JPH0560480B2

JPH0560480B2 -

Info

Publication number: JPH0560480B2
Application number: JP60112474A
Authority: JP
Inventors: Masaaki Yamada; Taiji Furuya; Michiko Yamayoshi; Mitsue Notake; Junichi Yamagishi
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 1985-05-24
Filing date: 1985-05-24
Publication date: 1993-09-02
Also published as: JPS61271222A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はヒトインターロイキン１ポリペプチ
ド及びその製造法に関する。ゲリーらはヒト
マイクロフアージの培養上清中に、マイトーゲン
によるマウス胸腺細胞分裂作用を促進させる物質
を見い出し、これをリンパ球活性化因子
（lymphocyte activating factor、以下LAFと略
記する）と名付けたが、1979年以降、インターロ
イキン１（以下、IL−１と略記する）の名称が用
いられている。従つて本明細書においてもこのよ
うな物質をインターロイキン１として扱う。 IL−１はＴ細胞やＢ細胞の増殖分化を促進さ
せ、またＴ細胞に作用してリンホカイン、特にイ
ンターロイキン２（Ｔ細胞増殖因子）の産生を促
進させる効果を有し、抗体産生や細胞性免疫の調
節に重要な役割を果たす因子の一つと考えられて
いる［Staruch，M.J.，et al.，J.Immunol.130，
2191（1983）］。その他、プロスタグランジンＥや
コラゲナーゼの産生促進、繊維芽細胞の増殖促
進、又はインターロイキン２やインターフエロン
の有するNK（ナチユラルキラー）細胞活性化
作用を増強させる効果があると報告されている
［Simon，P.L.，et al.，“ymphokines”vol.6，
p.47（1982）Academic Press Inc.］。このようにIL−１は免疫応答のみならず、生
体の防御やその修復等にも関与する生体物質であ
り、免疫不全症に対する治療薬や抗腫瘍剤として
の臨床応用が期待されている。 IL−１のこれまでの取得方法は、主としてマ
イクロフアージや末梢単核細胞又はマイクロフア
ージ様株化細胞（例えばマウスP388D₁細胞）や
単球性又は骨髄性白血病細胞等を適当な誘導剤の
存在下で培養し、その培養上清中より単離するも
のである。ヒトIL−１は、ヒト単球性白血病株化細胞で
あるU937細胞及びヒト末梢単核細胞の培養上清
から分離精製され、その分子量が11300及び15000
ダルトンであると報告されている。［Mizel，S.B.，et al.，J.Immunol.131，1834
（1983）；Schmidt，J.A.，J.Exp.Med.160，772
（1984）］。最近、マウスP388D₁細胞を用いマウスIL−１
ポリペプチドをコードするcDNAをクローニング
し、IL−１活性を有する156個のアミノ酸から成
るポリペプチドを大腸菌で生産させることに成功
したと報告されている［Lomedico P.T.et al.，
Nature，312，458（1984）］。また、ヒトIL−１に
関しては、ヒト単核球を用いヒトIL−１ポリペ
プチドをコードするcDNAがクローニングされて
いる［Auron，P.E.et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.
USA 81，7907（1984）］。上記のマウスIL−１ポ
リペプチド及びヒトIL−１ポリペプチドをそれ
ぞれコードするDNAの塩基配列の間には相同性
が認められず、複数のIL−１の存在の可能性が
示唆された。本発明者らは、遺伝子組み換え技術を応用して
ヒトIL−１ポリペプチドを製造すべく鋭意研究
の結果、ヒトHL−60細胞を用いてヒトIL−１前
駆体ポリペプチドをコードするクローン化cDNA
の単離に成功し、このクローン化DNAに由来す
るDNAを組み込んだ組み換えプラスミドで形質
転換された微生物中で、上記公知のヒトIL−１
ポリペプチドとアミノ酸配列を全く異にする新た
なヒトIL−１ポリペプチドを生産させることに
成功すると共に、不純物を実質的に含有しないヒ
トIL−１ポリペプチドを単離することに成功し、
本発明を完成した。本発明は、ヒトIL−１ポリペプチド、すなわ
ち下記のアミノ酸配列を有するヒトIL−１ポリ
ペプチド及びその製造法に関する。 Ser Ser Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn
Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg lle lle Lys
Tyr Glu Phe lle Leu Asn Asp Ala Leu
Asn Gln Ser lle lle Arg Ala Asn Asp Gln
Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn
Leu Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met
Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp Asp
Ala Lys lle Thr Val lle Leu Arg lle Ser
Lys Thr Gln Leu Tyr Val Thr Ala Gln
Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys
Glu Met Pro Glu lle Pro Lys Thr lle Thr
Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe
Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr
Phe Thr Ser Val Ala His Pro Asn Leu
Phe lle Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp
Val Cys Leu Ala Gly Gly Pro Pro Ser lle
Thr Asp Phe Gln lle Leu Glu Asn Gln
Ala ［］上記IL−１ポリペプチド［］自体をコード
するDNAの典型的な塩基配列は次に示す通りで
ある。（5′） TCA TCA CCT TTT AGC TTC
CTG AGC AAT GTG AAA TAC AAC
TTT ATG AGG ATC ATC AAA TAC
GAA TTC ATC CTG AAT GAC GCC
CTC AAT CAA AGT ATA ATT CGA
GCC AAT GAT CAG TAC CTC ACG
GCT GCT GCA TTA CAT AAT CTG
GAT GAA GCA GTG AAA TTT GAC
ATG GGT GCT TAT AAG TCA TCA
AAG GAT GAT GCT AAA ATT ACC
GTG ATT CTA AGA ATC TCA AAA
ACT CAA TTG TAT GTG ACT GCC
CAA GAT GAA GAC CAA CCA GTG
CTG CTG AAG GAG ATG CCT GAG
ATA CCC AAA ACC ATC ACA GGT
AGT GAG ACC AAC CTC CTC TTC
TTC TGG GAA ACT CAC GGC ACT
AAG AAC TAT TTC ACA TCA GTT
GCC CAT CCA AAC TTG TTT ATT
GCC ACA AAG CAA GAC TAC TGG
GTG TGC TTG GCA GGG GGG CCA
CCC TCT ATC ACT GAC TTT CAG
ATA CTG GAA AAC CAG GCG（3′）
［］本発明のポリペプチドの塩としては、該ポリペ
プチドのカルボキシル基又はアミノ基等とで形成
される塩、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、アルギニン、カフエイン、プロカイン、塩
酸、グルコン酸等との塩が挙げられる。本発明のポリペプチドは、会合体として存在し
得る場合もあり、このような会合体も本発明のポ
リペプチドに包含される。以下に本発明のポリペプチドをコードする
DNA並びに本発明のポリペプチドの製造法につ
いて述べる。ヒトIL−１前駆体ポリペプチドをコードする
塩基配列を有するDNAは、例えば後記参考例に
示した方法により単離することができる。このDNAを適当な制限酵素で切断したのち、
これと必要に応じて常法により合成したDNAア
ダプターとを結合することにより、IL−１ポリ
ペプチド［］をコードするDNA断片、すなわ
ちヒトIL−１ポリペプチド［］をコードする
DNA塩基配列の5′末端に開始コドンATG、3′末
端に終止コドンを有する塩基配列を含むDNA断
片を作製することができる。これを適当なプロモーター及びシヤイン・ダル
ガーノ（SD）配列に続いて結合させ、ベクター
に組み込むことにより、ポリペプチド［］生産
用の形質発現ベクターを得ることができる。プロモーターとしては、例えばlac，trp，tac，
phoS，phoA，PL，SV40初期プロモーター等が
挙げられる。ベクターとしては、形質転換させる
宿主中で増殖するものはすべて用いることができ
る。例えば、プラスミド（pBR322等）、フアー
ジ（λフアージ誘導体等）、ウイルス（SV40等）
が挙げられる。また、ランナウエイプラスミド
も有用である。これらの形質発現ベクターを適当な宿主、例え
ば大腸菌などに、例えばコーエンらの方法
［Proc.Nat.Acad.Sci.USA，69，2110（1972）］に
より導入することにより形質転換体を得、次いで
該形質転換体を培養することによりポリペプチド
［］或いはそのＮ末端にメチオニンが付加した
ポリペプチドを産生させることができる。該生産
物は使用したプロモーターと形質発現ベクターの
構築法により、宿主中の細胞質内又は細胞質外の
いずれにも蓄積させることができる。細胞質外に
分泌させるには、例えばアルカリホスフアターゼ
の構造遺伝子（phoA）やリン酸結合蛋白の構造
遺伝子（phoS）を用い、それらのシグナルペプ
チドをコードするDNAを結合させた形質発現ベ
クターを構築すればよい。このようにして得られた形質転換体を、それぞ
れの形質転換体に応じた適当な培養条件下で、目
的のポリペプチドが十分に産生されるまで培養し
たのち、培養物からポリペプチドを抽出する。産
生したポリペプチドが細胞質中に蓄積される場合
は、例えば、リゾチーム消化と凍結融解や超音波
破砕、フレンチプレス等により宿主細胞を破壊し
たのち、遠心分離又は濾過にて抽出液を集める。
また、ペリプラスムに蓄積される場合は、例えば
ウイルスキーらの方法［J.Bacteriol.，127，595
（1976）］に従つて抽出することができる。このようにして得られた粗製のポリペプチドは
蛋白質の一般的な精製法（限外濾過、透析、イオ
ン交換クロマトグラフイー、ゲル濾過、電気泳
動、アフイニテイクロマトグラフイー等）に従い
精製することにより、目的とするポリペプチドを
実質的に純品として得ることができる。本発明のポリペプチドの誘導体は、上記のよう
にして得られたポリペプチドを原料として、これ
に脂肪属アルコールを作用させ該ポリペプチドの
エステル体を、カルボン酸の反応性誘導体を作用
させ該ポリペプチドのＮ−アシル又はＯ−アシル
体を、第１アミン又は第２アミンを作用させ該ポ
リペプチドのアミド体を、それぞれ形成せしめる
ことができる。これらの反応は常法に従い行なわ
れる。さらには、本発明のポリペプチドに有機
酸、無機酸、塩基を常法により加えることにより
本発明のポリペプチドの酸又はアルカリ塩を形成
せしめることができる。次に、本発明のポリペプチド［］の特性につ
いて以下に詳述する。 (1) 物理化学的並びに化学的特性分子量分子量はドデシル硫酸ナトリウム（SDS）存在
下におけるポリアクリルアミドゲル（ゲル濃度
12.5％）電気泳動分析により測定した。ポリペプチド［］溶液を等容量の４％SDS、
10％２−メルカプトエタノール、20％グリセロー
ル及び0.02％ブロムフエノールブルーを含む
0.125M Tris−HCl緩衝液（PH6.8）と混合し、30
分間室温で放置後、SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動分析に付した。泳動用溶媒として0.1
％SDSを含む25mM Tris−0.2Mグリシン液を用
い、200ボルトで３時間電気泳動させた。泳動終
了後、クマシーブリリアントブルーG250を用い
る染色で蛋白質の泳動位置を、また別途にゲルを
２mm巾で切り出し各ゲル片を５％牛胎児血清を含
む組織培養用培地RPMI−1640（Flow I.abs.）に
浸漬し、ゲル中の蛋白質を抽出した。各ゲル片か
ら得たそれぞれの抽出液について後記するLAF
活性を指標としてIL−１活性を測定した。その
結果、分子量約18000±500の位置に単一の蛋白質
のバンドと一致して、IL−１活性を認めた。等電点等電点は、フアルマライト（フアルマシア社、
PH範囲４〜6.5）と５％ポリアクリルアミドを含
むフラツトゲルを用いる等電点電気泳動法にて測
定した。その結果、ポリペプチド［］の等電点は約
5.3±0.3であつた。泳動は５ワツトで３時間行つた。クマシーブリ
リアントブルーG250を用いる染色で蛋白質の
位置を、又ゲルを２mm巾に切り出し、20mM
Tris−HCl緩衝液（PH7.8）で抽出し、IL−１活
性を測定した。染色による蛋白質の位置と一致し
て強いIL−１活性を認めた。Ｎ末端部分アミノ酸配列Ｎ末端部分のアミノ酸配列をエドマン分解法
［Arch.Biochem.Biophys.22，475（1949）］により
決定した。ポリペプチド［］をフエニルイソチオシアネ
ートとカツプリング反応させ、次いでＮ末端アミ
ノ酸をチアゾリノン誘導体として切断し、さらに
フエニルチオヒダントインアミノ酸に変換した
のち、これをTSK−gel ODS−120Aカラム（東
洋曹達工業）を用いた高速液体クロマトグラフイ
ーにより同定した。この操作を順次繰り返すこと
により、Ｎ末端部分のアミノ酸配列を決定した。その結果、ポリペプチド［］のＮ末端部分の
アミノ酸配列は、Ser−Ser−Pro−Pbe……であ
つた。Ｃ末端部分アミノ酸配列Ｃ末端部分のアミノ酸配列はカルボキシペプチ
ダーゼを用いる酵素法により決定した。ポリペプチド［］にカルボキシペプチダーゼ
Ａ（シグマ社）及びカルボキシペプチダーゼＹ（オ
リエンタル酵母社）を作用させ、反応開始後から
２時間にわたり、経時的に遊離してくるアミノ酸
を微量アミノ酸分析システム（島津製作所）を用
いて定量した。その結果、ポリペプチド［］のＣ末端部分の
アミノ酸配列は、……Asx−Glx−Alaであつた。 GlxはGlu又はGlnを、AsxはAsp又はAsnを意
味する。 (2) IL−１活性 IL−１活性は、マイトーゲンによるマウス胸
腺細胞分裂作用を促進させる生物活性、すなわち
リンパ球活性化因子（LAF）活性により評価し
た。ポリペプチド［］の約40μｇ／ml溶液を５％
牛胎児血清を含む組織培養用培地RPMI−1640に
て希釈した。各希釈液の50μを96穴平底型プレ
ート（Flow Labs.）に入れ、それぞれに50μｇ／
ml濃度のフイトヘマグルチニン−Ｐ（Difco社）
の50μを添加し、更にC3H／Heマウスより採取
した胸腺細胞（１×10⁷個／ml）溶液の100μを
加え、37℃で５％炭酸ガス含有空気中、湿度90〜
100％で３日間培養した。次いで、³H−チミジン
の1μCiを加え、更に18時間培養したのち、細胞
内にとりこまれた³H−チミジン量を計測するこ
とにより、LAF活性を測定した。結果は表１に示す通りである。表１希釈倍数 ³H−チミジン取り込み量（cpm） 10⁵ 32746 10⁶ 14498 10⁷ 4206 10⁸ 2582 陰性対照 3210 本発明に係るポリペプチドおよびその誘導体
は、免疫不全治療剤又は抗腫瘍剤として用いられ
うる。本発明に係るポリペプチド及びその誘導体の製
剤化にあたつては、溶液及び凍結乾燥品のいずれ
でも良いが、長期安定性の点から凍結乾燥品が望
ましい。そして賦形剤や安定化剤を添加するのが
好ましい。安定化剤としては、例えばアルブミ
ン、グロブリン、ゲラチン、プロタミン、プロタ
ミン塩、グルコース、ガラクトース、キシロー
ス、マンニツト、グルクロン酸、トレハロース、
デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、非イ
オン界面活性剤（ポリオキシエチレン脂肪酸エス
テル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポ
リオキシエチレンアルキルフエニルエーテル、ポ
リオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポ
リオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポ
リオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチ
レンヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプ
ロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン
ポリオキシプロピレンブロツクポリマー、ソルビ
タン脂肪酸エステル、シヨ糖脂肪酸エステル、グ
リセリン脂肪酸エステル）等が挙げられる。これ
らの製剤は常法に従い製造することができる。本明細書では記載の簡略化のために以下の略号
を使用する。ＡアデニンＣシトシンＧグアニンＴチミン Ala アラニン Arg アルギニン Asn アスパラギン Asp アスパラギン酸 Cys システイン Gln グルタミン Glu グルタミン酸 Gly グリシン His ヒスチジン lle イソロイシン Leu ロイシン Lys リジン Met メチオニン Phe フエニルアラニン Pro プロリン Ser セリン Thr スレオニン Trp トリプトフアン Tyr チロシン Val バリン DNA デオキシリボ核酸 cDNA 相補DNA sscDNA 単鎖cDNA dscDNA 二重鎖cDNA RNA リボ核酸 mRNA 伝令RNA ポリ(A)mRNA
ポリアデニル酸含有伝令RNA dATP デオキシアデノシン三リン酸 dCTP デオキシシチジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸 dTTP デオキシチミジン三リン酸オリゴ（dC）オリゴデオキシシチジル酸オリゴ（dG）オリゴデオキシグアニル酸オリゴ（dT）オリゴデオキシチミジル酸ポリ(A) ポリアデニル酸ポリ（Ｕ）ポリウリジル酸ポリ（dA）ポリデオキシアデニル酸ポリ（dC）ポリデオキシシチジル酸ポリ（dG）ポリデオキシグアニル酸ポリ（dT）ポリデオキシチミジル酸 ATP アデノシン三リン酸 EDTA エチレンジアミン四酢酸 kb キロ塩基 kbp キロ塩基対 bp 塩基対以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に
具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に
限定されるものではない。また下記の実施例の理解を容易にするため第１
図を示した。実施例１ヒトIL−１ポリペプチド生産用形質転換体の作
製式［］で示されるアミノ酸配列を有するヒト
IL−１ポリペプチド生産用形質発現プラスミド
（PHLP383）を第１図に示すように構築した。すなわち、参考例１で得た組み換え体プラスミ
ドPHL4から制限酵素Pstによりクローン化
cDNA部分を切り出し、更に制限酵素Aluを作
用させ、第２表に示した塩基配列の第351番目か
ら下流側の約533bpのDNA断片を得、更にこれ
に制限酵素BstNを作用させ、第２表の塩基配
列の第351番から第808番までに相当するDNA断
片を単離した。このDNA断片に、常法により合
成した次式 5′−CGATTATGTCATCACCTTTTAG
［］ 3′−TAATACAGTAGTGGAAAATC 及び次式 5′−AGGCGTGATGA ［］ 3′−CCGCACTACTTCGA で示されるオリゴヌクレオチドアダプターを順
次T₄DNAリガーゼを用いて結合させることによ
り、ヒトIL−１ポリペプチド［］をコードす
る塩基配列の5′末端に開始コドンATGを付加し、
更に終止コドンTGATGAを付加したDNA断片
を得た。このDNA断片をHIL−１断片という。一方、プラスミドpCT−１［Ikehara，M.et
al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 81，5956（1984）］
に制限酵素HpaとAatを作用させtrpプロモ
ーター領域の一部を含む約380bpのDNA断片を
切り出し、このDNA断片に、常法により合成し
た次式 5′−
AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGG
ＴＴＡＴ［］ 3′−
TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCC
ＡＡＴＡＧＣで示されるオリゴヌクレオチドアダプターを
T₄DNAリガーゼを用いて結合させた。この結合DNA断片に、先に調製したHIL−１
断片をT₄DNAリガーゼを用いて結合させ、
DNA断片を得た。このDNA断片をプロモーター
HIL−１断片という。別途に、プラスミドpBR322に制限酵素Ava
とPvuを作用させ、大きなDNA断片（約
3.7kbp）を0.7％アガロースゲル電気泳動により
分離した。このDNA断片の両端をDNAポリメラ
ーゼ（クレノーフラグメント）及びdGTP，
dATP，dCTP，dTTPを用い平滑末端とし、そ
の両端をT₄DNAリガーゼを用いて結合させた。
このプラスミドベクターをpBRS6という。さら
に、このpBRS6ベクターに制限酵素Aatと
Hindを作用させ、大きなDNA断片（約
3.6kbp）を単離精製した。このDNA断片に先に調整したプロモーター
HIL−１断片をT₄DNAリガーゼを用いて結合さ
せることにより、ヒトIL−１ポリペプチド［］
生産用形質発現プラスミドを構築した。この形質
発現プラスミドをpHLP383と名づけた。この形質発現ベクター（pHLP383）を下記の
方法によりE.coli HB101に導入し形質転換体を
得た。すなわち、E.coli HB101をＬブロス（組
成：１当たり、トリプトン10ｇ、酵母エキス５
ｇ、NaCl5ｇ、ブドウ糖１ｇ；PH7.2）の５mlに
接種し、37℃で一夜培養した。その菌体懸濁液の
１mlを100mlのＬブロスに接種し、濁度（吸光度
650nm）が0.6になるまで37℃で培養した。氷水
中で30分間静置後、菌体を遠心分離により集め、
これを50mlの50mM CaCl₂に懸濁し、０℃で60分
間静置した。次いで、遠心分離により菌体を集
め、20％グリセリンを含む50mM CaCl₂の10mlに
再懸濁した。この懸濁液に上記の形質発現ベクター
pHLP383を添加し、これを氷水中で20分間、42
℃で１分間、室温で10分間インキユベートした
後、LBブロス（組成：１当たり、トリプトン
10ｇ、酵母エキス５ｇ及びNaCl10ｇ、PH7.5））
を加え、37℃で60分間振盪した。その菌体懸濁液
の一部を25μｇ／mlアンピシリンを含むLB寒天平
板に播き、37℃で一夜培養した後、アンピシリン
耐性クローンを選択して形質転換体を得た。この
形質転換体をHB101／pHLP383と名づけた。実施例２ヒトIL−１ポリペプチドの製造及び精製実施例１で得た形質転換体HB101／pHLP383
をLBブロス中37℃で一夜振盪培養した。その菌
体懸濁液の10mlを１の改良M9培地（組成：1.5
％Na₂HPO₄・12H₂Ｏ，0.3％KH₂PO₄，0.05％
NaCl，0.1％NH₄Cl，２mg／ビタミンB₁，0.5
％カザミノ酸、2mM MgSO₄，0.1mM CaCl₂，
0.5％ブドウ糖）に接種し、37℃で１時間培養し、
次いでインドール−３−アクリル酸を終濃度20μ
ｇ／mlになるように加え、更に24時間培養を継続
した後、遠心分離により菌体を集めた。菌体を
100mlの0.1％リゾチーム及び30mM NaClを含む
50M Tris−HCl（PH8.0）緩衝液に再懸濁し、０
℃で30分間静置した後、ドライアイス／エタノー
ル浴での凍結と37℃での融解を繰り返した後２ml
の10％ポリエチレンイミンを加え静置した。次い
で、遠心分離により菌体残渣を除き、清澄な抽出
液を得た。この抽出液に等容量の飽和硫酸アンモニウム水
溶液を加え静置したのち、遠心分離にて沈殿画分
を集めた。この沈殿画分を約100mlの20mM Tris
−HCl緩衝液（PH8.0）に溶解し、同緩衝液に対
して透析したのち、予め同緩衝液にて平衡化され
たDEAE−セフアロースCL−6Bカラムに負荷し
た。同緩衝液にて該カラムを充分洗浄したのち、
NaCl濃度０〜0.5Mの濃度勾配にて溶出した。IL
−１活性を有する溶出画分を集め、限外濾過にて
濃縮したのち、セフアクリルＳ−200によるゲル
濾過に付し、IL−１活性を有する画分を集めた。
更に、上記のDEAE−セフアロースを用いるカラ
ムクロマトグラフイー及びセフアクリルＳ−
200によるゲル濾過を繰り返すことにより精製品
を得た。１の培養により得た菌体抽出液より、約15mg
の精製ヒトIL−１ポリペプチド［］が得られ
た。この調製品中には、前記のSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動分析によりIL−１活性を
有する単一の蛋白質バンドのみが検出され、不純
蛋白質は認められなかつた。参考例１ヒトIL−１ポリペプチドをコードするcDNA
のクローニング及び塩基配列の決定 (1) 急性骨髄性白血病株細胞（HL−60細胞）か
らのヒトIL−1mRNAの調製 HL−60細胞をペトリデイツシユ（直径８cm）
に１×10⁷個／10ml／dishの条件で播いた。培養
液には10％牛胎児血清含有のRPMI−1640培地を
用い、分化誘導剤としてホルボール−12−ミリス
テート−13−アセテートとビタミンＡ酸をいずれ
も最終濃度として500ng／mlになるように添加し
た。37℃で５％炭酸ガス含有空気中、湿度90〜
100％で２日間培養したのち、培養液と浮遊細胞
を吸引除去した。分化した細胞が付着したデイツ
シユに10％牛胎児血清含有RPMI−1640培地に誘
導剤としてエンドトキシン（大腸菌由来のリポポ
リサツカライド）を10μｇ／ml濃度に、蛋白合成
阻害剤としてシクロヘキシミドを1μｇ／ml濃度
に添加した培地の10mlを加え、更に５時間培養し
た。培養終了後、培養液を吸引除去し、デイツシ
ユ上に残つた分化細胞を0.5％ラウロイルサルコ
シン酸ナトリウム、5mM クエン酸ナトリウム
及び0.1M2−メルカプトエタノールを含む6Mグ
アニジルチオシアネート液で溶解し、ホモジナイ
ズした。このホモジネートを0.1M EDTA含有
5.7M塩化セシウム水溶液上に重層し、超遠心分
離機（RPS27−２ローター、日立工機）を用い
26500rpmで20時間遠心し全RNA画分をペレツト
として得た。これを0.35M NaCl，20mM Tris
及び20mM EDTAを含む7M尿素液の少量に溶解
し、エタノール沈殿として回収した。この全RNA画分を1mM EDTAを含む10mM
Tris−HCl緩衝液（PH7.4）（以下TE液という）
２mlに溶解し、65℃で５分間加熱した。これに
NaCl溶液を0.5Mとなるように加えた後、あらか
じめ0.5M NaClを含むTE液で平衡化したオリゴ
（dT）セルロースカラムに付し、吸着したポリ(A)
mRNAをTE液で溶出した。ここで得られたポリ(A)mRNAを以下の実験に
用いた。 (2) cDNAの合成 (1)項で得られたポリ(A)mRNAを鋳型としてグ
ブラーとホフマンの方法［Gene25，263（1983）］
に準じてcDNAを合成した。該ポリ(A)mRNA（6μ
ｇ）を6μの蒸留水に溶解させ、これに0.6μの
100mM水酸化メチル水銀水溶液を添加し室温で
10分間放置した。次いで、20単位のRNA分解酵
素阻害剤（RNasin ，Promega Biotec社製品）
を含む500mM ２−メルカプトエタノール液の
1.7μを添加した。室温で５分間放置したのち、
更に10mM MgCl₂，1.25mM dGTP，1.25mM
dATP，1.25mM dTTP，0.5mM dCTP，
0.17μM α−〓Ｐ−dCTP（比活性、750Ci／
mmole）、4μｇオリゴ（dT）_12〜18、120単位トリ
骨髄性白血病ウイルス由来逆転写酵素を含む32μ
の50mM Tris−HCl（PH8.3）緩衝液を添加し、
42℃で60分間反応させた後、EDTAを加えて反
応を停止させた。フエノール／クロロホルム混液
（１：１）で抽出し、その水層に酢酸アンモニウ
ムを終濃度2.5Mになるように加え、エタノール
により反応生成物（sscDNA−mRNA複合体）
を沈殿させた。このsscDNA−mRNA複合体を
下記組成の反応緩衝液100μに溶解した。反応緩衝液組成： 5mM MgCl₂，10mM （NH₄）₂SO₄，100mM
KCl，0.15mM β−ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド、40μM dGTP，40μM dATP，
40μM dTTP，40μM dCTP、及び5μｇウシ血清
アルブミン、1.25単位大腸菌リボヌクレアーゼ
Ｈ、24単位大腸菌DNAポリメラーゼＩを含む
20mM Tris−HCl（PH7.5）緩衝液。該溶解液を12℃で60分間反応させ、これに2.5
単位の大腸菌DNAリガーゼを添加し、更に22℃
で60分間反応させた。EDTAを加えて反応を停
止させた後、上記と同様にフエノール／クロロホ
ルム混液で抽出し、エタノールにより反応生成物
（dscDNA）を沈殿させ、回収した。 (3) オリゴ（dC）テール付加cDNAの調製 (2)項で得られたdscDNAを下記組成の反応緩衝
液100μに溶解させ、37℃で30分間反応させ、
dscDNAにオリゴ（dC）テールを付加させた。反応緩衝液組成： 2mM CoCl₂，0.2mM ジチオスレイトール、
0.1mM α−³²Ｐ−dCTP（比活性1Ci／mmole）
及び10単位ターミナルデオキシヌクレオチジルト
ランスフエラーゼを含有する100mMカコジル酸
ナトリウム（PH7.2）。反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フ
エノール／クロロホルム混液で抽出し、オリゴ
（dC）テール付加dscDNAをエタノールにより沈
殿させ回収した。これを1mM EDTA及び
100mM NaClを含む10mM Tris−HCl（PH7.4）
緩衝液にて、2μｇ／mlの濃度に溶解させた。 (4) 組み換え体プラスミドの作製オリゴ（dG）テール付加pBR322（Bethesda
Res.Labs.Inc.製）と(3)項で得られたオリゴ（dC）
テール付加dscDNAを1.5mlの1mM EDTA及び
100mM NaClを含む10mM Tris−HCl（PH7.4）
緩衝液中、それぞれ1.5μｇ及び0.09μｇを含むよ
うに溶解混合させた後、65℃で10分間、57℃で２
時間、さらに45℃で２時間加温しアニーリングを
行い、組み換え体プラスミド溶液を調製した。 (5) 形質転換体の選択 (4)項で得られた組み換え体プラスミド溶液を用
い、E.colix1776株を形質転換させた。即ち、E.
colix1776株を、ジアミノピメリン酸100μｇ／ml
及びチミジン40μｇ／mlを補つたＬ−ブロス（組
成：１当りトリプトン10ｇ、酵母エキス５ｇ、
NaCl5ｇ、ブドウ糖１ｇ、PH7.2）20ml中、37℃
で吸光度（600nm）が0.5となるまで培養し、菌
体を遠心分離し、50mM CaCl₂含有10mM Tris
−HCl緩衝液（PH7.3）10mlにて洗浄した。集めた菌体を同じ緩衝液２mlに懸濁させ、０℃
で５分間静置した。この懸濁液0.2mlに上記組み
換え体プラスミド溶液0.1mlを添加混合し、０℃
で15分間静置し、更に42℃で２分間保持した後、
上記の培養で用いたのと同一組成のＬ−ブロス
0.5mlを加えて１時間振盪培養を行つた。この培
養液の一部を取り、上記組成に加えてテトラサイ
クリン（15μｇ／ml）が添加されたＬ−ブロス寒
天平板に広げ37℃で約12時間培養し、テトラサイ
クリン耐性菌を選択してcDNAライブラリーを作
製した。 (6) クローニング (5)項で得られたcDNAライブラリーから、参考
例２で得た組み換え体プラスミドpRL15からウサ
ギIL−１をコードするクローン化cDNAの断片
をプローブとして用いたコロニーハイブリダイ
ゼーシヨン試験及びハイブリダイゼーシヨントラ
ンスレーシヨン試験［Maniatis，T.，et al.，
“MoleculaCloning”329（1980）Cold Spring
Harbor Lab.］によりヒトIL−１ポリペプチド
をコードするcDNAを含むプラスミドを有する形
質転換体を選び出した。この組み換え体プラスミドをPHL4と名づけた。 (7) クローン化cDNAの塩基配列の決定クローン化cDNAの塩基配列はM13フアージを
用いるジデオキシ法にて決定した。Ｍ 13mp18
及びM13mp19（Pharmacia Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製）をクローニングベクターと
し、M13シークエンシングキツト（Amersham
International plc社製）を用い、“M13クローニ
ング及びシークエンシングハンドブツク”
（Amersham International plc社製）に従つて
実施した。その塩基配列及びその塩基配列から推測される
アミノ酸は下記第２表に示すとおりであり、ヒト
IL−１前駆体ポリペプチドをコードしている。第１〜３番の塩基が開始コドンATGであり、
第814〜816番の塩基は終止コドンTAGである。【表】【表】【表】ンを示す。
参考例２ウサギIL−１ cDNAの調製 (1) ウサギIL−1mRNAの調製ウサギにプロピオニバクテリウムアクネス死
菌体を１羽当たり100mgの投与量で静脈内に注入
し、８日後に屠殺した。直ちに開胸気管切開し、
気管内に挿入したチユーブを介してリン酸緩衝化
生理食塩液を用い肺洗浄を繰り返し、肺胞マクロ
フアージを採取した。この肺胞マクロフアージを
10％牛胎児血清含有のRPMI−1640培地に懸濁さ
せてペトリデイツシユ（直径８cm）に１枚当たり
１×10⁷となるように播き、37℃で５％炭酸ガス
含有空気中、湿度90〜100％で前培養した。１時
間の前培養の後、エンドトキシン（大腸菌由来の
リポポリサツカライド）、TPA（ホルボール−12
−ミリステート−13−アセテート）及びシクロヘ
キシミドをそれぞれ最終濃度が10μｇ／ml、500n
ｇ／ml及び1μｇ／mlとなるように添加混和し、
更に培養を継続した。４時間後に培養液を吸引除去し、デイツシユ上
に残つたマクロフアージから参考例１−(1)項に示
した方法に従つてポリ(A)mRNAを得た。ここで得たポリ(A)mRNAをアガロースゲル電
気泳動（ゲル濃度１％、6M尿素存在下、PH４）
に付し、2.6〜3.7kbの分子サイズに相当する泳動
位置からポリ(A)mRNAを回収した。 (2) cDNAライブラリーの作製 (1)項で得られたポリ(A)mRNAを鋳型として、
参考例１−(2)から(5)に示した方法に準じて、
cDNAライブラリーを作製した。 (3) クローニング上記のcDNAライブラリーについて、ウサギ
IL−１をコードするcDNAを含むプラスミドを
持つ形質転換体をスクリーニングするため〓Ｐ標
識cDNAプローブを用いるコロニー・ハイブリダ
イゼーシヨン試験をハナハンらの方法［Gene，
1063（1980）］に従つて行つた。エンドトキシン、
TPA及びシクロヘキシミドと共に培養［上記(1)
項参照］した肺胞マクロフアージ及びこれらの誘
導操作を省略した肺胞マクロフアージからそれぞ
れ上記(1)項の方法で得たポリ(A)mRNAを鋳型と
して、参考例１−(2)項の方法で合成し、³²Pで標識
したcDNAをそれぞれ誘導プラス及び誘導マイナ
スプローブとした。この試験により誘導プラスの
プローブと結合し、誘導マイナスのプローブとは
ハイブリダイズしない塩基配列を含む組み換え体
プラスミドを有する形質転換体を選別した。次いで、これらの選択されたクローンについて
ハイブリダイゼーシヨン・トランスレーシヨン試
験を上記(1)項で得たポリ(A)mRNAを用い、ウサ
ギIL−1mRNAと強くハイブリダイズするクロー
ンを選び出した。このクローンの有する組み換え体プラスミドを
pRL15と名づけた。

【図面の簡単な説明】

第１図は形質発現ベクターpHLP383の構築工
程を示す。尚、図中の式［］、［］、［］は実
施例１で示したそれぞれのオリゴヌクレオチド
アダプターを意味する。

Claims

【特許請求の範囲】１下記式〔〕で示されるアミノ酸配列からな
るヒトインターロイキン1αポリペプチド。 Ser Ser Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn
Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg lle lle Lys
Tyr Glu Phe lle Leu Asn Asp Ala Leu
Asn Gln Ser lle lle Arg Ala Asn Asp Gln
Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn
Leu Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met
Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp Asp
Ala Lys lle Thr Val lle Leu Arg lle Ser
Lys Thr Gln Leu Tyr Val Thr Ala Gln
Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys
Glu Met Pro Glu lle Pro Lys Thr lle Thr
Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe
Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr
Phe Thr Ser Val Ala His Pro Asn Leu
Phe lle Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp
Val Cys Leu Ala Gly Gly Pro Pro Ser lle
Thr Asp Phe Gln lle Leu Glu Asn Gln
Ala 〔〕２下記式〔〕で示されるアミノ酸配列からな
るヒトインターロイキン1αポリペプチドをコ
ードするDNAを微生物中で増殖可能な形質発現
ベクターに組み込み、形質発現ベクターを構築
し、これを用いて微生物を形質転換し、この微生
物形質転換体を培養し、ヒトインターロイキン
１活性を有するポリペプチドを産生せしめること
を特徴とする該ポリペプチドの製法。 Ser Ser Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn
Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg lle lle Lys
Tyr Glu Phe lle Leu Asn Asp Ala Leu
Asn Gln Ser lle lle Arg Ala Asn Asp Gln
Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn
Leu Asp Glu Ala Val Lys Phe Asp Met
Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp Asp
Ala Lys lle Thr Val lle Leu Arg lle Ser
Lys Thr Gln Leu Tyr Val Thr Ala Gln
Asp Glu Asp Gln Pro Val Leu Leu Lys
Glu Met Pro Glu lle Pro Lys Thr lle Thr
Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe
Trp Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr
Phe Thr Ser Val Ala His Pro Asn Leu
Phe lle Ala Thr Lys Gln Asp Tyr Trp
Val Cys Leu Ala Gly Gly Pro Pro Ser lle
Thr Asp Phe Gln lle Leu Glu Asn Gln
Ala 〔〕３ヒトインターロイキン1αポリペプチドを
コードするDNAが下記式〔〕で示される塩基
配列である特許請求の範囲第２項記載のポリペプ
チドの製法。（5′） TCA TCA CCT TTT AGC TTC
CTG AGC AAT GTG AAA TAC AAC
TTT ATG AGG ATC ATC AAA TAC
GAA TTC ATC CTG AAT GAC GCC
CTC AAT CAA AGT ATA ATT CGA
GCC AAT GAT CAG TAC CTC ACG
GCT GCT GCA TTA CAT AAT CTG
GAT GAA GCA GTG AAA TTT GAC
ATG GGT GCT TAT AAG TCA TCA
AAG GAT GAT GCT AAA ATT ACC
GTG ATT CTA AGA ATC TCA AAA
ACT CAA TTG TAT GTG ACT GCC
CAA GAT GAA GAC CAA CCA GTG
CTG CTG AAG GAG ATG CCT GAG
ATA CCC AAA ACC ATC ACA GGT
AGT GAG ACC AAC CTC CTC TTC
TTC TGG GAA ACT CAC GGC ACT
AAG AAC TAT TTC ACA TCA GTT
GCC CAT CCA AAC TTG TTT ATT
GCC ACA AAG CAA GAC TAC TGG
GTG TGC TTG GCA GGG GGG CCA
CCC TCT ATC ACT GAC TTT CAG
ATA CTG GAA AAC CAG GCG（3′）〔〕４構築された形質発現ベクターがpHLP383で
ある特許請求の範囲第２項記載のポリペプチドの
製法。