JPH01224664A - 抗体の標識方法 - Google Patents

抗体の標識方法

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JPH01224664A
JPH01224664A JP5239488A JP5239488A JPH01224664A JP H01224664 A JPH01224664 A JP H01224664A JP 5239488 A JP5239488 A JP 5239488A JP 5239488 A JP5239488 A JP 5239488A JP H01224664 A JPH01224664 A JP H01224664A
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JP
Japan
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antibody
labeled
antigen
hafp
labeling
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JP5239488A
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English (en)
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Shoichi Murata
祥一 村田
Mutsuyuki Sugimura
杉村 睦之
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Daikin Industries Ltd
Original Assignee
Daikin Industries Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、各種免疫学的測定法において用いられる抗体
の標識方法、さらに詳しくは、抗体の標識に際して、抗
原抗体反応に関与する部位を、予め対応する抗原と結合
させて保護しておき、その保護された抗体を標識処理に
付すことにより抗体活性を低下させることなく抗体を標
識する方法に関する。
附米遺■ 抗原抗体反応を利用して各種の抗原または抗体を定性的
または定量的に測定するために種々の免疫学的方法が採
用されており、代表的なものとして酵素免疫法(EIA
と略称)、ラジオイムノアッセイ(RI Aと略称)な
どが知られている。また、反応生成物の光学的特性を利
用した吸光度測定法、分光測定法、さらに最近では先導
波路におけるエバネッセント波を利用して先導波路外方
の界面近傍に存在する物質の光学的特性を測定する方法
らあり、とくに、本出願人において新しく開発されたエ
バネッセント波免疫測定法(EVIAと略称、特願昭6
2−107788号を参照)も有力な方法の1つである
ところで、これら免疫学的測定法では、用いる抗体を色
素、酵素またはアイソトープなどの種々の標識物質で標
識したものを用いており、その抗体の標識には、抗体に
直接、標識物質を作用させて標識する方法が採用されて
いる。しかしながら、このような方法によれば、抗体全
体に標識物質が接触して結合するため、その標識抗体を
抗原抗体反応に供した場合、抗原との反応に関与する部
位まで標識物質が結合しているため抗体活性が低下する
傾向にある。
発明の目的 本発明者らは、上記のような抗体活性の低下のない標識
抗体を得るべく種々研究を重ねた結果、該抗体を予め対
応する抗原と結合させ、ついでこれに標識処理を行なっ
たのちに抗原から遊離させて回収することにより、抗原
抗体反応に関与する部位がフリーの状態のままで標識さ
れた抗体が得られ、それが標識抗体としてきわめて優れ
たものであることを見い出し、本発明を完成させるに至
った。
すなわち、本発明は、標識すべき抗体を予め対応する抗
原と結合させて抗原抗体反応に関与する部位を保護した
うえで標識処理を行なうことを特徴とする抗体の改良標
識方法を提供するものである。
発明の構成および効果 本発明によれば、免疫学的測定法において用いられる抗
体を標識する方法において、該標識すべき抗体を、適当
な担体に固定させた対応する抗原と反応させて、抗原抗
体反応に供した場合に抗原と反応する部位を抗原と結合
させることによって保護しておき、これに標識物質を作
用させて標識し、得られた標識抗体を抗原から遊離させ
て回収することにより所望の標識抗体を得ることができ
る。
本発明方法を実施するには、まず、対応する抗原を適当
な担体、例えばポリスチレンビーズ、ポリスチレンラテ
ックスなどのポリマー担体、好ましくは無孔質担体に常
法により固定しておき、これに標識すべき抗体を反応さ
せる。この場合、該抗原固定化担体をカラムに充填して
おき、これに標識すべき抗体含有液を通す方法が簡便で
ある。
標識すべき抗体としてはいずれの抗体も用いられ、通常
、りん酸緩衝液などの適当な緩衝液(pH6,0〜10
.0)の溶液として用いられる。この抗体の抗原への結
合反応は、通常、室温または冷却下に行なわれ、数〜数
十時間で完了する。
上記の方法で抗体を結合させた抗原固体化担体を適当な
緩衝液で洗浄後、標識物質を作用させる。
標識物質としては、通常用いられるいずれの物質も用い
られ、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(F
ITC)、ローダミンなどの蛍光物質、エオシン、オー
ラミンなどの燐光物質、過酸化酵素、アルカリホスファ
ターゼなどの酵素類、1125、I II+などのアイ
ソトープ類などが挙げられる。
標識物質は、通常、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液などの適
当な緩衝液の溶液として用いられ、これを室温または冷
却下に上記担体に数〜十数時間作用させる。
このように標識処理された抗体は公知の方法によって容
易に抗原から遊離させて回収することができる。例えば
、上記標識処理した担体を洗浄して未標識・物質を除去
したのち、上記結合反応に用いた緩衝液と異なるp)(
および/またはイオン強度を有する緩衝液、例えばpH
2、0〜4.0のクエン酸緩衝液やギ酸緩衝液で処理す
ることにより標識抗体が遊離される。また、ラウリル酸
ナトリウムなどの蛋白質変性剤で処理する方法も採用さ
れ得る。
本発明方法で得られる標識抗体は抗原抗体反応に関与す
る部位かフリーの状態で標識されているため抗体活性の
低下がなく、これを用いて免疫学的測定を行なった場合
、高感度で定性または定量が可能となる利点を有する。
また、標識処理に用いた抗原固定化担体は、標識抗体を
遊離したのち、繰返し標識処理に用いることができ、き
わめて経済的である。さらに、該処理をカラムを用いて
行った場合には、標識処理後、未標識物質を容易に分離
し得る利点がある。
本発明の方法は、通常のEIASRIAなどの免疫分析
法、各種光学的分析法、ならびに本出願人の開発に係る
EVIAなどのいずれの方法にも適用される。とくにE
VIA法では測定がきわめて短時間で行なわれるうえ、
抗原抗体反応の進行も観測し得る利点がある。
つぎに、実施例を挙げて本発明方法をさらに具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されない。
実施例1 抗ヒトアルファフェトプロティン抗体(抗hAFP抗体
)のフルオレセインイソチオシアネート(FITC)に
よる標識; ヒドロキシエチレンメタクリレート、ビニルアルデヒド
およびスチレンの共重合体ラテックス5豹を5mMりん
酸緩衝液(pH7、5) 5 xcl、:!l!’濁し
、この懸濁液にヒトアルファフェトプロティン(hAF
P)5i@を添加し、4℃で一晩振盪してhAFP固定
化ラテックスを得る。
得られたhAFP固定化ラテックスをガラスカラムに充
填し、これに、抗hAFP抗体5IIIg/次Qを含有
する50mMりん酸緩衝液(pH7,4)0.511Q
、を通し、ポンプを用いて4°Cにて一晩循環させる。
このカラムを50mMりん酸緩衝液(pH7,4)で洗
浄後、抗hAFP抗体のモル濃度の50〜I00倍量の
FITCを含有する50mM炭酸緩衝液(pH9,5)
2酎を通し、ポンプを用いて15°Cにて数時間循環さ
せる。
未反応のFITCを50mMりん酸緩衝液(pH7,4
)で洗い流したのち、0.1Mショートサリチル酸リチ
ウムを通して抗原(hAF P )に結合したFITC
標識抗hAFP抗体を遊離、溶出させる。この溶出液を
50mMりん酸緩衝液(pH7,4)に対して透析し、
適当な濃度まで濃縮してIITC標識抗hAFP抗体を
得る。
上記の方法で得られたFITC標識抗hAFP抗体およ
び従来法で得られたFITC標識抗体を用いて、下記の
ようにしたEVIA法によるhAFPの測定を行なった
用いたEVIAキュベツトは以下のようにして作成した
抗hAFP抗体(20u9/mQ)含有10mMリン酸
緩衝液(pH7、4,0,9%NaC1) O、’2 
m(lを加え、4℃で一晩静置して抗体をキュベツトに
固定化し、同緩衝液で洗浄後、0.5%牛血清アルブミ
ン−10mMりん酸緩衝液(pH7、4,0,9%Na
CQ、0.01%ツイン20)0.7xdを加え、室温
で2時間静置する。このキュベツトを同緩衝液で洗浄し
、凍結乾燥して測定用キュベツトを調整する。
該測定用キュベツトをEVIA測定装置(特願昭62−
107788号を参照)に取付け、これに試料であるh
AFPおよびFITC標識抗体(20u9/mQ)の混
合液(50mMTris−HCQ緩衝液、PH7,4,
0,9%NaC12) 0 、8 m(lを加え、抗原
抗体反応に付し、その反応による蛍光の増加を10分間
測定する。
上記の方法により、種々の濃度のhAFP含有試料を用
いて測定してhAFP濃度と信号強度の関係を示す検量
線を求めると第1図に示すグラフが得られる。第1図中
、実線は本発明方法によるもの、点線は従来法によるF
ITC標識抗体を用いた対照のものを意味する。
第1図に示すように、本発明の方法によれば対照に比し
、約30%の信号増加が得られた。
実施例2 抗hAFP抗体の過酸化酵素による標識:実施例1と同
様にして調製したhAFP固定化ラテックスを充填した
カラムに、N−サクシンイミジル−3−(2−ピリジル
ジチオ)プロピオネート(SPDP)を結合させた抗h
AFP抗体5巧/肩Q含有50mMりん酸緩衝液(PH
7,4)0.5肩Qを通し、ポンプを用いて4℃にて一
晩循環させる。
このカラムを50mMりん酸緩衝液(pH7,4)で洗
浄後、2−イミノチオランでチオール化した過酸化酵素
5mg/mQ含有50mMりん酸緩衝液(pH7,4)
1.0112を通し、ポンプを用いて37℃にて2時間
循環させる。
未反応のチオール化過酸化酵素を上記りん酸緩衝液で洗
浄後、3.5M塩化マグネシウム水溶液を通して酵素標
識抗hAFP抗体を遊離、溶出させ、以下、実施例1と
同様に処理して、過酸化酵素標識抗hAFP抗体を得る
上記の方法で得られたFrTC標識抗hAFP抗体およ
び従来法で得られたFITC標識抗体を用いて、下記の
ようにしてEIAによるhAFPの測定を行なった。
96wellイムノプレートにhAF P(20119
/EIQ)含有リン酸緩衝液(pH7,4,0,9%N
aC1)50μQ/wellを加え、4℃で一晩静置し
て抗体を固定化し、同緩衝液で洗浄後、0.5%牛血清
アルブミン−10mMりん酸緩衝液(pH7、4,0゜
9%NaC(!、0.01%ツイン20)100μQ/
wellを加え、室温で2時間静置する。このイムノプ
レートを上記牛血清アルブミン含有緩衝液で洗浄後、こ
れに過酸化酵索標識抗hAFP抗体(牛血清アルブミン
含有緩衝液で希釈、20μ9/mQ) 50μρ/we
llを加え、試料であるhAFPと室温で2時間静置し
て反応させろ。
このイムノプレートを上記牛血清アルブミン含有緩衝液
で洗浄後、さらにO−フェニレンジアミン溶液(20H
/ 50 m(l  Me I 1vain  緩衝液
、20uQH20を液)50 μ(2/wellを加え
、室温で30分間呈色反応に付したのち、2NHtS0
゜50μQ/wellを加えて反応を止め、該反応液の
450nmにおける吸光度を測定する。
上記の方法により、種々の濃度のhAFP含有試料を用
いて測定してhAFPfi度と吸光度の関係を示す検量
線を求めると第2図に示すグラフが得られる。第2図中
、実線は本発明方法によるもの、点線は従来法による過
酸化酵素標識抗hAFP抗体を用いた対照のものを意味
する。
第2図に示すように、本発明の方法によれば、対照に比
し、約20%の吸光度増加が得られた。
【図面の簡単な説明】
第1図は、本発明方法および従来法によるFITC標識
抗hAFP抗体を用いたEVIAによるhAFP測定の
検量線、第2図は、本発明方法および従来法による過酸
化酵素標識抗hAF’P抗体を用いたEIAによるhA
FP測定の検量線を示す。 特許出願人ダイキン工業株式会社

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)免疫学的測定法において用いられる抗体の標識方
    法において、標識すべき抗体を、担体に固定させた対応
    する抗原に結合させ、ついで該抗体を標識したのち、標
    識抗体を抗原から遊離、回収することを特徴とする抗体
    の標識方法。
  2. (2)抗体を対応する抗原に結合させる工程を、抗原を
    固定した担体をカラムに充填し、これに該抗体含有液を
    通して行なう請求項1に記載の方法。
JP5239488A 1988-03-04 1988-03-04 抗体の標識方法 Pending JPH01224664A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04232859A (ja) * 1990-07-16 1992-08-21 Eastman Kodak Co 免疫反応性標識チロキシン結合体の精製方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS52154519A (en) * 1976-06-16 1977-12-22 Kotai Kasei Kk Production of labeled antibody
JPS614961A (ja) * 1984-06-20 1986-01-10 Hitachi Ltd 抗体精製標識法

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