JPH04232859A - 免疫反応性標識チロキシン結合体の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はイムノアッセイに関する
。

【０００２】

【従来の技術】チロキシン（Ｔ４）は、哺乳類の生理学
上重要なホルモンであり甲状腺より排出されている。チ
ロキシンの測定は、疾病の決定における重要な診断上の
手段である。チロキシンの測定に使用されてきた種々の
技術としては、ラジオイムノアッセイ、競合タンパク質
バインディングおよびクロマトグラフィーなどが挙げら
れる。

【０００３】Ｔ４（チロキシン）と酵素類の結合体類が
Ｔ４についてのイムノアッセイで使用されてきた。ほと
んどのこれらのアッセイでは、Ｔ４−酵素結合体および
試料中のＴ４が、競合的不均一系アッセイに際し、固体
表面上に固定されたＴ４抗体のＴ４抗体バインディング
サイトに対して競争する。このような表面類としては、
試験管のウェル、マイクロタイタープレートのウェルお
よびポリマービーズの表面が挙げられる。

【０００４】試料中のＴ４濃度がアッセイに使用される
Ｔ４−酵素濃度と比較して高い場合、相対的により多く
のＴ４およびより少ないＴ４−酵素結合体が固定化され
た抗体と結合するため、固定化された抗体へ結合される
Ｔ４−酵素の量および試料中のＴ４の量の間には逆の相
関性がある。これらのアッセイでは、バインディング反
応が生じた後固定化表面を広範に洗浄し、いずれかの遊
離（未結合）Ｔ４−酵素を除去する。次いで酵素の基質
を含む溶液が添加されて、基質が固定化された酵素と接
触される。基質は、基質に対し酵素が反応することで観
察できる変化（例えば、色調の変化）が生ずるように選
択される。上記変化は、固定化された抗体へ結合される
酵素結合体の量の測度であるので、最初の試料中におけ
るＴ４の量に関連する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記課題は、Ｔ４−酵
素調製物中の一定の酵素が固定された抗体による結合が
不可能（非免疫反応性Ｔ４−酵素結合体）である場合に
は、Ｔ４−酵素結合体の有用性が低下することにある。 このことは、一定の酵素がＴ４で誘導されないかまたは
誘導されたＴ４がＴ４抗体バインディングサイトへ接近
しにくい場合に起こりうる。非免疫反応性Ｔ４−酵素は
、競合反応に関することなく酵素活性を与える。このこ
とがより低い最終シグナルもしくはより高いバックグラ
ウンド（非特異的）シグナルのいずれかをもたらすかも
しれない。高いバックグランウンドシグナルが課題であ
る場合には、一般に固定化された抗体を広範に洗浄する
ことにより過剰のシグナルを最終測定物から除去すべき
である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、下記の工程を
含んでなる免疫反応性標識チロキシン結合体の精製方法
を提供する。 （ａ）ｉ）チロキシン（Ｔ４）類縁体に対して産生され
、そしてｉｉ）チロキシンと交差反応性である抗体を固
定する工程； （ｂ）標識チロキシン結合体の粗液状混合物を調製する
工程； （ｃ）標識チロキシン結合体の液状混合物を固定化され
た抗体上へ通過させる工程； （ｄ）固定化された抗体をｐＨ４〜９の緩衝溶液で洗浄
する工程；ならびに （ｅ）チロキシンの緩衝溶液を固定化された抗体上へ通
過させることにより免疫反応性標識チロキシン結合体を
脱離する工程。

【０００７】以下、本発明を具体的に説明する。本発明
は、標識Ｔ４結合体、特にこれまで入手可能であった物
よりも非常に高いレベルの免疫反応性を含有するＴ４−
酵素調製物の取得方法を提供する。上記方法は酵素アル
カリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）を用いて具体的に説明
されるであろうが、関係する原理をいずれかの標識に対
して応用することは当業者らに理解されるであろう。ま
た、上記方法の生成物が、Ｔ４についてのいずれのイム
ノアッセイにおいても有用であることも明らかであろう
。免疫反応性標識Ｔ４結合体を精製するのに用いられる
この方法は、アフィニティークロマトグラフィーにより
非免疫反応性成分を除去することを必要とする。アフィ
ニティークロマトグラフィーがカラムを用いてまたは用
いないで実施できることは、当業者らに理解されるであ
ろう。例えば、固定化された抗体を標識Ｔ４結合体の試
料と単に混合し、次いで上記方法の他の工程を完了する
ことも成功するであろう。

【０００８】アフィニティークロマトグラフィーは、溶
液成分のあるサブセットを認識し、そして成分のそのサ
ブセットと結合する固形支持体上に固定化された抗体を
使用するので、成分のサブセットの１つを他から分離で
きる。しかしながら、アフィニティークロマトグラフィ
ーの工程で固形支持体上に用いられる抗体と、精製する
溶液の所望の成分の間には強い相互作用が存在する可能
性がある。この作用が生じる場合、所望の成分は固定化
された抗体で保持し、望ましくない成分から所望の成分
を分離する。しかし、固定化された抗体から所望の成分
を脱離して使用に役立てることは困難である。これは、
標識Ｔ４結合体の精製に使用する目的でＴ４抗体が固定
化される場合に生ずる。

【０００９】本発明では、通常のＴ４抗体と比較してＴ
４と弱く結合する抗体を用いることによりこの困難が取
り除かれるので、固定化された抗体より所望の成分（こ
の例では、免疫反応性標識Ｔ４結合体）の脱離は簡単で
ある。上記アフィニティー精製工程で用いられる抗体は
、Ｔ４類縁体に対して産生されそしてＴ４と交差反応性
を有するものである。Ｔ４類縁体の具体例としては、３
，３′、５−トリヨードチロニン（Ｔ３）；３，５−ジ
ヨードチロニン（Ｔ２）；もしくは３，３′，５′−ト
リヨードチロニンが挙げられ、これらのすべてはＴ４に
対して弱反応性を有する。従って、これらの抗体は免疫
反応性Ｔ４−ＡＬＰを弱バインディング相互作用で吸着
できるようなＴ４を認識する所望の特性を有する。また
、この弱バインディングが免疫反応性標識Ｔ４結合体を
容易に脱離することも可能にする。

【００１０】抗体を固定する種々の固形支持体としては
、例えばアガロース（精製された形状の多糖寒天）、セ
ルロース、デキストランおよびガラスビーズが挙げられ
る。抗体用、具体的には高性能アフィニティークロマト
グラフ法用として特に有用な他の支持体は、付加重合性
ビニル（アクリルを含む）モノマーのポリマー粒子であ
る。

【００１１】一般にポリマー粒子は、０．０１マイクロ
メートルを越える平均粒度を有する水不溶性ラテックス
粒子である。好ましくは、上記ポリマー粒子は、０．０
１〜１０マイクロメートル、より好ましくは０．３〜３
マイクロメートルの範囲内の平均粒度を有する。好まし
いポリマー類は、次式（ＩＩＩ）

【００１２】

【化１】

【００１３】（上式中、−Ａ−は、疎水性エチレン系不
飽和モノマー１種以上から誘導される反復単位を表わし
、−Ｂ−は、必須の反応性基であって、その基を介して
ポリマー粒子を付加してリガンド類似体を形成すること
ができる基、を有するエチレン系不飽和モノマー１種以
上から誘導される反復単位を表し、−Ｄ−は、−Ａ−も
しくは−Ｂ−により表わされるものとは別のエチレン系
不飽和モノマー１種以上から誘導される反復単位を表わ
す）で示すことができる。

【００１４】式（ＩＩＩ）中、ｘは０〜９９．９モルパ
ーセントでありｙは０．１〜１００モルパーセントであ
り、そしてｚは０〜２０モルパーセントである。好まし
くはｘは４５〜９９．５モルパーセントであり、ｙは０
．５〜５０モルパーセントであり、そしてｚは０〜１０
モルパーセントである。式（ＩＩＩ）に従うポリマービ
ーズは、ヨーロッパ特許出願公開第０　　３０８　　２
３３Ａ号、同０　　３２３　　６９２Ａ号、同０２８０
　　５５６Ａ号、および同０　　３０２　　７１５Ａ号
明細書ならびに特開平１−５４２５８号および同１−５
４２５９号公報に公表されており、これらの各々は、明
らかに、引用することにより本明細書の内容となる。

【００１５】上記−Ａ−反復単位が選ばれるモノマー類
は疎水性であり、そして水に不溶性のホモポリマー類を
形成する。好ましくは、これらのモノマー類は芳香族基
を有する。限定されるものではないが、代表的な疎水性
モノマー類としては、スチレンおよびスチレン誘導体類
（例えば、４−ビニルトルエン、２，５−ジ−メチルス
チレン、４−ｔ−ブチルスチレン、２−クロロスチレン
および当該技術分野で既知の他のもの）、アクリル酸な
らびにメタクリル酸のエステル類およびアミド類（例え
ば、ｎ−ブチルアクリレート、プロピルメタクリレート
、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチル
メタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、
Ｎ−フェニルアクリルアミドおよび当該技術分野で既知
の他のもの）、アクリロニトリルならびにビニルアセテ
ートが挙げられる。

【００１６】上記−Ｂ−反復単位が選ばれるモノマー類
としては、ビニルベンジルクロリド、ビニルベンジルブ
ロミド、ｍ−およびｐ−（２−クロロエチルスルホニル
メチル）スチレン、Ｎ−（４−クロロエチルスルホニル
メチルフェニル）アクリルアミド、ビニルクロロアセテ
ート、Ｎ−（３−クロロアセタミドプロピル）メタクリ
ルアミド、２−クロロアセタミドエチルメタクリレート
、４−クロロアセタミドスチレン、ｍ−およびｐ−クロ
ロアセタミドメチルスチレン、Ｎ−（３−クロロアセタ
ミドカルボニルイミノプロピル）メタクリルアミド、２
−クロロアセタミドカルボニルイミノエチルメタクリレ
ート、４−クロロアセタミドカルボニルイミノスチレン
、ｍ−およびｐ−クロロアセタミドカルボニルイミノメ
チルスチレン、Ｎ−ビニル−Ｎ′−（３−クロロプロピ
オニル）尿素、４，（３−クロロプロピオナミド）スチ
レン、４−（３−クロロプロピオナミドカルボニルイミ
ノ）スチレン、２−（３−クロロプロピオナミド）エチ
ルメタクリレート、Ｎ−〔２−（３−クロロプロピオナ
ミド）エチル〕メタクリルアミド、アクリル酸、メタク
リル酸、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリ
レート、ビニルベンズアルデヒドおよびＮ−（３−アミ
ノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩が挙げられる。

【００１７】上記−Ｄ−反復単位が誘導されるモノマー
類は、−Ａ−および−Ｂ−が誘導されるものとは別のモ
ノマー類が挙げられる。具体的には、上記−Ｄ−反復単
位は、粒子に対して水性分散安定性もしくは他の性質を
与えるモノマー類から誘導される。限定されるものでは
ないが、代表的なモノマー類としては、アニオンモノマ
ー類、例えば２−アクリルアミド−２−メチルプロパン
スルホン酸ナトリウム、アクリル酸、メタクリル酸、２
−カルボキシエチルアクリレートおよびスチレンスルホ
ン酸のカリウム塩ならびにｍおよびｐ−カルボキシメチ
ルスチレンならびに他のエチレン系不飽和重合性スルホ
ネート類、カルボキシレート類、スルフェート類、およ
びホスホネート類、他の親水性かつ非イオン性のモノマ
ー類、例えば２−ヒドロキシエチルアクリレートおよび
２−ヒドロキシエチルメタクリレートならびに当業者に
既知の他のものが挙げられる。

【００１８】上記−Ｄ−単位が誘導される好ましいモノ
マー類としては、アクリル酸、メタクリル酸、２−アク
リルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム
、ｍおよびｐ−カルボキシメチルスチレンならびにｐ−
スチレンスルホン酸のカリウム塩が挙げられる。

【００１９】上記モノマー類の代表的なポリマー類とし
ては、下記、ポリ（ｍおよびｐ−クロロメチルスチレン
）、ポリ（スチレン−コ−ｍおよびｐ−クロロメチルス
チレン−コ−２−ヒドロキシエチルアクリレート）（モ
ル比６７：３０：３）、ポリ（スチレン−コ−ｍおよび
ｐ−クロロエチルスルホニルメチルスチレン）（モル比
９５．５：４．５）、ポリ（スチレン−コ−Ｎ−〔ｍお
よびｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニ
ル〕アクリルアミド）（モル比９９．３：０．７）、ポ
リ（ｍおよびｐ−クロロメチルスチレン−コ−メタクリ
ル酸）（モル比９５：５、９８：２および９９．８：０
．２）、ポリ（スチレン−コ−ｍおよびｐ−クロロエチ
ルスルホニルメチルスチレン−コ−メタクリル酸）（モ
ル比９３．５：４．５：２）、ポリ（スチレン−コ−Ｎ
−〔ｍおよびｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル
）フェニル〕アクリルアミド−コ−メタクリル酸）（モ
ル比９７．３：０．７：２）、ならびにポリ（スチレン
−コ−ｍおよびｐ−クロロメチルスチレン）（モル比７
０：３０）が挙げられる。

【００２０】上記抗体は支持体へ直接付着されうるか、
または抗体もしくは支持体のどちらかを誘導化した後に
付着することもできる。一般に、スペーサーアーム類は
抗体もしくは支持体のどちらかに取り付けられ、付着さ
れる抗体をより接近しやすくする。一般に、支持体への
タンパク質の付着に用いられるカプリング技術は、タン
パク質上の求核基、例えばアミノ基、スルフヒドリル基
およびヒドロキシル基とキャリア上の種々の求電子基の
反応を伴う。

【００２１】一般にタンパク質のアミノ基は、支持体上
のエポキシド、アルデヒド、イソチオシアネート基、ビ
ニル基もしくは活性エステルと反応する。タンパク質の
スルフヒドリル基はチオエステルもしくはジスルフィド
結合を形成できる。一般に支持体を形成するアガロース
もしくはシリカ上に見い出されるヒドロキシル基は、反
応前に臭化シアン、クロロギ酸エステル、１，１′−カ
ルボニルジイミダゾール、塩化スルホニルおよびトレシ
ルクロリドによって活性化される。また、支持体上の求
核基はタンパク質上の求電子基とも反応されてきた。抗
体を初めとする特定のタンパク質の炭水化物残基は支持
体上のアミノ基もしくはヒドラジド基と反応できるアル
デヒドに酸化できる。

【００２２】精製された標識Ｔ４結合体はＴ４について
のイムノアッセイのいずれにも有用である。そのアッセ
イは上述のような競合的なものであってもよく、これら
の表現上均一系もしくは不均一系は当該技術分野で理解
されている。例えば、米国特許第４，６７０，３８１号
明細書を参照のこと。アッセイは直接的または間接的で
あってもよい。ＥＬＩＳＡ，ＥＭＩＴおよびＦＩＡは、
このようなイムノアッセイの周知の例である。

【００２３】広範な態様では、本発明は、次の工程を含
んでなるＴ４のイムノアッセイに応用できる。 （ａ）本発明の標識Ｔ４結合体を供給する工程、（ｂ）
Ｔ４を含む試料を（ａ）と混合する工程、（ｃ）（ｂ）
由来の混合物を既知量のＴ４に対する抗体と反応させる
工程、ならびに （ｄ）Ｔ４抗体と結合もしくは未結合のどちらかの標識
量を測定する工程。 上記標識Ｔ４結合体は、イムノアッセイを実施するよう
に設計された乾式分析要素で有用である。典型的には、
このような要素類は支持層、試薬区画および展開区画を
含む。２つの区画を単一層内へ組み込むこともでき、ま
たは個別の層へ分けることもできる。上記要素は、１つ
以上の層、例えば個別のもしくは共同の試薬／展開層な
らびに他の必要な添加剤およびカプリング酵素などを含
有するゼラチン緩衝層を含むことができる。ビーズ類と
しては、大きなポリマービーズおよび小さなポリマービ
ーズの両方を挙げることができ、これらは同一のもしく
は別々の層のどちらかへ塗布されうる。小さなビーズ類
は、大きなビーズ類の前に、もしくは同時にまたは後に
塗布されうる。

【００２４】要素の試薬層もしくは展開層は、１種以上
の合成もしくは天然のバインダー物質類（例えば、ゼラ
チン）または他の天然産のコロイド類、ホモポリマー類
およびコポリマー類〔例えば、ポリ（アクリルアミド）
、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−イソプロピル
アクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド−コ−Ｎ−ビ
ニル−２−ピロリドン）および同様のコポリマー類〕へ
分散された１種以上の試薬類を包含する指示組成物を含
むことができる。他の任意の層類、例えば下塗り層およ
び放射線遮断層などを必要により含むことができる。要
素のすべての層は流体中で相互に接触しており、これは
流体類、試薬類および流体類中の未複合体化反応生成物
類が隣接層の重なった領域間を通過できることを意味す
る。

【００２５】本発明のアッセイにより提供される種々の
イムノアッセイは、Ｔ４へ付着できる適当な標識のいず
れかを用いて実施できる。有用な標識類としては、放射
性タグ類、色素類、螢光剤類、酵素類、酵素基質類、酵
素阻害剤類、アロステリックエフェクター類、コファク
ター類および他の既知酵素モジュレーター類が挙げられ
る。酵素類、例えばグルコースオキシダーゼ、ペルオキ
シダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、西洋
ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（アミン富化西洋ワ
サビペルオキシダーゼを含む）およびガラクトシダーゼ
が好ましい標識類である。

【００２６】酵素標識を用いる場合には、その酵素に対
する基質は要素中に存在するかまたは洗液中へそれが添
加される。上記基質は前もってもしくは液状試料と同時
に、またはバインディング反応完了後に要素へ添加でき
る。供給する標識に適する基質を決定することは、臨床
化学における当業者の技術範囲内である。上記基質は、
酵素標識により直接作用を受ける物質であるか、または
標識の酵素反応を伴う一連の反応を必要とする物質類で
あってもよい。例えば、酵素標識がペルオキシダーゼで
あれば、基質は過酸化水素である。グルコールオキシダ
ーゼを用いる例では、一般に基質グルコースを試薬層へ
存在させるか洗液へ０．０１モル／ｍ２　、好ましくは
０．０１〜０．１モル／ｍ２　となるように添加する。 アッセイに用いられる酵素標識の量に対する特定の基質
の量をどのように調節すればよいかは当業者らに既知で
あろう。

【００２７】ある標識、例えば酵素類、コファクター類
、酵素基質類もくしは酵素モジュレーター類を用いる場
合、試薬層は、標識反応生成物として検出可能な種を提
供する試薬類を１種以上包含する指示組成物を含む。 好ましくは、指示組成物は、基質と酵素標識リガンド類
似体の酵素反応の結果として比色的に検出可能な種を提
供する比色的指示組成物である。

【００２８】指示組成物は、酵素反応で検出可能な色素
を生成する単一化合物、もしくは色素を生成する試薬類
の組み合わせであってもよい。例えば、グルコースが基
質として用いられそしてグルコースオキシダーゼが酵素
標識として用いられる場合、比色的指示組成物は反応し
て色素を提供するカプラーおよび被酸化性化合物を含ん
でもよい。または、上記組成物は、グルコースオキシダ
ーゼがグルコースをグルコン酸へ転化する場合に生成さ
れる過酸化水素の生成の結果として検出可能な色素を生
成するロイコ染料およびペルオキシダーゼあるいは別の
適当な過酸化物に作用する化合物を含んでもよい。有用
なロイコ染料は当該技術分野で既知であり、そして、例
えば米国特許第４，０８９，７４７号および同４，６７
０，３８５号明細書に記載のものを含む。比色的指示組
成物およびその種々の成分類の特定の量は、当業者の技
術範囲内にある。

【００２９】要素の層は、界面活性剤類、増粘剤類、緩
衝剤類、硬化剤類、抗酸化剤類、カプラー溶剤類および
当該技術分野で既知の他の物質類を初めとする種々の他
の所望の成分類を含んでもよい。これらの成分類の量も
また当業者の技術範囲内にある。

【００３０】上記イムノアッセイは手動もしくは自動化
できる。一般に液状試料中の被検体量は、供給ロール、
チップパケットもしくは他の供給源から要素を取り出し
て、そして展開層の限定領域をその液状試料（例えば、
１〜１００ｍｌ）と物理的に接触せしめることにより測
定される。接触される限定領域は一般に１００ｍｍ２　
以下である。

【００３１】試料塗布後、いずれの態様においても、要
素をインキュベーションもしくは加熱などのようないず
れかの状況下にさらし、試験結果を得ることを速めるか
または促進することが望ましいかもしれない。要素を、
複合体化リガンド類似体を直接測定するかまたは酵素標
識と基質の酵素反応の結果として生成される検出可能な
種を検出するのに適する装置を通過させることによりＴ
４の量は測定される。例えば、上記種は一般に既知の操
作により、適する放射線測定器、螢光測定器もしくは分
光測光器で検出できる。ある酵素反応では、試験試料と
接触する限定領域の中心で、例えば反射濃度、透過濃度
もしくは螢光を測定することにより生成物を測定する。 一般に測定される領域は競合アッセイについて直径３〜
５ｍｍである。液状試料中のＴ４の量は限定領域の中心
で測定される標識の量に対して反比例する。本明細書に
言及されるように、好ましい態様における分離洗浄工程
は複合体化Ｔ４を未複合体化Ｔ４から分離するために必
要とされる（ラジアル洗浄）。一般に標識測定は試料を
接触および展開後または洗液の塗布後、５〜１８０秒後
に実施される。

【００３２】本発明の具体的な態様を請求項１との関連
で以下に列挙する。 ２．　　上記抗体が、３，３′，５−トリヨードチロニ
ン（Ｔ３）；３，５−ジヨードチロニン（Ｔ２）もしく
は３，３′，５′−トリヨードチロニンより選ばれるチ
ロキシン類縁体に対して産生される請求項１の方法。

【００３３】３．　　上記抗体が、Ｔ３に対して産生さ
れる請求項２の方法。

【００３４】４．　　上記抗体が、カラム中のポリマー
ビーズ、アガロースビーズ、セルロースビーズ、デキス
トランビーズもくしはガラスビーズより選ばれるビーズ
上に固定される上記請求項のいずれか１つの方法。

【００３５】５．　　上記抗体が、アガロースビーズ上
に固定される請求項４の方法。

【００３６】６．　　上記標識が、酵素である請求項１
，２もしくは３の方法。

【００３７】７．　　上記標識が、アルカリ性ホスファ
ターゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼである請求
項６の方法。

【００３８】８．　　上記緩衝溶液中のチロキシン濃度
が１０−５〜１０−３Ｍでありそして緩衝溶液のｐＨが
４〜９である請求項１，２もしくは３の方法。

【００３９】９．　　上記結合体が、７５％を越える免
疫反応性を示す標識チロキシン結合体の調製物。

【００４０】１０．上記結合体が、７５〜１００％の間
の免疫反応性である請求項９の調製物。

【００４１】１１．請求項９もしくは１０の標識Ｔ４結
合体を用いるイムノアッセイ。

【００４２】１２．上記標識が、酵素である請求項１１
の方法。

【００４３】１３．上記標識が、アルカリホスファター
ゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼである請求項１
１の方法。

【００４４】１４．（ａ）カラム中のアガロースビーズ
上へトリヨードチロニンに対して産生される抗体を固定
する工程； （ｂ）標識チロキシン結合体の粗液状混合物を調製する
工程； （ｃ）標識チロキシン結合体の液状混合物を固体化され
た抗体上へ通過させる工程； （ｄ）固定化された抗体をｐＨ４〜９の緩衝溶液で洗浄
する工程；そして （ｅ）チロキシンの緩衝溶液を固定化された抗体上へ通
過させることにより免疫反応性標識チロキシン結合体を
脱離する工程；を含んでなる免疫反応性標識チロキシン
結合体を精製する方法。

【００４５】１５．請求項９もしくは１０の標識Ｔ４結
合体を含んでなるイムノアッセイを実施するための乾式
多層分析要素。

【００４６】

【実施例】ＡＬＰ標識Ｔ４を用いる以下の例は、Ｔ４に
ついてのいずれかの標識に対して本発明の広範な適用を
明らかにするであろう。Ｔ４−ＡＬＰ調製物の免疫反応
性成分を精製する本例で用いられる方法の具体的な態様
では、Ｔ３アフィニティーカラムを用いた。しかしなが
ら、本明細書記載のＴ４類縁体に対して産生される他の
抗体も使用できる。Ｔ３抗体は標準のプロトコールによ
りアガロースビーズ上へ固定されて、そしてクロマトグ
ラフィーカラムが調製された。Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｄｅａｎ　および他、ＩＲＬ　
Ｐｒｅｓｓ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｅｎｇｌａｎｄ　１９８５
　を参照されたい。ｐＨ４〜９、Ｔ４−ＡＬＰ（０．０
０１〜１０ｍｇ／ｍｌ）を含むように調製された緩衝溶
液をカラムへ注入した。抗体は、ｐＨ４〜９の範囲を越
えるか下まわるレベルでは悪影響を受けることが多い。 Ｔ４−ＡＬＰ調製物の非免疫反応性成分のすべては、カ
ラムを素通りした。カラムに吸着された成分は免疫反応
性であった。これらの成分はＴ４を含む緩衝液をカラム
へ通過させることによりカラムから脱離された。上記Ｔ
４は１０−５Ｍ〜１０−３Ｍの濃度で存在させた。溶液
中のＴ４はＴ３抗体のバインディングサイトでＴ４−Ａ
ＬＰと競争する。緩衝液中に過剰のＴ４が存在すること
により、Ｔ４−ＡＬＰは置換されてそしてカラムの外へ
溶出された。免疫反応性Ｔ４−ＡＬＰ中の過剰なＴ４は
、カラムより採集されて透析により除去された。

【００４７】例 Ｔ４−ＡＬＰ結合体の調製 Ｔ４−ＡＬＰは、チオラート化アルカリホスファターゼ
をヘテロ二官能性剤ＳＭＣＣ〔スクシンイミジル４−（
Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキ
シレート〕で活性化されたＴ４と反応させることにより
調製した。この方法はＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　３０，　Ｉｔｏおよび他、１６８２〜１６８５
ページ（１９８４）に記載されている。標識結合体を作
成するのに有用な他の方法は周知である。 例えばＰｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ
　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　：　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｎｅｓ　ｉｎ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｎｌａｒ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　
Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、アムステルダ
ム、オランダ、１９８５を参照されたい。

【００４８】免疫反応性試験 マウスモノクローナルＴ４抗体（ロット１４および２３
）をミクロンポリマービーズ上へ共有結合で固定した。 Ｔ４−ＡＬＰ結合体の溶液（緩衝液中）を調製してそし
て一連の試験管へ等分配した。ビーズ上へ固定化された
Ｔ４抗体の増加量を一連の試験管へ加え、次いで室温で
１時間Ｔ４−ＡＬＰ溶液とインキュベーションした。そ
の溶液を遠心して固定化された抗体および固定化された
Ｔ４抗体へ結合されたＴ４−ＡＬＰのいずれかを除去し
た。試料の上清を採取してそしてアルカリ性ホスファタ
ーゼ基質、ｐ−ニトロフェニルホスフェートを含有する
緩衝溶液（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール
、ｐＨ１０）を添加することによりアルカリ性ホスファ
ターゼ活性についてアッセイした。酵素活性は、４０５
ｎｍで色調変化を観察することによりモニターした。 既知アルカリ性ホスファターゼ活性の溶液を上清中のＡ
ＬＰ濃度を予測するための標準として用いた。上清中の
ＡＬＰの量対Ｔ４抗体の添加量のプロットを、調製物中
の免疫反応性Ｔ４−ＡＬＰ結合体のパーセント値を測定
するために作製した。典型的には、未精製Ｔ４−ＡＬＰ
の調製物は非免疫反応性物質を約７０％含んでいた（免
疫反応性物質、３０％、図１参照）。ビーズ上へ固定化
された非特異的マウスモノクローナル抗体を用いる対照
実験を、ビーズへのＴ４−ＡＬＰ調製物の非特異的バイ
ンディングを検査するために用いた。これらの実験では
非特異的バインディングは何も観察されなかった（図１
）。

【００４９】アフィニティークロマトグラフィーによる
固定化されたＴ３抗体の調製 ＣＮＢｒ−活性化アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　を、室温で３０分間
、０．００１ＭＨＣｌ１５ｍｌ中で膨潤させた。膨潤し
たビーズを０．００１ＭＨＣｌ２００ｍｌで洗浄して、
さらに０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ
、ｐＨ７．９で洗浄した。次いで上記ビーズを０．１Ｍ
炭酸水素ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．９、
５ｍｌ中で懸濁した。マウスモノクローナルＴ３抗体（
ケンブリッジ、ロットＡ１６４１）３．４ミリグラムを
、懸濁されたビーズへ添加し、そして室温で一晩混合し
た。次いでビーズを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、０．
５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．９、１００ｍｌで洗浄した。次
に、ビーズを１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．０）１０
０ｍｌで洗浄して、さらに室温で２時間１Ｍエタノール
アミン（ｐＨ８．０）１５ｍｌ中でインキュベーション
した。次いでビーズを最初は０．１Ｍ酢酸ナトリウム、
１．０ＭＮａＣｌ、ｐＨ４．０、５０ｍｌで洗浄し、そ
して０．１Ｍホウ酸、１．０ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０、
５０ｍｌで２回洗浄した。Ｔ３抗体が固定化されたアガ
ロースを、最後に０．０１Ｍリン酸、０．１５ＭＮａＣ
ｌ、ｐＨ７．０、１００ｍｌで洗浄した。

【００５０】Ｔ３抗体が固定化されたアガーロースビー
ズをガラスカラム（直径１ｃｍ）中へ高さ１ｃｍまで注
入した。次いでカラムを０．０１Ｍリン酸緩衝溶液（Ｐ
ＢＳ、０．０１Ｍリン酸、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７
．４）で十分に洗浄した。

【００５１】Ｔ４−ＡＬＰのアフィニティー精製ＰＢＳ
中Ｔ４−ＡＬＰ（２．４ｍｇ／ｍｌ）の溶液１ｍｌをア
フィニティーカラムへ注入した。次いで最初にＰＢＳで
溶出した。ＰＢＳ２５ｍｌをカラムへ通過させた後、溶
出液を０．０００１ＭＴ４を含有するＰＢＳへ変えた。 この緩衝液３５ｍｌを溶出した。全流出液を１ｍｌずつ
の画分で採集し、続いて各画分をアルカリ性ホスファタ
ーゼ活性について分析した。これらのアッセイの結果を
図２にプロットする。アルカリ性ホスファターゼ活性の
２つのピークを回収し、そしてピークＩ（カラムを通過
した活性）およびピークＩＩ（カラムに吸着してそして
緩衝液へＴ４を添加後溶出された活性）と表示した。

【００５２】ピークＩおよびピークＩＩの溶出物の免疫
反応性 ピークＩ溶出物およびピークＩＩ溶出物の試料を上述の
ように免疫反応性について試験した。図３ＡはピークＩ
溶出物が免疫反応性ではないことを示す。すなわち、添
加される固定化されたＴ４抗体の濃度が最高濃度であっ
ても除去されるアルカリ性ホスファターゼ活性は何もな
い。ピークＩがアフィニティーカラムへ吸着されないの
で、この結果は予測されたものであった。図３Ｂは、ピ
ークＩＩ溶出物が約９０％の免疫反応性であることを示
す。これは、Ｔ４−ＡＬＰ調製剤の免疫反応性成分がカ
ラムに吸着され、そして溶出液へのＴ４の添加により溶
出されることを例証する。また、１００％の免疫反応性
は、固定化された抗体を反応混合物へより多く添加する
ことにより達成できる。

【００５３】アフィニティー精製Ｔ４−ＡＬＰを用いる
Ｔ４イムノアッセイでの増強されたシグナル精製された
Ｔ４−ＡＬＰを、上述の型の薄層フィルムホーマットに
基づいてＴ４についてのイムノアッセイで試験した。薄
層フィルムの展開層はポリマービーズ上へ固定化された
Ｔ４抗体を含む。Ｔ４およびＴ４−ＡＬＰを含む試験試
料１０マイクロリットルを展開層へ塗布した。次いでフ
ィルムを３７℃で５分間インキュベーションする間に、
Ｔ４およびＴ４−ＡＬＰならびに固定化された抗体の間
で競合反応が起きた。５分間インキュベーション後、洗
浄溶液１０マイクロリットルを塗布して固定化された抗
体へ結合されないいずれかのＴ４−ＡＬＰをスポットの
中心から洗浄した。また、この第２の流体もＡＬＰに対
する基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェート）を含むの
で、固定化された抗体によりスポットの中心へ吸着され
る酵素の活性を、４００ｎｍの光線を用いて色調変化を
測定することにより定量できる。この測定は反射率濃度
計を用いて３７℃で実施した。上記イムノアッセイでは
、固定化された抗体へ結合される酵素の量は試料中のＴ
４の量と逆に相関した。従って、低いＴ４濃度の溶液は
、これらがフィルムへ塗布される場合、高いＴ４濃度の
溶液よりも色調変化がより高く測定されるであろう。こ
れは図４中のデータに認められる。また、図４は上記試
料へ未調製Ｔ４−ＡＬＰもしくはアフィニティー精製Ｔ
４−ＡＬＰのどちらかを添加した後にそれらを上記薄層
フィルムに塗布した場合に観察されるシグナルを比較し
ている。同濃度のアルカリ性ホスファターゼ活性が試料
へ添加される場合には、アフィニティー精製Ｔ４−ＡＬ
Ｐを用いて得られるシグナルは未精製Ｔ４−ＡＬＰを用
いて得られるシグナルよりも高いことが認められる。

【００５４】

【発明の効果】本明細書に記載される精製方法で新規な
特徴は、Ｔ４−酵素結合体を精製するのに非−Ｔ４アフ
ィニティーカラムの使用にある。Ｔ４ならびにｉ）チロ
キシン（Ｔ４）類縁体に対して産生されそしてｉｉ）チ
ロキシンと交差反応性を有する抗体の間の減少されたア
フィニティーは、Ｔ４アフィニティーカラムを用いるよ
りも、アフィニティーカラムへ吸着された物質の脱離を
容易にする。本発明の方法は、７５％を越える免疫反応
性、好ましくは７５〜１００％の免疫反応性を有する標
識チロキシン結合体を提供する。

【図面の簡単な説明】

【図１】未精製標識Ｔ４結合体の免疫反応性を示すグラ
フ。

【図２】アフィニティーカラムより溶出されるフラクシ
ョンのアルカリ性ホスファターゼ活性を示すグラフ。

【図３】図２の溶出物の免疫反応性を示すグラフ。

【図４】上記例の標識Ｔ４結合体を用いるＴ４について
のアッセイ生成物を示すグラフ。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　（ａ）ｉ）チロキシン（Ｔ４）類縁体
   に対して産生され、そしてｉｉ）チロキシンと交差反応
   性を有する抗体を固定する工程、 （ｂ）標識チロキシン結合体の粗液状混合物を調製する
   工程、 （ｃ）標識チロキシン結合体の液状混合物を固定化され
   た抗体上へ通過させる工程、 （ｄ）固定化された抗体をｐＨ４〜９の緩衝溶液で洗浄
   する工程、ならびに （ｅ）ｐＨ４〜９のチロキシンの緩衝溶液を固定化され
   た抗体上へ通過させることにより免疫反応性標識チロキ
   シン結合体を脱離する工程、を含んでなる免疫反応性標
   識チロキシン結合体を精製する方法。