JPH01202285A - β−ガラクトシダーゼの安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はβ−ガラクトシダーゼの安定化法に係り、β−
ガラクトシダーゼを凍結乾燥し、製剤化する場合の酵素
活性の安定化の向上と、溶解時における溶状の改善およ
び活性の安定化に関する。

（従来の技術） β−ガラクトシダーゼは乳糖を加水分解してグルコース
と〃ラクトースを生成する酵素であり、医薬用や食品製
造用の酵素として各起源のものがそれぞれの酵素化学的
特性に応じて広く利用されている。

即ち医薬品としては乳糖不耐症の治療や乳幼児の下痢症
の治療に、又動物医薬としても汗腺の下痢症の治療に用
いられ、食品製造業に於いては乳糖分解ミルクの製造や
チーズホエーの処理、発酵乳の前処理などの多方面にわ
たっている。

これらの各産業分野に於いて実際に利用されているβ−
ガラクトシダーゼは、現在では主とじてアスペルギス・
オリーゼ、又はアスベルギス・ニが一山米の糸状菌酵素
とクルイベロマイセス・ラクチス又はクルイベロマイセ
ス・７ラギリス由来の酵母菌酵素であって、いずれもそ
の用途に応じて酵素純度と酵素活性に適宜の調整が施さ
れ、−定の規格値が保証された酵素剤として利用されて
いる。

しかるにβ−ガラクトシダーゼ産生能を有する糸状菌や
酵母菌の培養によって得たβ−ガラクトシダーゼは一般
的に安定性が乏しく、培養物から酵素画分を分離精製す
る各工程に酵素の失活が発生ずるために、可及的に低温
で処理することは勿論であるが、その他にも種々の対策
が施されている。

例えば通常精製の最終工程である凍結乾燥の際にもかな
りの活性損失を伴うため、〃ラクトースやグルコース等
を酵素の保護物質として添加する方法が既に提案されて
いる（特開昭５８−１０７１７８号公報）。しかしこれ
らの保護剤は必ずしも常に効果が充分なものでなく、特
に酵素剤を溶解希釈する際の溶状の改善や溶解失活の防
止になお不都合を米すことが多い。

（本発明が解決しようとする問題点） β−ガラクトシダーゼの活性測定は７−ド・ケミカルズ
・コデツクス（ＦｃｃＩ［［／Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｔｅ５
ｔ　ａｎｄ＾ｐｐａｒａｔｕｓ　Ｐ・４９１）に準拠し
たもので、同測定法は次に示す通りである。

■　ラクターゼ（β−ブラクトシグーゼ）活性測定法 ０．１モル（ＰＨ４，５）酢酸塩ｖｃ街液で溶解した０
、３７ズ％０ＮＰＣ（０−ニトロフェニール−β−Ｄ−
がラクトピラノシド）溶液４ｍｌに、０．１モル（ＰＨ
４，５）酢酸塩緩衝液で希釈した酵素液１ｔｎｌを加え
、３７℃で１５分間酵素反応を杼わせた後、その１１を
１０ズ％炭酸ナトリウム溶液の１１１１ｆｆ中に加えて
反応を停止し、水を加えて１０　Ｉｎ　ｌに希釈して波
長４２０旧台の吸光度を測定。この条件でラクターゼが
０ＮＰＣを分解して１分間に１μモルの０−ニトロ７エ
／−ルを生成する酵素量を一単位とする。

■　、供試酵素剤 本発明における供試酵素剤は第１表に示す通りで、アス
ペルギルス・オリーゼと７スペルギルス・二〃−及びベ
ニシリワムＳＰ、の酵素剤は何れも市販品として入手可
能であり、トリコデルマＳＰ。

の酵素も試験研究用として一般に入手可能である。

第１表 供試酵素剤 上記の酵素剤の最終的剤形は何れも凍結乾燥品であり、
酵素の安定化用として糖類、蛋白質などの適量が既に配
合されていることもあるが、さらに力価調整用としてデ
キストリン、マルトース、マンニトール、乳糖などの糖
類の外にリン酸力ｌレシウム、硫酸ナトリウム、塩化カ
リウムなどを倍散剤として配合するのが通例である６ しかしこれらのうち倍散剤として特にカルシウム塩を用
いた場合には、酵素剤の活性測定に際してＰｌｔ索を溶
解しようとすると、溶解困難で透明な酵素液の調製が不
可能なことが多い。又カルシウム塩を添加しない酵素剤
でも、溶解用緩衝液のＰｌ＋４．５は酵素の安定ｐＨ域
の限界近くであり、且つ酵゛素蛋白質の等電、α付近で
もあるために、溶状が不良となる傾向があり、溶解希釈
に伴う酵素活性の失活がおこり、測定値がバラついたり
、片寄ったりして正確な酵素活性の測定には不都合であ
る。

従ってこのような状況で酵素剤を精製処理したり、さら
に医薬用や食品産業用に利用する場合には、上記の力価
測定法に準拠して精製工程の管理をする時は勿論、商取
引に際して保証力価の相互確認をするときなどに支障を
未すことが多い。しかし上記の力価測定法は、国際的に
も公式に採用されている慣用法であって、容易に改訂す
ることが困難であることに鑑み、その対策につ１１て検
討した。

即ち、β−ガラクトシダーゼを０．１モル（ＰＨ４，５
）酢酸塩緩衝液に溶解した際、明らかな溶状不良と、着
しい溶解失活とを伴うにもかかわらず、同濃度、同Ｉ’
ｌ＋のマツキルペン緩ｌｌｉ液に溶解した場合では比較
的影響が少なかったことから、マツキルベン緩衝液の１
＆分であるクエン酸塩もしくはリン酸塩のキレート化剤
効果が寄与しているのではないかと考えられた。事実本
発明者らは、１７４０倍希釈（Ｐｉ（６，０）のマツキ
ルベン緩衝液での溶解が最も安定であることを認めた。

そこで凍結乾燥上りの酵素原末に各種の水溶性キレート
化剤のうち、主として食品添加物とじて許容され且つ吸
湿性の少な０ものにつ（％で、倍数剤の一部としてこれ
らを添加し、活性の測定を行ってみた処、クエン酸塩を
はじめ多数のキレート化剤が、この用途に有効であるこ
とが確認された。

さらにその添加法について試験した結果、凍結乾燥上り
の原末への倍散時のみでなく、凍結乾燥に先立って添加
しておくことによって、製剤の溶状改善、溶解失活の防
止だけでなく、凍結乾燥失活をも防ぐ効果が見出された
。

そこでこれらの添加量と添加方法、及び従来公知の安定
剤などとの併用についても鋭意検討した結果、本発明の
安定化法に到達した。

（問題点を解決するための手段） 本発明はβ−ガラクトシダーゼに水溶性キレート化剤を
加えて水に溶解し、凍結乾燥することによってβ−〃ラ
クトシダーゼの安定化をはかることを目的とするもので
ある。

本発明において好適な水溶性キレート化剤はクエン酸塩
、酒石酸塩、ポリリン酸塩、ピロリン酸塩などで、この
ときマンニトールやゼラチンなど従来公知の安定剤を混
合して用いればさらに相乗効果が得られる。

又これらの添加量はβ−ガラクトシダーゼ１部（乾燥重
量）に対し、水溶性キレート化剤０．０１乃至０．２（
重量）部、好ましくは０．１乃至０．２（重量）ｎ１マ
ンニトール０．０５乃至１（重量）部、好ましくは０．
２乃ｆｆｉ　０．５（ｌｆｉ）ｆｆ！！、セ５　ｆ　ン
０．０１乃ｕ　１　（ｌｆｌ）ｆｆｌＳ−好ましくは０
．０５乃至０．２（重量）部とする。

混合水溶液を凍結乾燥する際、その溶質濃度（ズ）は５
乃至４０％とし、凍結乾燥法は通常用いられる条件でよ
い。

例えば、温度としては約−５０乃至＋４０°Ｃ力Ｃ１圧
力としては１０−コ乃至１０−’ｗｍｌ１ｇが、時間と
して１よ２４乃至４８時間がそれぞれ適宜採用される。

又これらの水溶性キレート化剤は、凍結乾燥時だけでな
く常法によって調製されたβ−ガラクトシダーゼの凍結
乾燥上り原末に倍散剤として配合した場合でも、０．１
モル（ｒ’ｌ１４．５）酢酸塩緩衝液に溶解した際の溶
状の改善と、酵素活性の安定性の向上には有効である。

以下、試験例及び実施例によって本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれによって限定されるものではな
い。

く試験例１〉 アスペルギルス・オリーゼを起源とするβ−ガラクトシ
ダーゼの凍結乾燥上り原末に、倍散剤として燐酸カルシ
ウム及びクエン酸カリウムの第２表に示す各所定量を配
合してβ−ガラクトシダーゼ製剤を調製した。

ついで製剤化した酵素剤を０．１モル（ＰＨ４，５）酢
酸温暖１Ｉｌｉ液に溶解し、溶状と酵素活性の安定性を
調べた。その結果は第２表に示すように、原末に対し５
％以上の場合には燐酸カルシウム添加の場合でも溶状が
明らかに改善され、酵素活性の安定性が着しく向上し溶
解失活が防止できた。

本２０．１ズ％液、−は透明、＋は濁りの度合を示す。

木３　溶解安定性＝ く試験例２〉 アスペルギルス・オリーゼを起源とするβ−ガラクトシ
ダーゼの凍結乾燥上り原末１（重ｆｆ１）部に対し、燐
酸カルシウム０．１（重量）部及び９種の水溶性キレー
ト化削のそれぞれ０．１（ｆｉ量）部を倍散剤として配
合して製剤化した。

ついでこれらの製剤を、０．１モル（ＰＨ４，５）酢酸
塩緩衝液に溶解し、溶状と酵素活性の安定性を調べた。

その結果は第３表に示す通りで水溶性キレート化削の場
合に、溶状はいずれも明らかに改善された。又酵素活性
の安定性はクエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、ポ
リリン酸ナトリウム、ビロリン酸ナトリウムの添加で明
らかに向上した。

注）本１　β−ガラクトシダーゼ１００ｇ当りの添加量 ＊２　対原米０．１部 本３０．１ズ％液、−は透明、＋は濁りの度合を示す。

く試験例３〉 ７スペルギルス・オリーゼを起源とするβ−ガラクトシ
ダーゼの１０ズ％水溶液に、保険物質としてクエン酸す
）　１７ウムの各所定量を混合し、凍結温度−５５℃、
圧力１０−’＋ａＩＩｌｔ１ｇ、乾燥温度＋３５℃の各
条件で凍結乾燥した。この原末１（重量）部に対し、倍
散剤として燐酸カルシウム０．１（重量）部を配合して
β−ガラクトシダーゼ製剤を調製した。ついでこの場合
のβ−ガラクトシダーゼの凍結乾燥安定性と、調製した
製剤の０．１モル（ＰＨ４，５）酢酸塩緩ｍｔｒ液に対
する、溶状と＃前活性の安定性を調べた。

その結果は第４表に示すように、討原末５％以上の場合
には凍結乾燥安定性が向上し、製剤の溶状と酵素活性の
安定性が明らかに改善された。

末３　凍結乾燥上り原末に燐酸カルシウム０．１（重量
）部配合 本４　０．１２％液、−は透明、＋は濁ｔ）の度合を示
す。

く試験例４〉 アスペルギルス・オリーゼを起源とするβ−〃ラクトシ
ダーゼの２０ズ％水溶故に保護物質として、マンニトー
ル及びゼラチンの各所定量とクエン酸ナトリウムを加え
て溶解し、試験例３と同じ条件で凍結乾燥して凍結乾燥
上り原末を得、原末１（重量）部に対し、倍散剤として
燐酸カルシウム０．１（重量）部を配合してβ−ガラク
トシダーゼ製剤を調製した。

ついでこの場合のβ−ガラクトシダーゼの凍結乾燥安定
性と、凍結乾燥上りの原末又は調製した製剤を０．１モ
ル（ｐＨ，４，５）酢酸塩緩衝液に溶解した場合の、溶
状と酵素活性の安定性を調べた。その結果は？５５表に
示すように、凍結乾燥安定性が公知の安定化剤であるマ
ンニトール又はゼラチン成るいはその両者のみの場合に
比べてさらに向上した。又製剤の溶状と酵素活性の安定
性も明らかに改善され、併用の効果が認められた。

＊２（＋）は対原末０．２部添加、（−）は無添加＊３
　凍結乾燥上り原末に燐酸カルシウム０．１（重量）部
配合 本４０．１ズ％液、−は透明、＋は濁りの度合を示す。

（実施例） アスペルギルス・オリーゼ、アスペルギルス・二Ｎ−、
ト＋）コデルマｓｐ、　、ペニシリウムＳＰ。

を起源とする各β−ガラクトシダーゼ１（重量）部に対
し保護物質としてキレート化剤であるクエン酸ナトリウ
ム０．１（重量）部と、マンニトール０．２（ｌ量）部
、ゼラチン０．２（重量）部をそれぞれ２０ズ％水溶液
として混合し、試験例３と同じ条件で凍結乾燥した。こ
の原末１（重量）ｇに対し、倍散剤として燐酸カルシウ
ム０．１（重１）部を配合してβ−〃ラクトシダーゼの
凍結乾燥安定性と、調製した製剤の０．１モル（ＰＨ４
，５）酢酸塩緩衝液に対する溶状と酵素活性の安定性を
調べた。

その結果は第６表に示すように、いずれの糸状菌起源の
酵素剤においても、凍結乾燥安定性が向上し、製剤の溶
状と酵素活性の安定性が明らかに改善された。

ｆｊＳ６表 各種起源のβ−ガラクトシダーゼの凍結乾燥安定性、溶
状及び酵素活性の溶解安定性 性）木１０．１ズ％液、−は透明、十は濁りの度合を示
す。

（効果） 本発明によれば、比較的不安定で失活しやすいβ−〃ラ
クトシダーゼの製造に於いて凍結乾燥工程または製剤時
に、水溶性キレート化剤を添加すると言う簡単な手段に
よって酵素の凍結乾燥安定性と溶解安定性を高めるとと
もに、溶状も昔しく改善することができ、その結果、生
産性は勿論、酵素製剤の表示活性の信頼度の向上と言う
産業上極めて有利な効果を生じた。

出願人　新日本化学工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）β−ガラクトシダーゼ原末に保護物質としてキレー
   ト化剤を添加し、若しくはキレート化剤の添加と、マン
   ニトール及びゼラチンの単独又は併用添加を施して凍結
   乾燥し、製剤化し、キレート化剤により乾燥工程におけ
   る酵素活性の安定化向上と溶解時における溶状の改善及
   び溶解失活を防止することを特徴とするβ−ガラクトシ
   ダーゼの安定化法。 ２）β−ガラクトシダーゼがアスペルギルス属、トリコ
   デルマ属又はペニシリウム属を起源とすることを特徴と
   する請求項１）記載のβ−ガラクトシダーゼの安定化法
   。 ３）保護物質のキレート化剤がクエン酸塩、酒石酸塩等
   のａ−オキシカルボン酸類、およびポリリン酸塩、ピロ
   リン酸塩等の縮合リン酸塩類に属することを特徴とする
   請求項１）記載のβ−ガラクトシダーゼの安定化法。 ４）保護物質の添加量がβ−ガラクトシダーゼ１部（乾
   燥重量）に対しキレート剤０．１乃至０．２重量部、マ
   ンニトールは０．２乃至０．５重量部、ゼラチンは０．
   ０５乃至０．２重量部であることを特徴とする請求項１
   ）記載のβ−ガラクトシダーゼの安定化法。