JPH01228494A - ヒトｐｓｔｉを認識するモノクローナル抗体、該抗体産生ハイブリドーマおよびヒトｐｓｔｉの測定方法 - Google Patents
ヒトｐｓｔｉを認識するモノクローナル抗体、該抗体産生ハイブリドーマおよびヒトｐｓｔｉの測定方法Info
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- JPH01228494A JPH01228494A JP63055431A JP5543188A JPH01228494A JP H01228494 A JPH01228494 A JP H01228494A JP 63055431 A JP63055431 A JP 63055431A JP 5543188 A JP5543188 A JP 5543188A JP H01228494 A JPH01228494 A JP H01228494A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
叉ｓｈｏと１呈立里
本発明は、抗ヒト膵分泌性トリプシンインヒビターモノ
クローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマおよび該モノクローナル抗体を利用したヒｈ
ＰＳＴＩの測定方法に関する。
クローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマおよび該モノクローナル抗体を利用したヒｈ
ＰＳＴＩの測定方法に関する。
従Ｊ肇膿え賓
膵分泌性トリプシンインヒビター（ＰＳＴｒ）はＫａｚ
ａｌら（Ｊ、 Ａｎ＋、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、
７０． ３０３４−３０４０（１９４８） ）によ
りウシ膵液中に発見きれたトリプシンインヒビターで、
その後、ブタ、ヒツジ、ヒト、イヌ、ラットの膵液から
も同様のインヒビターが精製されている。膵液中では本
来消化酵素類は不活性な前駆体として分泌され存在する
が、なんらかの要因により酵素の活性化が著しく進行す
ると、腸組織の壊死のみならず他臓器の機能不全も伴う
急性膵炎を発症すると考えられる。ＰＳＴＩは他の酵素
前駆体と同時に膵腺房細胞より膵液中に分泌きれ、酵素
活性化の引き金となるトリプシンがその前駆体より活性
化された場合、直ちにそれに結合阻害し、酵素の本来の
活性化の場である十二指腸に達するまでその活性を制御
するものと考えられる。このようにＰＳＴＩは急性膵炎
の発症過程における制御に大きな役割を果たしているが
、また急性膵炎の患者においては、このＰＳＴＩの血清
中濃度が著しく上昇することも知られテイル（北ｗ、（
ｔｎ、胆ト膵、３．３８３−３８８ （１８９２））。
ａｌら（Ｊ、 Ａｎ＋、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、
７０． ３０３４−３０４０（１９４８） ）によ
りウシ膵液中に発見きれたトリプシンインヒビターで、
その後、ブタ、ヒツジ、ヒト、イヌ、ラットの膵液から
も同様のインヒビターが精製されている。膵液中では本
来消化酵素類は不活性な前駆体として分泌され存在する
が、なんらかの要因により酵素の活性化が著しく進行す
ると、腸組織の壊死のみならず他臓器の機能不全も伴う
急性膵炎を発症すると考えられる。ＰＳＴＩは他の酵素
前駆体と同時に膵腺房細胞より膵液中に分泌きれ、酵素
活性化の引き金となるトリプシンがその前駆体より活性
化された場合、直ちにそれに結合阻害し、酵素の本来の
活性化の場である十二指腸に達するまでその活性を制御
するものと考えられる。このようにＰＳＴＩは急性膵炎
の発症過程における制御に大きな役割を果たしているが
、また急性膵炎の患者においては、このＰＳＴＩの血清
中濃度が著しく上昇することも知られテイル（北ｗ、（
ｔｎ、胆ト膵、３．３８３−３８８ （１８９２））。
その他最近の知見によると、ＰＳＴＩはα１−アンチト
リプシンなどと同様な急性用反応物質としての挙動（小
川、胆と膵、２．１５４１−１５４９ （１９８６）
）を示すこと、及びある種の腫瘍マーカーともなりうろ
こと（小川、臨床病理、ハ、１２２９−１２３５ ＜１
９８６））も示きれている。このようにＰＳＴＩはその
診断上の意義も大きいものがある。血清中ＰＳＴＩの濃
度測定については、本来のインヒビターとしての活性を
調べる酵素学的方法は血清中に他の多量のトリプシンイ
ンヒビターが存在することにより困難であるが、すでに
ウサギ抗ヒトＰＳＴＩ抗血清を用いた拮抗法によるラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）が確立きれ（Ｅｄｄｅｌａ
ｎｄ ＆ ０ｈｌｓｓｏｎ、Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ
’ｓ Ｚ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、
３５９．６７１−６７５ （１９７８）；北原他、Ｂｉ
ｏｍｅｄｉｃａｌ Ｊ、、 ３．１１１９−１１２３
（１９７９） ；特開昭５６−４６４６５、特開昭５６
−７４６５３、特開昭５６−７４６５４ ）、同原理に
基つきキット化されたものも市販されている。これによ
り、該患者血清中のＰＳＴＩ測定値は、正常人に比べて
著しい高値を示し、実際に急性膵炎等の診断に利用きれ
ている。
リプシンなどと同様な急性用反応物質としての挙動（小
川、胆と膵、２．１５４１−１５４９ （１９８６）
）を示すこと、及びある種の腫瘍マーカーともなりうろ
こと（小川、臨床病理、ハ、１２２９−１２３５ ＜１
９８６））も示きれている。このようにＰＳＴＩはその
診断上の意義も大きいものがある。血清中ＰＳＴＩの濃
度測定については、本来のインヒビターとしての活性を
調べる酵素学的方法は血清中に他の多量のトリプシンイ
ンヒビターが存在することにより困難であるが、すでに
ウサギ抗ヒトＰＳＴＩ抗血清を用いた拮抗法によるラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）が確立きれ（Ｅｄｄｅｌａ
ｎｄ ＆ ０ｈｌｓｓｏｎ、Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ
’ｓ Ｚ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、
３５９．６７１−６７５ （１９７８）；北原他、Ｂｉ
ｏｍｅｄｉｃａｌ Ｊ、、 ３．１１１９−１１２３
（１９７９） ；特開昭５６−４６４６５、特開昭５６
−７４６５３、特開昭５６−７４６５４ ）、同原理に
基つきキット化されたものも市販されている。これによ
り、該患者血清中のＰＳＴＩ測定値は、正常人に比べて
著しい高値を示し、実際に急性膵炎等の診断に利用きれ
ている。
発明が解決しようとする課題
上記の様に、ヒトＰＳＴＩは免疫学的に測定きれうるよ
うになっているが、上記の報告等で使用されている抗体
は、いずれもポリクローナル抗体（ウサギ抗血清）であ
り、診断薬として用いるには、特異性、均一性、安定し
た供給などの点から、モノクローナル抗体の方が望まし
い。また、異なる特異性を有し、かつ親和性の高いモノ
クローナル抗体を得ることができれば、それを用いて、
ＰＳＴＩのより簡便なｉ’ｉ１１定方法を開発すること
が可能になる。
うになっているが、上記の報告等で使用されている抗体
は、いずれもポリクローナル抗体（ウサギ抗血清）であ
り、診断薬として用いるには、特異性、均一性、安定し
た供給などの点から、モノクローナル抗体の方が望まし
い。また、異なる特異性を有し、かつ親和性の高いモノ
クローナル抗体を得ることができれば、それを用いて、
ＰＳＴＩのより簡便なｉ’ｉ１１定方法を開発すること
が可能になる。
課題を解決するための手段
本発明は、ヒトＰＳＴＩに特異的でかつ親和性の高いモ
ノクローナル抗体を得、もって急性膵炎などの診断に有
効に用いることができる測定方法を提供する。
ノクローナル抗体を得、もって急性膵炎などの診断に有
効に用いることができる測定方法を提供する。
本発明者らは、上記の状況を鑑み、鋭意研究を進め、ヒ
トＰＳＴＩに特異的でがっ親和性の高いモノクローナル
抗体を得た。
トＰＳＴＩに特異的でがっ親和性の高いモノクローナル
抗体を得た。
すなわち、本発明の抗ヒトＰＳＴＩモノクロ−＋ Ｊｌ
−抗体ハ、ヒトＰＳＴＩで免疫したマウスＩＪ ”／バ
球とミエローマ細胞との融合によって得たハイブリドー
マが産生じたものであることを特徴とする。
−抗体ハ、ヒトＰＳＴＩで免疫したマウスＩＪ ”／バ
球とミエローマ細胞との融合によって得たハイブリドー
マが産生じたものであることを特徴とする。
本発明のモノクローナル抗体を得るために、まず、免疫
原としてヒトＰＳＴＩを精製することが必要である。ヒ
トＰＳＴＩの精製は上記の通りいくつかの報告があり、
該方法によって精製することができる。
原としてヒトＰＳＴＩを精製することが必要である。ヒ
トＰＳＴＩの精製は上記の通りいくつかの報告があり、
該方法によって精製することができる。
得られた精製ヒトＰＳＴＩを免疫原として、実輸動物例
えばマウスを免疫する。免疫方法は定法に従えばよく、
例えば生理食塩水に溶かした抗原をフロイントの完全ア
ジュバントと混合し、乳濁液としたものを投与する。
えばマウスを免疫する。免疫方法は定法に従えばよく、
例えば生理食塩水に溶かした抗原をフロイントの完全ア
ジュバントと混合し、乳濁液としたものを投与する。
このようにして免疫された動物からＢリンパ球を得、こ
れを永久骨髄腫細胞系（例えばマウスｘ６３−Ａｇ８、
ＮＳｌ−Ａｇ４／１、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｌｌｌなど
）と融合さける。この融合はに６ｈｌｅｒおよびＭｉｌ
ｓｔｅｉｎの公知方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６．４９５
−４９７．１９７５）に準じて行なえばよい。これによ
って得られたハイブリドーマの中から抗ヒトＰＳＴＩ抗
体を産生じているものを選択する。
れを永久骨髄腫細胞系（例えばマウスｘ６３−Ａｇ８、
ＮＳｌ−Ａｇ４／１、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｌｌｌなど
）と融合さける。この融合はに６ｈｌｅｒおよびＭｉｌ
ｓｔｅｉｎの公知方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６．４９５
−４９７．１９７５）に準じて行なえばよい。これによ
って得られたハイブリドーマの中から抗ヒトＰＳＴＩ抗
体を産生じているものを選択する。
この選択は、培養上清中の抗ヒトＰｓＴＩ抗体の有無を
適当な方法、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）や
ラジオイムノアッセイで調べて行なう。上清中に抗ヒト
ＰＳＴＩ抗体活性が確認されたウェルのハイブリドーマ
を培地２〜１０ｍ１程度まで増殖させてから凍結保存す
る。その際採取した培養上清を用いて各ハイブリドーマ
の産生する抗体の性質を調べ、目的にあった性質の抗体
を産生するハイブリドーマを選び出す＠選び出されたハ
イブリドーマを常法、例えば限界希釈法で七ツクローン
化し、細胞株を確立する。確立されたハイブリドーマ細
胞株を、免疫に使用した動物の腹腔内に移植し、抗体濃
度の高い腹水を得ることができるし、培地に培養しその
培養液から該抗体を得ることもできる。
適当な方法、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）や
ラジオイムノアッセイで調べて行なう。上清中に抗ヒト
ＰＳＴＩ抗体活性が確認されたウェルのハイブリドーマ
を培地２〜１０ｍ１程度まで増殖させてから凍結保存す
る。その際採取した培養上清を用いて各ハイブリドーマ
の産生する抗体の性質を調べ、目的にあった性質の抗体
を産生するハイブリドーマを選び出す＠選び出されたハ
イブリドーマを常法、例えば限界希釈法で七ツクローン
化し、細胞株を確立する。確立されたハイブリドーマ細
胞株を、免疫に使用した動物の腹腔内に移植し、抗体濃
度の高い腹水を得ることができるし、培地に培養しその
培養液から該抗体を得ることもできる。
このようにして得られた抗体は、必要に応じて精製して
使用することができる。例えば、硫安分画、イオン交換
クロマトグラフィー、プロティンＡカラム等の常法を用
いることによって精製することができる。
使用することができる。例えば、硫安分画、イオン交換
クロマトグラフィー、プロティンＡカラム等の常法を用
いることによって精製することができる。
本発明においては、以上のようにして、抗ヒトＰＳＴＩ
抗体を産生するハイブリドーマｈＰＳＴＩ−１５０，１
６７および３６０とそれぞれの産生するモノクローナル
抗体１５０．１６７及び３６０を得た。
抗体を産生するハイブリドーマｈＰＳＴＩ−１５０，１
６７および３６０とそれぞれの産生するモノクローナル
抗体１５０．１６７及び３６０を得た。
得られたハイブリドーマ細胞株は、昭和６２年１２月３
日から、茨城系つくば南東１丁目１番３号の微生物工業
技術研究所に、下記の受託番号の下に、ブダペスト条約
に基づいて寄託きれている。
日から、茨城系つくば南東１丁目１番３号の微生物工業
技術研究所に、下記の受託番号の下に、ブダペスト条約
に基づいて寄託きれている。
Ｈｙｂｒｆｄｏｍａ ｈＰＳＴＩ−１５０：微工研条
寄第１５８５号 （ＦＥＲＭ ＢＰ−１５８５） Ｈｙｂｒｌｄ’ｏｍａ ｈＰＳＴＩ−１６７：微工研
条寄第１５８３号 （ＦＥＲＭ ＢＰ−１５８３） Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｈＰＳＴＩ−３６０：微工研条
寄第１５８４号 （ＦＥＲＭ ＢＰ−１５８４） 七ツクローナル抗体１５０．１６７．３６０は以下のよ
うな性質を有している。
寄第１５８５号 （ＦＥＲＭ ＢＰ−１５８５） Ｈｙｂｒｌｄ’ｏｍａ ｈＰＳＴＩ−１６７：微工研
条寄第１５８３号 （ＦＥＲＭ ＢＰ−１５８３） Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｈＰＳＴＩ−３６０：微工研条
寄第１５８４号 （ＦＥＲＭ ＢＰ−１５８４） 七ツクローナル抗体１５０．１６７．３６０は以下のよ
うな性質を有している。
（１） イムノグロブリンクラス、サブクラスは、１
５０はＩｇＧ＋、、１６７と３６０はＩｇＧ１でＬ鎖は
いずれもに型である。
５０はＩｇＧ＋、、１６７と３６０はＩｇＧ１でＬ鎖は
いずれもに型である。
（２）結合定数は、１５０は４．９Ｘ１０″Ｍ−’、１
６７は３．７Ｘ１０”Ｍ−’、３６０は１４Ｘ１０’ｔ
’であり、いずれも親和性が高い抗体である。
６７は３．７Ｘ１０”Ｍ−’、３６０は１４Ｘ１０’ｔ
’であり、いずれも親和性が高い抗体である。
（３）１５０はＰＳＴＩのトリプシン阻害活性を中和し
ないが、１６７と３６０は阻害活性を中和する。すなわ
ち、少なくとも１５０は１６７．３６０と異なった特異
性を有する。
ないが、１６７と３６０は阻害活性を中和する。すなわ
ち、少なくとも１５０は１６７．３６０と異なった特異
性を有する。
このように、本発明のモノクローナル抗体は、ヒ）ＰＳ
ＴＩに特異的でかつ親和性が高く、ヒトＰＳＴＩの免疫
学的測定法に用いる抗体として非常に優れた性質を有す
るものである。
ＴＩに特異的でかつ親和性が高く、ヒトＰＳＴＩの免疫
学的測定法に用いる抗体として非常に優れた性質を有す
るものである。
本発明のモノクローナル抗体を用いれば、例えば、以下
の様にしてＰＳＴＩを免疫学的に測定できる。
の様にしてＰＳＴＩを免疫学的に測定できる。
本発明のモノクローナル抗体を、１１６１ 、 Ｉｌｌ
ｉ等の放射性同位元素で標識したヒトＰＳＴＩととも
に使用することを特徴する競合法により、ヒト血清ＰＳ
ＴＩのラジオイムノア・ンセイを行なうことができる。
ｉ等の放射性同位元素で標識したヒトＰＳＴＩととも
に使用することを特徴する競合法により、ヒト血清ＰＳ
ＴＩのラジオイムノア・ンセイを行なうことができる。
すなわち、イムノア・７セイ自体は公知の方法に従って
行なうい、一定量の該モノクローナル抗体に対し、一定
量の１１８ 工標識ＰＳＴＩ（公知のクロラミンＴ法等
によりＰＳＴＩのＴｙｒ残基に１′８工を導入したもの
）と標準ヒトＰＳＴ■あるいは血清試料を競合反応させ
、二抗体法あるいはポリエチレングリコール法等により
抗体と結合した１ｆｆｉ８１標識Ｐ Ｓ Ｔ Ｉ （ｂ
ｏｕｎｄ）と遊離の１１＆Ｉ標識Ｐ ＳＴ Ｉ （ｆｒ
ｅｅ）を分離したのち、ｂｏｕｎｄあるいはｆｒｅｅの
放射活性を計測し、標準ＰＳＴＩと血清試料の放射活性
の対比によって血清ＰＳＴＩｆｉ度を求める。
行なうい、一定量の該モノクローナル抗体に対し、一定
量の１１８ 工標識ＰＳＴＩ（公知のクロラミンＴ法等
によりＰＳＴＩのＴｙｒ残基に１′８工を導入したもの
）と標準ヒトＰＳＴ■あるいは血清試料を競合反応させ
、二抗体法あるいはポリエチレングリコール法等により
抗体と結合した１ｆｆｉ８１標識Ｐ Ｓ Ｔ Ｉ （ｂ
ｏｕｎｄ）と遊離の１１＆Ｉ標識Ｐ ＳＴ Ｉ （ｆｒ
ｅｅ）を分離したのち、ｂｏｕｎｄあるいはｆｒｅｅの
放射活性を計測し、標準ＰＳＴＩと血清試料の放射活性
の対比によって血清ＰＳＴＩｆｉ度を求める。
また、本発明のモノクローナル抗体をペルオキシダーゼ
、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素で標識したヒトＰ
ＳＴＩとともに使用することを特徴とする競合法により
、ヒト血清ＰＳＴＩのエンザイムノアッセイを行なうこ
とができる。すなわち、上記のラジオイムノアッセイの
１１６１標識ＰＳＴＩの代わりにペルオキシダーゼ等の
酵素で標識したヒトＰＳＴＩを用いて、上記と同じ手順
で測定する。酵素活性は、たとえばペルオキシダーゼの
場合には、０−フェニレンジアミンなどの発色剤を用い
た比色法、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸などの
螢光基質を用いた螢光法等により測定することができる
。
、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素で標識したヒトＰ
ＳＴＩとともに使用することを特徴とする競合法により
、ヒト血清ＰＳＴＩのエンザイムノアッセイを行なうこ
とができる。すなわち、上記のラジオイムノアッセイの
１１６１標識ＰＳＴＩの代わりにペルオキシダーゼ等の
酵素で標識したヒトＰＳＴＩを用いて、上記と同じ手順
で測定する。酵素活性は、たとえばペルオキシダーゼの
場合には、０−フェニレンジアミンなどの発色剤を用い
た比色法、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸などの
螢光基質を用いた螢光法等により測定することができる
。
このエンザイムノアッセイではｂｏｕｎｄとｆｒｅｅの
分離を必要としない均一系の測定も可能である。たとえ
ば、Ｅ Ｍ Ｉ Ｔ ” （ｅｎｚｙｍｅ ｍｕｌｔｉ
ｐｌｉｅｄｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅ ）の商品名で知られる測定法で、ｂｏｕｎｄの酵素
標識ヒトＰＳＴＩの酵素活性が、抗体の立体障害あるい
は酵素の活性中心の構造変化によってｆｒｅｅの場合に
比べ減少したとき、その減少度からｂｏｕｎｄの割合を
知ることができる。その他、エンザイムチ〜ンネリング
イムノアッセイ等の均一系の測定法が挙げられる。
分離を必要としない均一系の測定も可能である。たとえ
ば、Ｅ Ｍ Ｉ Ｔ ” （ｅｎｚｙｍｅ ｍｕｌｔｉ
ｐｌｉｅｄｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅ ）の商品名で知られる測定法で、ｂｏｕｎｄの酵素
標識ヒトＰＳＴＩの酵素活性が、抗体の立体障害あるい
は酵素の活性中心の構造変化によってｆｒｅｅの場合に
比べ減少したとき、その減少度からｂｏｕｎｄの割合を
知ることができる。その他、エンザイムチ〜ンネリング
イムノアッセイ等の均一系の測定法が挙げられる。
本発明のモノクローナル抗体を、アクリジニウムエステ
ルやイソルミノール等の化学発光物質あるいはルシフェ
リン等の生物発光物質で標識したヒトＰＳＴＩとともに
使用することを特徴とする競合法によりケミルミネッセ
ントイムノアッセイあるいはバイオルミネッセントイム
ノアッセイを行なうことができる。すなわち、上記のラ
ジオイムノアッセイのＩＩＩ １標ｍＰｓＴＩの代わり
にアクリジニウムエステル等の発光物質を標識したヒト
ＰＳＴＩを用いて上記と同じ手順で測定する。
ルやイソルミノール等の化学発光物質あるいはルシフェ
リン等の生物発光物質で標識したヒトＰＳＴＩとともに
使用することを特徴とする競合法によりケミルミネッセ
ントイムノアッセイあるいはバイオルミネッセントイム
ノアッセイを行なうことができる。すなわち、上記のラ
ジオイムノアッセイのＩＩＩ １標ｍＰｓＴＩの代わり
にアクリジニウムエステル等の発光物質を標識したヒト
ＰＳＴＩを用いて上記と同じ手順で測定する。
ｂｏｕｎｄあるいはｆｒｅｅの発光強度はルミノメータ
−により計測する。
−により計測する。
そのイ也、フルオレッセインイソチオシアネート等の螢
光物質を標識したヒトＰＳＴＩを用いることを特徴とす
るフルオロイムノアッセイが可能である。
光物質を標識したヒトＰＳＴＩを用いることを特徴とす
るフルオロイムノアッセイが可能である。
また、本発明のモノクローナル抗体のうち、ヒトＰＳＴ
Ｉ分子に対する認識部位が異なる二種類のモノクローナ
ル抗体を使用することを特徴とする非競合法によるイム
ノアッセイが挙げるれる。
Ｉ分子に対する認識部位が異なる二種類のモノクローナ
ル抗体を使用することを特徴とする非競合法によるイム
ノアッセイが挙げるれる。
上記に記載の二種類のモノクローナル抗体のうち、一方
が同相化されたもの、他方が目Ｊ等の放射性同位元素で
標識されたものを用いることを特徴とするヒト血清ＰＳ
ＴＩのイムノラジオメトリックアッセイも可能である。
が同相化されたもの、他方が目Ｊ等の放射性同位元素で
標識されたものを用いることを特徴とするヒト血清ＰＳ
ＴＩのイムノラジオメトリックアッセイも可能である。
すなわち、該モノクローナル抗体の一方をポリスチレン
ビーズ等の固相に吸着あるいは化学結合させ、他方を１
１１１等の放射性同位元素で標識しておき、同相抗体に
標準ヒトＰＳＴＩあるいは血清試料をカロえてヒトＰＳ
ＴＩを抗体に結合させ、次いで１！６■標識抗体を加え
て固相抗体上のヒトＰＳＴＩに結合させたのち、上清（
ｆｒｅｅ ）を除去し、ｂｏｕｎｄの放射活性を計測し
て標準ヒトＰｓＴＩと血清試料の放射活性の対比によっ
て血清ＰＳＴＩｉｆｉ度を求める。
ビーズ等の固相に吸着あるいは化学結合させ、他方を１
１１１等の放射性同位元素で標識しておき、同相抗体に
標準ヒトＰＳＴＩあるいは血清試料をカロえてヒトＰＳ
ＴＩを抗体に結合させ、次いで１！６■標識抗体を加え
て固相抗体上のヒトＰＳＴＩに結合させたのち、上清（
ｆｒｅｅ ）を除去し、ｂｏｕｎｄの放射活性を計測し
て標準ヒトＰｓＴＩと血清試料の放射活性の対比によっ
て血清ＰＳＴＩｉｆｉ度を求める。
また、固相抗体に標準ヒトＰＳＴＩあるいは血清試料と
１１６１標識抗体を同時に加え、次いで上清を除去して
ｂｏｕｎｄの放射活性を計測する方法（上記の二段階法
に対し一段階法）も可能である。
１１６１標識抗体を同時に加え、次いで上清を除去して
ｂｏｕｎｄの放射活性を計測する方法（上記の二段階法
に対し一段階法）も可能である。
次に、上記に記載のモノクローナル抗体のうち、一方が
固相化されたもの、他方がペルオキシダーゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ等の酵素で標識きれたものを使用する
ことを特徴とする広義のイムノエンザイモメトリックア
ッセイが挙げられる。すなわち、該モノクローナル抗体
の一方をポリスチレンビーズ等の同相に吸着あるいは化
学結合許せ、他方をペルオキシダーゼ（マレイイミド法
、過ヨウ素酸酸化法等により標識）、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ（マイレミド法、ゲルタールアルデヒド法等に
より標識）等の酵素で標識しておき、固相抗体に標準ヒ
トＰＳＴＩあるいは血清試料を加えてヒトＰＳＴＩを抗
体に結合させ、ついで酵素標識抗体を加えて固相抗体上
のヒ）ＰＳＴｌに結合させたのち、上清（ｆｒｅｅ ）
を除去し、ｂｏｕｎｄの酵素活性を測定して標準ヒトＰ
ｓＴＩと血清試料の酵素活性の対比によって血清ＰＳＴ
Ｉ濃度を求める。また、−段階法による測定も可能であ
る。ペルオキシダーゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ等の酵素活性は、それぞれ。−フェニレンジアミンあ
るいは。−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドなど
の発色剤を用いた比色法、ｐ−ヒドロキシフェニルプロ
ピオン酸あるいは４−メチルランベリフェリールーβ−
Ｄ−ガラクトシドなどの螢光基質を用いた螢光法等によ
り、ｉｑ定することができる。
固相化されたもの、他方がペルオキシダーゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ等の酵素で標識きれたものを使用する
ことを特徴とする広義のイムノエンザイモメトリックア
ッセイが挙げられる。すなわち、該モノクローナル抗体
の一方をポリスチレンビーズ等の同相に吸着あるいは化
学結合許せ、他方をペルオキシダーゼ（マレイイミド法
、過ヨウ素酸酸化法等により標識）、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ（マイレミド法、ゲルタールアルデヒド法等に
より標識）等の酵素で標識しておき、固相抗体に標準ヒ
トＰＳＴＩあるいは血清試料を加えてヒトＰＳＴＩを抗
体に結合させ、ついで酵素標識抗体を加えて固相抗体上
のヒ）ＰＳＴｌに結合させたのち、上清（ｆｒｅｅ ）
を除去し、ｂｏｕｎｄの酵素活性を測定して標準ヒトＰ
ｓＴＩと血清試料の酵素活性の対比によって血清ＰＳＴ
Ｉ濃度を求める。また、−段階法による測定も可能であ
る。ペルオキシダーゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ等の酵素活性は、それぞれ。−フェニレンジアミンあ
るいは。−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドなど
の発色剤を用いた比色法、ｐ−ヒドロキシフェニルプロ
ピオン酸あるいは４−メチルランベリフェリールーβ−
Ｄ−ガラクトシドなどの螢光基質を用いた螢光法等によ
り、ｉｑ定することができる。
非競合法によるエンザイムイムノアッセイでは、ｂｏｕ
ｎｄとｆｒｅｅを分離する必要がない均一系の測定法も
可能である。
ｎｄとｆｒｅｅを分離する必要がない均一系の測定法も
可能である。
上記に記載のモノクローナル抗体のうち、一方がβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼで標識されたもの、他方がサクシニ
ル化されたもので、これらをデキスランに結合させた。
−ガラクトシダーゼで標識されたもの、他方がサクシニ
ル化されたもので、これらをデキスランに結合させた。
−フェニル−β−Ｄ−ガラクトシドとともに用いること
を特徴とするヒト血ｆｌ Ｐ Ｓ Ｔ Ｉのエンザイム
インハンスドイムノアッ仕イ（ｅｎｚｙｍｅ ｅｎｈａ
ｎｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ）も可能である。
を特徴とするヒト血ｆｌ Ｐ Ｓ Ｔ Ｉのエンザイム
インハンスドイムノアッ仕イ（ｅｎｚｙｍｅ ｅｎｈａ
ｎｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ）も可能である。
すなわち、マイレイミド法等により該モノクローナル抗
体の一方をβ−Ｄ−ガラクトンダーゼで１１４２し、他
方を無水コハク酸でサクシニル化しておく。標準ヒトＰ
ＳＴＩあるいは血清試料に前記の二種類の修飾抗体を加
えてヒｈＰＳＴＩ分子に結合させ、これにデキストラン
を結合させた０−フェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを加
えたのち、比濁計により濁度をθり定する。標準ヒトＰ
ＳＴＩと血清試料の濁度の対比によって血清ＰＳＴＩａ
度を求める。
体の一方をβ−Ｄ−ガラクトンダーゼで１１４２し、他
方を無水コハク酸でサクシニル化しておく。標準ヒトＰ
ＳＴＩあるいは血清試料に前記の二種類の修飾抗体を加
えてヒｈＰＳＴＩ分子に結合させ、これにデキストラン
を結合させた０−フェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを加
えたのち、比濁計により濁度をθり定する。標準ヒトＰ
ＳＴＩと血清試料の濁度の対比によって血清ＰＳＴＩａ
度を求める。
また、上記に記載のモノクローナル抗体のうち、一方が
固相化きれたもの、他方がアクリジニウムエステル等の
発光物質で標識されたものを用いることを特徴とするイ
ムノルミノメトリックア／セイが挙げられる。すなわち
、該モノクローナル抗体の一方をポリスチレンビーズ等
の同相に吸着あるいは化学結合させ、他方を４−（２−
サクンンイミジルオキシ力ルボキシエチル）フェニル−
１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレート
フルオロスルフォネートのようなアクリジニウムエステ
ルなどで標識（上記のアクリジニウムエステルのＤＭＦ
溶液に抗体を含むリン酸緩衝液、ｐＨ８，０を加えるこ
とにより標識する。）しておき、固相抗体に標準ヒトＰ
ＳＴＩあるいは血清試料を加えてヒ１−ＰＳＴＩを抗体
に結合させ、次いで発光物質を標識した抗体を加えて固
相抗体上のヒ）ＰＳＴＩに結合させたのち、上清（ｆｒ
ｅｅ）を除去し、ｂｏｕｎｄの発光強度をルミノメータ
−により計測して、標準ヒトＰＳＴＩと血清試料の発光
強度の対比によって血清ＰＳＴＩａ度を求める。
固相化きれたもの、他方がアクリジニウムエステル等の
発光物質で標識されたものを用いることを特徴とするイ
ムノルミノメトリックア／セイが挙げられる。すなわち
、該モノクローナル抗体の一方をポリスチレンビーズ等
の同相に吸着あるいは化学結合させ、他方を４−（２−
サクンンイミジルオキシ力ルボキシエチル）フェニル−
１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレート
フルオロスルフォネートのようなアクリジニウムエステ
ルなどで標識（上記のアクリジニウムエステルのＤＭＦ
溶液に抗体を含むリン酸緩衝液、ｐＨ８，０を加えるこ
とにより標識する。）しておき、固相抗体に標準ヒトＰ
ＳＴＩあるいは血清試料を加えてヒ１−ＰＳＴＩを抗体
に結合させ、次いで発光物質を標識した抗体を加えて固
相抗体上のヒ）ＰＳＴＩに結合させたのち、上清（ｆｒ
ｅｅ）を除去し、ｂｏｕｎｄの発光強度をルミノメータ
−により計測して、標準ヒトＰＳＴＩと血清試料の発光
強度の対比によって血清ＰＳＴＩａ度を求める。
本発明のモノクローナル抗体の１つを、ウサギなどを感
作して作製した抗ヒトＰＳＴＩポリクローナル抗体とと
もに使用することを特徴とする非競合法によるイムノア
ッセイも可能である。モノクローナル抗体とポリクロー
ナル抗体の一方を同相化し、他方を放射性同位元素、酵
素あるいは発光物質等で標識し、上記と同し手順で測定
する。
作して作製した抗ヒトＰＳＴＩポリクローナル抗体とと
もに使用することを特徴とする非競合法によるイムノア
ッセイも可能である。モノクローナル抗体とポリクロー
ナル抗体の一方を同相化し、他方を放射性同位元素、酵
素あるいは発光物質等で標識し、上記と同し手順で測定
する。
また、上記の２種類の抗体を組合わせた非競合法による
イムノアッセイの場合には以下に示す方法も可能である
。
イムノアッセイの場合には以下に示す方法も可能である
。
あらかじめ、該モノクローナル抗体をポリスチレンボー
ルなどの同相に吸着あるいは化学結合し、またヤギ抗つ
サギＩｇＧ抗体を前記の放射性同位元素、酵素あるいは
発光物質等で標識しておく。固相抗体に標準ヒトＰＳＴ
Ｉあるいは血清試料を加え、次いでウサギ抗ヒトＰＳＴ
Ｉポリクローナル抗体（抗血清）を加えて固相抗体上の
ヒトＰＳＴＩに結合させたのち、酵素等で標識したヤギ
抗つサギＩｇＧ抗体を加えてウサギ抗ヒトＰＳＴｌポリ
クローナル抗体に結合させ、 ｂｏｕｎｄの酵素活性を
前記と同じ方法で測定する。
ルなどの同相に吸着あるいは化学結合し、またヤギ抗つ
サギＩｇＧ抗体を前記の放射性同位元素、酵素あるいは
発光物質等で標識しておく。固相抗体に標準ヒトＰＳＴ
Ｉあるいは血清試料を加え、次いでウサギ抗ヒトＰＳＴ
Ｉポリクローナル抗体（抗血清）を加えて固相抗体上の
ヒトＰＳＴＩに結合させたのち、酵素等で標識したヤギ
抗つサギＩｇＧ抗体を加えてウサギ抗ヒトＰＳＴｌポリ
クローナル抗体に結合させ、 ｂｏｕｎｄの酵素活性を
前記と同じ方法で測定する。
以上の様に、様々な免疫学的測定法が実施可能であるが
、これらに限定きれるものではなく、公知の殆どのｉ’
５ｔｌｌ定法が適用可能である。
、これらに限定きれるものではなく、公知の殆どのｉ’
５ｔｌｌ定法が適用可能である。
（以下余白）
衷皇忽
実施例１ 抗ヒトＰＳＴＩモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマの作成と抗体の 産生 （１）抗原の調製 抗原として用いたヒトＰＳＴＩ（以後、ＰＳＴＩと略す
る場合がある。）はヒト膵液から菊池らの方法（Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９８．６８７−６９４．１
９８５＞に従って精製した。
ブリドーマの作成と抗体の 産生 （１）抗原の調製 抗原として用いたヒトＰＳＴＩ（以後、ＰＳＴＩと略す
る場合がある。）はヒト膵液から菊池らの方法（Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９８．６８７−６９４．１
９８５＞に従って精製した。
（り 免疫
ヒトＰＳＴＩの生理食塩水溶液（０，５あるいは０ 、
１ ｍＢ／ｍｌ）とフロイントの完全アジュバントを動
量ずつ混合して乳濁液とし、これをＢＡＬＢ／Ｃマウス
（雌、５週令）の背部皮下に０ 、２ ｍｌずつ４適間
隔で４回注射した。マウス１匹当りＰＳＴＩの投与量は
５０あるいは１０μｇである。
１ ｍＢ／ｍｌ）とフロイントの完全アジュバントを動
量ずつ混合して乳濁液とし、これをＢＡＬＢ／Ｃマウス
（雌、５週令）の背部皮下に０ 、２ ｍｌずつ４適間
隔で４回注射した。マウス１匹当りＰＳＴＩの投与量は
５０あるいは１０μｇである。
さらに、４回目免疫の１０日後にブースター免疫として
、ヒトＰＳＴ１５０μｇを溶解した生理食塩水２００μ
ｌを腹腔内に投与した。
、ヒトＰＳＴ１５０μｇを溶解した生理食塩水２００μ
ｌを腹腔内に投与した。
０）細胞融合
ブースター免疫から３日後にマウスの膵臓を摘出し、そ
の細胞を０．１７Ｍ塩化アンモニウム溶液中に水冷下５
分装置いて赤血球を破壊した。
の細胞を０．１７Ｍ塩化アンモニウム溶液中に水冷下５
分装置いて赤血球を破壊した。
残った細胞をＲＰＭ１１６４０培地に懸濁して、細胞融
合に用いる牌リンパ球とした。次に、同じ＜ＲＰＭ１１
６４０培地に懸濁した８−アザグアニン耐性ミエローマ
細胞（ＮＳ−１） ６．３ Ｘ １０’（あるいは３．
５Ｘ１０’）個と牌リンパ球１，９ＸＩＯ’（あるいは
３．５Ｘ１０’）個を混合し、遠心（１、ＯＯＯｒｐｍ
、１０分間）後上清を除去した。細胞沈澱物に、ＲＰＭ
１１６４０培地に溶かした５０％ポリエチレングリコー
ル（分子量４．０００、Ｍσｃｋ）１．０ｍｌを１分間
かけてピペットの先で攪拌しながら加え、きらに１．５
分間攪拌した。その後２ｍｌのＲＰＭ１１６４０を２分
間かけて、次に同じく２ｍｌを１分間かけて攪拌しなが
ら加えた。
合に用いる牌リンパ球とした。次に、同じ＜ＲＰＭ１１
６４０培地に懸濁した８−アザグアニン耐性ミエローマ
細胞（ＮＳ−１） ６．３ Ｘ １０’（あるいは３．
５Ｘ１０’）個と牌リンパ球１，９ＸＩＯ’（あるいは
３．５Ｘ１０’）個を混合し、遠心（１、ＯＯＯｒｐｍ
、１０分間）後上清を除去した。細胞沈澱物に、ＲＰＭ
１１６４０培地に溶かした５０％ポリエチレングリコー
ル（分子量４．０００、Ｍσｃｋ）１．０ｍｌを１分間
かけてピペットの先で攪拌しながら加え、きらに１．５
分間攪拌した。その後２ｍｌのＲＰＭ１１６４０を２分
間かけて、次に同じく２ｍｌを１分間かけて攪拌しなが
ら加えた。
さらに、１８ｍ１のＲＰＭ１１６４０を緩やかに攪拌し
ながら徐々に滴加した。遠心（１，００Ｏｒｐｍ、 １
０分間ン後、上清を除去し、沈殿した細胞をＨＡＴ培地
（Ｉ Ｘ １０−’Ｍヒポキサンチン、４Ｘ１０−’Ｍ
アミノプテリン、１．６Ｘ１０−’Ｍチミジンを含む２
０％ＦＣ８−ＲＰＭＩ １６４０培地）９０（あるいは
１６０）ｍｌに懸濁し、９６ウエル細胞培養プレート（
Ｃｏ５ｔａｒ ） ９ （あるいは１６）枚の各ウェル
に０．１ｍｌずつ分注した。細胞培養プレートには前も
って栄養細胞としてマウス膵臓細胞のＨＡＴ培地懸濁液
をｌＸｌ０’個１０．１ｍｌ／ウェルずつ入れておいた
。以後２〜３日に一度ずつＨＡＴ培地を半量ずつ新しい
ものと入れ変えた。
ながら徐々に滴加した。遠心（１，００Ｏｒｐｍ、 １
０分間ン後、上清を除去し、沈殿した細胞をＨＡＴ培地
（Ｉ Ｘ １０−’Ｍヒポキサンチン、４Ｘ１０−’Ｍ
アミノプテリン、１．６Ｘ１０−’Ｍチミジンを含む２
０％ＦＣ８−ＲＰＭＩ １６４０培地）９０（あるいは
１６０）ｍｌに懸濁し、９６ウエル細胞培養プレート（
Ｃｏ５ｔａｒ ） ９ （あるいは１６）枚の各ウェル
に０．１ｍｌずつ分注した。細胞培養プレートには前も
って栄養細胞としてマウス膵臓細胞のＨＡＴ培地懸濁液
をｌＸｌ０’個１０．１ｍｌ／ウェルずつ入れておいた
。以後２〜３日に一度ずつＨＡＴ培地を半量ずつ新しい
ものと入れ変えた。
約１０日後にはハイプリドーマの増殖が認められた。ハ
イプリドーマが増殖してきたウェルは全部で６２９ウエ
ル（２５％）であった。
イプリドーマが増殖してきたウェルは全部で６２９ウエ
ル（２５％）であった。
（４） ハイプリドーマの凍結保存
増殖してきたすべてのハイプリドーマをＨＴ培地（上記
ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）中で培地
的２ｍｌまで増殖させ、凍結用培地（１０％ＤＭＳＯを
含むウシ胎児血清）０．５ｍｌに懸濁して一８０°Ｃに
凍結保存した。各培養上清は、産生抗体の性質を調べる
ために採取保存した。
ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）中で培地
的２ｍｌまで増殖させ、凍結用培地（１０％ＤＭＳＯを
含むウシ胎児血清）０．５ｍｌに懸濁して一８０°Ｃに
凍結保存した。各培養上清は、産生抗体の性質を調べる
ために採取保存した。
（５） ハイブリドーマの選択■
予備的にＰＳＴＩをコートした９６ウエルマイクロプレ
ート（０，１μｇ／ウェル〕によるＥＬＩＳＡ法で、大
部分のハイブリドーマが抗ＰＳＴＩ抗体を産生じている
ことがゎがったため、イムノアッセイに適するような高
親和性の抗体産生株を選択するためにラジオイムノアッ
セイを試みた。
ート（０，１μｇ／ウェル〕によるＥＬＩＳＡ法で、大
部分のハイブリドーマが抗ＰＳＴＩ抗体を産生じている
ことがゎがったため、イムノアッセイに適するような高
親和性の抗体産生株を選択するためにラジオイムノアッ
セイを試みた。
上記のハイブリドーマ凍結保存時に採取した培養上清の
原液、１０倍、１００倍希釈液１００μｌと１１６１標
識ヒトＰｓＴＩ （実施例３に記載）１００μｌおよ
び２％ウシガンマグロブリンを含むアッセイ用緩衝液（
０，９％塩化ナトリウム、０．ＩＸアシ化ナトリウム、
１ｍＭエチレンジアミン四酢酸四ナトリウムおよび０．
５ｚ牛血清アルブミンを含有す６０． ＯＩＭ ’）
ン酸緩衝液（ｐＨ７，４）） ５０１１１を混合し、３
７℃で１時間インキュベーションした。
原液、１０倍、１００倍希釈液１００μｌと１１６１標
識ヒトＰｓＴＩ （実施例３に記載）１００μｌおよ
び２％ウシガンマグロブリンを含むアッセイ用緩衝液（
０，９％塩化ナトリウム、０．ＩＸアシ化ナトリウム、
１ｍＭエチレンジアミン四酢酸四ナトリウムおよび０．
５ｚ牛血清アルブミンを含有す６０． ＯＩＭ ’）
ン酸緩衝液（ｐＨ７，４）） ５０１１１を混合し、３
７℃で１時間インキュベーションした。
次に、２％ウシガンマグロブリンを含むリン酸緩衝化生
理食塩液１００μｍと２０％ポリエチレングリコール６
０００溶液５００μｍを加えて直ちに８１！拌し、遠心
（３，００Ｏｒｐｍ、２０分間）後、上清を吸引除去し
て沈殿の放射能を測定し、抗体に結合した１ｌｆｉ ｌ
標識ヒトＰＳＴＩの割合を求めた。同時に、５０μｌの
アッセイ用緩衝液の代わりに、ヒトＰＳＴＩ ４０ｎ
ｇ／ｍｌを含むアッセイ用緩衝液５０μｌを加えて同様
の操作を行ない、＋６Ｉ標識ヒｈＰＳＴＩの放射能の沈
殿からの減少、すなわち添加したヒトＰＳＴＩによって
１！６■標識ヒ１−ＰＳＴＩがどの程度抗体から置換さ
れたかを調へた。この置換の割合が大きな培養上清が親
和性の高い抗体を含んでいるものとした。このような方
法により、１０倍希伏した上清を用いたときに総ＰＳＴ
Ｉ量に対する結合ＰＳＴＩ量（Ｂ／Ｔ）の割合が２０％
以上のもの、さらに１０倍あるいは１００倍希釈液でＰ
ＳＴＩにより結合標識ＰＳＴＩの１０％以上が置換きれ
るものという条件で、２１株のハイブリドーマを選択し
た。
理食塩液１００μｍと２０％ポリエチレングリコール６
０００溶液５００μｍを加えて直ちに８１！拌し、遠心
（３，００Ｏｒｐｍ、２０分間）後、上清を吸引除去し
て沈殿の放射能を測定し、抗体に結合した１ｌｆｉ ｌ
標識ヒトＰＳＴＩの割合を求めた。同時に、５０μｌの
アッセイ用緩衝液の代わりに、ヒトＰＳＴＩ ４０ｎ
ｇ／ｍｌを含むアッセイ用緩衝液５０μｌを加えて同様
の操作を行ない、＋６Ｉ標識ヒｈＰＳＴＩの放射能の沈
殿からの減少、すなわち添加したヒトＰＳＴＩによって
１！６■標識ヒ１−ＰＳＴＩがどの程度抗体から置換さ
れたかを調へた。この置換の割合が大きな培養上清が親
和性の高い抗体を含んでいるものとした。このような方
法により、１０倍希伏した上清を用いたときに総ＰＳＴ
Ｉ量に対する結合ＰＳＴＩ量（Ｂ／Ｔ）の割合が２０％
以上のもの、さらに１０倍あるいは１００倍希釈液でＰ
ＳＴＩにより結合標識ＰＳＴＩの１０％以上が置換きれ
るものという条件で、２１株のハイブリドーマを選択し
た。
（６）ハイブリドーマの選択■
（９で選択した２１株のハイブリドーマの培養上清をＢ
／Ｔ−２５％となるように調整した希釈液を用いて、（
５）と同様にＲＩＡを行なった。今回はＰＳＴＩの標準
曲線を求めるため、標準ＰＳＴＩ溶液（０，２，８，３
２，１２５，５００ｎｇ／ｍｌ ）各５０μｍをアッセ
イ用緩衝液５０μｍの代わりに加えた。（５）と同様の
操作の後、得られた結合標識ＰＳＴＩ量に基づいて標準
曲線を作成し、さらに公知の５ｃａｔｃｈａｒｄ Ｐｌ
ｏｔ法（Ａｎｎ、 Ｎ、Ｙ、 ＡｃａｄＳｃｉ、 ５１
．６６０ （１９４９））により、各上清に含まれる抗
体とＰＳＴＩの結合定数を求めた。この結果、結合定数
としてＩ Ｘ １０”Ｍ−’以上の値を示したハイブリ
ドーマのみを選択し、１５０．１６７．１７９．３６０
．３８４．４３２．６２２の７株を得た。各抗体の結合
定数は各々４９Ｘ１０ｍ、３．７Ｘ１０’、４．８Ｘ１
０”、１．４Ｘ１０１．６．０Ｘ１０″、５．ｌＸ１０
’、１．７Ｘ １０”Ｍ −１であった。
／Ｔ−２５％となるように調整した希釈液を用いて、（
５）と同様にＲＩＡを行なった。今回はＰＳＴＩの標準
曲線を求めるため、標準ＰＳＴＩ溶液（０，２，８，３
２，１２５，５００ｎｇ／ｍｌ ）各５０μｍをアッセ
イ用緩衝液５０μｍの代わりに加えた。（５）と同様の
操作の後、得られた結合標識ＰＳＴＩ量に基づいて標準
曲線を作成し、さらに公知の５ｃａｔｃｈａｒｄ Ｐｌ
ｏｔ法（Ａｎｎ、 Ｎ、Ｙ、 ＡｃａｄＳｃｉ、 ５１
．６６０ （１９４９））により、各上清に含まれる抗
体とＰＳＴＩの結合定数を求めた。この結果、結合定数
としてＩ Ｘ １０”Ｍ−’以上の値を示したハイブリ
ドーマのみを選択し、１５０．１６７．１７９．３６０
．３８４．４３２．６２２の７株を得た。各抗体の結合
定数は各々４９Ｘ１０ｍ、３．７Ｘ１０’、４．８Ｘ１
０”、１．４Ｘ１０１．６．０Ｘ１０″、５．ｌＸ１０
’、１．７Ｘ １０”Ｍ −１であった。
これらの抗体のうち親和性が高く、かつ抗体産生率の高
い１６７株を選択した。また、上記の抗体を組み合わせ
たイムノラジオメトリックアッセイ（後記）により、該
サンドインチ法に最適な抗体の組み合わせを調べ（第１
図参照）、１５０と３６０株を選択した。
い１６７株を選択した。また、上記の抗体を組み合わせ
たイムノラジオメトリックアッセイ（後記）により、該
サンドインチ法に最適な抗体の組み合わせを調べ（第１
図参照）、１５０と３６０株を選択した。
（７） モノクローン化
上記の選択法により選択されたハイブリドーマを凍結か
ら起こし、限界希釈法でクローニングした。９６ウエル
細胞培養プレートにハイブリドーマを０．５個／２００
μｌ／ウェルの濃度で培養し、ハイブリドーマが単一コ
ロニーで増殖してきたウェルの培養上清について上記ラ
ジオイムノアッセイを行ない、抗ヒトＰＳＴＩ抗体陽性
のウェルのハイブリドーマを培養拡大した。このように
して抗ヒトＰＳＴＩ抗体産生ハイブリドーマ細砲株１５
０．１６７及び３６０を確立した。
ら起こし、限界希釈法でクローニングした。９６ウエル
細胞培養プレートにハイブリドーマを０．５個／２００
μｌ／ウェルの濃度で培養し、ハイブリドーマが単一コ
ロニーで増殖してきたウェルの培養上清について上記ラ
ジオイムノアッセイを行ない、抗ヒトＰＳＴＩ抗体陽性
のウェルのハイブリドーマを培養拡大した。このように
して抗ヒトＰＳＴＩ抗体産生ハイブリドーマ細砲株１５
０．１６７及び３６０を確立した。
（８）腹水抗体液の作製
確立したハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、抗体
濃度の高い腹水を作製した。マウス（ＢＡ Ｌ Ｂ ／
ｃ 、雌、１０日前にブリスタンを０．５ｍｌ腹腔内
投与）にリン酸緩衝化生理食塩液に懸濁したハイブリド
ーマ約３Ｘ１０’個を腹腔内に投与した。１〜３週目に
適宜腹水を採取し、細胞を遠心分離した後、上清にアジ
化ナトリウム０．１％を加えて、凍結保存した。この方
法でハイプリドーマ１５０．１６７及び３６０の産生す
るモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水１５０Ａ、１
６７Ａ及び３６０Ａを得た。
濃度の高い腹水を作製した。マウス（ＢＡ Ｌ Ｂ ／
ｃ 、雌、１０日前にブリスタンを０．５ｍｌ腹腔内
投与）にリン酸緩衝化生理食塩液に懸濁したハイブリド
ーマ約３Ｘ１０’個を腹腔内に投与した。１〜３週目に
適宜腹水を採取し、細胞を遠心分離した後、上清にアジ
化ナトリウム０．１％を加えて、凍結保存した。この方
法でハイプリドーマ１５０．１６７及び３６０の産生す
るモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水１５０Ａ、１
６７Ａ及び３６０Ａを得た。
（９） モノクローナル抗体の精製
アフィゲルプロティンＡ ＭＡＰＳ−ＩＩキット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、腹水１５０Ａ、１６７Ａ及
び３６０Ａより抗体を精製した。ゲル２ｍｌを用いて、
腹水それぞれ１ｍｌをキットの操作手順に従って精製し
たところ、１５０Ａから約７ｍ＆、１６７Ａから約６ｍ
ｇ、３６０Ａから約６ｍｇの抗体を得ることができた。
ｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、腹水１５０Ａ、１６７Ａ及
び３６０Ａより抗体を精製した。ゲル２ｍｌを用いて、
腹水それぞれ１ｍｌをキットの操作手順に従って精製し
たところ、１５０Ａから約７ｍ＆、１６７Ａから約６ｍ
ｇ、３６０Ａから約６ｍｇの抗体を得ることができた。
抗体の純度の確認には、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動を用いた。精製した抗体画分を２−メルカプトエ
タノールで還元した後、１２．５％ＳＤＳゲルで泳動を
行なった。その結果、分子量的５３．０００前後ｉ：Ｈ
鎖、約２６，０００前後ｉ、：Ｌｕ４ノ２−）Ｂ７）／
＜ンドが認められた。
気泳動を用いた。精製した抗体画分を２−メルカプトエ
タノールで還元した後、１２．５％ＳＤＳゲルで泳動を
行なった。その結果、分子量的５３．０００前後ｉ：Ｈ
鎖、約２６，０００前後ｉ、：Ｌｕ４ノ２−）Ｂ７）／
＜ンドが認められた。
実施例２ モノクローナル抗体の性質
（１） クラス・サブクラスの決定
ハイブリドーマが産生じた免疫グロプリ、ンのクラス・
サブクラスの決定は、マウスイムノグロブリン各クラス
・サブクラスに特異的なウサギＩｇＧ抗体およびペルオ
キシダーゼ標識したヤギ抗ウサギ抗体（ＭｏｎｏＡｂ−
ＩＤ ＥＩＡ Ｋｉｔ、 Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅＳ）を用いて、上記のＥＬＩＳＡに準じて行な
った。その結果、腹水１５０Ａは抗７３．抗体及び抗に
抗体、１６７Ａ及び３６０Ａは抗７１抗体および抗に抗
体を用いたときに発色が認められた。
サブクラスの決定は、マウスイムノグロブリン各クラス
・サブクラスに特異的なウサギＩｇＧ抗体およびペルオ
キシダーゼ標識したヤギ抗ウサギ抗体（ＭｏｎｏＡｂ−
ＩＤ ＥＩＡ Ｋｉｔ、 Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅＳ）を用いて、上記のＥＬＩＳＡに準じて行な
った。その結果、腹水１５０Ａは抗７３．抗体及び抗に
抗体、１６７Ａ及び３６０Ａは抗７１抗体および抗に抗
体を用いたときに発色が認められた。
従って、１５０はＩｇＧ□、１６７と３６０はＩ ｇ
Ｇ ｌに属し、Ｌ鎖はいずれもに型であることが判った
。
Ｇ ｌに属し、Ｌ鎖はいずれもに型であることが判った
。
（り モノクローナル抗体の免疫学的性質後記実施例に
示すラジオイムノアッセイにより、前記実施例１−（８
）に記載した抗ＰＳＴＩモノクローナル抗体を含む腹水
１５０Ａ、１６７Ａおよび３６０Ａの免疫学的性質を調
べた。
示すラジオイムノアッセイにより、前記実施例１−（８
）に記載した抗ＰＳＴＩモノクローナル抗体を含む腹水
１５０Ａ、１６７Ａおよび３６０Ａの免疫学的性質を調
べた。
・扱体鵞
段階的に４倍希釈（２０００〜２０４８０００倍）した
抗体溶液５００μｍをポリスチレンチューブにとり目′
１標識ＰＳＴＩ溶液（５，５ｘ １０’ ｄｐｍ／ｍｌ
） １００μｍおよび、’Ｊ！ＩＩ定緩衝液（標準ＰＳ
ＴＩ Ｏａ度温溶液５０μｍを加え混和し、３７℃で２
時間インキュベーションした。以下、前記の方法に従っ
て測定した。
抗体溶液５００μｍをポリスチレンチューブにとり目′
１標識ＰＳＴＩ溶液（５，５ｘ １０’ ｄｐｍ／ｍｌ
） １００μｍおよび、’Ｊ！ＩＩ定緩衝液（標準ＰＳ
ＴＩ Ｏａ度温溶液５０μｍを加え混和し、３７℃で２
時間インキュベーションした。以下、前記の方法に従っ
て測定した。
加えた１１６１標識ＰＳＴＩのカウント数（Ｔ）に対す
る各希釈抗体のカウント数（Ｂ）の比率（Ｂ／ＩＳ ）
をｌｉｎ側に、抗体の希釈倍数をｌｏｇ側にプロ／上し
て希釈曲線を作成した。抗体価は、１１８１標識ＰＳＴ
Ｉ５５０００ｄｐｍ（７） ２０Ｘが結合するのに要す
る１５０．１６７及び３６０抗体の希釈倍数で表わした
値で、それぞれ１０００００．１５００００及び３６０
０００倍であった。
る各希釈抗体のカウント数（Ｂ）の比率（Ｂ／ＩＳ ）
をｌｉｎ側に、抗体の希釈倍数をｌｏｇ側にプロ／上し
て希釈曲線を作成した。抗体価は、１１８１標識ＰＳＴ
Ｉ５５０００ｄｐｍ（７） ２０Ｘが結合するのに要す
る１５０．１６７及び３６０抗体の希釈倍数で表わした
値で、それぞれ１０００００．１５００００及び３６０
０００倍であった。
それぞれの抗体の希釈曲線は第２図に示すとおりであっ
た。
た。
毀坦姓
公知の５ｃａｔｃｈａｒｄ ｐｌｏｔ法［Ａｎｎ、 Ｎ
、 Ｙ、 Ａｃａｄ。
、 Ｙ、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、、■、 ６６０ （１９４９）］により求めた
１５０Ａ、１６７Ａおよび３６０ＡとＰＳＴＩとの結合
定数は、それぞれ４．９ Ｘ １０” Ｍ−’、３．７
Ｘ １０’ Ｍ−’および１゜４ Ｘ １０’ Ｍ−
’であった。
１５０Ａ、１６７Ａおよび３６０ＡとＰＳＴＩとの結合
定数は、それぞれ４．９ Ｘ １０” Ｍ−’、３．７
Ｘ １０’ Ｍ−’および１゜４ Ｘ １０’ Ｍ−
’であった。
交差反応性
１５０Ａ、１６７Ａおよび３６０Ａに対するｄｅｓ（１
−５） ＰＳＴＩの交差反応性は第３図に示すとおり
で、ＰＳＴＩを１００％としたとき、それぞれ〈５．９
０及び２９０％であった。
−５） ＰＳＴＩの交差反応性は第３図に示すとおり
で、ＰＳＴＩを１００％としたとき、それぞれ〈５．９
０及び２９０％であった。
また、１５０Ａ、１６７Ａおよび３６０Ａは動物血清に
対して全く交差反応性を示きなかった。
対して全く交差反応性を示きなかった。
実施例１（９）の方法で腹水１５０Ａ、１６７Ａ、３６
０Ａより精製したＩｇＧ各々約１５μｇとＰ Ｓ Ｔ
Ｉ ’０．５μｇを含む０．９ｍｌのＯ，ＬＭ トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０＞を２５°Ｃで３０分間加温後
、ウシトリプシン２．３μｇを含む１ｍＭ塩酸、２０ｍ
Ｍ塩化カルシウム水溶液０．１ｍｌを加え混合する。２
５°Ｃで１５分間加温後、８６８μｇのヘンシイルーし
一アルギニンーｐ−ニトロアニリド塩酸塩を含む１ｍｌ
のＯ，ＩＭ トリス塩酸緩衝液を加えさらに１０分間２
５℃に加温後、０５ｍ１の３０ｘ酢酸水溶液を加え、酵
素反応を停止する。酵素の残存活性は４１０ｎｍでの反
応液の吸光度として得られる。ＰＳＴＩ、ＩｇＧ共に含
まない反応系での吸光度値を酵素の全活性とする。Ｉｇ
Ｇを含まｆＰｓＴＩとトリプシンのみの反応系での酵素
ノ残存活性は全活性の２０Ｘであったが、腹水１６７Ａ
及び３６０Ａ由来のＩｇＧが存在する場合の酵素の残存
活性は約８０％に回復した。一方腹水１５０Ａ由来のＩ
ｇＧ存在下では残存活性は２０％のままであった。この
ことはハイブリドーマ１６７及び３６０が産生するモノ
クローナル抗体１６７及び３６０はＰＳＴＩのトリプシ
ン阻害活性を中和するが、抗体１５０は中和しない、す
なわち、１６７．３６０と１５０は異なった特異性を有
することを示している。
０Ａより精製したＩｇＧ各々約１５μｇとＰ Ｓ Ｔ
Ｉ ’０．５μｇを含む０．９ｍｌのＯ，ＬＭ トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０＞を２５°Ｃで３０分間加温後
、ウシトリプシン２．３μｇを含む１ｍＭ塩酸、２０ｍ
Ｍ塩化カルシウム水溶液０．１ｍｌを加え混合する。２
５°Ｃで１５分間加温後、８６８μｇのヘンシイルーし
一アルギニンーｐ−ニトロアニリド塩酸塩を含む１ｍｌ
のＯ，ＩＭ トリス塩酸緩衝液を加えさらに１０分間２
５℃に加温後、０５ｍ１の３０ｘ酢酸水溶液を加え、酵
素反応を停止する。酵素の残存活性は４１０ｎｍでの反
応液の吸光度として得られる。ＰＳＴＩ、ＩｇＧ共に含
まない反応系での吸光度値を酵素の全活性とする。Ｉｇ
Ｇを含まｆＰｓＴＩとトリプシンのみの反応系での酵素
ノ残存活性は全活性の２０Ｘであったが、腹水１６７Ａ
及び３６０Ａ由来のＩｇＧが存在する場合の酵素の残存
活性は約８０％に回復した。一方腹水１５０Ａ由来のＩ
ｇＧ存在下では残存活性は２０％のままであった。この
ことはハイブリドーマ１６７及び３６０が産生するモノ
クローナル抗体１６７及び３６０はＰＳＴＩのトリプシ
ン阻害活性を中和するが、抗体１５０は中和しない、す
なわち、１６７．３６０と１５０は異なった特異性を有
することを示している。
実施例３ ラジオイムノアッセイ
（１） ”’Ｉ標識ＰＳＩＩの調製
ＰＳＴＩ ５μｇを含むＯ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，４）１０μｍに０．５Ｍリン酸緩衝液５０μｍおよび
［１−ＩＩコヨウ化ナナトリウムＡｍｅｒｓｈａｍ、
１００ｍＣ１／ｍｌ） １０Ｂ １を加え混和後、０．
２ｘクロラミンＴ １０μｍを加えて室温で３０秒間攪
拌した。次いで、１ｚピロ亜硫酸ナトリウム１０μｍを
加え混和後、１ｏｚヨウ化ナトリウムおよび１ｚ牛血清
アルブミンをそれぞれ１０μｍ加え、反応溶液をゲル濾
過［セファデックスＧ−２５（Ｆｉｎｅ、０．９ Ｘ
２５ ｃｍ、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，４）］により精製して、比放射能２０
０μＣｉ／μｇの１１１１標３９１ ＰＳＴＩを得た。
，４）１０μｍに０．５Ｍリン酸緩衝液５０μｍおよび
［１−ＩＩコヨウ化ナナトリウムＡｍｅｒｓｈａｍ、
１００ｍＣ１／ｍｌ） １０Ｂ １を加え混和後、０．
２ｘクロラミンＴ １０μｍを加えて室温で３０秒間攪
拌した。次いで、１ｚピロ亜硫酸ナトリウム１０μｍを
加え混和後、１ｏｚヨウ化ナトリウムおよび１ｚ牛血清
アルブミンをそれぞれ１０μｍ加え、反応溶液をゲル濾
過［セファデックスＧ−２５（Ｆｉｎｅ、０．９ Ｘ
２５ ｃｍ、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，４）］により精製して、比放射能２０
０μＣｉ／μｇの１１１１標３９１ ＰＳＴＩを得た。
クロマトグラム（溶出曲線）は第４図に示すとおりであ
った。
った。
（２） ＰＳＴＩのラジオイムノアッセイ直皇迭
試薬の希釈および調製は、すへて０．９ｚ塩化ナトリウ
ム、０．１ｘアジ化ナトリウム、ＬｍＭエチレンジ゛ア
ミン四酢酸四ナトリウムおよび０５＠Ａ牛血清アルブミ
ンを含有するＯ、 ０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）
を用いて行なった。
ム、０．１ｘアジ化ナトリウム、ＬｍＭエチレンジ゛ア
ミン四酢酸四ナトリウムおよび０５＠Ａ牛血清アルブミ
ンを含有するＯ、 ０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）
を用いて行なった。
標準ＰＳＴＩ溶液（０，２，５，１０，５０，１５０，
５００ｎｇ／ｍ１）あるいは血清試料５０μｍをポリス
チレンチューブにとり、前記の１１８１標識ＰＳＴＩ溶
液（５，５Ｘ１０’ ｄｐｍ／ｍｌ） １００μｍおよ
び１６７Ａの希釈液（１：１５０．０００＞ ５００μ
ｍを加え、３７℃で２時間インキュベーションしたのち
、固相化したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の懸濁液（１ｍｇ
／ｍｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ） １００μｍを加え、３７℃
で３０分間インキュベーションした。次いで、室温で遠
心分離（１５００ｘ ｇ、１０分間）したのち上清を吸
引除去し、その沈澱の放射能をガンマ線シンチレーショ
ンカウンターで撹り定した。
５００ｎｇ／ｍ１）あるいは血清試料５０μｍをポリス
チレンチューブにとり、前記の１１８１標識ＰＳＴＩ溶
液（５，５Ｘ１０’ ｄｐｍ／ｍｌ） １００μｍおよ
び１６７Ａの希釈液（１：１５０．０００＞ ５００μ
ｍを加え、３７℃で２時間インキュベーションしたのち
、固相化したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の懸濁液（１ｍｇ
／ｍｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ） １００μｍを加え、３７℃
で３０分間インキュベーションした。次いで、室温で遠
心分離（１５００ｘ ｇ、１０分間）したのち上清を吸
引除去し、その沈澱の放射能をガンマ線シンチレーショ
ンカウンターで撹り定した。
標準曲線
標準曲線は、標準ＰＳＴＩ濃度をｌｏｇ側に、ＰＳＴＩ
Ｏｎｇ／ｍｌのカウント数（Ｂｏ）に対する各標準Ｐ
ＳＴＩのカウント数（Ｂ）の比率（Ｂ／ＢＪ）をｌｉｎ
側にプロットして作成し、これに血清試料のＢ／ＢＪを
対応させて血清中のＰＳＴＩｆｉ度を求めた。
Ｏｎｇ／ｍｌのカウント数（Ｂｏ）に対する各標準Ｐ
ＳＴＩのカウント数（Ｂ）の比率（Ｂ／ＢＪ）をｌｉｎ
側にプロットして作成し、これに血清試料のＢ／ＢＪを
対応させて血清中のＰＳＴＩｆｉ度を求めた。
上記の測定法に従って作成した標準曲線ならびに急性膵
炎等の体外診断薬として既に市販されているＰＳＴＩテ
ストジオツギ（塩野義製薬製）の標準曲線は第５図に示
すとおりであった。
炎等の体外診断薬として既に市販されているＰＳＴＩテ
ストジオツギ（塩野義製薬製）の標準曲線は第５図に示
すとおりであった。
血清ＰＳＴＩの回収試験
健常人血清に標準ＰＳＴＩを添加し、末法により測定し
たときのＰＳＴＩの回収率は表１に示すとおりで、平均
回収率は１０２．２±６．８ｘであった。
たときのＰＳＴＩの回収率は表１に示すとおりで、平均
回収率は１０２．２±６．８ｘであった。
表１ 血清ＰＳＴＩの回収試験
健常人あるいは膵疾患患者から採取した血清を段階的に
２倍希釈した試料を測定し、希釈率を１゜ｇ側に、Ｂ／
Ｂ、Ｘをｌｉｎ側にプロットした曲線は第６図に示すと
おりであった。
２倍希釈した試料を測定し、希釈率を１゜ｇ側に、Ｂ／
Ｂ、Ｘをｌｉｎ側にプロットした曲線は第６図に示すと
おりであった。
常人の血清ＰＳＴＩ濃度
前記の測定法に従って測定した健常人１０例の血清ＰＳ
ＴＩ濃度は、表１に示すとおりで、平均濃度は９．４±
１．９ｎｇ／ｍｌであった。これらの血清試料を前出の
ＰＳＴ１テストンオノギで測定したときの血清ＰＳＴＩ
濃度は表２に示すとおりで、平均濃度は８．４±２．３
０ｇ／ｍｌであった。
ＴＩ濃度は、表１に示すとおりで、平均濃度は９．４±
１．９ｎｇ／ｍｌであった。これらの血清試料を前出の
ＰＳＴ１テストンオノギで測定したときの血清ＰＳＴＩ
濃度は表２に示すとおりで、平均濃度は８．４±２．３
０ｇ／ｍｌであった。
（以下余白）
表２ 健常人の血清Ｐ Ｓ Ｔ Ｉ ａ度ＰＳＴＩｆｉ
度（ｎｇ／ｍｌ ） ｍ清 末法 ＰＳ
ＴＩデストシオノギ１ １１．２
１１．６２
１２．７ １１．５３
１０．６ ９．５
４ ８、５
７．７５ １０．３
９．１６ ９
、６ ８．３７
８．５ ８．４８
６、９
６．０９ ６、７ ４．１１０
８、５
７．４平均濃度 ９．４±１．９ ８．４±２．
３急性膵炎における血清ＰＳＴＩ１度 急性Ｆｙ＃炎患者の血清ＰＳＴＩ ４度は、表３に示す
とおりで、上記の健常人の血清ＰＳＴＩｄ度に比べ、有
意に高値を示した。
度（ｎｇ／ｍｌ ） ｍ清 末法 ＰＳ
ＴＩデストシオノギ１ １１．２
１１．６２
１２．７ １１．５３
１０．６ ９．５
４ ８、５
７．７５ １０．３
９．１６ ９
、６ ８．３７
８．５ ８．４８
６、９
６．０９ ６、７ ４．１１０
８、５
７．４平均濃度 ９．４±１．９ ８．４±２．
３急性膵炎における血清ＰＳＴＩ１度 急性Ｆｙ＃炎患者の血清ＰＳＴＩ ４度は、表３に示す
とおりで、上記の健常人の血清ＰＳＴＩｄ度に比べ、有
意に高値を示した。
表３ 急性膵炎患者の血清ＰＳＴＩｆｉ度血清 Ｐ
ＳＴＩｆｉ度 （ｎｇ／ｍｌ） ＰＳＴＩテストジオツギによる測定値との相関ヒト血清
１５検体を前記の測定法ならびに前出のＰＳＴＩテスト
ジオツギにより測定した。両側定値の関係は第７図に示
すとおりで、両者間には良好な相関関係が認められた。
ＳＴＩｆｉ度 （ｎｇ／ｍｌ） ＰＳＴＩテストジオツギによる測定値との相関ヒト血清
１５検体を前記の測定法ならびに前出のＰＳＴＩテスト
ジオツギにより測定した。両側定値の関係は第７図に示
すとおりで、両者間には良好な相関関係が認められた。
（３） ＰＳＴＩのイムノラジオメトリックアッセイ
腹水の精製 前記のハイブリドーマクローン１５０および３６０から
得た腹水をアフィゲルプロティンＡＭＡＰＳ−１ｔキッ
ト［Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製コにより精製した。すなわち、
腹水１ｍｌに結合パンファー１ｍｌを加え、この溶液を
あらかじめ結合バッファーで平衡化したアフィゲルプロ
ティンＡカラム（０，７ｃｍφ×５．５ｃｍ）に加え、
結合バッファー３０ｍ１で洗浄した。次いで溶出バッフ
ァー１０ｍ１で展開し、溶出液をＬｍｌずつ分取して吸
光度（２８０ｎｍ）が０１以上の両分を集め、これを蒸
留水に対して透析してＩｇＧ画分を得た。
腹水の精製 前記のハイブリドーマクローン１５０および３６０から
得た腹水をアフィゲルプロティンＡＭＡＰＳ−１ｔキッ
ト［Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製コにより精製した。すなわち、
腹水１ｍｌに結合パンファー１ｍｌを加え、この溶液を
あらかじめ結合バッファーで平衡化したアフィゲルプロ
ティンＡカラム（０，７ｃｍφ×５．５ｃｍ）に加え、
結合バッファー３０ｍ１で洗浄した。次いで溶出バッフ
ァー１０ｍ１で展開し、溶出液をＬｍｌずつ分取して吸
光度（２８０ｎｍ）が０１以上の両分を集め、これを蒸
留水に対して透析してＩｇＧ画分を得た。
固相化抗体の調製
ポリスチレンビーズ（積木化学社製、直径６．４ｏ＋ｍ
）５０個を、前記実施例１（９）で得た抗ＰＳＴＩ抗体
１５０を０．３５ｍｇ含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５） ５０ｍ１に浸漬し、室温で１６時間静置し
た。次いで０．２２牛血清アルブミン、５ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸四ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび０．１ｚアジ化ナトリウムを含むＯ，０１Ｍリ
ン酸緩衝液、ｐＨ７４（緩衝液Ａ）で十分に洗浄後、同
緩衝液中に４℃で保存した。
）５０個を、前記実施例１（９）で得た抗ＰＳＴＩ抗体
１５０を０．３５ｍｇ含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５） ５０ｍ１に浸漬し、室温で１６時間静置し
た。次いで０．２２牛血清アルブミン、５ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸四ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ムおよび０．１ｚアジ化ナトリウムを含むＯ，０１Ｍリ
ン酸緩衝液、ｐＨ７４（緩衝液Ａ）で十分に洗浄後、同
緩衝液中に４℃で保存した。
＋ｔａＩ標識抗ＰＳＴＩ抗体の調製
前記実施例１（９）で得た抗ＰＳＴＩモノクローナル抗
体３６０（５μｇ）に０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
５）５０μｍと［”’Ｉ］ヨウ化ナトナトリウムｍｅｒ
ｓｈａｍ） １ ｍＣ１を加え混和後、０．２″Ａクロ
ラミンＴ １０μｍを加え、室温で４５秒間攪拌した。
体３６０（５μｇ）に０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
５）５０μｍと［”’Ｉ］ヨウ化ナトナトリウムｍｅｒ
ｓｈａｍ） １ ｍＣ１を加え混和後、０．２″Ａクロ
ラミンＴ １０μｍを加え、室温で４５秒間攪拌した。
次いで、１ｚピロ亜硫酸ナトリウム１０μｍを加え混和
後、１０ｘヨウ化カリウムおよび１ｘ牛血清アルブミン
をそれぞれ１０μｍずつ加え、反応溶液をゲル濾過［セ
ファデックスＧ−２５（Ｆｉｎｅ、 ０．７５ｃｍφｘ
２５ｃｍ％Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；０．１Ｍリン酸緩
衝液、ｐＨ７，４］により精製した。この時の溶出曲線
は第８図に示すとおりであった。
後、１０ｘヨウ化カリウムおよび１ｘ牛血清アルブミン
をそれぞれ１０μｍずつ加え、反応溶液をゲル濾過［セ
ファデックスＧ−２５（Ｆｉｎｅ、 ０．７５ｃｍφｘ
２５ｃｍ％Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；０．１Ｍリン酸緩
衝液、ｐＨ７，４］により精製した。この時の溶出曲線
は第８図に示すとおりであった。
サンドインチ法
ポリスチレンチューブに前記固相化抗体ビーズ１個を入
れ、これに標準ＰＳＩＩ溶液２００μｍを加えて３７℃
で２時間インキュベーションした０反応溶液を吸引除去
し、緩衝液Ａ ２ｍｌで２回洗浄した後、前記の１１８
１標識抗ＰＳＴＩ抗体溶液２００μｍを加え、３７°Ｃ
で２時間インキュベーションした。反応溶液を吸引除去
し、緩衝液Ａ ２ｍｌで２回洗浄して固相に結合した放
射能をガンマカウンターで測定した。
れ、これに標準ＰＳＩＩ溶液２００μｍを加えて３７℃
で２時間インキュベーションした０反応溶液を吸引除去
し、緩衝液Ａ ２ｍｌで２回洗浄した後、前記の１１８
１標識抗ＰＳＴＩ抗体溶液２００μｍを加え、３７°Ｃ
で２時間インキュベーションした。反応溶液を吸引除去
し、緩衝液Ａ ２ｍｌで２回洗浄して固相に結合した放
射能をガンマカウンターで測定した。
標準ＰＳＴＩ濃度を横軸に、放射能を縦軸にプロットし
た標準曲線は、第９図に示すとおりであった。
た標準曲線は、第９図に示すとおりであった。
実施例４ エンザイムイムノアッセイ
抗ＰＳＴＩ抗体Ｆａｂ ’フラグメントの調製前記実施
例１（９）で得た抗ＰＳＴＩモノクローナル抗体３６０
（４，４ｍｇ）を、Ｏ，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，
５）に溶解し、２２０μｇのペプシンで３７℃１０時間
消化した。これを、セファデックスＧ−１００カラム＜
１゜ＯＸ ４７ ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に付し、
０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）で流速４．８ｍｌ
／ｈｒで溶出し、１ｍｌずつ分画した。その分画１６〜
２２を、アフィゲルプロティンＡカラム（２，Ｏｍｌ、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）に付し、通過画分を得た。該通
過画分をアミコンウルトロフィルトレーターＰＭ−１０
（Ａ＋ｙ＋１ｃｏｎ）で濃縮して、溶媒を０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ６，１）に交換した。
例１（９）で得た抗ＰＳＴＩモノクローナル抗体３６０
（４，４ｍｇ）を、Ｏ，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，
５）に溶解し、２２０μｇのペプシンで３７℃１０時間
消化した。これを、セファデックスＧ−１００カラム＜
１゜ＯＸ ４７ ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に付し、
０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）で流速４．８ｍｌ
／ｈｒで溶出し、１ｍｌずつ分画した。その分画１６〜
２２を、アフィゲルプロティンＡカラム（２，Ｏｍｌ、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）に付し、通過画分を得た。該通
過画分をアミコンウルトロフィルトレーターＰＭ−１０
（Ａ＋ｙ＋１ｃｏｎ）で濃縮して、溶媒を０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ６，１）に交換した。
これを濃縮して、１５ｍ１のｐ（ａｂ’）ｚフラグメン
ト（ＯＤＩｇ。０．８５０＞を得た。１５０μｍの０．
１Ｍ２−メルカプトエチルアミンを加え、３７℃で１２
０分間インキユヘーションした。これをセファデックス
Ｇ−２５カラム（１，Ｏｘ ５１．５ ｃｍ％Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）に付し、０．正リン酸緩衝液（ｐＨ６，１
）により流速２４ｍ１／ｈｒで溶出し、分画１５〜２５
を得た。これらをアミコンウルトロフィルトレーターＰ
Ｍ−１０（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮して０５ｍ１とし、Ｆ
ａｂ’フラグメントを得た。
ト（ＯＤＩｇ。０．８５０＞を得た。１５０μｍの０．
１Ｍ２−メルカプトエチルアミンを加え、３７℃で１２
０分間インキユヘーションした。これをセファデックス
Ｇ−２５カラム（１，Ｏｘ ５１．５ ｃｍ％Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）に付し、０．正リン酸緩衝液（ｐＨ６，１
）により流速２４ｍ１／ｈｒで溶出し、分画１５〜２５
を得た。これらをアミコンウルトロフィルトレーターＰ
Ｍ−１０（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮して０５ｍ１とし、Ｆ
ａｂ’フラグメントを得た。
マレイミド−ＰＯＤの調製
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） （３，０ｍｇ、Ｓｉｇｍ
ａ）を０３ｍ１の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，１＞
に溶解した。３．２ｍｇのＮ−スクシンイミジル４−（
Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキ
シレート（Ｐｉｅｒｃｅ ）を４０μｍのジメチルホル
ムアミドに溶解したものを３０μｍ加え、３０℃で６０
分間インキュベーションした。これを３００Ｏｒｐｍで
１ｏ分間遠心分離した上清を、セファデックスＧ−２５
カラム（１４ｘ４１．０ ｃｍ、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）に付し、Ｏ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，１）により
、流速１８ｍ１／ｈｒで溶出して、１．Ｏｍｌずつに分
画した。分画１３〜１７を、アミコンウルトロフィルト
レイターＰＭ−１０（Ａｍｉｃｏｎ）で０．５ｍｌまで
濃縮し、マレイミド−ＰＯＤを得た。
ａ）を０３ｍ１の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，１＞
に溶解した。３．２ｍｇのＮ−スクシンイミジル４−（
Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキ
シレート（Ｐｉｅｒｃｅ ）を４０μｍのジメチルホル
ムアミドに溶解したものを３０μｍ加え、３０℃で６０
分間インキュベーションした。これを３００Ｏｒｐｍで
１ｏ分間遠心分離した上清を、セファデックスＧ−２５
カラム（１４ｘ４１．０ ｃｍ、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）に付し、Ｏ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，１）により
、流速１８ｍ１／ｈｒで溶出して、１．Ｏｍｌずつに分
画した。分画１３〜１７を、アミコンウルトロフィルト
レイターＰＭ−１０（Ａｍｉｃｏｎ）で０．５ｍｌまで
濃縮し、マレイミド−ＰＯＤを得た。
ＰＯＤ標識抗ＰＳＴＩ抗体Ｆａｂ’フラグメントの調製
上記のマレイミド−ＰＯＤ （０，５ｍ１）とＦａｂ
’フラグメント （０，５ｍ１）を混合し、４℃で１６
時間放置した。ウルトロゲルＡｃＡ ４４カラム（１，
６Ｘ ５５．５ ｃｍ、 ＬＫＢ Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ
ＡＢ）に付し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）
により流速１３ｍ１／ｈｒで溶出し、１．Ｏｍｌずつに
分画して、分画４８〜５３ （６，０ｍ１）として、■
Ｄ標識抗ＰＳＴＩ抗体Ｆｅｂ ’フラグメントを得た。
上記のマレイミド−ＰＯＤ （０，５ｍ１）とＦａｂ
’フラグメント （０，５ｍ１）を混合し、４℃で１６
時間放置した。ウルトロゲルＡｃＡ ４４カラム（１，
６Ｘ ５５．５ ｃｍ、 ＬＫＢ Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ
ＡＢ）に付し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）
により流速１３ｍ１／ｈｒで溶出し、１．Ｏｍｌずつに
分画して、分画４８〜５３ （６，０ｍ１）として、■
Ｄ標識抗ＰＳＴＩ抗体Ｆｅｂ ’フラグメントを得た。
抗ＰＳＴＩモノクローナル抗体（１５０） 感作ピース
の調製 ２５２個のビーズ（０，１８ｇ／１０ビーズ、ポリスチ
レンピース、直径３ｍｍ、和光紬薬）を、Ｏ，ＬＭ ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）に抗ＰＳＴＩモノクロ
ーナル抗体（１５０）を溶解した溶液２０ｍ１ （１５
，５μｇ／ｍｌ）に浸ｆ、４℃で２４時間放置し、緩衝
液Ａ （０，１％ウシ血清アルブミン、０．３Ｍ塩化ナ
トリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１″Ａアジ化
ナトリウムを含む０、１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，０）
で４回洗浄して、抗ＰＳ１１モノクローナル抗体（１５
０）固相化ビーズを得た。
の調製 ２５２個のビーズ（０，１８ｇ／１０ビーズ、ポリスチ
レンピース、直径３ｍｍ、和光紬薬）を、Ｏ，ＬＭ ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）に抗ＰＳＴＩモノクロ
ーナル抗体（１５０）を溶解した溶液２０ｍ１ （１５
，５μｇ／ｍｌ）に浸ｆ、４℃で２４時間放置し、緩衝
液Ａ （０，１％ウシ血清アルブミン、０．３Ｍ塩化ナ
トリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１″Ａアジ化
ナトリウムを含む０、１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，０）
で４回洗浄して、抗ＰＳ１１モノクローナル抗体（１５
０）固相化ビーズを得た。
２段階測定法
９６ウエルマイクロプレートのウェルに１個の抗ＰＳＴ
Ｉモノクローナル抗体（１５０）同相化ビーズを入れ、
２５０μｍの緩衝液Ａを加え、室温で１０分間放置した
後、溶液を吸引除去した。そこへ、２００μｍのＢ衝液
Ａと２０μｍのサンプルまたは標準ＰＳＴＩを加え、室
温で９０分間放置した。２５０μｍの緩衝液Ｂ（０１ｚ
ウシ血清アルブミンを含むＯ，０１Ｍリン酸緩衝液、ｐ
Ｈ７，０）で４回洗浄した後、２００μｍの■Ｄ標識抗
ＰＳＴＩ抗体Ｆａｂ’フラグメント （緩衝液Ｂで１０
０倍に希釈）を加え、室温で９０分間放置する。吸引除
去後、２５０μｍの緩衝液Ｂで４回洗浄し、ピースを異
なる９６ウエルマイクロプレートに移す。
Ｉモノクローナル抗体（１５０）同相化ビーズを入れ、
２５０μｍの緩衝液Ａを加え、室温で１０分間放置した
後、溶液を吸引除去した。そこへ、２００μｍのＢ衝液
Ａと２０μｍのサンプルまたは標準ＰＳＴＩを加え、室
温で９０分間放置した。２５０μｍの緩衝液Ｂ（０１ｚ
ウシ血清アルブミンを含むＯ，０１Ｍリン酸緩衝液、ｐ
Ｈ７，０）で４回洗浄した後、２００μｍの■Ｄ標識抗
ＰＳＴＩ抗体Ｆａｂ’フラグメント （緩衝液Ｂで１０
０倍に希釈）を加え、室温で９０分間放置する。吸引除
去後、２５０μｍの緩衝液Ｂで４回洗浄し、ピースを異
なる９６ウエルマイクロプレートに移す。
次いで、３ｍｇ／ｍｌのオルトフェニレンジアミン（Ｏ
ＰＤ）および０．０２％過酸化水素を含むＯ，ＬＭマク
ルバイン緩＃液（ｐＨ６，５＞ ２００μｍを加えた。
ＰＤ）および０．０２％過酸化水素を含むＯ，ＬＭマク
ルバイン緩＃液（ｐＨ６，５＞ ２００μｍを加えた。
室温で２０分間でインキュベートした後、ＩＮ硫ｌＮ２
５０μｌを加えて酵素反応を止めた。４９２ｎｍにおけ
る吸光度を測定することにより、ＰＳＩＩａ度を求めた
。
５０μｌを加えて酵素反応を止めた。４９２ｎｍにおけ
る吸光度を測定することにより、ＰＳＩＩａ度を求めた
。
１段階測定法
９６ウエルマイクロプレートのウェルに１個の抗ＰＳＴ
Ｉモノクローナル抗体＜１５０）固相化ビーズを入れ、
２０μｍのサンプルまたは標準ＰＳＴＩをとり、２００
μｍのＰＯＤ標識抗ＰＳＴＩ抗体Ｆａｂ ’フラグメン
ト （緩衝液Ｂで１００倍に希釈）を加えた。室温で１
２０分間放置した後、吸引除去し、２５０μｍの緩衝液
Ｂで４回洗浄した。ビーズを他の９６ウエルマイクロプ
レートに移し℃、０．３ｍｇ／ｍｌのＯＰＤを含む０．
１Ｍマクルバイン緩衝液（ｐＨ６，５＞ ２００μｍを
加え、室温で２０分間でインキュベーションした後、Ｉ
Ｎ硫酸５０μｍを加えて酵素反応を止めた。４９２ｎｍ
における吸光度を測定することにより、ＰＳＴＩ 濃度
を求めた。
Ｉモノクローナル抗体＜１５０）固相化ビーズを入れ、
２０μｍのサンプルまたは標準ＰＳＴＩをとり、２００
μｍのＰＯＤ標識抗ＰＳＴＩ抗体Ｆａｂ ’フラグメン
ト （緩衝液Ｂで１００倍に希釈）を加えた。室温で１
２０分間放置した後、吸引除去し、２５０μｍの緩衝液
Ｂで４回洗浄した。ビーズを他の９６ウエルマイクロプ
レートに移し℃、０．３ｍｇ／ｍｌのＯＰＤを含む０．
１Ｍマクルバイン緩衝液（ｐＨ６，５＞ ２００μｍを
加え、室温で２０分間でインキュベーションした後、Ｉ
Ｎ硫酸５０μｍを加えて酵素反応を止めた。４９２ｎｍ
における吸光度を測定することにより、ＰＳＴＩ 濃度
を求めた。
結果を、第１０〜１１図に示す。図から明らかなように
、末法によってもｐｓｒｒを定Ｊｉすることが可能であ
った。
、末法によってもｐｓｒｒを定Ｊｉすることが可能であ
った。
第１図はモノクローナル抗体を用いたイムノラジオメト
リックアッセイの標準曲線を示す。第２図は各モノクロ
ーナル抗体の希釈曲線を示す。第３図は各モノクローナ
ル抗体の交差反応性を示す。第４図は目６Ｉ標１ＰｓＴ
Ｉの溶出曲線を示す。第５図はラジオイムノアッセイに
おける１６７抗体の標準曲線およびＰＳＴＩテストジオ
ツギの標準曲線を示す。第６図は１６７抗体を用いたラ
ジオイムノアッセイにおけるヒト血清の希釈曲線を示す
。 第７区は１６７抗体を用いたラジオイムノアッセイによ
る測定値とＰＳＴＩテストジオツギによる測定値の相関
関係を示す。第８図は目６１標識抗ＰＳＴＩ抗体の溶出
曲線を示す。第９図は１６７抗体を用いたサンドイツチ
法によるラジオイムノアッセイにおける標準曲線を示す
、第１０図は１段階測定法によるエンザイムイムノアッ
セイの標準曲線を示す。第１１図は２段階測定法による
エンザイムイムノアッセイの標準曲線を示す。 特許出願人 塩野義製薬株式会社 代 理 人 弁理士 潮１）雄−１ 著 第 １ 図 ０２．５９．８３９．３１５７６３０ ヒトＰＳ丁１ （ｎ＆／ｍｌ ） ヒトＰＳＴＩのイムノラジオメトリックアッセイの標準
曲線第 ２ 図 廊訳度 モノクローナル抗体の４ケ、田劫（ 第 ＰＳＴＩ （ｎｇ／ｍｌ） ＰＳＴＩ （ｎｓｒ／ｍｌ） モノクローナル抗体の交差反応性 ０−−−０ ヒトＰＳＴＩ ・−−ｍ−・ Ｄｃｓ（１−５）−ヒトＰＳＴＩ第
４ 図 ン霧出名りＥ（ｍｌ） １２５工標識ヒトＰＳＴＩの溶出曲迄 第 ５ 図 ヒトＰＳＴＩ （ｎｇ／ｍｌ ） ラジオイムノアッセイのＭ、 孕曲淡 第 ６ 図 １／１６１／８１／４ １／２ １／１４罠度 血清の４訳曲線 第 ７ 図 ＰＳＴＩテストジオツギ （ｎｇ／ｍｌ ）ラジオイム
ノアッセイとＰＳＴＩテストジオツギによる血清ｐｓ’
ｒ■のＩ関第 ８ 図 溶出ｉ（ｍｌ） １２５■標識ＰＳＴＩモノクロ一ナル抗体の浴出曲線筒
９ 図 ０２．５ ９．８３９．３ １５７ ６３０ヒトＰＳＴ
Ｉ （ｎｇ／ｍｌ ） イムノラジオメトリックアッセイ標準曲線筒 １０
図 エンザイムノアツセイ（１段階性）の標準曲線ヒトＰＳ
ＴＩ （Ｐｇ／ｍｌ ｌ 第 １１ 図 エンザイムノアツセイ（２段階性）の標準曲線α℃１
０．０１ ０
ｊ １．０ヒトＰＳＴＩ （
ｐｇｌｍｌ １
リックアッセイの標準曲線を示す。第２図は各モノクロ
ーナル抗体の希釈曲線を示す。第３図は各モノクローナ
ル抗体の交差反応性を示す。第４図は目６Ｉ標１ＰｓＴ
Ｉの溶出曲線を示す。第５図はラジオイムノアッセイに
おける１６７抗体の標準曲線およびＰＳＴＩテストジオ
ツギの標準曲線を示す。第６図は１６７抗体を用いたラ
ジオイムノアッセイにおけるヒト血清の希釈曲線を示す
。 第７区は１６７抗体を用いたラジオイムノアッセイによ
る測定値とＰＳＴＩテストジオツギによる測定値の相関
関係を示す。第８図は目６１標識抗ＰＳＴＩ抗体の溶出
曲線を示す。第９図は１６７抗体を用いたサンドイツチ
法によるラジオイムノアッセイにおける標準曲線を示す
、第１０図は１段階測定法によるエンザイムイムノアッ
セイの標準曲線を示す。第１１図は２段階測定法による
エンザイムイムノアッセイの標準曲線を示す。 特許出願人 塩野義製薬株式会社 代 理 人 弁理士 潮１）雄−１ 著 第 １ 図 ０２．５９．８３９．３１５７６３０ ヒトＰＳ丁１ （ｎ＆／ｍｌ ） ヒトＰＳＴＩのイムノラジオメトリックアッセイの標準
曲線第 ２ 図 廊訳度 モノクローナル抗体の４ケ、田劫（ 第 ＰＳＴＩ （ｎｇ／ｍｌ） ＰＳＴＩ （ｎｓｒ／ｍｌ） モノクローナル抗体の交差反応性 ０−−−０ ヒトＰＳＴＩ ・−−ｍ−・ Ｄｃｓ（１−５）−ヒトＰＳＴＩ第
４ 図 ン霧出名りＥ（ｍｌ） １２５工標識ヒトＰＳＴＩの溶出曲迄 第 ５ 図 ヒトＰＳＴＩ （ｎｇ／ｍｌ ） ラジオイムノアッセイのＭ、 孕曲淡 第 ６ 図 １／１６１／８１／４ １／２ １／１４罠度 血清の４訳曲線 第 ７ 図 ＰＳＴＩテストジオツギ （ｎｇ／ｍｌ ）ラジオイム
ノアッセイとＰＳＴＩテストジオツギによる血清ｐｓ’
ｒ■のＩ関第 ８ 図 溶出ｉ（ｍｌ） １２５■標識ＰＳＴＩモノクロ一ナル抗体の浴出曲線筒
９ 図 ０２．５ ９．８３９．３ １５７ ６３０ヒトＰＳＴ
Ｉ （ｎｇ／ｍｌ ） イムノラジオメトリックアッセイ標準曲線筒 １０
図 エンザイムノアツセイ（１段階性）の標準曲線ヒトＰＳ
ＴＩ （Ｐｇ／ｍｌ ｌ 第 １１ 図 エンザイムノアツセイ（２段階性）の標準曲線α℃１
０．０１ ０
ｊ １．０ヒトＰＳＴＩ （
ｐｇｌｍｌ １
Claims (10)
- （１）ヒトＰＳＴＩを認識するモノクローナル抗体。
- （２）ハイブリドーマｈＰＳＴＩ−１５０により産生さ
れる請求項１に記載のモノクローナル抗体１５０。 - （３）ハイブリドーマｈＰＳＴＩ−１６７により産生さ
れる請求項１に記載のモノクローナル抗体１６７。 - （４）ハイブリドーマｈＰＳＴＩ−３６０により産生さ
れる請求項１に記載のモノクローナル抗体３６０。 - （５）ヒトＰＳＴＩを認識するモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ。 - （６）モノクローナル抗体１５０を産生する請求項５に
記載のハイブリドーマｈＰＳＴＩ−１５０。 - （７）モノクローナル抗体１６７を産生する請求項５に
記載のハイブリドーマｈＰＳＴＩ−１６７。 - （８）モノクローナル抗体３６０を産生する請求項５に
記載のハイブリドーマｈＰＳＴＩ−３６０。 - （９）ヒトＰＳＴＩを認識するモノクローナル抗体を用
いるラジオイムノアッセイ法またはエンザイムイムノア
ッセイ法によりヒトＰＳＴＩを測定することを特徴とす
るヒトＰＳＴＩの測定方法。 - （１０）請求項２〜４に記載のモノクローナル抗体のう
ち少なくとも１種のモノクローナル抗体を用いることを
特徴とする請求項９に記載の測定方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63055431A JPH0677518B2 (ja) | 1988-03-08 | 1988-03-08 | ヒトｐｓｔｉを認識するモノクローナル抗体、該抗体産生ハイブリドーマおよびヒトｐｓｔｉの測定方法 |
| CA000592970A CA1334077C (en) | 1988-03-08 | 1989-03-07 | Monoclonal antibody recognizing human psti, hybridoma producing the antibody, and determination of human psti |
| EP89302305A EP0332421B1 (en) | 1988-03-08 | 1989-03-08 | Monoclonal antibodies recognizing human psti, hybridomas producing the same, and their preparation and use |
| DE89302305T DE68909276T2 (de) | 1988-03-08 | 1989-03-08 | Monoklonale Antikörper, geeignet für den aus der menschlichen Bauchspeicheldrüse sekretierten Trypsin-Inhibitor, Hybridomen, die diese produzieren und ihre Herstellung und Verwendung. |
| AT89302305T ATE94881T1 (de) | 1988-03-08 | 1989-03-08 | Monoklonale antikoerper, geeignet fuer den aus der menschlichen bauchspeicheldruese sekretierten trypsin-inhibitor, hybridomen, die diese produzieren und ihre herstellung und verwendung. |
| KR1019890002855A KR970008426B1 (ko) | 1988-03-08 | 1989-03-08 | 인간 psti를 인지하는 단클론성 항체, 이러한 항체를 생산하는 하이브리도마 및 인간 psti의 결정 방법 |
| ES89302305T ES2059726T3 (es) | 1988-03-08 | 1989-03-08 | Anticuerpos monoclonales que reconocen el itsp humano, hibridomas que producen los mismos, y su preparacion y uso. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63055431A JPH0677518B2 (ja) | 1988-03-08 | 1988-03-08 | ヒトｐｓｔｉを認識するモノクローナル抗体、該抗体産生ハイブリドーマおよびヒトｐｓｔｉの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01228494A true JPH01228494A (ja) | 1989-09-12 |
| JPH0677518B2 JPH0677518B2 (ja) | 1994-10-05 |
Family
ID=12998396
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63055431A Expired - Lifetime JPH0677518B2 (ja) | 1988-03-08 | 1988-03-08 | ヒトｐｓｔｉを認識するモノクローナル抗体、該抗体産生ハイブリドーマおよびヒトｐｓｔｉの測定方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0332421B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0677518B2 (ja) |
| KR (1) | KR970008426B1 (ja) |
| AT (1) | ATE94881T1 (ja) |
| CA (1) | CA1334077C (ja) |
| DE (1) | DE68909276T2 (ja) |
| ES (1) | ES2059726T3 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7574781B2 (en) | 2004-04-09 | 2009-08-18 | S.C. Johnson Home Storage, Inc. | Closure assembly with slider |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3827145A1 (de) * | 1987-12-03 | 1989-06-15 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Monoklonale antikoerper, hybridoma-zellinien zur gewinnung der antikoerper, verfahren zur gewinnung der antikoerper und der zellinien, sowie verwendung der antikoerper |
-
1988
- 1988-03-08 JP JP63055431A patent/JPH0677518B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-03-07 CA CA000592970A patent/CA1334077C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-08 ES ES89302305T patent/ES2059726T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-08 DE DE89302305T patent/DE68909276T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-08 EP EP89302305A patent/EP0332421B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-08 AT AT89302305T patent/ATE94881T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-08 KR KR1019890002855A patent/KR970008426B1/ko not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2059726T3 (es) | 1994-11-16 |
| KR890014129A (ko) | 1989-10-21 |
| DE68909276T2 (de) | 1994-04-07 |
| JPH0677518B2 (ja) | 1994-10-05 |
| EP0332421B1 (en) | 1993-09-22 |
| ATE94881T1 (de) | 1993-10-15 |
| CA1334077C (en) | 1995-01-24 |
| EP0332421A2 (en) | 1989-09-13 |
| DE68909276D1 (de) | 1993-10-28 |
| EP0332421A3 (en) | 1990-01-31 |
| KR970008426B1 (ko) | 1997-05-24 |
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