JPH0121907B2 - - Google Patents

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JPH0121907B2
JPH0121907B2 JP56005833A JP583381A JPH0121907B2 JP H0121907 B2 JPH0121907 B2 JP H0121907B2 JP 56005833 A JP56005833 A JP 56005833A JP 583381 A JP583381 A JP 583381A JP H0121907 B2 JPH0121907 B2 JP H0121907B2
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Suni Yuka
Paatanen Pauru
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KOMANDEIITEIYUUTEIO FUINPIPETSUTE OSUMO EE SUOBANIEMI
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は糞便中のヘモグロビンまたはヘモグロ
ビン分解産物の検出方法に関するものである。
糞便中の潜血を測定する方法としては従来何種
類かの方法が知られている。一つの方法は、糞便
中のヘモグロビンから遊離されたヘミンを検出す
る方法に基づく。この方法では、糞便試料を、グ
アヤク樹脂を含んだ試験紙上にのせる。この試験
紙上に過酸化水素溶液を加えると、糞便中のヘミ
ンはパーオキシダーゼ酵素同様の作用を奏し、こ
のためグアヤク樹脂は酸化されて青色の化合物に
変化する。生成される色の強さは糞便試料中のヘ
モグロビンの濃度に依存する。この方法に使用す
る適当な装置として、登録商標名フエカテスト・
パツケージ（Fecatest package）として知られ
る装置が米国特許第4092120号明細書に開示され
ている。この米国特許明細書の開示は、実験室用
試料の保存および試験のための装置に関するもの
である。この装置は開口部および該開口部から底
面にまで達する孔部を有するほぼ四角形のベース
プレートよりなる。開口部は該プレート面から突
出した中空の円筒の内壁よりなつてもよい。試料
はこの孔部に保存できるようになつている（試料
保存面積は、開口部の面積によつて規定される）。
このベースプレートの一辺にはジヨイントによ
り、該ジヨイントを中心に開閉して該プレートの
上面を覆う頂部カバーが取りつけられている。こ
の頂部カバーは該プレート上面に見合う形状を有
し、そして孔部に採取した試料を適度に圧縮する
ために、開口部の内壁に嵌合する突起部を有す
る。
このベースプレートの底面（裏面）には、前記
孔部をほぼ中心にして前記孔部より大きい凹部が
形成されており、該凹部には濾紙等のシートが納
められるようになつている。試料は前記孔部の下
端で該凹部に入れた濾紙に接触させることができ
る。さらにこのベースプレートの別の一辺には、
ジヨイントにより、該ジヨイントを中心に開閉し
て該プレートの裏面を覆う底部カバーが取りつけ
られている。この底部カバーは、ベースプレート
底面の前記凹部にぴつたり嵌合し、該凹部の濾紙
を押える役目を果す。この底部カバーを濾紙とと
もに開いて、「測定部」とする。
今日糞便中の潜血を検出するために用いられる
診断用製品は、例えば肉を含む食品および血液を
含む食品由来のヘモグロビンとヒトのヘモグロビ
ンを区別することができない。同様に、糞便中の
植物たとえばカブラおよび西洋ワサビ由来のパー
オキシダーゼ酵素は、これらの試験において誤つ
た陽性結果をひきおこす。本発明の目的は、この
ような問題を解決することである。本発明におい
ては誤差の原因を除くために、ヒト血液由来のヘ
モグロビンを糞便試料中から免疫学的手段によつ
て、特異的に分離する。
免疫学的反応においては、抗原は対応する抗体
と反応し、免疫学的複合物を形成する。その際反
応成分の一方を固相、最も都合良くはある種のポ
リマーに結合させておき、検出すべき物質（成
分）を溶液中に存在させて、溶液中の成分を前記
固相に結合した成分と接触させ、免疫学的複合物
の形成を起させることもできる。検出すべき抗原
成分または抗体成分の定量は、検出すべき成分と
同じ免疫学的性質を有する一定量の酵素標識成分
を反応混合物中に添加して行なう。酵素標識成分
の相手成分との結合は検出すべき物質成分の量に
依存する。その結果、最終的に得られた反応溶液
中の酵素活性または、固相中の酵素活性を、検出
すべき物質の量で指標として使用できる。このよ
うなエンザイム−イミユノ−アツセイ（enzyme
−immuno−assay）（以下、EIAと略す）は、例
えば米国特許第3654090号および第4016043号明細
書に記載されている。
本発明の方法は、(a)糞便試料を、片面が吸着材
に接触しているグアヤク脂含浸濾紙の反対側の面
に接触させることにより、ヘモグロビンを該吸着
材に吸着させ、(b)吸着したヘモグロビンを該吸着
材から溶離し、(c)溶離したヘモグロビンを特定の
抗ヒトヘモグロビン抗体と反応させることによ
り、該抗体とヘモグロビンとの複合体を形成さ
せ、(d)該複合体の量を定量することからなる。
ヘモグロビンは、グアヤク脂含浸濾紙を通過し
て吸着材に良好に吸着されるが、該濾紙を通過で
きる粒子の径は限定されているため、夾雑物とな
りうる物質の大半は該濾紙により除去される。こ
れにより、ヘモグロビンを高濃度で含有し、且つ
夾雑物質が少なく、高い精度でヘモグロビンを検
出しうる試料を調製することができる。
また、本発明の方法によると、ヘモグロビンの
抽出を、糞便試料を該濾紙の片面に接触させるだ
けという非常に簡便な操作により行うことがで
き、糞便自体を取り扱う不快な操作が少なくな
り、操作性、衛生上の点からも好ましい。本発明
の抗原検出法に基づく免疫学的ヘモグロビン検出
法は、非常に少量のヘモグロビンまたはその分解
産物を検出するに充分な感度を有する。
本発明の方法によれば、ヒト糞便中のあらゆる
潜血が免疫学的に検出される。本発明の方法は、
特異抗体の使用に基づく。これにより、ヒト由来
のヘモグロビンのみが検出できる。
本発明の方法の重要な要件は、試料中のヒト血
液由来のいかなるヘモグロビンをも回収するため
に、抗−ヒト−ヘモグロビン抗体を使用する点に
ある。
反応においては、試験に使用した吸着剤からサ
ンプルを溶出するために、適当な緩衝液を使用す
る。
免疫学的反応は、適当な標識剤例えば適当な酵
素で標識した同じ特異性を有する抗体を使用する
か、またはグアヤク脂を含む溶液を使用し、グア
ヤク脂をヘモグロビンのヘム部の存在により酸化
して青色化合物に変える（シユードーパーオキシ
ダーゼ反応）ことによつて肉眼的に判定出来るよ
うにすることもできる。
次に本発明を図面に基づいて詳しく説明する。
本発明の方法に、例えば第１図のフエカテスト
パツケージ１が使用できる。
フエカテストパツケージ１を使用することによ
り、サンプルを容易かつ衛生的に取扱うことがで
きる。「測定部」２上に、フエカテストパツケー
ジ（フエカテストケース）は、例えば濾紙（１枚
もしくは数枚の小さい濾紙または１枚の比較的大
きな濾紙）を有する。
糞便試料を衛生的に移送および試験するように
特別に設計されたフエカテストケース中には、測
定部２に吸着剤物質３（例えば濾紙）が備えられ
ており、この吸着剤物質３中に、糞便中に含まれ
ている血液由来ヘモグロビンおよびまたはその分
解産物が吸着される。
この吸着剤物質は、フエカテストのグアヤク脂
含浸紙とプラスチツク製カバー（測定部の）との
間に位置するようにフエカテストケースに固定す
る。本発明者等が行なつた試験において、糞便試
料から、充分量のヘモグロビンまたはその分解産
物がグアヤク脂を含む紙を通して隣りの濾紙に移
行することが認められた。もちろん吸着剤の位置
を別の方法で配置することも可能である。吸着剤
３は容易に取り出して他の適当な容器、例えば第
２図に示すキユベツトセツト４中に移しかえ、ヘ
モグロビンまたはその分解産物を溶出することが
できるようにケース中に取りつけられている。
濾紙または他の任意の多孔性吸着剤２に吸着さ
れた試料中のヘモグロビンまたはヘモグロビン分
解産物は、吸着剤２から溶出できる。溶出液５か
らEIA法または他の免疫学的方法によつてヘモグ
ロビン量を測定することができる。溶出を行なわ
ず、吸着剤をそのまま免疫学的方法によるヘモグ
ロビン量の測定に使用することもできる。
ヘモグロビンを吸着剤から溶出するときには、
糞便中から、ヘモグロビンおよび他の溶解性分子
を含む溶液が得られる。この溶液をピペツトで、
例えば第３図に示す予め壁および底に一定量の抗
ヒトヘモグロビン特異抗体６を結合させたポリス
チレンキユベツトセツト７のキユベツトに移す
と、抗体（すなわち、抗ヒトヘモグロビン）と抗
原（すなわち、試料中のヘモグロビン）との間に
免疫学的抗原抗体反応が生ずる（以下、単に免疫
反応という。）。
このようにして、試料中のヘモグロビンは、こ
のキユベツトの固相（IgGすなわち、抗体である
免疫グロブリンＧ画分）に結合される。
一定時間（免疫反応に要する時間）インキユベ
ートした後、キユベツト（固相）７を充分注意深
く洗浄して結合していない夾雑物を全て除去す
る。もちろん、固相はこのようなキユベツト７と
全く別の形態にしてもよい。すなわち、固相はポ
リスチレンと全く異なるポリマーでもよく、また
同様に固相の形はキユベツトや容器と全く異なる
例えばボール、リング、円盤等の形にしてもよ
い。
次に免疫反応が生じたかどうか、すなわち、固
相に存在する抗ヒトヘモグロビンに試料中から何
かが結合したかどうかを次のようにして調べる。
免疫反応発生の有無は、例えば次の方法で確認
することができる： (1) 試料をキユベツトの固相に結合している抗体
に結合させ、キユベツトを洗浄した後、このキ
ユベツトに標識剤としてある種の酵素を結合さ
せた一定量の抗ヒトヘモグロビンIgGを加え
る。酵素標識IgGの固相の抗体への結合は、試
料の処理後に固相に「未結合状態の遊離抗体」
がどれくらい存在するかに関係する。このよう
に、酵素標識法によつて、抗体（抗ヒトヘモグ
ロビン抗体）と抗原（ヒトヘモグロビン）との
反応を、該酵素に特異的な基質を加え、この酵
素により該基質から、肉眼的または測光法的に
判定可能な着色物質を生じさせることによつ
て、検出することができる。上記のいわゆるサ
ンドイツチ法は、EIA法と関連して、例えば前
記米国特許第4016043号明細書に開示されてい
る。酵素の量は、固相に結合した量を測定する
ことによつても、または溶液中に遊離状態で残
つている量を測定することによつても決定でき
る。
(2) 酵素反応を行なわせる他の方法は、試料と同
時に一定量の結合物（酵素標識ヒトヘモグロビ
ン）を加え、試料中のヘモグロビンと添加した
ヘモグロビンに抗体（固相中の抗ヒトヘモグロ
ビン）との反応を競合させる方法である。免疫
反応（抗原抗体反応）は、該酵素に特異的な基
質を加え、この基質から着色物質を生じさせる
ことによつて検出できる。この方法に相当する
いわゆる競合的EIA−試験は、例えば前記米国
特許第3654090号明細書に記載されている。
(3) 酵素反応の別の方法として、グアヤク反応を
用いることもできる。試料を固相の抗ヒトヘモ
グロビン抗体と反応させてから、固相（キユベ
ツト）を洗浄した後、このキユベツトに一定量
のグアヤク脂を添加する。試料がヒトヘモグロ
ビンを含んでおり、このヘモグロビンがキユベ
ツトの壁の特異抗体に結合していれば、シユー
ド・パーオキシダーゼ反応が生じ（すなわち、
グアヤク脂は過酸化水素の存在下で酸化されて
青色化合物に変化する）、この青色化合物は測
光法的に測定できる。青色の強さは、試料中の
ヒトヘモグロビンの量に比例する。したがつ
て、この方法では、EIAで必要とされる酵素反
応は使用しなくてよい。そして酵素反応を使用
しなくても、特異抗体を使用して、ヒトヘモグ
ロビンのみを測定できる。
本発明の態様を以下の実施例により具体的に説
明するが、本発明は実施例のみに限定されるもの
ではない。
実施例 (1) 試料を吸着した吸着剤をフエカテストケース
の測定部のカバーから取り出し、例えばFP−
９キユベツト中に移した。
(2) このポリスチレン製FP−９キユベツトは、
予め抗ヒトヘモグロビンIgG抗体画分を結合
（感作）しておいた。
(3) このキユベツト中に、リン酸塩で緩衝化した
塩類溶液（0.1M PBS、PH7.4）200μを加え
た。
(4) 例えば37℃で２時間インキユベートした。
(5) このキユベツトを蒸留水400μで洗浄した。
(6) 適当な酵素（例えばアルカリホスフアター
ゼ）で標識した抗ヒトヘモグロビンIgG分画
（希釈液はPBSを使用）200μを、このキユベ
ツトに加えた（標識酵素の添加）。
(7) 例えば37℃で２時間インキユベートした。
(8) 前記(5)と同様に洗浄した。
(9) 標識酵素の酵素に特異的な基質（本実施例で
は、パラニトロフエニルホスフエート）を添加
した。
(10) 37℃で30分間インキユベートして酵素反応を
行なつた後、酵素反応を停止させるために適当
な溶液（本実施例では0.1M NaOH）200μを
加えた。
(11) 結果を肉眼または測光法的に測定した。反応
は他の多くの方法で行なうこともできる。
上記の実施例は、都合よく実施されることが判
明した多くのEIA法のうちの一例である。インキ
ユベーシヨン時間、反応混合物の量、標識酵素お
よび固相の条件は変化させることができる。
フエカテストケース中の吸着剤は、化学結合に
よつて特異抗体（抗ヒトヘモグロビン抗体）を結
合させることにより、抗原（すなわち、ヒトヘモ
グロビンまたはその分解産物）を吸着剤に吸着す
る時点で特異的に結合させてもよい。その場合に
は、吸着剤自身が固相として使用される。その場
合、洗浄後に標識酵素を添加し、一定のインキユ
ベートおよび洗浄操作後、基質を加え、最終結果
を肉眼的またはデンシトメーター等で判定する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、糞便中に含まれる血液を吸着剤に吸
着させるのに使用可能なフエカテストパツケージ
を示す図、第２図は、一部断面図として示したキ
ユベツトセツトを溶出用容器とした溶出過程での
吸着剤を示す図、第３図は、一部断面図として示
した免疫反応用キユベツトセツト中で、キユベツ
トの壁に結合した抗体分子の拡大図を表わす。 １……フエカテストパツケージ、２……測定
部、３……吸着剤物質、４……キユベツトセツ
ト、５……溶出液、６……抗ヒトグロブリン特異
抗体。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 糞便試料を、片面が吸着材に接触してい
    るグアヤク脂含浸濾紙の反対側の面に接触させ
    ることにより、ヘモグロビンを該吸着材に吸着
    させ、 (b) 吸着したヘモグロビンを該吸着材から溶離
    し、 (c) 溶離したヘモグロビンを特定の抗ヒトヘモグ
    ロビン抗体と反応させることにより、該抗体と
    ヘモグロビンとの複合体を形成させ、 (d) 該複合体の量を定量することからなる、糞便
    中のヒトヘモグロビンの特異的検出方法。 ２ 抗体に結合したヒトヘモグロビンをエンザイ
    ム−イミユノ−アツセイ（EIA法）で測定する特
    許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 抗体に結合したヒトヘモグロビンを、グアヤ
    ク脂および過酸化水素を添加してグアヤク脂によ
    り生じた青色の強さによつて測定する特許請求の
    範囲第１項記載の方法。
JP583381A 1980-01-17 1981-01-17 Detection method of hemoglobin in night soil Granted JPS56106154A (en)

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