JPH01226900A - プロテインｃの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はプロティンＣの精製方法に関する。

〔従来技術〕

プロティンＣは、ビタミンにの存在下に合成されるアミ
ノ酸のγ−力ルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）を含有す
る蛋白質の一つであり、血漿からの精製過程におけるク
ロマトグラフィーの分画番号“Ｃ°゛にちなんで命名さ
れたものである。プロティンＣは、分子量６２．０００
の１本鎖糖蛋白質として主に肝で合成され、循環血液中
では大部分は２本鎖分子（Ｌ鎖およびＨ鎖）として存在
する。プロティンＣは、Ｇｌａ含有凝固因子の■因子、
Ｘ因子、■因子と同様のセリンプロテアーゼ前駆酵素で
あり、その構造はこれら因子に類似し、相互に４０％程
度の相同性が存在する。

生体の凝固機転により生成されたトロンビンは、血管内
皮細胞膜上に存在する特異的レセプターであるトロンボ
モジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｓ＋ｏｄｕｌｉｎ）　　と
複合体を形成して、本来の凝固因子としての種々の触媒
作用を失い、もっばらプロティンＣの強力なアクチベー
ターとなる。プロティンＣはこの複合体により限定分解
を受けて活性化プロティンＣ（ＡＰＣ：活性化されたプ
ロティンＣ）となり、抗凝固と線溶促進の両方の作用を
持つ掻めて効率のよい凝固線溶ｔＪ４節因子となる。そ
の作用機作は血小板膜および内皮細胞膜表面のリン脂質
上で、いわゆるテンナーゼおよびプロトロンビナーゼ複
合体中の補酵素であるＦ、ＶａとＦ、ＶＩＩＩａを選択
的に分解し、失活させることで血液凝固反応を強く阻止
する。またＡＰＣは、ｔＰＡ阻害因子のＦＡＩ（プラス
ミノーゲン・アクチベーター・インヒビター）を選択的
に分解し、線溶反応をも促進させる。

プロティンＣの精製方法としては、塩化バリウムによる
沈′ｉｔｉ吸着法、硫安分画、陰イオン交換体による処
理、調製用電気泳動、プロティンＣに対する抗体カラム
、夾雑蛋白質に対する抗体カラムなどが知られている＠
　　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　ｌ。

３５５〜３６３　（１９７６）、同、　２５ｉＬ１９１
４〜１９２０　（１９８３）。

Ｊ、　Ｎａｒａ　Ｍａｄ　Ａｓｓ、、　Ｊ５！、　４４
８〜４５４　（１９８４）。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、　　２ｊ２Ｊ、　１１
０９７〜１１１０５　（１９８６）　。

Ｔｈｒｏｍｂ、　ｌ１ａｅｓ＋ｏｓｔａｓ、、　ｉｌｌ
、　１〜５　（１９８３））しかし、上記の方法によっ
ては、精製度、収率、作業効率の点で満足すべき結果が
得られない、あるいは蛋白質の大量精製には不向きであ
ることが本発明者らによって知見された。

〔発明が解決しようとする課題〕

そこで本発明者らは、プロティンＣを効率良く精製単離
できる方法を検討したところ、等電点沈澱法、逆相クロ
マトグラフィーの使用が有効であることを見出し、さら
に、これらの工程を軸としたプロティンＣの精製方法を
見出し、本発明を完成した。

〔課題を解決するための手段〕

即ち、本発明は次の通りである。

発明１ニ プロティンＣ含有溶液を等電点沈澱法により、ｐＨ４〜
６の条件下で処理して上清を回収する工程を含むことを
特徴とするプロティンＣの精製方法。

発明２ニ プロティンＣ含有溶液を逆相クロマト用担体にｐＨ１〜
２の条件下で添加した後、有機溶媒濃度１０ｖ／ｖ％か
ら８０ｖ／ｖ％までの濃度勾配で溶出する工程を含むこ
とを特徴とするプロティンＣの精製方法。

発明３ニ プロティンＣ含有溶液を （ａ）　　等電点沈澱法により、ｐＨ４〜６の条件下で
処理して上清を回収する工程、 （ｂ）　　陽イオン交換体にｐｌ（４〜６の条件下で添
加シタ後に塩濃度０．１〜２Ｍの条件で溶出させる工程
、 （Ｃ）　　陰イオン交換体にｐＨ６〜９の条件下で添加
した後に塩濃度０．２から２Ｍまでの濃度勾配で溶出さ
せる工程、 （ｄｌ　　分画分子量範囲１０００〜１００万のゲル濾
過用担体を用いてゲル濾過を行う工程、（ｅ）　　固定
化硫酸子ｗ類にｐＨ５〜７の条件下で添加した後に塩濃
度ＯＭがら２Ｍまでの濃度勾配で溶出させる工程、 （「）逆相クロマト用担体にｐＨ１〜２の条件下で添加
した後に有機溶媒４度１０ｖ／ｖ％から８゜ｖ　／　ｖ
％までの濃度勾配で溶出させる工程、からなるプロティ
ンＣの精製方法。

〔１〕出発原料 本発明で使用されるプロティンＣ含有溶液は、ヒト血漿
に由来するものであれば特に限定されない 具体的には血ＩＦ！凝固■因子含存画分、濃縮プロトロ
ンビン複合体台を画分およびその他プロティンＣ含存画
分等が例示される。

〔２〕情製方法 （ａ）　　等電点法５法 等電点沈澱法とは、蛋白質が等電点において溶解度が最
小になって沈澱を生じるのでこれを利用して、蛋白質を
精製する方法である。

即ち、本工程においてはプロティンＣ含有溶液をｐＨ４
〜６の条件下で処理して上清を回収する。

その際の処理温度は２〜６°Ｃであり、処理時間は６〜
２４時間である。

当該処理後、５０００〜２万ｇ、１０〜６０分間遠心分
離して上清を回収する。

（ｂ）　　陽イオン交換体による処理 （ａ）で得たプロティンＣ含有溶液を陽イオン交換体に
ｐＨ４〜６の条件下で添加する。

陽イオン交換体としてはカルボキシメチル基をリガンド
とするＢａｋｅｒｂｏｎｄ　ＣＢｘあるいはＣＭ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂ等が例示される。

その後、開−ｐＨ１塩濃度０．１〜２Ｍの条件で溶出さ
せたプロティンＣ含有画分を回収する。

（Ｃ）　　陰イオン交換体による処理 （ｂ）で得たプロティンＣ含有溶液を陰イオン交換体に
ｐＨ６〜９の条件下で添加する。

陰イオン交換体としては高速液体クロマトグラフ用Ｍｏ
ｎｏ　Ｑ　（ＱＡＥ系）等が例示される。

その後、同−ｐ）ｌ、塩濃度０．２〜０．３Ｍの条件で
洗浄した後、同−ｐ）ｌ、塩濃度０．２Ｍから２．０Ｍ
までの濃度勾配で溶出を行い、プロティンＣ含有画分を
回収する。

（（支）ゲル濾過 （Ｃ）で得たプロティンＣ含有溶液を分画分子量範囲１
０００〜１００万のゲル濾過用担体に添加する。

このような担体としてはアガロースを基材とした高速液
体クロマトグラフ用５ａｐｅｎｓｅ　１２等が例示され
る。

溶出は、ｐＨ６〜Ｂ、塩濃度０．１〜２Ｍで行いプロテ
ィンＣ含有画分を回収する。

（ｅ）　　固定化硫酸多ａｍによる処理（ｄ）で得たプ
ロティンＣ含有溶液をｐＨ５〜７の条件下で固定化硫酸
多Ｉ！類に添加する。

固定化硫酸多糖類としては硫酸デキストラン、ヘパリン
をリガンドとする５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ４Ｂ等が例
示される。

その後、開−ｐＨ２塩濃度ＯＭから２．０Ｍまでの濃度
勾配で溶出を行い、プロティンＣ含を画分を回収する。

（ｆ）　　逆相クロマトグラフィー ｔｅｌで得たプロティンＣ含有溶液をｐＨ１〜２の条件
下で逆相クロマトグラフィー用担体に添加する。

逆相クロマトグラフィー用担体としてはｃｌをリガンド
とした逆相カラム等が例示される。

その後、開−ｐＨ１有機溶媒（たとえば、アセトニトリ
ル、メタノール、エタノール、プロパツール、ジオキサ
ン等）濃度１０　ｖ　／　ｖ％から８０ｖ／Ｖ％までの
濃度勾配で溶出を行い、プロティンＣ含有画分を回収す
る。

なお、各々の工程を行った後、所望により硫安分画ある
いは透析等を行う。

すなわち、硫安分画はプロティンＣ含有溶液を６０〜８
０％飽和濃度の硫安で処理し、その沈澱画分を回収する
ことにより行われる。

また、透析は、ｐＨ４〜７の条件下に２〜６°Ｃ１６〜
２４時間行われる。

本発明においてはさらに、公知の精製工程を組み合わせ
ることも可能である。

か（して得られたプロティンＣは、生化学用、薬理学用
の試薬として用いてもよく、また、医薬品として用いる
場合には医薬品製造の通例技術に従って、要すれば、滅
菌、除菌、凍結乾燥、製剤化等を行えばよい。

〔効果〕

本発明の方法によれば、プロティンＣを効率よく単離精
製できる。しかも、本発明の方法は操作が簡略で、大規
模製造にも適用できる。従って、プロティンＣの精製方
法として極めて有用である。

（実施例〕 本発明をより詳細に説明するために、実施例を挙げるが
、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない
。

（１１精製方法 １〕クリスマシン製剤ｌバイアルに１０献の蒸留水を加
えて、完全に溶解させた後、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、
ｐＨ５，０の緩衝液で透析した。透析後、ｉｏ、　ｏｏ
ｏ　ｃで２０分間遠心分離して上清画分を回収した。

２）陽イオン交換クロマトグラフィー 上清画分をＢａｋｅｒｂｏｎｄ　ＣＢｘに添加した。開
始バッファーに２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ＰＨ５，０を
、ン容出バッファーに１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ酢
酸ナトリウム、ｐ）１５．０を使用した。試料添加後開
始バッファーで洗浄した後、溶出パンファーに切換え、
パス画分を回収した。

３）陰イオン交換クロマトグラフィー 透析復液をＭｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ６０／１０（またはＱ　
ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨｉｇｈ　Ｐｅｆｏｒｍａｎｃｅ　
６０／１００）に添加した。開始バッファーに２０ｖＭ
）リス塩酸、ｐＨ７，１５を、溶出バッファーに１Ｍ塩
化ナトリウム、２０ｍＭ）リス塩酸、ｐ）１７．１５を
使用した。試料添加後、３０％（Ｖ／ν）溶出ハンファ
ー／開始バッファーで洗浄した後、３０％→４０％溶出
バッファー／開始パンファーのリニアーグラジェント溶
出を行い、活性画分を回収した。

４）ゲルフィルトレージョンクロマトグラフィ透析復液
を５ｕｐｅｒｏＳｅ　１２　ｐｒｅｐ　ｇｒａｄｅ　６
０／６００に添加した。ｉ８離バッファーに２０−Ｍト
リス塩酸、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７，２緩衝
液を使用し、活性画分を回収した。

５）デキストランサルフェートクロマトグラフィー 透析復液を硫酸デキストランをリガンドにしたセファロ
ースＣＬ４Ｂに添加した。開始バッファーには２５ｍＭ
イミダゾール、ｐＨ６を、溶出バッファーにはｌ塩化ナ
トリウム、２５＋＋Ｍイミダゾール、ｐＨ６，０を使用
した。試料添加後、０％→５０％溶出バッファー／開始
パンファーのりニア−グラジェント溶出を行い、′活性
画分を回収した。

６）逆相クロマトグラフィー 得られた両分を０８をリガンドとした逆相カラムに添加
した。ストック溶液Ａ（０，１％テトラフルオロ酢酸含
有蒸留水）・Ｂ（８００−のアセトニトリルをＡｆｉ、
で１．０００　ａＺとしたもの）をａｌｌ製し、開始パ
ンファーは４００ＩＩ７のＢ液にＡ液を加えて１．００
０　ａｔとしくアセトニトリル最終濃度３２％）、溶出
バッファーは５００ａＺのＢ液にＡ液を加えて１．００
０−とじて（アセトニトリル最終濃度４０％）使用した
。開始バッファーで洗浄後、０％→５０％溶出パンファ
ー（実際のアセトニトリル濃度は３２％→３６％）のリ
ニアーグラジェント溶出を行った０分画後各フラクショ
ン中の有機溶媒を減圧乾燥させた。

〔２〕測定 １）オフタロニー法 常法通りに作成した１、２％の寒天ゲルに試料および各
種抗血清を１０μずつ添加した。４°Ｃで一晩放置して
沈降線を確認後に、同ゲルを濾紙で脱水・生理食塩水で
洗浄し、脱水洗浄をさらに２回。

繰り返したのちに常法通りにクーマシー染色した◆２）
免疫電気泳動法 １．２％の寒天ゲルを作成しくｐ）１Ｂ、６、μｍ０．
０６）、試料１０パを添加後、ゲル中１０曹あたり２ｍ
Ａで約４時間、４°Ｃで泳動した。泳動後、各溝に抗血
清１００μを添加し、４°Ｃで一晩放置して沈降線を確
認後に、同ゲルを濾紙で脱水・生理食塩水で洗浄し、脱
水洗浄をさらに２回繰り返したのちに常法通りにクーマ
シー染色した。

３）活性測定法 試料は２０−門トリス塩酸、１００＠Ｍ塩化ナトリウム
、ｐＨ，５緩衝液にて希釈後、測定に供した。

プロタックＣ（ＰＲＯＴＡＣＣ）　（３単位／バイアル
）は痕留水１２−で希釈して使用した０発色基質ＭＣＡ
−３１１２ｖば、ｌバイアル（５，Ｉ　Ｎ、　７．０　
μｍｏｌｅ）の内容物をｌａ／のジメチルスルホキシド
で完全に溶解した後、８５−の２０ｍＭトリス塩酸、ｐ
）１８．５緩衝液で希釈して使用した０反応停止液は、
２０％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液を使用した。測定フローシ
ートを第１表に示した。

第１表　プロタックＣを使ったプロティンＣ分析法プロ
タックＣサンプル　　　　　５０ｓｔ■ ３０°Ｃｌ２Ｏ分間インキュベート ３０°Ｃ５２０分間インキュベート 精製ステップ、活性回収率および精製度を第２表に示し
た。

第２表 等電点沈澱　　２０００　３６．９　　１．０２０　　
１００　　　１９６陽イオン　交Ｉ桑　　　　２４００
　　　１８．０　　　　　　８０８　　　　　９５　　
　　　　３１８り■マドグラフ（− 陰イオン　交換　　　　　２９０　　　２５．９　　　
　４．０１２　　　　５７　　　　１．０９９クロマト
クラフイー ゲル濾過　　　　　６７　２８．０　１３．１９５　　
４３　　３．３４２りＵマトクラフィー クロマドグラフイー 逆相　　　　　３５０　　０．３２　２，００１　　３
４　４４，３４２クロマトクラフイー 〔４〕精製プロテインＣの物理化学的性状５Ｏ３−ＰＡ
ＧＥ法による分子量測定の結果、非還元下の５ＯＳ−Ｐ
ＡＧＥでは分子量６２，０００に一本のバンドを認め、
還元条件下では分子量４１，０００（Ｈｌｌｔ）と２１
，０００（Ｌ鎖）に二本のバンドを認めた。

免疫電気泳動では、α位にのみ一本の明瞭な沈降線を認
め、抗正常ヒト血清ウサギ血清をはじめ抗ヒトＰＳ、　
Ｆ、ＩＩ、　Ｆ、ＩＸ、　Ｆ、Ｘウサギ血清とは沈降線
を形成しなかった。

等電点電気泳動の結果、プロティンＣはｐｌ　３．８〜
４．２の間に連続したバンドとして認められた。

以上の結果から、単離されたプロティンＣは純度９９％
以上と推定された。

ｍ−」 手続十甫正書（自発） １、事件の表示 昭和６３年特許願第５４１５９号 ２、発明の名称 プロティンＣの精製方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字 ４、代理人■５４１ 住所　大阪市東区平野町４丁目５６番地（場末ビル） Ｔａ　（０６）　２２７−１１５６ ６、補正の内容 （１）明細書第１５頁第２行の「プロタックＣサンプル
」を「プロティンＣサンプル」に訂正する。

（２）明細書第１６頁第２表の プロトロシビン　　　　　　２２００　　　６７．１　
　　　９２７　　　　　　１００　　　　　　９８複合
体濃度　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　」
を ブ日トロシビン　　　　　　　　２２００　　　６７．
１　　　　９２７　　　　　１００　　　　　９８複合
体濃縮液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　」
に訂正する。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロテインＣ含有溶液を等電点沈澱法により、ｐ
   Ｈ４〜６の条件下で処理して上清を回収する工程を含む
   ことを特徴とするプロテインＣの精製方法。
2. （２）プロテインＣ含有溶液を逆相クロマト用担体にｐ
   Ｈ１〜２の条件下で添加した後、有機溶媒濃度１０ｖ／
   ｖ％から８０ｖ／ｖ％までの濃度勾配で溶出する工程を
   含むことを特徴とするプロテインＣの精製方法。
3. （３）プロテインＣ含有溶液を、 （ａ）等電点沈澱法により、ｐＨ４〜６の条件下で処理
   して上清を回収する工程、 （ｂ）陽イオン交換体にｐＨ４〜６の条件下で添加した
   後に塩濃度０．１〜２Ｍの条件で溶出させる工程、 （ｃ）陰イオン交換体にｐＨ６〜９の条件下で添加した
   後に塩濃度０．２から２Ｍまでの濃度勾配で溶出させる
   工程、 （ｄ）分画分子量範囲１０００〜１００万のゲル濾過用
   担体を用いてゲル濾過を行う工程、 （ｅ）固定化硫酸多糖類にｐＨ５〜７の条件下で添加し
   た後に塩濃度０Ｍから２Ｍまでの濃度勾配で溶出させる
   工程、 （ｆ）逆相クロマトグラフィー用担体にｐＨ１〜２の条
   件下で添加した後に有機溶媒濃度１０ｖ／ｖ％から８０
   ｖ／ｖ％までの濃度勾配で溶出させる工程、 からなるプロテインＣの精製方法。