐｖｕ
Ｉ［とＨｉｎｄｎＩにて消化し、ヒト インターロイキ
ン１ポリペプチドをコードする領域及び大腸菌トリプト
ファンプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を単離した。 このＤＮＡ断片を、Ｍ１３ｍｐ１９ベクターの制限酵素
ＨｉｎｄｍとＨｉｎｃｌｌ認識部位間に挿入した。この
組み換え体ＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０５株に感染させ、こ
れを培養して該ファージを採取した０次いで、このファ
ージを大腸菌ＣＪ２３６株に感染させるとともに、ウリ
ジン（１μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（２０
）ｔ ｇ／ｍｌ）を含有する２ Ｘ Ｔ Ｙ培地［組成
：１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％塩化
ナトリウム］中、３７℃で５時間培養し、その培養上清
からファージＤＮＡを精製分離した。培養容量１０ｍ１
当り、約２μｇのファージＤＮＡが得られた。 別途、下記式［Ｂ］、で示される塩基配列のオリゴデオ
キシリボヌクレオチドを常法に従って化学合成した。 ５°−ＣＴＡＴＣＡＣＴＴＡＣＴＴＴＣＡ−３′［Ｂ］
この塩基配列は、第８表の塩基配列において第７８７番
目の塩基を除いて、第７７９〜７９４番目の配列と一致
する。この化学合成りＮＡを変異誘導プライマーという
。 この変異誘導プライマーの５′末端にリン酸基を付加し
、このプライマーを先に調製したファージＤＮＡとアニ
ール［ｒ液［組成：２ｍＭ塩化マグネシウム及び５０ｍ
Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）］中、７０℃で１０分間反応させのち、１分
間に１℃の割合で３０℃まで徐々に冷却し、ブライマー
をファージＤＮＡに結合させた０次いで、Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼ！及びＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてｄＧＴＰ
、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びＡＴＰ等の存在下
で、ファージＤＮＡに対して相補的なりＮＡを合成し環
状二本ｆｉＤＮＡとした。これを大腸菌ＪＭ１０５株に
感染させ、各クローンについてそれぞれ培養し、その培
養菌体から複製型二本鎖ＤＮＡを単離した。その塩基配
列は、培養上清から単離した単鎖ＤＮＡを用いて蛋白翻
訳領域を中心に塩基配列を決定し、ＴＮ−５５ポリペプ
チドをコードする塩基配列を有していることを確認した
０次いで、複製型二本鎖ＤＮＡから制限酵素ＨｐａＩと
ＸｈｏＩによる消化にて、該蛋白翻訳領域を含むＤＮＡ
断片を切り出した。このＤＮＡ断片を、ＴＮ−５５ＤＮ
Ａ断片という。 別途、参考例１に記載の組み換え体プラスミドｐＨｌＰ
Ｈ３８３ａから制限酵素旦Ｊ２ｊ−Ｉ とＸｈｏＩ
を用いて、アンピシリン耐性遺伝子及び複製開始点を含
む大きなりＮＡ断片を切り出し、これを上記のＴＮ−５
５ＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させる
ことにより、形質発現プラスミドｐ ＨＴＮ ５５を構
築した。 この形質発現プラスミドｐ ＨＴＮ ５５を、次の方法
に従って大腸菌Ｈ８１０１株に導入し形質転換体を作製
した。即ち、大腸菌Ｈ８１０１株をＬＢ培地［組成：１
％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウ
ム（ｐ）（７，５）］に接種し、３０℃で一夜培養した
。その菌体懸濁液の１ｍｌを１００ｍ１のＬＢ培地に接
種し、濁度（波長６００ｎｍの吸光度）が約０．６に達
するまで、３０℃で培養した。この培養液を氷水中で３
０分間静置したのち、遠心分離にて菌体を採取した。 この菌体を５０ｍ１の５０ｍＭ塩化カルシウム液中に再
懸濁させ、氷水中で６０分間静置したのち、遠心分離に
て菌体を採取し２０％グリセリンを含む５０ｍＭ塩化カ
ルシウム液の１０ｍ１に懸濁させた。この懸濁液に上記
の形質発現プラスミドｐＨＴＮ５５を添加し、氷水中で
２０分間、室温で１０分間反応させたのち、ＬＢ培地を
添加して３７℃で６０分間振盪培養した。その菌体懸濁
液の一定量を、２５μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンを含
むＬＢ寒天平板（寒天濃度１．５％）に播き、３７℃で
一夜培養し、アンピシリン耐性クローンを得た。このア
ンピシリン耐性クローン、即ち形質転換体をＨＢＩＯＩ
／ｐ）（ＴＭ０１と名付け、ＴＮ−５５ポリペプチドの
生産菌とした。 （２）ＴＮ−５５ポリペプチドの製造 第１項で得たＴＮ−５５ポリペプチド生産菌ＨＢ１０ｔ
／Ｐ）ＩＴＮ５５を、ＬＢ培地にて３７℃で−後培養し
たのち、その菌体懸濁液を約１００倍量の栄養培地［組
成：１．５％リン酸二ナトリウム・１２水塩、０．３％
リン酸−カリウム、０．１％塩化アンモニウム、２ ｍ
ｇ ／ １ビタミンＢ１．０．５％カザミノ酸、２ｍ
Ｍ硫酸マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、１％
トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム
、０．４％グリセリン］に接種し、更にインドール−３
−アクリル酸を最終濃度２０μｇ ／ ｍ １になるよ
うに添加したのち２８時間培養した。菌体を遠心分離に
より採取し、０．１％リゾチーム及び３０ｍＭ塩化ナト
リウムを含む５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ Ｈ８，０
）に懸濁させた。氷水中で３０分間靜靜置たのちドライ
アイス／エタノール浴での凍結と３７℃での融解を繰り
返して菌体を破壊した。 これに１１５０容量の１０％ポリエチレンイミンを加え
て静置ののち遠心分離にて菌体残金等を除いた抽出液を
得た。この抽出液に硫酸アンモニウムを最終７０％飽和
になるように添加し、静置ののち遠心分離により沈澱を
採取した。この沈澱を蒸留水に溶解させ、５ｍＭリン酸
塩緩衝化生理食塩液（ｐＨ６，５）［以下、ＰＢＳと記
す］に対して透析したのちセファクリルＳ−２００カラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を用いるゲル
沢過に付した９分子量約１５〜２０ｋＤの溶出位置に相
当する画分からＴＮ−５５ポリペプチドを含む溶出液を
爪め、これを予めＰＢＳにて平衡化したＤＥＡＥ−セフ
ァロースＣＬ−６Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負
荷し、ＰＢＳにてカラムを洗浄した。同カラムに吸着し
たＴＮ−５５ポリペプチドを、ＰＢＳ中０〜０．５Ｍの
塩化ナトリウム濃度勾配にて溶出したところ、ＴＮ−５
５ポリペプチドの計算分子量と一致する分子量を有する
ポリペプチドが、二分画に分離されて溶出された。低濃
度の塩化ナトリウムで溶出された画分をＴＮ−５５（ａ
）ポリペプチド画分と名付け、より高い塩化ナトリウム
濃度で溶出された画分をＴＮ−５５（ｂ）ポリペプチド
画分と名付けた。 ＴＮ−５５（ａ）ポリペプチド画分をＰＢＳに対して透
析したのち、予めＰＢＳにて平衡化したＳ−セファロー
スファーストフローカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負
荷し、ＰＢＳにてカラムを洗浄し、次いでＰＢＳ中０〜
０．２５Ｍの塩化ナトリウム濃度勾配にて溶出した。Ｔ
Ｎ−５５（ａ）ポリペプチド画分を集め限外濾過にて濃
縮したのち、トヨパールＨＷ−５５カラム（東ソー）を
用いるゲル濾過により精製し、最終的に５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動分析にて不純物を認めない高
度精製品を得た。 ここで得たＴＮ−５５（ａ）ポリペプチド画分から精製
分離したポリペプチドを、前記試験例（１）及び（２）
に供した。 前記試験例の結果等により、このポリペプチドが目的と
するＴ没−５５ポリペプチドであると結論された。 実施例２ ＴＮ−５５ポリペプチドの脱アミド体の製造ＴＮ−５５
ポリペプチドのアミノ酸配列中、Ｎ末端から第３６番目
のアミノ酸がＡｓｐに変化したポリペプチド（Ｔ Ｎ
−５５Ａｓｐポリペプチドという）を以下の方法により
分離精製した。 実施例１第２項に記載したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ
−６Ｂカラムクロマトグラフィーにおいて、より高い塩
化ナトリウム濃度で溶出されたＴＮ−５５（ｂ）ポリペ
プチド画分に含まれるポリペプチドを、実施例１第２項
記載の方法に準じて精製した。即ち、Ｓ−セファロース
ファーストフローカラムクロマトグラフィー及びトヨ
パールＨＷ−５５カラムを用いるゲルー過により精製し
、高度精製品を得た。 このＴＮ−５５（ｂ）ポリペプチド画分から単離精製し
たポリペプチドのアミノ酸配列を、Ｎ末端から順次エド
マン分解法により分析したところ、本ポリペプチドのＮ
末端から４０番目までのアミノ酸配列は、次のとおりで
あった。 ＳｅｒＳｅｒＰｒｏＰｈｅＳｅｒＰｈｅＬｅｕＳｅｒＡ
ｓｎＶａｌＬｙｓＴｙｒＡｓｎＰｈｅＭｅｔＡｒｇＩｌ
ｅｌｌｅＬｙｓＴｙｒＧｌｕＰｈｅｌｌｅＬｅｕＡｓｎ
ＡｓｐＡｌａＬｅｕＡｓｎＧｌｎＳｅｒＩ ｌｅ Ｉ
ｌｅＡｒｇＡｌａＡｓｐＡｓｐＧｌｎＴｙｒＬ、ｅｕ即
ち、Ｎ末端から第３６番目のアミノ酸はＡｓｐと同定さ
れた。この結果から、このポリペプチド精製品は、ＴＮ
５５Ａｓｐポリペプチドであると結論された。尚、
このＴＮ−５５Ａｓｐポリペプチドの等電点は、等電点
電気泳動法により５．４±０．２と求められた。 実施例３ Ｔ Ｎ −５５（１４１）ポリペプチドの製造前記第３
表の式［Ｉ１１］に示したアミノ酸配列を有するポリペ
プチド（但し、第３表中のＸ ！、ｔＡｓｎであり、Ｙ
はＴｙｒである）、即ちＴＮ−５５ポリペプチドのアミ
ノ酸配列中、Ｎ末端から１４残基のへブチド及びＣ末端
から４残基のペプチドを欠失させたアミノ酸配列に対応
するポリペプチド［ＴＮ −５５（１４１）ポリペプチ
ドという］を以下の方法により分離精製した。 （１）形質発現プラスミドの構築 ヨーロッパ公開特許第０１８８９２０号に記載の方法で
得たヒト インターロイキン１前駆体ポリペプチドをコ
ードするクローン化ｃＤＮＡが組み込まれた組み換え体
プラスミドｐＨＬ４から、制限酵素ＰｓｔＩによる消化
にて、ｃＤＮＡ領域を切り出した。このｃＤＮＡがコー
ドするヒトインターロイキン１前駆体ポリペプチドのア
ミノ酸配列及びその塩基配列を第８表に示す、このクロ
ーン化ｃＤＮＡから、制限酵素ＥｃｏＲＩとｍ９６ Ｉ
による消化にて、第８表に示した塩基配列の第３９８〜
７６９番目までに相当するＤＮＡ断片を単離した。 このＤＮＡ断片に、下記の式［Ｃ］及び［Ｄ］で示され
る二種類の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターを７
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。 式［Ｃ］及び［Ｄ］の化学合成オリゴヌクレオチドアダ
プターの塩基配列は、次の通りである。 ここで得られたＤＮＡ断片を、Ｉ Ｌ １ （１４１）
ｌ！ｌｒ片という。 形質発現ベクターｐＥＰ３０２を、古谷らの方法（Ｆｕ
ｒｕｔａｎｉ、Ｙ、ら、 Ｎｕｃｌｅｌｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、、 １３巻、５８６９頁、 １９８５年）
に従って作製し、これを制限酵素ｍＩとＢａｍＨＩにて
消化し、大腸菌トリプトファンプロモーター領域部分及
びアンピシリン耐性遺伝子を含む大きなりＮＡ断片を単
離した。この断片に下記式［Ｅｌで示される化学合成オ
リゴヌクレオチドアダプターをＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて結合させた。 更に、この得られたＤＮＡ断片を、上記のＩＬ １ （
１４１）断片と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ
ることにより、ＴＮ−５５（１４１）ポリペプチド生産
用の形質発現プラスミドを構築した（図１参照）、この
形質発現プラスミドをｐＨＴＮ ５５ （１４１）と名
付けた。 （２） ＴＮ ５５ （１４１）ポリペプチドの製造
第１項で作製した形質発現プラスミドをｐＨＴＮ ５５
（１４１）を用いて実施例１に記載した方法に準じて
、形質転換体を作製し、その培養菌体よりＴ Ｎ −５
５（１４１）ポリペプチドを分離精製した。 得られたＴ Ｎ −５５（１４１）ポリペプチド精製品
について、そのＮ末端部分のアミノ酸配列をエドマン分
解法により分析した結果、そのＮ末端から第４０番目ま
でのアミノ酸配列は、次のとおりであり、前記第３表の
式［１１［］に示したアミノ酸配列と一致した（但し、
第３表中のＸはＡｓｎである）。 ＭａｔＡｒｇＩｌｅＩｌｅＬｙｓＴｙｒＧ１ｕＰｈｅＩ
ｌｅＬａｕＡｓｎＡｓｐＡ１ａＬｅｕＡｓｎＧ１ｎＳｅ
ｒｌｌｅＩｌｅＡｒｇＡ１ａＡｓｎＡｓｐＧｌｎＴｙｒ
ＬｅｕＴｈｒＡ１ａＡｌａＡ１ａＬｅｕＨ３５ＡｓｎＬ
ｅｕＡｓｐＧ１ｕＡ１ａＶａ ＩＬｙｓＰｈｅまた、カ
ルボキシペプチダーゼ酵素分解及びアミノ酸分析の結果
では、ロイシンが検出された。 このＴ Ｎ −５５（１４１）ポリペプチドの精製過程
中、実施例２に示したと同様により酸性側の等電点を有
する脱アミド体の存在を１ｉｉ認した。その脱アミド体
ポリペプチドのアミノ酸配列分析の結果から、Ｎ末端か
ら第２２番目のアミノ酸がＡｓｐに変化していることを
確認した。 Ｔ Ｎ −５５（１４１）ポリペプチドの等電点は５．
４±０．２であり、その脱アミド体ポリペプチドの等電
点は５．２±０．２と求められた。 参考例１ 形質発現プラスミドｐＨｌＰＨ３８３ａの構築ヒト イ
ンターロイキン１前駆体ポリペプチドをコードするクロ
ーン化ＣＤＮＡ（第８表参照）が組み込まれた組み換え
体プラスミドｐＨＬ４から、制限酵素ＰｓｔＩによる消
化にて、ｃＤＮＡ領域を切り出した。このクローン化ｃ
ＤＮＡから、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｓｔＮＩにて消化
し、第８表に示した塩基配列の第３９８〜８０８番目ま
でに相当するＤＮＡ断片を単離した。 このＤＮＡ断片に、下記の式［Ｆ］及び［Ｇｌで示され
る二種類の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターをＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。ここで得られた
ＤＮＡ断片を、ＳＤ−ＩＬ１断片という、但し、式［Ｆ
］の化学合成オリゴヌクレオチド アダプターとは、下
記式［ａ］〜〔８］で示される５種類のＤＮＡ断片を、
順次結合させて作製したＤＮＡアダプターである（以下
、化学合成りＮＡ［Ｆ］と記す）。 ５’−ＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣ［ａ］
３’−ＴＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＴ
Ｔ５’−ＧＴＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡ
［ｂ］３’−ＴＴＣＣＴ
ＣＣＡＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣ５’−ＴＴＡＴＧＴＣＡＴ
ＣＡＣＣＴＴＴＴＡＧ
［ｃ１３’−ＡＧＴＡＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＧＡＡＧ
Ｇ３’−ＣＴＡＧＴＡＧＴＴＴＡＴＧＣＴＴＡＡ式［Ｇ
ｌの化学合成オリゴヌクレオチドアダプターの塩基配列
は、次の通りである。 別途に、形質発現ベクターｐＥＰ３０２を、制限酵素旦
り立ＩとＢａｍＨＩにて消化し、大腸菌トリプトファン
プロモーター領域部分及びアンピシリン耐性遺伝子を含
む大きなりＮＡ断片（以下、ベクター断片という）を単
離した。このベクター断片と上記の５Ｄ−ＩＬＬ断片を
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることにより、
ヒト インターロイキン１ポリペプチド生産用の形質発
現プラスミドを構築した（第２図参照）。 この形質発現プラスミドをｐＨｌＰＨ３８３ａと名付け
た。 参考例２ 多 プラスミド ＨＩＰ３１２ＥＣの 築プラスミ
ドｐＢＲ３２２を、制限酵素ＡｖａｌとＰｖｕｎにて消
化し、得られた大きなりＮＡ断片（約３．７ ｋ ｂ
ｐ ＞を単離した。このＤＮＡ断片の両端を、ＤＮＡポ
リメラーゼＩ（クレノーフラグメント）及びｄＧＴＰ、
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを用いて平滑末端とした
のちＴ４ＤＮＡリガーゼにて結合させ、ｐＢＲ３２２の
複製開始点近傍のコピー数制御領域を欠失させたプラス
ミドベクター（ｐＢＲＳ６という）を作製した。 このプラスミドベクターｐＢＲ３６を、制限酵素Ｆ、ｃ
ｏＲＩにて消化し、直鎖状ＤＮＡとしたのち、その両端
をＤＮＡポリメラーゼエ（クレノーフラグメント）及び
ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを用いて平滑
末端とした。このＤＮＡ断片の両端に、下記式［Ｈ］で
示されるオリゴヌクレオチド リンカ−をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合させた。 化学合成リンカ−の塩基配列は、次の通りである。 ５′−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３°
［Ｈ］次いで、得られたＤＮＡ断片を制限酵素Ｐｓｔ工
とＸｈｏＩにより消化し、テトラサイクリン耐性遺伝子
を含む大きなりＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を
、ｐＢＲ８６−断片という。 別途、参考例１に記載した組み換え体プラスミドｐＨｌ
ＰＨ３８３ａを、制限酵素Ｐｓｔ Ｉ とＸｈｏＩに
より消化し、ヒト インターロイキン１ポリペプチドを
コードする領域を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮ
Ａ断片を、上記のｐＢＲ８６−断片と結合させることに
より、テトラサイクリン耐性遺伝子を有するヒト イン
ターロイキン１ポリペプチド生産用形質発現プラスミド
を構築した（第３図参照）。 この形質発現プラスミドをｐＨＩ Ｐ３１２ＥＣと名付
けた。 （以下余白） 第８表 ヒトインターロイキン１（α型）前駆体ポリペプチドを
゛コードするｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列 ＡＴＧＧＣＣＡＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴＴＴＧ
ＡＡＧＡＣ（３０）ＣＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＴＴＡＣＡ
ＧＴＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡ’Ａ （６０）ＧＡＣＡＧ
ＴＴＣＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＣＡＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧ
（９０）ＡＡＴＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣＴＡＴＣＡ
ＴＧＴＡＡＧＣＴＡＴ （１２０）ＧＧＣＣＣＡＣＴＣ
ＣＡＴＧＡＡＧＧＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＣＡＡ （１５
０）ＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＴＡＴＣＴＣＴＧＡ
ＡＡＣＣＴＣＴ （１８０）ＡＡＡＡＣＡＴＣＣＡＡＧ
ＣＴＴＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣ（２１０）Ｌｓ
ｕＬｙｓＬｙｓＡｒｇＡｒｇＬｅｕＳｅ ｒＬｅｕｓｅ
ｒＧｌｎＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＴＧＡＧ
ＴＴＴＡＡＧＣＣＡＡ （２７０）ＴｈｒＶａｌＩｌｅ
ＬｅｕＡｒｇｌｌｅＳｓｒＬｙｓＴｈｒＧｌｎＡＣＣＧ
ＴＧＡＴＴＣＴＡＡＧＡＡＴＣＴＣＡＡＡＡＡＣ：ＴＣ
ＡＡ（５７０）ＬｅｕＴｙｒＶａｌＴｈｒＡｌａＧｌｎ
ＡｓｐＧｌｕＡｓｐＧｌｎＴＴＧＴＡＴＧＴＧＡＣＴＧ
ＣＣＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡＡ（６００）Ｐｒｏ
ＶａｌｌａｕＬｅｕＬｙｇＧｌｕＭｅｔＰｒｏＧｌｕＩ
ｌｅＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＣＣ
ＴＧＡＧＡＴＡ（６３０）ＰｒｏＬｙｓＴｈｒｌｌｅＴ
ｈｒＧｌｙＳｅｒＧｌｕＴｈｒＡｇｎＣＣＣＡＡＡＡＣ
ＣＡＴＣＡＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＡＣＣＡＡＣ（６６
０）ＬｅｕＬｅｕＰｈｅＰｈｅＴｒｐＧｌｕＴｈｒＨ１
ｓＧ１ｙＴｈｒＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＡ八
ＡＣＴＣＡＣＧＧＣＡＣＴ（６９０）ＬｙｓＡｓｎＴｙ
ｒＰｈｅＴｈｒＳｅｒＶａｌＡｌａＨｌｓＰｒ。 ＡＡＧＡＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＡＴＣＡＧＴＴＧＣＣＣ
ＡＴＣＣＡ（７２０）ＡｓｎＬｅｕＰｈｅｌｌｅＡｌａ
ＴｈｒＬｙｓＧｌｎＡｓｐＴｙｒＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡ
ＴＴＧＣＣＡＣＡＡＡＧＣＡＡＧＡＣＴＡＣ（７５０）
ＴｒｐＶａｌＣｙｓＬｅｕＡｌａＧｌｙＧｌｙＰｒｏＰ
ｒｏＳｅｒＴＧＧＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＧＧ
ＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴ（７８０）１１ｅＴｈｒＡｓｐＰ
ｈｅＧｌｎ１１ｅＬｓｕＧｌｕＡｓｎＧ１ｎＡＴＣＡＣ
ＴＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＧ
（８１０）Ａｌｉ＊＊＊ ＣＧＴＡＧ 零本本は、翻訳終止コドンを意味する。 （以下余白）
した。陰性対照には、供試試料のかわりに５％ウシ胎児
血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を添加した系におけ
るマウスの胸！！細胞培養時の［３Ｈ］−チミジン取り
込み量を示した。第６表に示すごとく、強いリンパ球活
性化作用を認めた。 （以下余白） 第６表 陰性対照 ６．７４０ （２）プロスタグランジンＥ２産生誘導能ＴＮ−５５ポ
リペプチドのヒト骨肉腫細胞ＭＧ−６３細胞（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃａ１ｌ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
ＣＲＬ１４２７）を標的細胞とするプロスタグランジ
ンＥ２産生誘導能を、前記のリンパ球活性化作用の測定
に用いた同じ試料原液を用い、以下の方法に従って測定
した。即ち、ＴＮ−５５ポリペプチド溶液を１０％０％
ウシ胎清、非必須アミノ酸及びピルビン酸ナトリウムを
含む組織培養用培地ＭＥＭア−ル液（Ｆｌｏｗ Ｌａｂ
ｓ、）にて希釈した。 各希釈液の１００μｍを２４穴
平底型プレートの各ウェルに注入し、更に各ウェル当り
約２万個のＭＧ−６３細胞を含む細胞懸濁液の４００μ
ｌを添加して、５％炭酸ガス含有空気中３７℃で４８時
間培培養た。培養終了後、培養上清を採取しその上清中
のプロスタグランジンＥ２含量を、ＲＩＡキット（Ｅ、
１．ｄｕＰｏｎｔ ｄａ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏ
、 、 米国）を用いて測定した。陰性対照には、供
試試料のかわりに上記の培養液を添加した系におけるＭ
Ｇ−６３細胞の培養上清中のプロスタグランジンＥ２ｆ
ｆｉを示した。 第７表に示すごとく、プロスタグランジンＥ２産生誘導
能は殆ど認められなかった。 第７表 の最終希釈倍数 産生遊離量（ｎｇ／ｍ１）５００
０、３６ ５、８００ ０．３０ ５０、０００ ０．１Ｂ ５００、０００ ０．１Ｂ ５、０００．８００ ０．２１５０、０００
．０００ ０．１Ｂ陰性対照
０．１８ 以上の結果から、ＴＮ−５５ポリペプチドは、強いリン
パ球活性化作用を発揮する量においても、有意なプロス
タグランジンＥ２産生誘導能は認められず、極めて特徴
的な特性を有するポリペプチドであることが証明された
。 尚、本明細書では記載の簡略化のなめに以下の略号を使
用する。 Ａ アデニン Ｃシトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン ＤＮＡ デオキシリボ核酸 ＣＤＮＡ 相補ｃＤＮＡ ＲＮＡ リボ核酸 ｍＲＮＡ 伝令ＲＮＡ ＡＴＰ アデノシン三リン酸 ｄＡＴＰ デオキシアデノシン三リン酸ｄＣＴＰ
デオキシシチジン三リン酸ｄＧＴＰ デオキシ
グアノシン三リン酸ｄＴＴＰ デオキシチミジン三
リン酸ｂｐ 塩基対 ｋｂｐ キロ塩基対 ｋＤ キロダルトン ＳＤＳ ラウリル硫酸ナトリウム以下に実施例を
挙げて本発明を更に具体的に説明する。。 （以下余白） 実施例Ｉ ＴＮ−５５ボ１ペプ ドの 口 前記第４表の式［ＩＶ］で示されるアミノ酸配列を有す
るＴＮ−５５ポリペプチドを以下の方法で製造した。 （１）形質発現プラスミドの構築 参考例２に記載の組み換え体プラスミドｐＨＩＰ３１２
ＥＣを出発材５料として用い、このプラスミドＤＮＡ中
のヒトインターロイキン１ポリペプチドのＣ末端から第
９番目のアミノ酸（Ａｓｐ）をコードするコドン（Ｇ
Ａ Ｃ）を、クンケルらの方法（Ｋｕｎｋｅ ｌ 、
Ｔ、 Ａ、ら、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、、 １５４巻。 ３６７頁、 １９８７年）に準じた部位特異的変異誘導
法によりチロシンに対応するコドンＴＡＣに変換するこ
とにより、ＴＮ−５５ポリペプチド生産用の形質発現プ
ラスミド（ｐＨＴＮ５５）を構築した。 その構築方法は以下のとおりであり、部位特異的変異誘
導には、ＭｔｌＴＡ−ＧＥＮＥインビトロムタジェネシ
スキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｓ、 、米国）を用
いた。 即ち、プラスミドｐＨＩＰ３１２Ｅｃを制限酵素ｐｖｕ
Ｉ［とＨｉｎｄｎＩにて消化し、ヒト インターロイキ
ン１ポリペプチドをコードする領域及び大腸菌トリプト
ファンプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を単離した。 このＤＮＡ断片を、Ｍ１３ｍｐ１９ベクターの制限酵素
ＨｉｎｄｍとＨｉｎｃｌｌ認識部位間に挿入した。この
組み換え体ＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０５株に感染させ、こ
れを培養して該ファージを採取した０次いで、このファ
ージを大腸菌ＣＪ２３６株に感染させるとともに、ウリ
ジン（１μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（２０
）ｔ ｇ／ｍｌ）を含有する２ Ｘ Ｔ Ｙ培地［組成
：１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％塩化
ナトリウム］中、３７℃で５時間培養し、その培養上清
からファージＤＮＡを精製分離した。培養容量１０ｍ１
当り、約２μｇのファージＤＮＡが得られた。 別途、下記式［Ｂ］、で示される塩基配列のオリゴデオ
キシリボヌクレオチドを常法に従って化学合成した。 ５°−ＣＴＡＴＣＡＣＴＴＡＣＴＴＴＣＡ−３′［Ｂ］
この塩基配列は、第８表の塩基配列において第７８７番
目の塩基を除いて、第７７９〜７９４番目の配列と一致
する。この化学合成りＮＡを変異誘導プライマーという
。 この変異誘導プライマーの５′末端にリン酸基を付加し
、このプライマーを先に調製したファージＤＮＡとアニ
ール［ｒ液［組成：２ｍＭ塩化マグネシウム及び５０ｍ
Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）］中、７０℃で１０分間反応させのち、１分
間に１℃の割合で３０℃まで徐々に冷却し、ブライマー
をファージＤＮＡに結合させた０次いで、Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼ！及びＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてｄＧＴＰ
、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びＡＴＰ等の存在下
で、ファージＤＮＡに対して相補的なりＮＡを合成し環
状二本ｆｉＤＮＡとした。これを大腸菌ＪＭ１０５株に
感染させ、各クローンについてそれぞれ培養し、その培
養菌体から複製型二本鎖ＤＮＡを単離した。その塩基配
列は、培養上清から単離した単鎖ＤＮＡを用いて蛋白翻
訳領域を中心に塩基配列を決定し、ＴＮ−５５ポリペプ
チドをコードする塩基配列を有していることを確認した
０次いで、複製型二本鎖ＤＮＡから制限酵素ＨｐａＩと
ＸｈｏＩによる消化にて、該蛋白翻訳領域を含むＤＮＡ
断片を切り出した。このＤＮＡ断片を、ＴＮ−５５ＤＮ
Ａ断片という。 別途、参考例１に記載の組み換え体プラスミドｐＨｌＰ
Ｈ３８３ａから制限酵素旦Ｊ２ｊ−Ｉ とＸｈｏＩ
を用いて、アンピシリン耐性遺伝子及び複製開始点を含
む大きなりＮＡ断片を切り出し、これを上記のＴＮ−５
５ＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させる
ことにより、形質発現プラスミドｐ ＨＴＮ ５５を構
築した。 この形質発現プラスミドｐ ＨＴＮ ５５を、次の方法
に従って大腸菌Ｈ８１０１株に導入し形質転換体を作製
した。即ち、大腸菌Ｈ８１０１株をＬＢ培地［組成：１
％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウ
ム（ｐ）（７，５）］に接種し、３０℃で一夜培養した
。その菌体懸濁液の１ｍｌを１００ｍ１のＬＢ培地に接
種し、濁度（波長６００ｎｍの吸光度）が約０．６に達
するまで、３０℃で培養した。この培養液を氷水中で３
０分間静置したのち、遠心分離にて菌体を採取した。 この菌体を５０ｍ１の５０ｍＭ塩化カルシウム液中に再
懸濁させ、氷水中で６０分間静置したのち、遠心分離に
て菌体を採取し２０％グリセリンを含む５０ｍＭ塩化カ
ルシウム液の１０ｍ１に懸濁させた。この懸濁液に上記
の形質発現プラスミドｐＨＴＮ５５を添加し、氷水中で
２０分間、室温で１０分間反応させたのち、ＬＢ培地を
添加して３７℃で６０分間振盪培養した。その菌体懸濁
液の一定量を、２５μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンを含
むＬＢ寒天平板（寒天濃度１．５％）に播き、３７℃で
一夜培養し、アンピシリン耐性クローンを得た。このア
ンピシリン耐性クローン、即ち形質転換体をＨＢＩＯＩ
／ｐ）（ＴＭ０１と名付け、ＴＮ−５５ポリペプチドの
生産菌とした。 （２）ＴＮ−５５ポリペプチドの製造 第１項で得たＴＮ−５５ポリペプチド生産菌ＨＢ１０ｔ
／Ｐ）ＩＴＮ５５を、ＬＢ培地にて３７℃で−後培養し
たのち、その菌体懸濁液を約１００倍量の栄養培地［組
成：１．５％リン酸二ナトリウム・１２水塩、０．３％
リン酸−カリウム、０．１％塩化アンモニウム、２ ｍ
ｇ ／ １ビタミンＢ１．０．５％カザミノ酸、２ｍ
Ｍ硫酸マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、１％
トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム
、０．４％グリセリン］に接種し、更にインドール−３
−アクリル酸を最終濃度２０μｇ ／ ｍ １になるよ
うに添加したのち２８時間培養した。菌体を遠心分離に
より採取し、０．１％リゾチーム及び３０ｍＭ塩化ナト
リウムを含む５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ Ｈ８，０
）に懸濁させた。氷水中で３０分間靜靜置たのちドライ
アイス／エタノール浴での凍結と３７℃での融解を繰り
返して菌体を破壊した。 これに１１５０容量の１０％ポリエチレンイミンを加え
て静置ののち遠心分離にて菌体残金等を除いた抽出液を
得た。この抽出液に硫酸アンモニウムを最終７０％飽和
になるように添加し、静置ののち遠心分離により沈澱を
採取した。この沈澱を蒸留水に溶解させ、５ｍＭリン酸
塩緩衝化生理食塩液（ｐＨ６，５）［以下、ＰＢＳと記
す］に対して透析したのちセファクリルＳ−２００カラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を用いるゲル
沢過に付した９分子量約１５〜２０ｋＤの溶出位置に相
当する画分からＴＮ−５５ポリペプチドを含む溶出液を
爪め、これを予めＰＢＳにて平衡化したＤＥＡＥ−セフ
ァロースＣＬ−６Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負
荷し、ＰＢＳにてカラムを洗浄した。同カラムに吸着し
たＴＮ−５５ポリペプチドを、ＰＢＳ中０〜０．５Ｍの
塩化ナトリウム濃度勾配にて溶出したところ、ＴＮ−５
５ポリペプチドの計算分子量と一致する分子量を有する
ポリペプチドが、二分画に分離されて溶出された。低濃
度の塩化ナトリウムで溶出された画分をＴＮ−５５（ａ
）ポリペプチド画分と名付け、より高い塩化ナトリウム
濃度で溶出された画分をＴＮ−５５（ｂ）ポリペプチド
画分と名付けた。 ＴＮ−５５（ａ）ポリペプチド画分をＰＢＳに対して透
析したのち、予めＰＢＳにて平衡化したＳ−セファロー
スファーストフローカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負
荷し、ＰＢＳにてカラムを洗浄し、次いでＰＢＳ中０〜
０．２５Ｍの塩化ナトリウム濃度勾配にて溶出した。Ｔ
Ｎ−５５（ａ）ポリペプチド画分を集め限外濾過にて濃
縮したのち、トヨパールＨＷ−５５カラム（東ソー）を
用いるゲル濾過により精製し、最終的に５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動分析にて不純物を認めない高
度精製品を得た。 ここで得たＴＮ−５５（ａ）ポリペプチド画分から精製
分離したポリペプチドを、前記試験例（１）及び（２）
に供した。 前記試験例の結果等により、このポリペプチドが目的と
するＴ没−５５ポリペプチドであると結論された。 実施例２ ＴＮ−５５ポリペプチドの脱アミド体の製造ＴＮ−５５
ポリペプチドのアミノ酸配列中、Ｎ末端から第３６番目
のアミノ酸がＡｓｐに変化したポリペプチド（Ｔ Ｎ
−５５Ａｓｐポリペプチドという）を以下の方法により
分離精製した。 実施例１第２項に記載したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ
−６Ｂカラムクロマトグラフィーにおいて、より高い塩
化ナトリウム濃度で溶出されたＴＮ−５５（ｂ）ポリペ
プチド画分に含まれるポリペプチドを、実施例１第２項
記載の方法に準じて精製した。即ち、Ｓ−セファロース
ファーストフローカラムクロマトグラフィー及びトヨ
パールＨＷ−５５カラムを用いるゲルー過により精製し
、高度精製品を得た。 このＴＮ−５５（ｂ）ポリペプチド画分から単離精製し
たポリペプチドのアミノ酸配列を、Ｎ末端から順次エド
マン分解法により分析したところ、本ポリペプチドのＮ
末端から４０番目までのアミノ酸配列は、次のとおりで
あった。 ＳｅｒＳｅｒＰｒｏＰｈｅＳｅｒＰｈｅＬｅｕＳｅｒＡ
ｓｎＶａｌＬｙｓＴｙｒＡｓｎＰｈｅＭｅｔＡｒｇＩｌ
ｅｌｌｅＬｙｓＴｙｒＧｌｕＰｈｅｌｌｅＬｅｕＡｓｎ
ＡｓｐＡｌａＬｅｕＡｓｎＧｌｎＳｅｒＩ ｌｅ Ｉ
ｌｅＡｒｇＡｌａＡｓｐＡｓｐＧｌｎＴｙｒＬ、ｅｕ即
ち、Ｎ末端から第３６番目のアミノ酸はＡｓｐと同定さ
れた。この結果から、このポリペプチド精製品は、ＴＮ
５５Ａｓｐポリペプチドであると結論された。尚、
このＴＮ−５５Ａｓｐポリペプチドの等電点は、等電点
電気泳動法により５．４±０．２と求められた。 実施例３ Ｔ Ｎ −５５（１４１）ポリペプチドの製造前記第３
表の式［Ｉ１１］に示したアミノ酸配列を有するポリペ
プチド（但し、第３表中のＸ ！、ｔＡｓｎであり、Ｙ
はＴｙｒである）、即ちＴＮ−５５ポリペプチドのアミ
ノ酸配列中、Ｎ末端から１４残基のへブチド及びＣ末端
から４残基のペプチドを欠失させたアミノ酸配列に対応
するポリペプチド［ＴＮ −５５（１４１）ポリペプチ
ドという］を以下の方法により分離精製した。 （１）形質発現プラスミドの構築 ヨーロッパ公開特許第０１８８９２０号に記載の方法で
得たヒト インターロイキン１前駆体ポリペプチドをコ
ードするクローン化ｃＤＮＡが組み込まれた組み換え体
プラスミドｐＨＬ４から、制限酵素ＰｓｔＩによる消化
にて、ｃＤＮＡ領域を切り出した。このｃＤＮＡがコー
ドするヒトインターロイキン１前駆体ポリペプチドのア
ミノ酸配列及びその塩基配列を第８表に示す、このクロ
ーン化ｃＤＮＡから、制限酵素ＥｃｏＲＩとｍ９６ Ｉ
による消化にて、第８表に示した塩基配列の第３９８〜
７６９番目までに相当するＤＮＡ断片を単離した。 このＤＮＡ断片に、下記の式［Ｃ］及び［Ｄ］で示され
る二種類の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターを７
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。 式［Ｃ］及び［Ｄ］の化学合成オリゴヌクレオチドアダ
プターの塩基配列は、次の通りである。 ここで得られたＤＮＡ断片を、Ｉ Ｌ １ （１４１）
ｌ！ｌｒ片という。 形質発現ベクターｐＥＰ３０２を、古谷らの方法（Ｆｕ
ｒｕｔａｎｉ、Ｙ、ら、 Ｎｕｃｌｅｌｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、、 １３巻、５８６９頁、 １９８５年）
に従って作製し、これを制限酵素ｍＩとＢａｍＨＩにて
消化し、大腸菌トリプトファンプロモーター領域部分及
びアンピシリン耐性遺伝子を含む大きなりＮＡ断片を単
離した。この断片に下記式［Ｅｌで示される化学合成オ
リゴヌクレオチドアダプターをＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて結合させた。 更に、この得られたＤＮＡ断片を、上記のＩＬ １ （
１４１）断片と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ
ることにより、ＴＮ−５５（１４１）ポリペプチド生産
用の形質発現プラスミドを構築した（図１参照）、この
形質発現プラスミドをｐＨＴＮ ５５ （１４１）と名
付けた。 （２） ＴＮ ５５ （１４１）ポリペプチドの製造
第１項で作製した形質発現プラスミドをｐＨＴＮ ５５
（１４１）を用いて実施例１に記載した方法に準じて
、形質転換体を作製し、その培養菌体よりＴ Ｎ −５
５（１４１）ポリペプチドを分離精製した。 得られたＴ Ｎ −５５（１４１）ポリペプチド精製品
について、そのＮ末端部分のアミノ酸配列をエドマン分
解法により分析した結果、そのＮ末端から第４０番目ま
でのアミノ酸配列は、次のとおりであり、前記第３表の
式［１１［］に示したアミノ酸配列と一致した（但し、
第３表中のＸはＡｓｎである）。 ＭａｔＡｒｇＩｌｅＩｌｅＬｙｓＴｙｒＧ１ｕＰｈｅＩ
ｌｅＬａｕＡｓｎＡｓｐＡ１ａＬｅｕＡｓｎＧ１ｎＳｅ
ｒｌｌｅＩｌｅＡｒｇＡ１ａＡｓｎＡｓｐＧｌｎＴｙｒ
ＬｅｕＴｈｒＡ１ａＡｌａＡ１ａＬｅｕＨ３５ＡｓｎＬ
ｅｕＡｓｐＧ１ｕＡ１ａＶａ ＩＬｙｓＰｈｅまた、カ
ルボキシペプチダーゼ酵素分解及びアミノ酸分析の結果
では、ロイシンが検出された。 このＴ Ｎ −５５（１４１）ポリペプチドの精製過程
中、実施例２に示したと同様により酸性側の等電点を有
する脱アミド体の存在を１ｉｉ認した。その脱アミド体
ポリペプチドのアミノ酸配列分析の結果から、Ｎ末端か
ら第２２番目のアミノ酸がＡｓｐに変化していることを
確認した。 Ｔ Ｎ −５５（１４１）ポリペプチドの等電点は５．
４±０．２であり、その脱アミド体ポリペプチドの等電
点は５．２±０．２と求められた。 参考例１ 形質発現プラスミドｐＨｌＰＨ３８３ａの構築ヒト イ
ンターロイキン１前駆体ポリペプチドをコードするクロ
ーン化ＣＤＮＡ（第８表参照）が組み込まれた組み換え
体プラスミドｐＨＬ４から、制限酵素ＰｓｔＩによる消
化にて、ｃＤＮＡ領域を切り出した。このクローン化ｃ
ＤＮＡから、制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｓｔＮＩにて消化
し、第８表に示した塩基配列の第３９８〜８０８番目ま
でに相当するＤＮＡ断片を単離した。 このＤＮＡ断片に、下記の式［Ｆ］及び［Ｇｌで示され
る二種類の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターをＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。ここで得られた
ＤＮＡ断片を、ＳＤ−ＩＬ１断片という、但し、式［Ｆ
］の化学合成オリゴヌクレオチド アダプターとは、下
記式［ａ］〜〔８］で示される５種類のＤＮＡ断片を、
順次結合させて作製したＤＮＡアダプターである（以下
、化学合成りＮＡ［Ｆ］と記す）。 ５’−ＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣ［ａ］
３’−ＴＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＴ
Ｔ５’−ＧＴＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＡ
［ｂ］３’−ＴＴＣＣＴ
ＣＣＡＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣ５’−ＴＴＡＴＧＴＣＡＴ
ＣＡＣＣＴＴＴＴＡＧ
［ｃ１３’−ＡＧＴＡＧＴＧＧＡＡＡＡＴＣＧＡＡＧ
Ｇ３’−ＣＴＡＧＴＡＧＴＴＴＡＴＧＣＴＴＡＡ式［Ｇ
ｌの化学合成オリゴヌクレオチドアダプターの塩基配列
は、次の通りである。 別途に、形質発現ベクターｐＥＰ３０２を、制限酵素旦
り立ＩとＢａｍＨＩにて消化し、大腸菌トリプトファン
プロモーター領域部分及びアンピシリン耐性遺伝子を含
む大きなりＮＡ断片（以下、ベクター断片という）を単
離した。このベクター断片と上記の５Ｄ−ＩＬＬ断片を
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させることにより、
ヒト インターロイキン１ポリペプチド生産用の形質発
現プラスミドを構築した（第２図参照）。 この形質発現プラスミドをｐＨｌＰＨ３８３ａと名付け
た。 参考例２ 多 プラスミド ＨＩＰ３１２ＥＣの 築プラスミ
ドｐＢＲ３２２を、制限酵素ＡｖａｌとＰｖｕｎにて消
化し、得られた大きなりＮＡ断片（約３．７ ｋ ｂ
ｐ ＞を単離した。このＤＮＡ断片の両端を、ＤＮＡポ
リメラーゼＩ（クレノーフラグメント）及びｄＧＴＰ、
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを用いて平滑末端とした
のちＴ４ＤＮＡリガーゼにて結合させ、ｐＢＲ３２２の
複製開始点近傍のコピー数制御領域を欠失させたプラス
ミドベクター（ｐＢＲＳ６という）を作製した。 このプラスミドベクターｐＢＲ３６を、制限酵素Ｆ、ｃ
ｏＲＩにて消化し、直鎖状ＤＮＡとしたのち、その両端
をＤＮＡポリメラーゼエ（クレノーフラグメント）及び
ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを用いて平滑
末端とした。このＤＮＡ断片の両端に、下記式［Ｈ］で
示されるオリゴヌクレオチド リンカ−をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて結合させた。 化学合成リンカ−の塩基配列は、次の通りである。 ５′−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３°
［Ｈ］次いで、得られたＤＮＡ断片を制限酵素Ｐｓｔ工
とＸｈｏＩにより消化し、テトラサイクリン耐性遺伝子
を含む大きなりＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を
、ｐＢＲ８６−断片という。 別途、参考例１に記載した組み換え体プラスミドｐＨｌ
ＰＨ３８３ａを、制限酵素Ｐｓｔ Ｉ とＸｈｏＩに
より消化し、ヒト インターロイキン１ポリペプチドを
コードする領域を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮ
Ａ断片を、上記のｐＢＲ８６−断片と結合させることに
より、テトラサイクリン耐性遺伝子を有するヒト イン
ターロイキン１ポリペプチド生産用形質発現プラスミド
を構築した（第３図参照）。 この形質発現プラスミドをｐＨＩ Ｐ３１２ＥＣと名付
けた。 （以下余白） 第８表 ヒトインターロイキン１（α型）前駆体ポリペプチドを
゛コードするｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列 ＡＴＧＧＣＣＡＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴＴＴＧ
ＡＡＧＡＣ（３０）ＣＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＴＴＡＣＡ
ＧＴＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡ’Ａ （６０）ＧＡＣＡＧ
ＴＴＣＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＣＡＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧ
（９０）ＡＡＴＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣＴＡＴＣＡ
ＴＧＴＡＡＧＣＴＡＴ （１２０）ＧＧＣＣＣＡＣＴＣ
ＣＡＴＧＡＡＧＧＣＴＧＣＡＴＧＧＡＴＣＡＡ （１５
０）ＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＴＡＴＣＴＣＴＧＡ
ＡＡＣＣＴＣＴ （１８０）ＡＡＡＡＣＡＴＣＣＡＡＧ
ＣＴＴＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣ（２１０）Ｌｓ
ｕＬｙｓＬｙｓＡｒｇＡｒｇＬｅｕＳｅ ｒＬｅｕｓｅ
ｒＧｌｎＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＧＧＴＴＧＡＧ
ＴＴＴＡＡＧＣＣＡＡ （２７０）ＴｈｒＶａｌＩｌｅ
ＬｅｕＡｒｇｌｌｅＳｓｒＬｙｓＴｈｒＧｌｎＡＣＣＧ
ＴＧＡＴＴＣＴＡＡＧＡＡＴＣＴＣＡＡＡＡＡＣ：ＴＣ
ＡＡ（５７０）ＬｅｕＴｙｒＶａｌＴｈｒＡｌａＧｌｎ
ＡｓｐＧｌｕＡｓｐＧｌｎＴＴＧＴＡＴＧＴＧＡＣＴＧ
ＣＣＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡＡ（６００）Ｐｒｏ
ＶａｌｌａｕＬｅｕＬｙｇＧｌｕＭｅｔＰｒｏＧｌｕＩ
ｌｅＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＣＣ
ＴＧＡＧＡＴＡ（６３０）ＰｒｏＬｙｓＴｈｒｌｌｅＴ
ｈｒＧｌｙＳｅｒＧｌｕＴｈｒＡｇｎＣＣＣＡＡＡＡＣ
ＣＡＴＣＡＣＡＧＧＴＡＧＴＧＡＧＡＣＣＡＡＣ（６６
０）ＬｅｕＬｅｕＰｈｅＰｈｅＴｒｐＧｌｕＴｈｒＨ１
ｓＧ１ｙＴｈｒＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＡ八
ＡＣＴＣＡＣＧＧＣＡＣＴ（６９０）ＬｙｓＡｓｎＴｙ
ｒＰｈｅＴｈｒＳｅｒＶａｌＡｌａＨｌｓＰｒ。 ＡＡＧＡＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＡＴＣＡＧＴＴＧＣＣＣ
ＡＴＣＣＡ（７２０）ＡｓｎＬｅｕＰｈｅｌｌｅＡｌａ
ＴｈｒＬｙｓＧｌｎＡｓｐＴｙｒＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡ
ＴＴＧＣＣＡＣＡＡＡＧＣＡＡＧＡＣＴＡＣ（７５０）
ＴｒｐＶａｌＣｙｓＬｅｕＡｌａＧｌｙＧｌｙＰｒｏＰ
ｒｏＳｅｒＴＧＧＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＣＡＧＧＧＧＧ
ＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴ（７８０）１１ｅＴｈｒＡｓｐＰ
ｈｅＧｌｎ１１ｅＬｓｕＧｌｕＡｓｎＧ１ｎＡＴＣＡＣ
ＴＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＧ
（８１０）Ａｌｉ＊＊＊ ＣＧＴＡＧ 零本本は、翻訳終止コドンを意味する。 （以下余白）
第１図は、形質発現プラスミドｐ ＨＴＮ ５５（１４
１）の構築工程を示す０図中の合成りＮＡアダプター［
Ｃ］、［Ｄ］及び［Ｅ］は、実施例３に記載した化学合
成オリゴヌクレオチドアダプターである。 第２図は、形質発現プラスミドｐ ＨＩ Ｐ Ｈ３８３
ａの構築工程を示す１図中の合成りＮＡアダプター［Ｆ
］と［Ｇ］は、参考例１に記載した化学合成オリゴヌク
レオチドアダプターである。 第３図は、形質発現プラスミドｐＨＩ Ｐ３１２ＥＣの
構築工程を示す０図中の合成りＮＡリンカ−［Ｈ］は、
参考例２に記載した化学合成オリゴヌクレオチド リン
カ−である。 特許出願人 大日本製薬株式会社
１）の構築工程を示す０図中の合成りＮＡアダプター［
Ｃ］、［Ｄ］及び［Ｅ］は、実施例３に記載した化学合
成オリゴヌクレオチドアダプターである。 第２図は、形質発現プラスミドｐ ＨＩ Ｐ Ｈ３８３
ａの構築工程を示す１図中の合成りＮＡアダプター［Ｆ
］と［Ｇ］は、参考例１に記載した化学合成オリゴヌク
レオチドアダプターである。 第３図は、形質発現プラスミドｐＨＩ Ｐ３１２ＥＣの
構築工程を示す０図中の合成りＮＡリンカ−［Ｈ］は、
参考例２に記載した化学合成オリゴヌクレオチド リン
カ−である。 特許出願人 大日本製薬株式会社
Claims (6)
- （１）下記式［ I ］で示されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチド又はそのＮ末端側の１ 〜１４個のアミノ酸及び／又はＣ末端側の １〜４個のアミノ酸が欠失したポリペプチ ド。 【遺伝子配列があります】 式［ I ］ 式中ＷはＳｅｒ又はＡｌａを意味し、ＸはＡｓｎ又はＡ
ｓｐを意味し、ＹはＡｓｐ以外のアミノ酸を意味する。 - （２）下記式［III］で示されるアミノ酸配列を有する
ポリペプチド。 【遺伝子配列があります】 式［III］ 式中ＸはＡｓｎ又はＡｓｐを意味し、ＹはＡｓｐ以外の
アミノ酸を意味する。 - （３）特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の式［
I ］又は［III］で示されるアミノ酸 配列中、ＹがＴｙｒであるアミノ酸配列を有するポリペ
プチド。 - （４）下記式［II］で示されるアミノ酸配列を有するポ
リペプチド又はそのＮ末端側の１ 〜３個のアミノ酸及び／又はＣ末端側の１ 〜３個のアミノ酸欠失したポリペプチド。 【遺伝子配列があります】 式［II］ 式中Ｚは、Ａｓｐ以外のアミノ酸を意味する。 - （５）特許請求の範囲第１項〜４項のいずれかに記載の
ポリペプチドをコードするＤＮＡ。 - （６）特許請求の範囲第５項記載のＤＮＡを組み込んだ
細胞を培養することを特徴とする 特許請求の範囲第１項〜４項記載のポリペ プチドの製造法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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