JPH01148185A - 逆相液体クロマトグラフィーによるｔ−ＰＡ精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は、組織プラスミノーゲン活性因子（１−Ｐ＾）
を含む組織抽出画分、培養細胞抽出画分、培養細胞培養
上清、あるいはそれらの濃度画分や粗精製画分を逆相液
体クロマトグラフィーで展開しｔ−ＰＡを他の細胞成分
または培地成分から分離し、高純度ｔ−ＰＡを得る方法
に関する。

（２）従来の技術 ｔ−ＰＡの精製に関連する技術としては、亜鉛キレート
カラムあるいはコンカナバリンＡカラムを用いたカラム
クロマトグラフィー（Ｒｉｊｋｅｎ、　Ｄ、Ｃ，＆Ｃｏ
１１ｅｎ、　Ｄ、、　（１９８１）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅｗ、、−だ坦、７０３５）、エリスリナトリプシ
ンインヒビターアフィニティカラムクロマトグラフィー
（特開昭５９−１１０６２５）、イオン交換カラムを用
いたカラムクロマトグラフ４−　（Ｓｕｅｉｓｈｉ、に
、ｅｔ　ａｌ、＋　（１９Ｂ２）、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　Ｊｕ、３２７）　、抗ｔ−
ｐ＾抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィー、リ
ジンまたはアルギニンセファロースカラムクロマトグラ
フィー（Ｅｉｎａｒｓｓｏｎ、　Ｍ、ｅｔ　ａｌ、　＋
　（１９８５）　＋　Ｂｉｏｃｈｉｓ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、Ａｃｔａ、　ｌ　１　）等各種液体カラムクロマトグ
ラフィーが知られている。

各種液体カラムクロマトグラフィーでｔ−ＰＡを分離、
精製する場合、ｔ−ＰＡの分離を助ける目的で溶離液中
に各種有機物または無機物を添加するので、次のステッ
プでｔ−ＰＡとそれら添加物を分離する必要が生じる。

その為に通常はさらに他の液体カラムクロマトグラフィ
ーを行なう必要があり、精型物を得る為に煩雑かつ長時
間の工程を要した。

（３）発明が解決しようとする問題点 従来の技術を用いて各種液体クロマトグラフィーでｔ−
ＰＡを精製を行うと、ｔ−ＰＡをカラムから溶出する際
に使用する溶離液中に含まれる各種有機物あるいは無機
物をｔ−ＰＡと分離する為に多大な労力と時間を要した
。

そこで逆相液体クロマトグラフィーを用い、易揮発性有
８１溶媒を含む極性移動相を用いてｔ−ＰＡを分離、精
製する−ことができれば、そのステップでｔ−ＰＡと極
性移動相である分離用溶液との分離は減圧上蒸発により
簡単にできるので有用である。

しかしながら、＄Ｊ！１１を有し分子量が比較的太きく
　（Ｍ、１１．約ＴＯＫＤａ）かつ複雑な立体構造をつ
くるといった特徴を有するｔ−ｐ＾を逆相液体クロマト
グラフを用い分離を試みると、その性質に由来してｔ−
ＰＡと逆相カラムを構成する活性基、あるいはその活性
基の担体との間で予想外の相互作用を起こし、予想され
るシャープな展開パターンでの分離なし得なくなる。

本発明者らは、上述のｔ−ＰＡの逆相カラム内での非特
異的吸着の問題を易揮発性有機溶媒を含み、かつ水素イ
オン濃度が、下限がカラム担体が溶解せず、上限がｔ−
ＰＡ＠ｔ８１１１１する条件を満たす範囲である極性移
動相を使用することで解決し、その結果得られた高純度
ｔ−ＰＡに生理学的活性の低下がないことを発見し、本
発明を完成するに到った。

本発明を用いると従来分離が容易でなかった１重鎖ｔ−
ＰＡと２本Ｉｔ−ＰＡを容易に分離できることがわかり
、フィブリン親和性の高い１本ｔｉｔ−ＰＡ　（Ｒｔｊ
ｋｅｎ、Ｄ、Ｃ，ｅｔ　　ａｌ、＋（１９８２）、Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５ヱ、２９２０）を簡単に得
ることができるので有用である。

本発明は、また、いわゆる高性能液体クロマト　。

グラフ（ＨＰＬＣ）を使用することにより、従来のカラ
ムクロマトグラフィーに比べ非常に短い時間で分離を終
了させることが容易に可能となるので有用である。

（４）問題を解決するための手段 本発明のいう逆相液体クロマトグラフィーは非極性固定
相と極性移動相で構成される。

非極性固定相の活性基（Ｒ）としてはｈがＯから２０で
あるアルキル基（Ｒニー（ＣＨｔ）−ＣＨｓ　）　、シ
アノアルキル基（Ｒニー（ＣＨｚ）ａ　ＣＮ）　、フェ
ニルアルキル基、ジフェニルアルキル基等が有効である
ことが知られており、活性基の担体としては通常シリカ
が用いられ、それら両者で構成される非極性固定相はカ
ラムに充填され使用される。

活性基がアルキル基であるＣ４またはＣＩｌ逆相カラム
は市販されており、入手も容易で本発明の目的を達成す
るが、逆相液体クロマトグラフィーとして働＜Ｃ１、Ｃ
１、Ｃ６あるいは上述の他の非極性活性基ならいかなる
ものも使用できる。

本発明で用いられる極性移動相は、水を主成分とする溶
液Ａと易揮発性有機溶媒を主成分とする溶液Ｂを任意の
割合で混合して供給される溶液である。

本発明で用いられる極性移動相の水素イオン濃度は、下
限がカラム担体が溶解せず、上限がｔ−ｐ＾を溶離する
条件を満たす範囲に設定する。

すなわち、極性移動相の水素イオンはｔ−ＰＡと非極性
固定相との予期せざる相互作用をさける目的で中性付近
より、より低く設定する。ある特定な条件で逆相カラム
でｔ−ＰＡを分離する場合、極性移動相の水素イオン濃
度は４．５より低くする。より好ましくには３．５より
低（する。

もちろん、極性移動相の水素イオン濃度が低すぎると、
非極性固定相担体の溶解の問題が生じ、またｔ−ＰＡ自
身の変性の可能性も高まるのでそれらの問題が起きない
程度の水素イオン濃度でなければならない。

すなわち、ある特定な条件で逆相カラムでｔ−ｐ＾を分
離する場合、極性移動相の水素イオン濃度は１．０より
高（する。

極性移動相に使用する溶液Ｂの主成分は親水性かつ易揮
発性有機溶媒ならいかなるものでも良いが、アセトニト
リル、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノー
ル、ｎ−プロピルアルコール、あるいはこれらの混合物
を使用するとプラスミノーゲン活性化因子の活性をそこ
なうことなく効率的な分離、精製を行うことができ、ま
た分離後それら親水性かつ易揮発性有機溶媒を減圧上蒸
発により効率的に除くことができる。

極性移動相に使用する溶液Ａの主成分は水であるが、Ｐ
Ｒを調整して用いる。ｐ■調整は揮発性の酢・酸等でも
良いが、イオン対形成剤として効果的な働きのあるトリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ）、過塩素酸を使用すると分離能
が向上するので望ましい、　０．１ＸＴＦＡ溶液の９Ｈ
は約１．７であるので、これを基準としてｐｎ　１．９
以上にするときは０．１χＴＦＡ溶液を、例えば、トリ
メチルアミンで滴定して作成すると良い。ＴＦＡは溶液
Ｂに添加してもしなくても良い。

本発明の逆相液体クロマトグラフィーは、カラム充填剤
の粒子が非常に小さく、堅く強固であり良くデザインさ
れた装置により高分解能、高圧、高速といった特徴を有
する、いわゆる高性能液体クロマトグラフ（Ｉ（ＰＬＣ
；旧ｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　１ｉｑｕｉｄ　ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を適用すると短時間で効
率良い分離が行えるので必要に応じてＨＰＬＣを利用す
ると良い、　ＨＰＬＣについては（Ｈａｎｃｏｃｋ、＠
、Ｓ、ａｎｄ　Ｓｐａｒｒｏｗ、Ｊ、？、、（１９８４
）＋ＨＰＬＣＡｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌＣｏ＊ｐｏｕｎｄＳ＋Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　　Ｇｕｉｄｅ、Ｍａｒｃｅｌ　　［１ｅｋｋｅｒ、
ＩＮＣ，Ｐ１１３６１）に詳細な説明がある。

本発明でいう組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−Ｐ
Ａ）は、線維素溶解系（ｆｉｂｌｉｎｏｌｙｓｉｓ）で
働く酵素であり、それが働くことにより血栓の構成成分
であるフィブリンクロット（ｆｉｂｌｒｉｎ−ｃｌｏｔ
）の熔解が始まることから血栓症に於ける新規な治療薬
として有用である。

ｔ−ＰＡは分子量的６５，０００の糖たんばく質でｓ−
ｓ結合によりクリングルが２個である立体構造をとると
されている（Ｖｅｈａｒ、Ｇ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、（１
９８４）、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＩｏｇＶｔ　！＋　１０
５１）　＊ｔ−ＰＡは元来１本鎖であるがプラスミンに
より所定分解を受けると２本鎖となる（Ｗａｌｌｅｎ　
Ｐ、ｅｔ　ａｌ、＋（１９８３）＋Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、、　１３２　：　６８１）。この２末鎖ｔ−
ｐ＾はメルカプトエタノール等で還元するとＳ−８結合
が切断され、ＳＯ３−ポリアクリルアミド電気泳動で２
本のバンドとして検出される。

ｔ−ＰＡはフィンガー領域とクリングル領域とそれに続
くセリンプロテアーゼ領域から成り立っており、セリン
プロテアーゼ領域には酵素活性中心があり、前者の２領
域にはフィブリン結合部位、インヒビター結合部位があ
る０例えば、フィンガー領域を欠＜　ｔ−ＰＡ　（Ｋａ
ｇｉｔａｎｉ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、（１９８５）、ＦＢＢ
ＳＬｅｔｔｅｒｓ、　皿１４５）やクリングルを除いた
ｔ−ｐ＾（特開昭６２−４８３７８）やポリクリングル
（例えば３〜４個のクリングル）　、ｔ−ＰＡ　（特開
昭６２−１０４５７７）の例が報告されており、これら
欠除、修飾、あるいは変異にあるｔ−ＰＡについても関
連物質としてここではｔ−ｐ＾に含める。

ｔ−ＰＡ以外のプラスミノーゲン活性化因子である、い
わゆるウロキナーゼといわれていた分子量的５４ＫＤａ
の尿プラスミノーゲン活性化因子（Ｕ−ＰＡ）あるいは
その関連物質、プラスミノーゲン活性化因子以外の酵素
、Ｔ−あるいはβ−インターフェロン等リすフォカイン
、コロニー刺激因子あるいはエリスロポイエチン等の成
長因子、ホルモンあるいはＨＢｓＡｇ等ウィルス抗原あ
るいはガン関連抗原といった糖鎖を有する蛋白質につい
てもプラスミノーゲン活性化因子と糖鎖を含むことで共
通点があり、本発明の逆相液体カラムクロマトグラフィ
ー法で分離、精製できると容易に推察できる。

以下に本発明の具体例をヒトｔ−ＰＡの分離、精製を例
にとって詳細に説明する。

本発明の方法ではヒトｔ−ｐ＾を含む混合物を逆相液体
カラムクロマトグラフで展開し、ｔ−ＰＡを他の混入物
から分離、精製する。また逆相液体クロマトグラフの分
離条件の設定のしかたによってはｔ−ＰＡのサブタイプ
である１本鎖ｔ−ＰＡと２末鎖ｔ−ＰＡを分離すること
ができる。

ヒ）　ｔ−ＰＡの分離、精製の出発材料にはヒト腎臓抽
出画分（特開昭５９−８０６１４）、メラノーマボウズ
（Ｂｏｗｅｓ）株培養上清（Ｒｉｊｋｅｎ、口、Ｃ，ａ
ｎｄ　Ｃｏ１１ｅｎ、　Ｄ、　、　（１９８１）　、Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、　、ｊ２６．７０３５）あるい
はヒト正常細胞（２ｎ＝４６）　、ヒトｔ−ＰＡ遺伝子
が導入された組換え体マウスＣ１２７細胞、組換え体ミ
エローマ細胞、組換え体チャイニーズ、ハムスター細胞
あるいは組換え体ヒト細胞（特開昭６２−１２６９７８
　）の培養上清等があるが、これらに限らすヒ）　ｔ−
ＰＡを含む組織抽出画分、培養細胞抽出画分、培養細胞
培養上清、組換え体抽出画分、組換え体培養上清あるい
は他のｔ−ＰＡを含む混合物であればいかなるものでも
良い。

ヒ）　ｔ−ＰＡを含む上述の混合物は、通常ヒ）　ｔ−
ＰＡの含有量が低いのであらかじめ抗ｔ−ＰＡ抗体カラ
ム、リジンまたはアルギニンセファロースカラム（Ｅｉ
ｎａｒｓｓｏｎ、　Ｍ、ｅｔ　ａｌ、＋（１９８５）＋
Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ　８３　１〜１０）、エリスリナトリプシンイ
ンヒビターカラム（特開昭５９−１１０６２５）　、亜
鉛キレートカラムあるいはコンカナバリンＡカラム（Ｒ
ｉｊｋｅｎ、　Ｄ、Ｃ，＆　Ｃｏ１１ｓｎ、０１（１９
８１）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５６．７０３５
　）　、イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｓｕｅ
ｉｓｈｉ、に、ｅｔ　ａｌ、、（１９８２）Ｊｉｏｃｈ
ｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｅｔａシ１ｉ３２７〜３３
６）等を用いヒトｔ−ＰＡの濃縮を行い、また同時にあ
る程度精製しておいた方が本発明の効果をより良く出せ
るので望ましい。

部分精製して得た少量の不純物を含むヒ１−ｔ−ＰＡ画
分を、逆相液体クロマトグラフィーを構成する極性移動
相の初期条件の溶液に溶解せしめ、逆相カラムに対しア
プライし、増大する濃度の易揮発性有機溶媒を含む極性
移動相を使用して展開しヒ）　ｔ−ＰＡを他の混合物、
すなわち細胞成分、培地成分あるいはその他の添加物よ
り分離し、高純度ヒ）　ｔ−ＰＡを得、あるいは必要が
あれば展開条件を厳しく設定することで１本１ｉｔ−Ｐ
Ａと２重鎖ｔ−ｐ＾を分離する。

極性移動相は水を主成分とする溶液Ａに対しグラジェン
トあるいは段階を追って易揮発性有機溶媒を主成分とす
る溶液Ｂが混合され供給される溶液である。

ヒ）　ｔ−ＰＡと他の物質との分離、また１末鎖ｔ−Ｐ
Ａと２本ｔｌ’Ｊｔ−ＰＡとの分離は、有機溶媒濃度が
増大する極性移動相の使用によってなされる。

Ｃ４逆相カラムを使用したｔ−ｐ＾を分離、精製する場
合、極性移動相の水素イオン濃度は１以上４．５以下、
好ましくは１以上３．５以下に調整し用いる、また、そ
の場合極性移動相の０．１％程度のトリフルオロ酢酸（
ＴＦＡ）を添加すると分解能が高まるので好ましい。

ヒトｔ−ｐ＾は、例えば０．１％ＴＦＡを含むｐＨ１，
９、ｐＨ２，５あるいはその付近の溶液Ａおよびアセト
ニトリルあるいはイソプロピルアルコールである溶液Ｂ
を使用したグラジェント溶出法でＣ４逆相カラムで特異
的ピークとして分離される。

分離されたヒトｔ−ｐ＾をＣ４逆相カラムを用い上述の
方法で再び展開し分析すると他の混入蛋白質由来のピー
クは認められないかわずかであり、上述の方法で分離し
た場合、純度が９９％以上と計算される。

１末鎖ｔ−ＰＡと２末鎖ｔ−ＰＡの分離は、例えばＣ４
逆相カラムを使用し、０．１％程度の濃度のＴＦＡを含
むｐ）１２．５付近の極性移動相の溶液Ａとアセトニト
リルである溶液Ｂを使用した３５％から３７．５％まで
の、あるいはその付近のリニアグラジェント法を用いる
ことによってなされる。

もちろん上述の分離例は１つの例であって逆相カラムで
あるならいかなるものでも原理的に測用可能であり、水
素イオン濃度の条件を満たしていれば溶液Ａに他の少量
の添加物があっても良いし、ＴＦ＾以外のイオン形成剤
を含めても良いし、また溶液Ｂについてはアセトニトリ
ルあるいはイソプロピルアルコール以外の易揮発性かつ
親水性有機溶媒を使用しても良い。

本発明の他の観点からの重要な点は分離され、溶媒の蒸
発によって回収されたヒトｔ−ＰＡにその生理的活性が
あるということである。

上述の方法で分離、精製されたヒ）　Ｌ−ＰＡは、ＴＦ
Ａおよびアセトニトリル等を含む水溶液の形状であるが
、この水溶液を例えば凍結乾燥でｔ−ＰＡ基以外物質を
蒸発により除き適当な溶液に再溶解せしめる。

再溶解したｔ−ＰＡを５Ｏ５−ポリアクリル電気泳動法
（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｏ，に、（１９７０）、Ｎａｔｕ
ｒｅ、　２２７　６８０）で分画しフィブリン−寒天プ
レートを使用する。ザイモグラフ法（Ｇｒａｎｅｌ　１
ｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ＋＾、ａｎｄ　Ｒｅ１ｃｈ＋［ｉ、
　、　（１９７８）　、　Ｊ、Ｉ！ｘｐ、Ｍｅｄ、Ｊ４
ｆｉ、　２２３）でその活性を調べたところオーセンテ
ィックなｔ−ＰＡと同様な分子量に位置にフィブリン−
クロット溶解活性が認められた。

すなわち、本発明の方法によると生理学的活性を保持し
たままヒトｔ−ＰＡあるいは１重鎖ｔ−ＰＡを分。

離、精製することができる。

次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、
これにより本発明は回答制限されるものではない。

本発明の方法を用いると短時間に高純度のｔ−ｐ＾をを
生理学的活性をそこなうことなく精製することができ、
また１重鎖ｔ−ＰＡと２末鎖ｔ−ｐ＾についてもこれら
を分離、精製することができる。高純度のｔ−ｐ＾ある
いは１重鎖ｔ−ＰＡは医薬として利用されることが期待
されているので、これら医薬を分離、精製する分野にも
係るので産業上有用である。

実施例 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

実施例Ｉ ＲｉｊｋｅｎとＣｏ１１ｅｎの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｓ、　、　（１９８１）　。

２５６７０３５）に基づいてメラノーマボウズ（Ｂｏｗ
ｅｓ）株を培養し、ダウドルの方法（特開昭５９−１１
０６２５）ｔ−ＰＡの部分精製物を得た。

すなわち、メラノーマボウズ株を培養し、アプロチニン
入り無血清培地を使用して得た培養上清にトウィーン８
０を０．１％になるように加え、ＮａＣ１を最終濃度が
０．４Ｍになるように加え、酢酸でｐＨ調整（ｐＨ５，
５〜６．０）を行ワた。この溶液をエリスリナトリプシ
ンインヒビ−ター（ＥＴＩ）セルロースカラムに流速４
５ｍ　Ａ！　／ｈでアプライした。カラムをその容量の
６倍以上の０．４ＭＮａＣ１および０．１χトウイーン
８０を含むリン酸緩衡液で洗浄した後、ＥＴ１カラムの
吸着蛋白質を１．６Ｍチオシアン酸カリウムおよび０．
４ＭＮａＣ１を含む生理食塩水で溶離させた。得られた
各両分の蛋白濃度を＾３．。の測定で調べ、またプラス
ミノーゲン依存性フィブリン溶解活性をプラスミノーゲ
ン含有フィブリンプレートで調べ、ｔ−ｐ＾活性のある
蛋白質のピークを分取できた百分を集め、０．１Ｍ酢酸
に対し透析を行いｔ−ＰＡの部分精製物を得た。

得られたＥＴＩカラムによるｔ−ＰＡ部分精製物（１本
領ｔ−ｐ＾、２本領ｔ−ｐ＾混合物）をＳＯ３−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（Ｌａｅｓｍｌｉ、　Ｕ、
　Ｋ、　＋　（１９７０）　＋　Ｎａｔｕｒｅ４３Ｊ、
６８０）で解析した結果いくらかの混入蛋白質が存在し
ていた。

ＥＴＩカラムで得たメラノーマｔ−ｐ＾部分精型物約２
００μｇを凍結乾燥し、０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）　、０．０７％トリメチルアミン（ＴＭＡ　）お
よび１５％アセトニトリルを含む水溶液（ｐＨ２，５）
に溶かし、Ｃ４逆相カラム（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｃｋ　
ＲＰ−４；　５ｙｎｃｈｒｏ−社製）に対しアプライし
、流速１ｍｊ！／ｓｉｎ、カラム温度３４℃でギルソン
社製ＨＰＬＣシステムを用いて極性移動相を構成する溶
液Ａ（０，１χＴＦ＾、０．０７χＴＩＩＡを含むｐ）
ｌ　２．５の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニトリル）
をアセトニトリルが１５％から５０％までのリニアグラ
ジェントとして３５分間かけて分離を行った。

上記の方法でリニアグラジェントで分離すると２８０ｎ
ｗの吸収を示す多くの小さなピークの他に、リチンシラ
ン時間約２６分（ＲＴζ２６）に１ピークが出現した。

主ピークを構成する百分を集め凍結乾燥を行い、得られ
た乾燥品を１００μｌの０．１１’！酢酸に溶解せしめ
た。

０．１Ｍ酢酸に溶解した試料を還元処理をせずに゛その
まま５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し
た後、銀染色であるいはザイモグラフ法（Ｇｒａｎｅｌ
　１ｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ、＾、　ａｎｄ　Ｒｅ１ｃｈ、
Ｅ、、（１９７８）、Ｊ。

Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、」弧、２２３）で分析を行った。銀染
色の結果、分子量約７０にＤａにダブレットの主バンド
を、また分子量約１４０ＫＤａに二量体と考えられるマ
イナーをバンドが観察され、混入蛋白質由来の他のバン
ドは観察されなかった。ザイモグラフで銀染色された蛋
白のバンドと同一の分子量の位置にフィブリン溶解活性
が検出され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの分離
でメラノーマｔ−ＰＡがその生理活性を維持したまま分
離されることが確かめられた０分離されたｔ−ＰＡの比
活性は、クロット溶解時間を測定して（Ｇａｆｆｎｅｙ
、Ｐ、Ｊ、　ａｎｄ　Ａ、Ｄ、Ｃｕｒｔｉｓ＋（１９８
５）、Ｔｈｒｏ＠ｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔ
ａｓｉｓ、且１３４）求めると約４　Ｘ１Ｇ’ｌＵ／ｍ
ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであった。

上記のリニアグラジェント法で得られたｔ−ｐ＾乾燥品
１６０μｇを０．１χＴＦＡ、　０．０７χＴＭ＾およ
び１５χアセトニトリルを含む水溶液（ｐＨ２，５）に
溶かし、再び上記のリニアグラジェント法で逆相カラム
で展開しＡ□。のピークを調べたところＩＩＴが２６分
付近に単一のピークが出現し、混入蛋白質由来の他のピ
ークは認められないか、わずかでありピーク面積の計算
からｔ−ＰＡの純度は９９％以上であった。

メラノーマ細胞の培養液に含まれるアプロチニン、わず
かに含まれる牛血清由来蛋白質またはＥＴＩカラムに含
まれるＥＴＩについてそれぞれ上記のリニアグラジェン
ト法で逆相カラムで展開するとＲＴはそれぞれＥＴＩで
約２４分、牛血清由来の主要な蛋白質で約２８分、また
アプロチニンで約８分となりヒトｔ−ＰＡの約２６分と
重なることがないこと、およびＥＴＩ　、牛血清白蛋白
質、アプロチニン、ヒトｔ−ＰＡを等量混合した試料の
分離を行うと、それぞれの蛋白質はＲＴの差により分離
できることを確認した。

逆相カラムクロマトグラフィに対する極性移動相の水素
イオン濃度の影響を調べる為、極性移動相の溶液Ａを０
．１χＴＰＡ　、　１５χアセトニトリルに対し異なる
濃度のＴＭＡを添加し作成し、種々の水素イオン濃度と
し他の条件は変えずｔ−ＰＡ部分精製物の分離以下の様
に行った。

ＴＭＡ濃度を０．１％とすると溶液ＡのｐＨは１．９と
なり、この水素イオン濃度で上述のリニアグラジェント
法で分離を行ったところ、上述のｐＨ２，５の場合と同
程度にシャープにヒトｔ−ＰＡを分離することができた
。

ＴＭＡ濃度を０．４２％とすると溶液ＡのｐＨは３．５
となり、この水素イオン濃度で上述のリニアグラジェン
ト法で分離を行ったところ、上述のｐＨ２，５の場合に
比較してややシャープさを欠くピークとしてｔ−ＰＡ画
分が得られた。

ＴＭＡ濃度をさらに減少させ溶液ＡのｐＨを４．５以上
にして上述のリニアグラジェント法で分離を行ったとこ
ろ、ｔ−ＰＡのピークはシャープさを欠きピーク面積も
減少した０分離終了後、逆相カラム内を１００％アセト
ニトリルで洗浄するとカラム内に非特異的吸着により残
っていたｔ−ｐ＾が溶出した。

上述のリニアグラジェント法で極性移動相を構成する溶
液Ｂをアセトニトリルに代えてイソプロピルアルコール
とすると、溶液Ａのｐ）を１．９あるいは２．５とする
ときｔ−ＰＡのＲＴは速（なった、そこでグラジェント
の条件を２５％から３５％イソプロピルアルコールのリ
ニアグラジェント（３５分間）に変更すると他の混入蛋
白質と良い分離が得られ、またｔ−ＰＡのシャープなピ
ークが得られることが判明した。分離されたｔ−ＰＡに
フィブリン溶解活性があることがザイモグラフ法で確か
められた。

実施例２ ＲｉｊｋｅｎとＣｏ１１ｅｎの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、、　（１９８１）。

２５６７０３５）に基づいてメラノーマボウズ（Ｂｏｗ
ｅｓ　）株を培養し、Ｅｉｎａｒｓｓｏｎらの方法（Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ＋Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ、　（１９８
５）　、　８３．１）でｔ−ＰＡの部分精製物を得た。

すなわち、メラノーマボウズ株を培養し、アプロチニン
入り無血清培地を使用して得た培養上清にトウィーン８
０を０．１％になるように加え、ｐ。

を７．３に調整し、その培養上清を０．０１％トウィー
ン８０を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化
した抗ｔ−ＰＡ抗体−セファロースカラムに対しアプラ
イした。

その後、カラムをカラム容量の６倍以上の０．２５ｈチ
オシアン酸カリウム、０．Ｏ１％トウィーン８０を含む
０．１Ｍリン酸緩衝液で洗浄した０次に吸着蛋白質を３
．０Ｍチオシアン酸カリウム及び０．０１％トウィーン
８０を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，３
で溶離した。　　２８ｈｓ＋の吸収を測定して蛋白質濃
度を調べ、又、プラスミノーゲン含有フィブリンプレー
トでプラスミノーゲン依存性フィブリン溶解活性を調べ
た。これによって得られたフィブリン溶解活性と対応す
る蛋白質のピークを分取したフラクシヨンを集めた。

この画分をＯ，１Ｍ酢酸に対して透析しｔ−ｐ＾部分精
製物を得た。

得られた抗ｔ−ｐ＾抗体カラムによるｔ−ＰＡ部分精製
物をＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｌａ
ｅｗ＋＊ｌ　Ｌ　Ｕ、に、（１９７０）　＋　Ｎａ　ｔ
ｕｒｅＩ＋　６８０　）で解析した結果、い（らかの混
入蛋白質が認められた。

抗体カラムで得たメラノーマｔ−ＰＡ部分精型物約２０
０μｇを凍結乾燥し、０．１！）リフルオロ酢酸（ＴＰ
Ａ）、０．０７％トリメチルアミン（ＴＭＡ　）および
１５％アセトニトリルを含む水溶液（ｐＨ２，５）に溶
かし、Ｃ４逆相カラム（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｃｋ　ＲＰ
−４；　Ｓｙｎｃｈｒｏｍ社製）に対しアプライし、梳
速ｌｌ１ｆｆｉ／ｌ１１ｎ、カラム温度３４℃でギルソ
ン社製ＨＰＬＣシステムを用いて極性移動相を構成する
溶液＾（０，１χＴＦＡ　、　０．０７χＴＭ＾を含む
ｐＨ２，５の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニトリル）
をアセトニトリルが１５％から５０％までのリニアグラ
ジェントとして３５分間かけて分離を行ワた。

上記の方法でリニアグラジェントで分離すると２８０ｎ
ｍの吸収を示す多（の小さなピークの他に、リテンショ
ン時間約２６分（ＲＴ−２６）に主ピークが出現した。

主ピークを構成する画分を集め凍結乾燥を行い、得られ
た乾燥品を１００μｌのＯ，１Ｍ酢酸に溶解せしめた。

０、１？Ｉ酢酸に溶解した試料を還元処理せずそのまま
Ｓ［ｌＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した
後、銀染色であるいはザイモグラフ法（ＧｒａｎｅｌＩ
ｔ−Ｐｉｐｅｒｎｏ＋Ａ、ａｎｄ　Ｒｅ１ｃｈ、Ｅ、、
（１９７８）＋Ｊ、ｔ！ｘｐ、Ｍｅｄ１．２２３）で分
析を行った。銀染色の結果、分子量的７０ＫＤａにダブ
レットの主バンドを、また分子量的１４０［１ａに二量
体と考えられるマイナーバンドが観察され、混入蛋白質
由来の他のバンドは観察されなかった。ザイモグラフで
銀染色された蛋白のバンドと同一の分子量の位置にフィ
ブリン溶解活性が検出され、本逆相カラムクロマトグラ
フィーでの分離でメラノーマｔ−ＰＡがその生理活性を
維持したまま分離されることが確かめられた０分離され
たｔ−ＰＡの比活性は、クロッ）ｔ９解時間を測定して
（Ｇａｆｆｎｅｙ＋Ｐ、Ｊ、ａｎｄ　Ａ、Ｄ、Ｃｕｒｔ
ｉｓ＋（１９８５）、Ｔｈｒｏｓ＋ｂｏｓｉｓ　ａｎｄ
　Ｈａｅｗｓｏｓｔａｓｌｓ、　Ｊ３．１３４　）求め
ると約４　Ｘ１０’ｒｔｌ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであ
った。

上記のリニアグラジェント法で得られたｔ−ｐ＾乾燥品
１６０μｇを０．１χＴＦＡ、　０１０７χＴＭＡおよ
び１５χアセトニトリルを含む水溶液（ｐｉ（２，５）
に溶かし、再び上記のリニアグラジェント法で逆相カラ
ムで展開しＡ、。のピークを調べたところＲＴが２６分
付近に単一のピークが出現し、混入蛋白質由来の他のピ
ークは認められないか、わずかでありピーク面積の計算
からｔ−ＰＡの純度は９９％以上であった。

メラノーマ細胞の培養液に含まれるアプロチニン、わず
かに含まれる牛血清由来蛋白質または抗体カラムに含ま
れるＩｇＧについてそれぞれ上記のリニアグラジェント
法で逆相カラムで展開するとＲＴはそれぞれＩｇＧで約
３０分、牛血清由来の主要な蛋白質で約２８分、またア
プロチニンはで約８分となりヒトｔ−ＰＡの約２６分と
重なるこ°とがないこと、およびアプロチニン、牛血清
由来蛋白質、ＩｇＧ　、ヒトｔ−ＰＡを等量混合した試
料の分離を行うと、それぞれの蛋白質は訂の差により分
離できることを確認した。

実施９１３ ＲｉｊｋｅｎとＣｏ１１ｅｎらの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、＋　（１９８１）、　２５６７０３５）に基
づいてメラノーマボウズ（ＢｏｗｅＳ）株を培養し、彼
等の方法でコンカナバリンＡカラムを用いてｔ−ＰＡの
部分精製物を得た。

すなわち、メラノーマボウズ株を培養し、アプロチニン
入り無血清培地を使用して得た培養上清にトウィーン８
０を０．１１になるように加え、ｐＨ７，２に調整し、
その培養上清をあらかじめ１．ＯＭ　ＮａＣ１および０
．０１％トウィーン８０を含む０．ＯＩＭ　リン酸緩衝
液ｐｉ　７．５で平衡化したコンカナバリンＡ　（Ｃｏ
ｎＡ）セファロースカラムにアプライした。その後、カ
ラムをその容量の６倍以上の平衡化緩衝液で洗浄した０
次に０．４Ｍα−Ｄ−メチルマンノシドと２Ｍチオシア
ン酸カリ、０．０１％トウィーン８０を含有する０、０
１Ｍリン酸緩衝液でα−Ｄ−メチルマンノシド０から０
．４Ｍ　、チオシアン酸カリ０から２Ｍの直線グラジェ
ントをかけ吸着蛋白を溶出した。

２８０ｎｍの吸収を測定して蛋白質濃度を調べ、又、プ
ラスミノーゲン含有フィブリンプレートでプラスミノー
ゲン依存性フィブリン溶解活性を調べた。これによって
得られたフィブリン溶解活性と対応する蛋白質のピーク
を分取したフラクションを集めた。この百分を０．１Ｍ
酢酸に対して透析しｔ−ＰＡ部分精製物を得た。

得られたＣｏｎ　Ａカラムによるｔ−ＰＡ部分精製物（
１本積ｔ−ＰＡ、　２本鎖ｔ−ＰＡ混合物）を５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｌａｅｍｍｌｉ、
ｔｌ、）１．、　（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ、　Ｊｉ
、６８０）で解析した結果、いくらかの混入蛋白質が認
められた。

ＣｏｎＡカラムで得たメラノーマｔ−ＰＡ部分精製物約
２００　ａ　ｇを凍結乾燥し、０．１％トリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ）　、０．０７％トリメチルアミン（ＴＭＡ
　）および１５％アセトニトリルを含む水溶液（ｐＨ２
，５）に溶かし、Ｃ４逆相カラム（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａ
ｃｋ　ＲＰ−４；　Ｓｙｎｃｈｒｏｍ社製）に対しアプ
ライし、流速１ｍ　ｌ　／ｓｉｎ、カラム温度３４℃で
ギルソン社製！１ＰＬｃシステムを用いて極性移動相を
構成する溶液Ａ（０，１χＴＦＡ　、　０．０７χＴＭ
八を含むｐＨ２，５の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニ
トリル）をアセトニトリルが１５χから５０χまでのリ
ニアグラジェントとして３５分間かけて分離を行った。

上記の方法でリニアグラジェントで分離すると２８０ｎ
ｍの吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンショ
ン時間約２６分（ＲＴ−２６）に主ピークが出現した。

主ピークを構成する両分を集め凍結乾燥を行い、得られ
た乾燥品を１００μｌの０．１）’ｌ酢酸に溶解せしめ
た。

０．１Ｍ酢酸に溶解した試料を還元処理せずそのままＳ
Ｏ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、
銀染色であるザイモグラフ法（Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉ
ｐｅｒｎｏ＋　Ａ、ａｎｄ　Ｒｅ１ｃｈ＋　Ｅ、　＋　
（１９７８）　＋　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１４ｆｉ＋２
２３）で分析を行った。

銀染色の結果、分子量的７０ＫＤａのダブレットの主バ
ンドを、また分子量的１４０ＫＤａの二量体と考えられ
るマイナーバンドが観察され、混入蛋白質由来の他のバ
ンドは観察されなかった。ザイモグラフで銀染色された
蛋白のバンドと同一の分子量の位置にフィブリン溶解活
性が検出され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの分
離でメラノーマｔ−ＰＡがその生理活性を維持したまま
分離されることが確かめられた。

分離されたｔ−ＰＡの比活性は、クロット溶解時間を測
定して（Ｇａｆｆｎｅｙ＋Ｐ、Ｊ、ａｎｄ　Ａ、Ｄ、Ｃ
ｕｒｔｉｓ、（１９８５）。

Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｃｖｏｓｔａｓｉ
ｓ　５３　＋１３４）求めると約４　ＸＩＯ’ｌＵ／ｍ
ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであった。

上記のリニアグラジェント法で得られたｔ−ＰＡ乾燥品
１６０μｇを０．１χＴＦＡ　、　０．０７χＴＭＡお
よび１５χアセトニトリルを含む水溶液（ｐＨ２，５）
に溶かし、再び上記のリニアグラジェント法で逆相カラ
ムで展開しＡつ。。のピークを調べたところＲＴが２６
分付近に単一のピークが出現し、混入蛋白質由来の他の
ピークは認められないか、わずかでありピーク面積の計
算からｔ−ｐａの純度は９９％以上であった。

メラノーマ細胞の培養液に含まれるアプロチニン、わず
かに含まれる牛血清由来蛋白質についてそれぞれ上記の
リニアグラジェント法で逆°相カラムで展開するとＲＴ
はそれぞれアプロチニンで約８分、牛血清由来の主要な
蛋白質で約２８分となり、ヒトｔ−ＰＡの約２６分と重
なることがないこと、およびアプロチニン、牛血清由来
蛋白質、ヒトｔ−ＰＡを等量混合した試料の分離を行う
と、それぞれの蛋白質はＲＴの差により分離できること
を確認した。

実施例４ ＲｉｊｋｅｎとＣｏ１１ｅｎらの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、　、　（１９８１）、　２５６７０３５）に
基づいてメラノーマボウズ（Ｂｏｗｅｓ）株を培養し、
彼等の方法で亜鉛キレートカラムを用いてｔ−ＰＡの部
分精製物を得た。

すなわち、メラノーマボウズ株を培養し、アプロチニン
入り無血清培地を使用し得た培養上清にトウィーン８０
をｏ、ｏｉχになるように加え、ｐＨ７，５に調整し、
その培養上清をＬＭ　ＮａＣ１及び０．０１χトウイー
ン８０を含むｐＨ７，５の０．０２Ｍ　　ｌ−リス塩酸
酸緩衡液で平衡化した亜鉛キレートアガロースカラムに
アプライした。

この後、カラムをＩＭ　ＮａＣ１及び０．０１χ　トウ
ィーン８０を含むＩ）！（７，５の０．０２Ｍ　　トリ
ス塩酸酸緩衡液を洗浄液としてカラム容量の６倍以上洗
浄した。次　　　　　′に上記の洗浄液にイミダゾール
を加えてカラムに０から０．０５Ｍまでのイミダゾール
の直線グラジェントをかけ吸着蛋白を溶離した。

２Ｂ０ｎｍの吸収を測定して蛋白質濃度を調べ、又、プ
ラスミノーゲン含有フィブリンプレートでプラスミノー
ゲン依存性フィブリン溶解活性を調べた。これによって
得られたフィブリン溶解活性と対応する蛋白質のピーク
を分取したフラクションを集めた。この両分を０．１Ｍ
酢酸に対して透析しｔ−ＰＡ部分精製物を得た。

得られた亜鉛キレートカラムによるｔ−ＰＡ部分精製物
（１零鎖ｔ−ＰＡ、　２末鎖ｔ−ＰＡ混合物）を５ＯＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＬａｅＩＩＩ１
１目、ＩＪ、に、、（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ、　　
２２７．６８０）で解析した結果、い（らかの混入蛋白
質が存在していた。

亜鉛キレートカラムで得たメラノーマｔ−ＰＡ部分精型
物約２００　ｔＩｇを凍結乾燥し、０．１％トリフルオ
ロ酢酸（ＴＭＡ）　、０．０７χ　トリメチルアミン（
ＴＭＡ　）および１５χアセトニトリルを含む水溶液（
ｐＨ２，５）に溶かし、Ｃ４逆相カラム（Ｓｙｎｃｈｒ
ｏｐａｃｋ　ＲＰ−４ｉ　ＳＶｎｃｈｒｏｍ社製）に対
しアプライし、流速Ｉｓ　１　／ｗｉｎ。

カラム温度３４℃でギルソン社製ｔｌＰＬｃシステムを
用いて極性移動相を構成する溶液Ａ（０，１χ↑ＰＡ、
０．０７χＴＭＡを含むｐ）ｌ　２．５の水溶液）およ
び溶液Ｂ（アセトニトリル）をアセトニトリルが１５％
から５０％までのリニアグラジェントとして３５分かけ
て分離を行った。

上記の方法でリニアグラジェントで分離すると２８０ｎ
ｍの吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンシ目
ン時間約２６分（ＲＴζ２６）に主ピークが出現した。

主ピークを構成する両分を集め凍結乾燥を行い、得られ
た乾燥品１００＃ｆｆｉの０．１Ｍ酢酸に溶解せしめた
。

０．１Ｍ酢酸に溶解した試料を還元処理をせずそのまま
５ＩｌｌＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し
た後、銀染色であるいはザイモグラフ法（Ｇｒａｎｅｌ
ｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ＋　　Ａ、　　ａｎｄ　　Ｒｅ１
ｃｈ、　　Ｅ−＋（１９７Ｂ）＋Ｊ、Ｅｘｐ−Ｍｅｄ、
１４８２２３　）で分析を行った。銀染色の結果、分子
量的７０ＫＤａにダブレットの主バンドを、また分子量
的１４０ＫＤａに二量体と考えられるマイナーバンドが
観察され、混入蛋白質由来の他のバンドは観察されなか
った。ザイモグラフで銀染色された蛋白のバンドと同一
の分子量の位置にフィブリン熔解活性が検出され、本逆
相カラムクロマトグラフィーでの分離でメラノーマｔ−
ＰＡがその生理活性を維持したまま分離されることが確
かめられた。

分離されたｔ−ＰＡの比活性は、クロット溶解時間を測
定して（Ｇａｆｆｎｅｙ、Ｐ、Ｊ、　ａｎｄ＾、Ｄ、Ｃ
ｕｒｔｉｓ＋　（１９８５）　＋τｈｒｏ＋＊ｂｏｓｉ
ｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　５３１３４）
求めると約４　Ｘ１０’ｌＬＩ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ
であった。

上記のリニアグラジェント法で得られたｔ−ＰＡ乾燥品
１６０μｇを０．１％ＴＦＡ　、　０．０７％ＴＭＡお
よび１５％アセトニトリルを含む水溶液（ｐＨ２，５）
に溶かし、再び上記のリニアグラジェント法で逆相カラ
ムで展開しＡｏ。のピークを調べたところＲＴが２６分
付近に単一のピークが出現し、混入蛋白質由来の他のピ
ークは認められないか、わずかでありピーク面積の計算
からｔ−ＰＡの純度は９９％以上であった。

メラノーマ細胞の培養液に含まれるアプロチニン、わず
かに含まれる牛血清由来蛋白質について、それぞれ上記
のリニアグラジェント法で逆相カラムで展開すると、Ｒ
Ｔはそれぞれアプロチニンで約８分、牛血清由来の主要
な蛋白質で約２８分となり、ヒトｔ−ＰＡの約２６分と
重なることがないこと、およびアプロチニン、牛血清由
来蛋白質、ヒト１−ＰＡを等量混合した試料の分離を行
うと、それぞれの蛋白質はＲＴの差により分離できるこ
とを確認した。

実施例５ ヒト正常細胞（２ｎ　＝４６）培養上清を実施例３と同
様な方法でコンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ　）セファ
ロースカラムで分離し、ｔ−ＰＡの部分精製物を得た。

すなわち、ヒト正常細胞ＭＴＣ０１７株（特開昭６２−
１２６９７８）を培養し、アプロチニンおよび少量の牛
胎児血清を含む培地を使用して得た培養上清よりＣｏｎ
　Ａカラムを用いｔ−ＰＡ部分精製物を得た。

得られたＣｏｎ　Ａカラムによるｔ−ＰＡ部分精製物（
１本鎖ｔ−ＰＡ、２末鎖ｔ−ＰＡ混合物）を５ＯＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｌａｅｍｍｌｋ、υ
Ｊ、　、　（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ、　」ｕ、６８
０）で解析した結果、いくらかの混入蛋白質が存在して
いた。

Ｃｏｎ　Ａカラムで得た正常細胞ｔ−ＰＡ部分精製物約
型物０μｇを凍結乾燥し、０．１χトリフルオロ酢酸（
ＴＦ＾）　、０．０７％トリメチルアミン（ＴＭＡ　）
および１５％アセトニトリルを含む水溶液（ｐｉｆ　２
．５）に溶かし、Ｃ４逆相カラム（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａ
ｃｋ　ＲＰ−４；　５ｙｎｃｈｒｏ＋ｓ社製）に対しア
プライし、流速１＋ｌｌ／ｗｉｎ、カラム温度３４“Ｃ
でギルソン社製ＨＰＬＣシステムを用いて極性移動相を
構成する溶液Ａ　（０，１％ＴＦ＾、０．０７％ＴＭＡ
を含むｐＨ２，５の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニト
リル）をアセトニトリルが１５％から５０％までのリニ
アグラジェントとして３５分間かけて分離を行９た。

上記の方法でリニアグラジェントで分離する・と２８ｏ
ｎ−の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リチンシ
コン時間約２６分（ＲＴ−２６）に主ピークが出現した
。主ピークを構成する画分を集め凍結乾燥を行い、得ら
れた乾燥品を１００μ２の０．１Ｍ酢酸に溶解せしめた
。

０．１Ｍ酢酸に溶解した試料を還元処理をせずそのまま
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後
、銀染色であるいはザイモグラフ法（Ｇｒａｎｅｌ　１
ｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ＋＾、ａｎｄ　Ｒｅ１ｃｈ、！、、
（１９７Ｂ）、　Ｊ、　Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１４８．２２
３）で分析を行った。１！染色の結果、分子量約７０Ｋ
Ｄａにダブレットの主バンドを、また分子量約１４０Ｋ
Ｄａに二量体と考えられるマイナーバンドが観察され、
混入蛋白質由来の他のバンドは観察されなかった。ザイ
モグラフで銀染色された蛋白のバンドと同一の分子量の
位置にフィブリン溶解活性が検出され、本道相カラムク
ロマトグラフィーでの分離で正常細胞ｔ−ｐ＾がその生
理活性を維持したまま分離されることが確かめられた０
分離されたｔ−ＰＡの比活性は、クロット溶解時間を測
定して（Ｇａｆｆｎｅｙ、Ｐ、Ｊ、　ａｎｄ＾、Ｄ、Ｃ
ｕｒｔｉｓ、　（１９８５）、Ｔｈｒｏ＋＊ｂｏｓｉｓ
　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、５３．１３４）求
めると約４Ｘ　１０’ｌＬＩ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎで
あった。

上記のリニアグラジェント法で得られたｔ−ｐ＾乾燥品
１６０μｇを０．ｌχＴＦ＾、０．０７χＴＭＡおよび
１５χアセトニトリルを含む水溶液（ｐＨ２，５）に溶
かし、再び上記のリニアグラジェント法で逆相カラムで
展開しＡ！、。のピークを調べたところＲＴが２６分付
近に単一のピークが出現し、混入蛋白質由来の他のピー
クは認められないか、わずか であり、ピーク面積の計算からｔ−ＰＡの純度は９９％
以上であった。

正常細胞の培養液に含まれるアプロチニン、わずかに含
まれる牛血清由来蛋白質についてそれぞれ上記のリニア
グラジェント法で逆相カラムで展開するとＲＴはそれぞ
れアプロチニンで約８分、牛血清由来の主要な蛋白質で
約２８分となりヒトｔ−ＰＡの約２６分と重なることが
ないこと、およびアプロチニン、牛血清由来蛋白質、ヒ
）　ｔ−ＰＡを等量混合した試料の分離を行うと、それ
ぞれの蛋白質はＲＴの差により分離できることを確認し
た。

実施例６ ヒ）ｔ−ＦＡ遺伝子を組み込んだチャイニーズ、ハムス
ター卵巣細胞の培養上清を実施例２と同様な方法で抗ｔ
−ｐａ抗体カラムで分離し、ｔ−ＰＡの部分精製物を得
た。

すなわち、組換え体チャイニーズ、ハムスター卵巣細胞
（特開昭６２−１２６９７８）を培養し、アプロチニン
および少量の牛胎児血清を含む培地を使用して得た培養
上清よりＣａｎ　Ａカラムを用いｔ−ＰＡ部分精製物を
得た。

得られた抗体カラムによるｔ−ＰＡ部分精製物（１末鎖
ｔ−ＰＡ、　２末鎖ｔ−ＰＡ混合物）を５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（Ｌａｅｓｓｌｉ、υ、に
、、　（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ＋Ｊ釘、６８０）で
解析した結果、いくらかの混入蛋白質が存在していた。

抗体カラムで得た組換え体ｔ−ＰＡ部分精製物約型物ｏ
ａｇを凍結乾燥し、０．１！）リフルオロ酢酸（ＴＦＡ
）　、０．０７χ　トリメチルアミン（ＴＭＡ　）およ
び１５％アセトニトリルを含む水溶液（ｐＨ２，５）に
溶かし、Ｃ４逆相カラム（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｃｋ　Ｒ
Ｐ　−４ｊ　Ｓｙｎｃｈｒｏｍ社製）に対しアプライし
、流速１ｍｆｆ１／ｍｉｓ、カラム温度３４°Ｃでギル
ソン社製ＨＰＬＣシステムを用いて極性移動相を構成す
る溶液Ａ（０，１％↑Ｆ＾、０．０７％ＴＭ＾を含むｐ
Ｈ２，５の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニトリル）を
アセトニトリルが１５％から５０％までのリニアグラジ
ェントとして３５分間かけて分離を行った。

上記の方法でリニアグラジェントで分離すると２８０＋
ｗａ＋の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リチン
シコン時間約２６分（ＲＴ−２６）に主ピークが出現し
た。主ピークを構成する両分を集め凍結乾燥を行い、得
られた乾燥品を１００μｌの０．１Ｍ酢酸に溶解せしめ
た。

０、１Ｍ酢酸に溶解した試料を還元処理をせずそのまま
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後
、銀染色であるいはザイモグラフ法（Ｇｒａｎｅｌｌｉ
−Ｐｉｐｅｒｎｏ、Ａ、　ａｎｄ　Ｒｅ１ｃｈ、Ｅ、、
（１９７８）、Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ　、」■、　２２３　）で分析を行った。１！染
色の結果、分子量約７０ＫＤａにダブレットの主バンド
を、また分子量的１４０ＫＤａに二量体と考えられるマ
イナーをバンドが観察され、混入蛋白質由来の他のバン
ドは観察されなかった。ザイモグラフで銀染色された蛋
白のバンドと同一の分子量の位置にフィブリン溶解活性
が検出され、本逆相カラムクロマトグラフィーでの分離
で組換え体ｔ−ＰＡがその生理活性を維持したまま分離
されることが確かめられた。

分離されたｔ−ＰＡの比活性は、りｑット溶解時間を測
定して（Ｇａｆｆｎｅｙ、Ｐ、Ｊ、　ａｎｄ＾、Ｄ、Ｃ
ｕｒｔｉｓ、　（１９８５ＬＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａ
ｎｄ　１Ｉａｅ＋５ｏｓｔａｓｉｓ＋　Ｊ３，１３４　
）求めると約４　ＸＩＯ’ｌＵ／＋＋ｇ　ｐｒｏｔｅｉ
ｎであった。

上記のリニアグラジェント法で得られたｔ−ＰＡ乾燥品
１６０μｇを０．１％ＴＦＡ　、　０．０７％ＴＭバお
よび１５％アセトニトリルを含む水溶液（ｐｉｌ　２．
５）に溶かし、再び上記のリニアグラジェント法で逆相
　カラムで展開しＡ、。のピークを調べたところＲＴが
２６分付近に単一のピークが出現し、混入蛋白質由来の
他のピークは認められないか、わずかでありピーク面積
の計算からｔ−ＰＡの純度は９９％以上であった。

組換え体培養液に含まれるアプロチニン、わずかに含ま
れる牛血清由来蛋白質または抗体カラムに含まれるＩｇ
Ｇについてそれぞれ上記のリニアグラジェント法で逆相
カラムで展開すると１丁はそれぞれＩｇＧで約３０分、
牛血清由来の主要な蛋白質で約２８分、またアプロチニ
ンで約８分となりヒトｔ−ＰＡの約２６分と重なること
がないこと、およびアプロチニン、牛血清由来蛋白質、
ＩｇＧ　、ヒトｔ−ＰＡを等量混合した試料の分離を行
う、と、それぞれの蛋白質はＲＴの差により分離できる
ことを確認し、た。

実施例７ ヒトｔ−ＰＡ遺伝子を組み込んだマウスＣ１２７細胞の
培養上清を、実施例１と同様な方法でＥＴＩセファロー
スカラムで分離し、ｔ−ＰＡの部分精製物を得た。

すなわち、組換え体マウスＣ１２７細胞（特開昭６２−
１２６９７８）を培養し、アプロチニンおよび少量の牛
胎児血清を含む培地を使用して得た培養上清よりＥＴＩ
カラムを用いｔ−ＰＡ部分精製物を得た。

得られたＥＴＩカラムによるｔ−ｐ＾部分精製物（１本
１ｔ−ｐ＾、２本鎖ｔ−ＰＡ混合物）をＳＯ３−潜りア
クリルアミドゲル電気泳動法（Ｌａｅ＋ｕ＋１ｅ＋υ、
に、、（１９７０）、　Ｎａｔｕｒｅ、ｍＬ６８０）で
解析した結果、いくらかの混入蛋白質が存在していた。

ＥＴＩカラムで得た姐換え体ｔ−ｐ＾部分精製物約型物
０μｇを凍結乾燥し、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ　）　、０．０７％トリメチルアミン（ＴＭＡ　）お
よび１５％アセトニトリルを含む水溶液（ｐＨ２，５）
に溶かし、Ｃ１逆相カラム（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｃｋ　
ＲＰ−４：　５ｙｎｃｈｒｏ−社製）に対しアプライし
、流速１ｓｊ！／ｍｉｎ、カラム温度３４℃でギルソン
社製ＨＰＬＣシステムを用いて極性移動相を構成する溶
液Ａ　（０，１％ＴＦＡ　、　Ｏ，Ｑ７％ＴＭＡを含む
ｐＨ２，５の水溶液）および溶液Ｂ（アセトニトリル）
をアセトニトリルが１５％から５０％までのリニアグラ
ジェントとして３５分間かけて分離を行った。

上記の方法でリニアグラジェントで分離すると２８０ｎ
鴇の吸収を示す多くの小さなピークの他に、リテンショ
ン時間約２６分（ＲＴ−２６）に主ピークが出現した。

主ピークを構成する両分を集め凍結乾燥を行い、得られ
た乾燥品を１００μｌの０．１Ｍ酢酸に溶解せしめた。

０．１Ｍ酢酸に溶解した試料を還元処理をせずそのまま
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後
、銀染色であるいはザイモグラフ法（Ｇｒａｎｅｌｌｉ
−Ｐｉｐｅｒｎｏ、＾、ａｎｄ　Ｒｅ１ｃｈ＋Ｅ、　＋
　（１９７Ｂ）　＋Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、」■、２２３
）で分析を行った。１１染色の結果、分子量的７０ＫＤ
ａにダブレットの主バンドを、また分子量的１４０ＫＤ
ａに二量体と考えられるマイナーバンドが観察され、混
入蛋白質由来の他のバンドは観察されなかった。ザイモ
グラフで銀染色された蛋白バンドと同一分子量の位置に
フィブリン熔解活性が検出され、零逆相カラムクロマト
グラフィーでの分離で組換え体ｔ−ＰＡがその生理活性
を維持したまま分離されることが確かめられた０分離さ
れたｔ−ＰＡの比活性はクロット溶解時間を測定して（
Ｇａｆｆｎｅｙ、Ｐ、Ｊ、ａｎｄ＾、Ｄ、Ｃｕｒｔｉｓ
、（１９８５）＋　Ｔｈｒ。

ｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　）Ｉａｅｓｏｓｔａｓｉｓ＋　
、５１＋１３４）求めると約４ＸＬＯ’　１０／ｍｇ　
ｐｒｏｔｅｉｎであった。

上記のリニアグラジェント法で得られたｔ−ＰＡ乾燥品
１６０μｇを０．１％ＴＦＡ　、　０．０７％ＴＭ＾お
よび１５％アセトニトリルを含む水溶液（ｐＨ２，５）
に溶かし、再び上記のリニアグラジェント法で逆相カラ
ムで展開しＡ１．。のピークを調べたところＲＴが２６
分付近に単一のピークが出現し、混入蛋白質由来の他の
ピークは認められないか、わずかでありピーク面積の計
算からｔ−ＰＡの純度は９９％以上であった。

組換え体細胞の培養液に含まれるアプロチニン、わずか
に含まれる牛血清由来蛋白質またはＥＴ１カラムに含ま
れるＥＴＩについてそれぞれ上記のリニアグラジェント
法で逆相カラムで展開するとＲＴはそれぞれアプロチニ
ンで約８分、牛血清由来の主要な蛋白質で約２８分、ま
たＥＴＩで約２４分となりヒトｔ−ＰＡの約２６分と重
なることがないこと、およびアプロチニン、ＥＴＩ　、
牛血清由来蛋白質、ヒトｔ−ＰＡを等量混合した試料の
分離を行うと、それぞれの蛋白質はＲＴの差により分離
できることを確認した。

実施例８ ＲｉｊｋｅｎとＣｏ１１ｅｎの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、　、　（１９８１）　。

■紅７０３５　）に基づいてメラノーマボウズ（Ｂｏｗ
ｅｓ）株を培養し、ダウドルの方法（特開昭５９−１１
０６２５）でｔ−ｐ＾部分精製物を得た。すなわち、メ
ラノーマボウズ株を培養し、アプロチニンを含む無血清
培地を使用して得た培養上清よりＥＴ１カラムを用いて
ｔ−ｐ＾部分精製物を得た。

得られたＥＴ１カラムによるｔ−ＰＡ部分精製物（１末
鎖ｔ−ｐ＾、２本鎖ｔ−ＰＡ混合物）を５ＯＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｌｌ
、に、　、　（１９７０）　＋Ｎａｔｕｒｅ、２２１．
６８０）で解析した結果、いくらかの混入蛋白質が存在
していた。

凍結乾燥したｔ−ＰＡ部分精製物を０．１％トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦ＾）　、０．０７％トリエチルアミン（Ｔ
ＭＡ　）およびアセトニトリル３５％を含む溶液（ｐＨ
２，５）に溶かし、Ｃ４逆相カラム（Ｓｙｎｃｈｒｏｐ
ａｃｋ　ＲＰ−４；　ＳｙｎＣｈｒｏｍ社製）にアプラ
イし、流速１＋ｗｌ／＋ｍｉｎ、カラム温度３４℃でギ
ルソン社ＨＰＬＣシステムを用いてアセトニトリル濃度
を３５％から３７．５％までのリニアグラジェント法で
３０分かけて溶出した。

この方法によりリチンシラン時間が１２分から１５分の
範囲で一つの主ピークが得られ、１５分から２０分の範
囲でもう一つの主ピークが得られた。

これらの二つの分画をメルカプトエタノールで還元して
、あるいは非還元でＳＯ３−ポリアクリルアミド電気泳
動後、銀染色で調べた結果、ＲＴが１２分から１５分の
範囲で溶出されたｔ−ｐ＾は非還元で分子量的７０ＫＤ
ａ　、還元すると約３０ＫＤａと約４０ＫＤａにバンド
が検出された。又、１５分から２０分の範囲で溶出され
た分画は還元しても約７０ＫＤａであり、３０ＫＤａお
よび４０ＫＤａのバンドは検出されなか・つた。

この結果から１２分から１５分の範囲で溶出されるｔ−
ｐ＾は１末鎖ｔ−ｐ＾であり、１５分から２０分の範囲
で溶出されるｔ−ＰＡは２本積ｔ−ｐ＾であることが確
認された。

これら１本鎖ｔ−ＰＡオヨび２本＄１　ｔ−ＰＡ　ハ５
０５−　ホ１７アクリルアミド電気泳動後ザイモグラフ
イー法で調べた結果、フィブリン溶解活性が検出された
。

上記の１本１ｔ−ｐ＾と２本１１ｔ−ＰＡの逆相カラム
クロマトグラフィーに於ける分離条件についてカラム温
度あるいはｐｌ＋を変動させその影響を調べた。

上記の分離条件でカラム温度を約１６°Ｃに設定した場
合、また４０°Ｃに設定した場合、いずれも３４°Ｃに
設定した場合に比較し１末鎖ｔ−ｐ＾と２重鎖ｔ−ＰＡ
の分離は優れるものではなかった。

上記の分離条件で極性移動相に含まれるＴＭＡの濃度を
増大させることでｐＨを３．５に高めた場合１本鎖ｔ−
ＰＡと２本＄１ｔ−ＰＡの分離はやや劣り、またＴＭ＾
の濃度をさらに増大しｐｉを４．５に高めた場合、１本
＄Ｊｊｔ−Ｐ＾と２本積ｔ−ＰＡの分離はさらにやや劣
り、またカラム内にｔ−ＰＡの非特異的吸着が認められ
た。

上記の分離条件でアセトニトリルの代わりにイソプロピ
ルアルコールを使用すると１本鎖および２重鎖ｔ−ＰＡ
の分離はやや劣った。

特許出願人　　三井東圧化学株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）ｔ−ＰＡを含む溶液を、易揮発性有機溶媒を含みか
   つ水素イオン濃度が、下限がカラム担体を溶解せず、上
   限がｔ−ＰＡを溶離する条件を満たす範囲である極性移
   動相を使用して、逆相液体クロマトグラフィーで展開す
   ることを特徴とするｔ−ＰＡの精製方法。