JPH01230522A - トランスフォーミンググロウスファクター―βの精製方法 - Google Patents
トランスフォーミンググロウスファクター―βの精製方法Info
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- JPH01230522A JPH01230522A JP1001906A JP190689A JPH01230522A JP H01230522 A JPH01230522 A JP H01230522A JP 1001906 A JP1001906 A JP 1001906A JP 190689 A JP190689 A JP 190689A JP H01230522 A JPH01230522 A JP H01230522A
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- JP
- Japan
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- tgf
- activity
- acid
- ethanol
- beta
- Prior art date
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Moving Of The Head For Recording And Reproducing By Optical Means (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、トランスフォーミンググロウスファクター−
β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃ
ｔｏｒ−β、以下ｒＴＧＦ−β」という）の精製方法に
関する。
β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃ
ｔｏｒ−β、以下ｒＴＧＦ−β」という）の精製方法に
関する。
従来の技術
ヒト血小板の抽出物には、多くの増殖因子が含まれてい
る。これら因子の単離及び特徴付は並びにこれらの相互
作用の研究が現在活発に行なわれている。上記増殖因子
ＴＧＦ−βは、当初、ヒト血小板の酸−エタノール抽出
物から単離された［アソイアン、アール、ケー、 （
Ａ ５ｓｏｉａｎ Ｒ。
る。これら因子の単離及び特徴付は並びにこれらの相互
作用の研究が現在活発に行なわれている。上記増殖因子
ＴＧＦ−βは、当初、ヒト血小板の酸−エタノール抽出
物から単離された［アソイアン、アール、ケー、 （
Ａ ５ｓｏｉａｎ Ｒ。
Ｋ、 ）ら、ジャーナル オブ バイオロジカルケミス
トリー（Ｊ、Ｂｌｏｔ 、Ｃｈｅｗ、、２５８゜７１５
５−７１６０ （１９８３）参照］。この方法は、８．
０Ｍ尿素の存在下又は不存在下における１、０Ｍ酢酸（
ｐ Ｈ２，７）で平衡化されたバイオゲルＰ６０ （Ｂ
ｉｏ−Ｇｅｔ Ｐ２Ｏ）分子量サイジングカラム（ａ
＋ｏｌｃｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｓｉｚｉｎｇｃｏ
ｌｕｍｎ）上でのＴＧＦ−βの異常なりロマトグラフィ
ー挙動を利用するものである。即ち、ＴＧＦ−βは、１
．０Ｍ酢酸（ｐＨ２，７）中で行なった場合予想される
よりもはるかに遅（溶離するが、１．０Ｍ酢酸（ｐＨ２
，７）中、８．０Ｍ尿素の存在下では、予想される溶離
量（ｅｌｕｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ）に戻るのである。
トリー（Ｊ、Ｂｌｏｔ 、Ｃｈｅｗ、、２５８゜７１５
５−７１６０ （１９８３）参照］。この方法は、８．
０Ｍ尿素の存在下又は不存在下における１、０Ｍ酢酸（
ｐ Ｈ２，７）で平衡化されたバイオゲルＰ６０ （Ｂ
ｉｏ−Ｇｅｔ Ｐ２Ｏ）分子量サイジングカラム（ａ
＋ｏｌｃｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｓｉｚｉｎｇｃｏ
ｌｕｍｎ）上でのＴＧＦ−βの異常なりロマトグラフィ
ー挙動を利用するものである。即ち、ＴＧＦ−βは、１
．０Ｍ酢酸（ｐＨ２，７）中で行なった場合予想される
よりもはるかに遅（溶離するが、１．０Ｍ酢酸（ｐＨ２
，７）中、８．０Ｍ尿素の存在下では、予想される溶離
量（ｅｌｕｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ）に戻るのである。
この方法を改良して、ＣＩ８樹脂（シンクロパック（Ｓ
ｙｎｃｈｒｏｐａｋ ） ）を用いる疎水性ＨＰＬＣ
工程を含めた方法もある［プリンク。
ｙｎｃｈｒｏｐａｋ ） ）を用いる疎水性ＨＰＬＣ
工程を含めた方法もある［プリンク。
アール、 （Ｄｃｒｙｎｃｋ、 Ｒ，）等、ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１６，７０１−７０５ （１９
８５）コ。しかし、これ等の方法は、長時間を要し、収
率が低いという問題点がある。
ー（Ｎａｔｕｒｅ）、３１６，７０１−７０５ （１９
８５）コ。しかし、これ等の方法は、長時間を要し、収
率が低いという問題点がある。
軟骨誘発因子−β（ｃａｒｔｉｌａｇｅ −１ｎｄｕｃ
ｆｎｇｆａｃｔｏｒ−β、以下ｒＣＩ Ｆ−β」という
）は、配列のホモロジー、活性等の多くの点でＴＧＦ−
βと密接に関連している因子である［セイエディン ニ
ス、エム、 （Ｓｃｙｃｄｉｎ Ｓ、 Ｍ、 ）ら
、ブロシーデインダス オブ ザ ナショナル アカデ
ミ−オブ サイエンス オブ ザ ニーニスニー（Ｐｒ
ｏｃ 、 Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ 、 Ｓｃｉ、
、 ＵＳＡ。
ｆｎｇｆａｃｔｏｒ−β、以下ｒＣＩ Ｆ−β」という
）は、配列のホモロジー、活性等の多くの点でＴＧＦ−
βと密接に関連している因子である［セイエディン ニ
ス、エム、 （Ｓｃｙｃｄｉｎ Ｓ、 Ｍ、 ）ら
、ブロシーデインダス オブ ザ ナショナル アカデ
ミ−オブ サイエンス オブ ザ ニーニスニー（Ｐｒ
ｏｃ 、 Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ 、 Ｓｃｉ、
、 ＵＳＡ。
旦ス、２２６７−２２７１ （１９８５）；セイエデ
ィン、ニス、エム、 （Ｓｃｙｃｄｌｎ、 Ｓ、
Ｍ、 ）ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリー （Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｗ、）２６１．５
６９３−５６９５ （１９８７）；及びセイエディン、
ニス。
ィン、ニス、エム、 （Ｓｃｙｃｄｌｎ、 Ｓ、
Ｍ、 ）ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリー （Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｗ、）２６１．５
６９３−５６９５ （１９８７）；及びセイエディン、
ニス。
エム、 （Ｓｅｙｅｄｉｎ、 Ｓ、 Ｍ、 ）ら、
ジャーナルオブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ。
ジャーナルオブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ。
Ｂｌｏｌ 、Ｃｈｅｗ 、２６２．１９４６−１９４９
（１９８７）参照］。カチオン交換樹脂ワットマンＣＭ
−５２（Ｗｈａｔｍａｎ ＣＭ−５２）が、ＣＩＦ−
βの精製に使用されている。該樹°脂は、脱ミネラル化
性（ｄｃｍｉｎｃｒａｌｌｚｃｄ ｂｏｎｅ）からＴＧ
Ｆ−βを単離するのにも使用されている。同様のカチオ
ン交換樹脂（即ち、ＬＫＢから人手されるシーエム−ト
リアクリル エム（ＣＭ −Ｔ ｒｉａｃｒｙｌ Ｍ）
樹脂）が、牛の腎臓からＴＧＦ−βを精製する際に、バ
イオ−ゲルＰ３０ （Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２Ｏ）分子
量サイジングカラム及び２つのＨＰＬＣ工程（一方の工
程はＣＩ８樹脂を用い、他方の工程はＣＮ樹脂を用いる
）と組み合わせて使用されている［ロバーツ、ニー、ビ
ー、 （Ｒｏｂｅｒｔｓ、 Ａ、Ｂ、 ）等、バイ
オケミストリー（Ｂ１ｏｃｈｅａ＋、 ） ２２． ５
６９２−５６９８ （１９８３）参照コ。しかしながら
、これらの方法は、収率が少ないという問題点がある。
（１９８７）参照］。カチオン交換樹脂ワットマンＣＭ
−５２（Ｗｈａｔｍａｎ ＣＭ−５２）が、ＣＩＦ−
βの精製に使用されている。該樹°脂は、脱ミネラル化
性（ｄｃｍｉｎｃｒａｌｌｚｃｄ ｂｏｎｅ）からＴＧ
Ｆ−βを単離するのにも使用されている。同様のカチオ
ン交換樹脂（即ち、ＬＫＢから人手されるシーエム−ト
リアクリル エム（ＣＭ −Ｔ ｒｉａｃｒｙｌ Ｍ）
樹脂）が、牛の腎臓からＴＧＦ−βを精製する際に、バ
イオ−ゲルＰ３０ （Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２Ｏ）分子
量サイジングカラム及び２つのＨＰＬＣ工程（一方の工
程はＣＩ８樹脂を用い、他方の工程はＣＮ樹脂を用いる
）と組み合わせて使用されている［ロバーツ、ニー、ビ
ー、 （Ｒｏｂｅｒｔｓ、 Ａ、Ｂ、 ）等、バイ
オケミストリー（Ｂ１ｏｃｈｅａ＋、 ） ２２． ５
６９２−５６９８ （１９８３）参照コ。しかしながら
、これらの方法は、収率が少ないという問題点がある。
また、馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｌｏｎｃｄ ｍｅｄｉａ
）も、多くの増殖因子を含んでいる。これ等増殖因子
の単離及び特徴付は並びにそれらの相互作用の研究も、
現在活発に行なわれている。」ユ記増殖囚子ＴＧＦ−β
は、馴化培地からも精製されている［デラーコ、ジエイ
、イー、 （Ｄａ Ｌａｒｃｏ、 Ｊ、 Ｅ、
）等、プロシーデインゲス オブ ザ ナショナル ア
カデミ−オブ サイエンス オブ ザ ニーニスニー
（Ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ 、 Ｓｃ
ｉ、 ＵＳＡ。
）も、多くの増殖因子を含んでいる。これ等増殖因子
の単離及び特徴付は並びにそれらの相互作用の研究も、
現在活発に行なわれている。」ユ記増殖囚子ＴＧＦ−β
は、馴化培地からも精製されている［デラーコ、ジエイ
、イー、 （Ｄａ Ｌａｒｃｏ、 Ｊ、 Ｅ、
）等、プロシーデインゲス オブ ザ ナショナル ア
カデミ−オブ サイエンス オブ ザ ニーニスニー
（Ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ 、 Ｓｃ
ｉ、 ＵＳＡ。
旦夕１，５０１５−５０１９ （１９８５）参照］。
この方法は、馴化培地を凍結乾燥し、これを１．０Ｍ酢
酸で抽出し、清澄化された抽出物についてパイオーゲル
Ｐ３０分子量すイジングカラム上でサイジングクロマト
グラフィーを行なうものである。この方法は、やはり長
時間を要し、収率が低いという問題点がある。
酸で抽出し、清澄化された抽出物についてパイオーゲル
Ｐ３０分子量すイジングカラム上でサイジングクロマト
グラフィーを行なうものである。この方法は、やはり長
時間を要し、収率が低いという問題点がある。
発明が解決しようとする課題
従って、本発明は、高収率でＴＧＦ−βを精製する方法
を提供することを目的とするものである。
を提供することを目的とするものである。
本発明の他の目的は、最小数の操作でもってより迅速に
ＴＧＦ−βを精製する方法を提供することにある。
ＴＧＦ−βを精製する方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
上記本発明の目的は、下記工程、即ち、（１）血小板を
酸−エタノール抽出する工程、（２）工程（１）で得ら
れる抽出物についてカチオン交換分離（ｃａｔｉｏｎ−
ｅｘｃｈａｎｇｅ ５ｅｐａｒａｔｉｏｎ）を行ない、
ＴＧＦ−β活性を有するフラクションを単離する工程、
及び （３）工程（２）で得られるＴＧＦ−β活性を有するフ
ラクションについて疎水性分離 （ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ５ｅｐａｒａｔｉｏｎ）を
行ない、ＴＧＦ−β活性を有するフラクションを単離し
、こうしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より測定した場合に均質となるまで精製されたＴＧＦ−
βを得る工程 を包含するＴＧＦ−βの精製法により達成される。
酸−エタノール抽出する工程、（２）工程（１）で得ら
れる抽出物についてカチオン交換分離（ｃａｔｉｏｎ−
ｅｘｃｈａｎｇｅ ５ｅｐａｒａｔｉｏｎ）を行ない、
ＴＧＦ−β活性を有するフラクションを単離する工程、
及び （３）工程（２）で得られるＴＧＦ−β活性を有するフ
ラクションについて疎水性分離 （ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ５ｅｐａｒａｔｉｏｎ）を
行ない、ＴＧＦ−β活性を有するフラクションを単離し
、こうしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より測定した場合に均質となるまで精製されたＴＧＦ−
βを得る工程 を包含するＴＧＦ−βの精製法により達成される。
また、本発明の上記目的は、下記工程、即ち、（１）Ｔ
ＧＦ−βを含有する馴化培地についてカチオン交換分離
を行ない、ＴＧＦ−β活性を有するフラクションを単離
する工程及び （２）工程（１）のＴＧＦ−β活性を有するフラクショ
ンについて疎水性分離（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｓｃｐ
ａｒａｔ ｔｏｎ）を行ない、ＴＧＦ−β活性を有する
ワラクシ１ンを単離し、こうしてＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により測定した場合に均質となるま
で精製されたＴＧＦ−βを得る工程 を包含するＴ Ｇ Ｆ−’βの精製法により達成される
。
ＧＦ−βを含有する馴化培地についてカチオン交換分離
を行ない、ＴＧＦ−β活性を有するフラクションを単離
する工程及び （２）工程（１）のＴＧＦ−β活性を有するフラクショ
ンについて疎水性分離（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｓｃｐ
ａｒａｔ ｔｏｎ）を行ない、ＴＧＦ−β活性を有する
ワラクシ１ンを単離し、こうしてＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により測定した場合に均質となるま
で精製されたＴＧＦ−βを得る工程 を包含するＴ Ｇ Ｆ−’βの精製法により達成される
。
上述のように、本発明は、
（１）血小板を酸−エタノール抽出する工程、（２）工
程（１）で得られる抽出物をカチン交換分離に供してＴ
ＧＦ−β活性含有フラクションを単離する工程、及び （３）工程（２）のＴＧＦ−β活性含有フラクションを
疎水性分離に供し、ＴＧＦ−β活性含有フラクションを
単離し、こうしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により測定した場合に均質となるまで精製されたＴ
ＧＦ−βを得る工程 を包ＳするＴＧＦ−βの精製方法を提供するものである
。
程（１）で得られる抽出物をカチン交換分離に供してＴ
ＧＦ−β活性含有フラクションを単離する工程、及び （３）工程（２）のＴＧＦ−β活性含有フラクションを
疎水性分離に供し、ＴＧＦ−β活性含有フラクションを
単離し、こうしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により測定した場合に均質となるまで精製されたＴ
ＧＦ−βを得る工程 を包ＳするＴＧＦ−βの精製方法を提供するものである
。
また、本発明は、
（１）ＴＧＦ−βを含有する馴化培地をカチオン交換分
離に供し、ＴＧＦ−β活性含有フラクションを単離する
工程、及び （２）工程（１）のＴＧＦ−β活性含Ｇフラクションを
疎水性分離に供し、ＴＧＦ−β活性含有フラクションを
単離し、こうしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により測定した場合に均質となるまで精製されたＴ
ＧＦ−βを得る工程 を包ＳするＴＧＦ−βの精製方法を提供するものである
。
離に供し、ＴＧＦ−β活性含有フラクションを単離する
工程、及び （２）工程（１）のＴＧＦ−β活性含Ｇフラクションを
疎水性分離に供し、ＴＧＦ−β活性含有フラクションを
単離し、こうしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により測定した場合に均質となるまで精製されたＴ
ＧＦ−βを得る工程 を包ＳするＴＧＦ−βの精製方法を提供するものである
。
本発明の精製方法において、血小板の処理は、前記した
公知方法［アソイアン、アール、ケー。
公知方法［アソイアン、アール、ケー。
ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｗ、、２５８．７１５５−
７１６０ （１９８３）及びプリンク、アール、ら、Ｎ
ａｔｕｒｅ、３１６，７０１−７０５ （１９８５）参
照］に比し、極めて簡単であり、本発明においては細胞
汚染物又は過剰の血漿を除去する必要がない。しかも、
蛋白質の総回は粗酸−エタノール抽出物においてかなり
変動し、第一義的には、赤血球汚染に依存するものであ
るが、これは引続く精製工程において問題を起すもので
はないことが判明した。即ち、最初の精製工程は高容量
のカチオン交換樹脂を利用するので、上記総蛋白質は、
存在するＴＧＦ−βの最良の遊離のためには第二義的な
ものとなるのである。
７１６０ （１９８３）及びプリンク、アール、ら、Ｎ
ａｔｕｒｅ、３１６，７０１−７０５ （１９８５）参
照］に比し、極めて簡単であり、本発明においては細胞
汚染物又は過剰の血漿を除去する必要がない。しかも、
蛋白質の総回は粗酸−エタノール抽出物においてかなり
変動し、第一義的には、赤血球汚染に依存するものであ
るが、これは引続く精製工程において問題を起すもので
はないことが判明した。即ち、最初の精製工程は高容量
のカチオン交換樹脂を利用するので、上記総蛋白質は、
存在するＴＧＦ−βの最良の遊離のためには第二義的な
ものとなるのである。
同様に、本発明の精製方法において、馴化培地の処理も
、前記公知の方法［デラーコ、ジエイ。
、前記公知の方法［デラーコ、ジエイ。
イー、ら、Ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、８２．５０１５−５０１
９ （１９８５）参照］に比し、はるかに簡単であり、
本発明では凍結乾燥も清澄化も必要ではない。
、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、８２．５０１５−５０１
９ （１９８５）参照］に比し、はるかに簡単であり、
本発明では凍結乾燥も清澄化も必要ではない。
上述のように、ＴＧＦ−βは、血小板又は馴化培地から
得ることができる。本明細書において、「馴化培地（ｃ
ｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｃｄｌａ ） Ｊとは、その
中で細胞が事前に増殖され、該細胞から分泌されたＴＧ
Ｆ−βその他の因子を含有する培地を指す。
得ることができる。本明細書において、「馴化培地（ｃ
ｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｃｄｌａ ） Ｊとは、その
中で細胞が事前に増殖され、該細胞から分泌されたＴＧ
Ｆ−βその他の因子を含有する培地を指す。
馴化培地は、低血清又は無血清のものが好ましく、こう
して該血清中に見出される他の蛋白質の混在を回避する
のが望ましい。ＴＧＦ−βを分泌する細胞は、特定のも
のに限らず、任意のものが使用できる。ＴＧＦ−βを分
泌する細胞としては、例えば、ヒトメラノーマセルライ
ンＭ３８２７（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ−９１９３） 、
アフリカミドリザル（Ａｆｒｌｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍ
ｏｎｋｅｙ ）腎上皮セルラインＢＳＣ−１［リスドウ
、エイチ、ジエイ。
して該血清中に見出される他の蛋白質の混在を回避する
のが望ましい。ＴＧＦ−βを分泌する細胞は、特定のも
のに限らず、任意のものが使用できる。ＴＧＦ−βを分
泌する細胞としては、例えば、ヒトメラノーマセルライ
ンＭ３８２７（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ−９１９３） 、
アフリカミドリザル（Ａｆｒｌｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍ
ｏｎｋｅｙ ）腎上皮セルラインＢＳＣ−１［リスドウ
、エイチ、ジエイ。
（Ｒｌｓｔｏｗ Ｈ，Ｊ、 ） 、 Ｐｒｏｅ 、
Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ 。
Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ 。
Ｓｅｔ、ＵＳＡ、８３．５５３１−５５３３ （１９８
６）］ 、正常ラット腎セルラインＮＨＫ−４９Ｆ （
ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ−１５７０）等を例示できる。
６）］ 、正常ラット腎セルラインＮＨＫ−４９Ｆ （
ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ−１５７０）等を例示できる。
血小板の使用量も、本発明では限定されるものではない
。一般に、血小板は約１００〜５００ユニツト、好まし
くは約１００〜３００ユニツトの量で使用される。また
、本発明では、馴化培地の使用量も限定されるものでは
ない。
。一般に、血小板は約１００〜５００ユニツト、好まし
くは約１００〜３００ユニツトの量で使用される。また
、本発明では、馴化培地の使用量も限定されるものでは
ない。
血小板の酸−エタノール抽出は、一般に、ｐＨ約４．０
以下、好ましくは約３．５〜約２．０、エタノール濃度
的５０％（Ｖ／Ｖ）以上、好ましくは約８０％（ｖ／ｖ
）〜約７０％（Ｖ／Ｖ）にて行なわれる。この酸−エタ
ノールの組合わせにより、血小板が崩壊し、ＴＧＦ−β
等の可溶性蛋白質が遊離する。
以下、好ましくは約３．５〜約２．０、エタノール濃度
的５０％（Ｖ／Ｖ）以上、好ましくは約８０％（ｖ／ｖ
）〜約７０％（Ｖ／Ｖ）にて行なわれる。この酸−エタ
ノールの組合わせにより、血小板が崩壊し、ＴＧＦ−β
等の可溶性蛋白質が遊離する。
カチオン交換分離を行なう前に、上記酸−エタノール抽
出物及び馴化培地は、ｐＨ約５．５、即ち、カチオン交
換樹脂の平衡化に使用する緩衝液のｐＨに調整する。
出物及び馴化培地は、ｐＨ約５．５、即ち、カチオン交
換樹脂の平衡化に使用する緩衝液のｐＨに調整する。
ＴＧＦ−βの精製は、ユニークなシリーズの分離工程に
より行なわれる。その１つの分離工程はカチオン交換に
基くものであり、他の分離工程は疎水性に基くものであ
る。
より行なわれる。その１つの分離工程はカチオン交換に
基くものであり、他の分離工程は疎水性に基くものであ
る。
本発明において、カチオン交換樹脂は特に限定されるも
のではない。例えば、カチオン交換分離は、ＴＳＫ
５Ｐ−５ＰＷカチオン交換樹脂、フアルマシア モノ＝
Ｓ （Ｐｈａｒｍａｃｌａ Ｍｏｎｏ −３）カチオ
ン交換樹脂、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ） ＣＭ−５
２セルロース、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）スルホエ
チルセルロース、ゼータ−ブレバレージョンカートリッ
ジ等を用いて行なうことができる。本発明においては、
ＴＳＫ ５Ｐ−５ＰＷカチオン交換樹脂を用いるカチ
オン−交換分離が、その高い分解能及び大きな容量故に
好ましい。
のではない。例えば、カチオン交換分離は、ＴＳＫ
５Ｐ−５ＰＷカチオン交換樹脂、フアルマシア モノ＝
Ｓ （Ｐｈａｒｍａｃｌａ Ｍｏｎｏ −３）カチオ
ン交換樹脂、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ） ＣＭ−５
２セルロース、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）スルホエ
チルセルロース、ゼータ−ブレバレージョンカートリッ
ジ等を用いて行なうことができる。本発明においては、
ＴＳＫ ５Ｐ−５ＰＷカチオン交換樹脂を用いるカチ
オン−交換分離が、その高い分解能及び大きな容量故に
好ましい。
同様に、疎水性樹脂も本発明では特に限定されるもので
はない。例えば、疎水性分離は、例えば、Ｃ４、Ｃ６、
Ｃ８、Ｃ５８等の多くの逆相樹脂を用いて行なうことが
できる。本発明では、Ｃ４ＨＰＬＣクロマトグラフイー
が、血小板により遊離され又は馴化培地中に見出される
他の活性とＴＧＦ−β活性とを分離する際の分離能に優
れているので、好ましい。本発明方法によれば、急速な
分離即ち、時間又は口のオーダーではなく、分のオーダ
ーでの分離が可能である。
はない。例えば、疎水性分離は、例えば、Ｃ４、Ｃ６、
Ｃ８、Ｃ５８等の多くの逆相樹脂を用いて行なうことが
できる。本発明では、Ｃ４ＨＰＬＣクロマトグラフイー
が、血小板により遊離され又は馴化培地中に見出される
他の活性とＴＧＦ−β活性とを分離する際の分離能に優
れているので、好ましい。本発明方法によれば、急速な
分離即ち、時間又は口のオーダーではなく、分のオーダ
ーでの分離が可能である。
ＴＧＦ−β活性は、１０％（ｖ／ｖ）の牛胎児血清（ハ
イクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）社製）を含有するダルベ
ツコ（Ｄ ｕｌｂｃｃｃｏ ）の修飾イーグル培地（以
下ｒＤＭＥＭＪという、ジブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）中
に維持されたミンクの肺上皮細胞を用いることにより、
測定することができる。より詳しくは、０．０５ｗ／ｖ
％トリプシン及びカルシウム及びマグネシウムを含まな
い０．１％（Ｗ／ Ｖ ）のＥＤＴＡのリン酸緩衝生理
食塩水溶液を添加することにより、組織培養プレートか
ら上記細胞を遊離させ、得られた細胞（約５Ｘ１０’細
胞／ｍり０．５軛を４８−ウェル組織培養プレートに接
種する。この時点で、標準ＴＧＦ−β及びアッセイされ
るべき未知の試料のアリコートを加える。３７℃にて、
９５％空気（ｖ／ｖ）１５％二酸化炭素（Ｖ／Ｖ）雰囲
気中で、２４時間インキュベートした後、０．０１ｍ１
Ｃｉ／ｌｎｅの３Ｈ−チミジンにニーイングランドヌク
レア（Ｎ ｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）社
製、比活性＝６．７Ｃｉ／ｍＭ）５０μｌで各ウェルを
パルスする。約１６時間後、ＤＭＥＭで３回、冷１０％
（ｗ ／ ｖ ）トリクロロ酢酸で２同各ウェルを洗浄
する。トリクロロ酢酸を除去した後、１． ＯＦＪ
ＮａＯＨ０，５軛を加え、細胞を溶解する。溶解した
細胞４５０μｌを取り、液体シンチレーションカウンタ
ーでカウントする。
イクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）社製）を含有するダルベ
ツコ（Ｄ ｕｌｂｃｃｃｏ ）の修飾イーグル培地（以
下ｒＤＭＥＭＪという、ジブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）中
に維持されたミンクの肺上皮細胞を用いることにより、
測定することができる。より詳しくは、０．０５ｗ／ｖ
％トリプシン及びカルシウム及びマグネシウムを含まな
い０．１％（Ｗ／ Ｖ ）のＥＤＴＡのリン酸緩衝生理
食塩水溶液を添加することにより、組織培養プレートか
ら上記細胞を遊離させ、得られた細胞（約５Ｘ１０’細
胞／ｍり０．５軛を４８−ウェル組織培養プレートに接
種する。この時点で、標準ＴＧＦ−β及びアッセイされ
るべき未知の試料のアリコートを加える。３７℃にて、
９５％空気（ｖ／ｖ）１５％二酸化炭素（Ｖ／Ｖ）雰囲
気中で、２４時間インキュベートした後、０．０１ｍ１
Ｃｉ／ｌｎｅの３Ｈ−チミジンにニーイングランドヌク
レア（Ｎ ｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）社
製、比活性＝６．７Ｃｉ／ｍＭ）５０μｌで各ウェルを
パルスする。約１６時間後、ＤＭＥＭで３回、冷１０％
（ｗ ／ ｖ ）トリクロロ酢酸で２同各ウェルを洗浄
する。トリクロロ酢酸を除去した後、１． ＯＦＪ
ＮａＯＨ０，５軛を加え、細胞を溶解する。溶解した
細胞４５０μｌを取り、液体シンチレーションカウンタ
ーでカウントする。
上記アッセイは、ミンクの肺上皮細胞の単層増殖が、Ｔ
ＧＦ−βの存在下で阻害されるという観察結果に基くも
のである［ホリー、アール、ダブリュ（Ｈｏｌｌｅｙ
、 Ｒ，Ｗ、 ）等、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏ。
ＧＦ−βの存在下で阻害されるという観察結果に基くも
のである［ホリー、アール、ダブリュ（Ｈｏｌｌｅｙ
、 Ｒ，Ｗ、 ）等、Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏ。
Ｉｎｔ、 Ｒｏｐ、 、ヱ、１４１〜１４７ （１９８
３）及びタッカ−、アール、エフ、 （Ｔｕｃｋｅｒ
、 ＲｏＦ、 ）等、プロシーデインゲス オフ
ザ ナショナル アカデミ−オフ サイエンス オブザ
ニーニスニー（Ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔｌ 、 Ａｃａ
ｄ 。
３）及びタッカ−、アール、エフ、 （Ｔｕｃｋｅｒ
、 ＲｏＦ、 ）等、プロシーデインゲス オフ
ザ ナショナル アカデミ−オフ サイエンス オブザ
ニーニスニー（Ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔｌ 、 Ａｃａ
ｄ 。
Ｓｃ１．、ＵＳＡ） 、８１．６７５７〜６７６１（１
９８４）参照］。３Ｈ−チミジン取込みアッセイにおい
て、ＴＧＦ−βに対し高い感度を有するミンク肺上皮細
胞［チンカース、エム（Ｃｈｉｎｋｅｒｓ Ｍ、 ）
、Ｊ、 Ｃｅ１ｌ 、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 。
９８４）参照］。３Ｈ−チミジン取込みアッセイにおい
て、ＴＧＦ−βに対し高い感度を有するミンク肺上皮細
胞［チンカース、エム（Ｃｈｉｎｋｅｒｓ Ｍ、 ）
、Ｊ、 Ｃｅ１ｌ 、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 。
１３０．１−５ （１９８７）参照コを用いることは、
第１図に示す如く、簡単で、再現性があり、定伝的なア
ッセイであることが判った。第１図において、二重のウ
ェル（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｗｅｌｌ）が各濃度で行な
われ、全ポイントで誤差は１０％未満であった。
第１図に示す如く、簡単で、再現性があり、定伝的なア
ッセイであることが判った。第１図において、二重のウ
ェル（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｗｅｌｌ）が各濃度で行な
われ、全ポイントで誤差は１０％未満であった。
３Ｈ−チミジンを用いる他のＴＧＦ−β活性のアッセイ
も報告されており、これらも本発明で用いることができ
る［アソイアン、アール、ケー。
も報告されており、これらも本発明で用いることができ
る［アソイアン、アール、ケー。
（Ａｓｓｏｉａｎ、 Ｒ，Ｋ、）等、ジャーナルオフバ
イオロジカル ケミストリー（Ｊ、 Ｂｌｏｌ 。
イオロジカル ケミストリー（Ｊ、 Ｂｌｏｌ 。
Ｃｈｅｗ、） 、２５８．７１５５〜７１６０ （１９
８３）及びチンカーズ、エム、 （Ｃｈｉｎｋｅｒｓ
、 Ｍ）、ジャーナル オフ セルラー フィオ口ジ
ー（Ｊ、 Ｃｅ１ｌ 、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 ）
、１３０． １〜５（１９８７）参照］。
８３）及びチンカーズ、エム、 （Ｃｈｉｎｋｅｒｓ
、 Ｍ）、ジャーナル オフ セルラー フィオ口ジ
ー（Ｊ、 Ｃｅ１ｌ 、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 ）
、１３０． １〜５（１９８７）参照］。
ＴＧＦ−βは傷の治癒及び細胞修復にａ用である（欧州
特許出願公開第０１２１８４９号及び０２００３４１号
）。
特許出願公開第０１２１８４９号及び０２００３４１号
）。
下記に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れに限定されるものではない。
れに限定されるものではない。
実施例
Ａ、血小板抽出
ワシントンＤ、 Ｃ，の赤十字から得られた臨床上の−
ａ効期限を徒過した血小板を２００単位用いた。２５０
贈の円錐形試験管内で、２０℃で、３０００ｒｐｍの速
度で、２５分間、遠心分離することにより、細胞をペレ
ット化した。血漿をデカントした後、セルパック１容量
部当り、７０％（Ｖ／Ｖ）エタノール及び０．０５Ｍ塩
酸（ｐＨ１，９）を含む酸−エタノール溶液の４容量部
を添加した。得られた懸濁液は、ｐＨ約３．５である。
ａ効期限を徒過した血小板を２００単位用いた。２５０
贈の円錐形試験管内で、２０℃で、３０００ｒｐｍの速
度で、２５分間、遠心分離することにより、細胞をペレ
ット化した。血漿をデカントした後、セルパック１容量
部当り、７０％（Ｖ／Ｖ）エタノール及び０．０５Ｍ塩
酸（ｐＨ１，９）を含む酸−エタノール溶液の４容量部
を添加した。得られた懸濁液は、ｐＨ約３．５である。
懸濁液を十分に攪拌し、プールし、４℃で一晩放置した
。次いで、該懸濁液をベックマン型１９０−ター内で、
１９．００Ｏｒｐｍ、１０℃で、４５分間遠心分離した
。上清を集めＮａＯＨでｐＨ５，５に：Ａ整した。回転
蒸留により、エタノールを除去し、生成した沈澱を、５
０．２Ｔｉローター内で、３０分間、１０℃で３５．０
０Ｏｒｐｍにて遠心分離することにより、除去した。得
られた粗抽出物（全量６７５ｍｅ）は蛋白質を合計８７
７ｍｇ含んでいた。この蛋白質の量は、標準物質として
牛血清アルブミンを用いるプラトフォード（Ｂ ｒａｄ
ｆｏｒｄ ）法により測定された［プラトフォード、エ
ム、エム、 （Ｂｒａｄｆｏｒｄ ＭｏＭ、 ） 、
アナリティ力ル バイオケミストリー（Ａｎａｌ 。
。次いで、該懸濁液をベックマン型１９０−ター内で、
１９．００Ｏｒｐｍ、１０℃で、４５分間遠心分離した
。上清を集めＮａＯＨでｐＨ５，５に：Ａ整した。回転
蒸留により、エタノールを除去し、生成した沈澱を、５
０．２Ｔｉローター内で、３０分間、１０℃で３５．０
０Ｏｒｐｍにて遠心分離することにより、除去した。得
られた粗抽出物（全量６７５ｍｅ）は蛋白質を合計８７
７ｍｇ含んでいた。この蛋白質の量は、標準物質として
牛血清アルブミンを用いるプラトフォード（Ｂ ｒａｄ
ｆｏｒｄ ）法により測定された［プラトフォード、エ
ム、エム、 （Ｂｒａｄｆｏｒｄ ＭｏＭ、 ） 、
アナリティ力ル バイオケミストリー（Ａｎａｌ 。
Ｂｌｏｃｈｅｍ、）、７２．２４８−２５４ （１９７
６）参照］。この粗抽出物のＴＧＦ−β活性を測定した
ところ、１．７ｍｇのＴＧＦ−βが存在することが判っ
た。この値は、精製ＴＧＦ−βの標準曲線の５０％阻害
ポイント（第１図参照）に対して、使用された試料の世
の外挿により測定したものである。このポイントは、第
１図に示される如く、通常０．２ｎｇ／贈（８，０ｐｍ
）程度である。
６）参照］。この粗抽出物のＴＧＦ−β活性を測定した
ところ、１．７ｍｇのＴＧＦ−βが存在することが判っ
た。この値は、精製ＴＧＦ−βの標準曲線の５０％阻害
ポイント（第１図参照）に対して、使用された試料の世
の外挿により測定したものである。このポイントは、第
１図に示される如く、通常０．２ｎｇ／贈（８，０ｐｍ
）程度である。
Ｂ、カチオン交換分離
次いで、得られた粗抽出物を、０．０２５Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５，５）で予め平衡化されたプレパラテイブ
ＴＳＫ ５Ｐ−５ＰＷカラム（４，５ｃｍｘ５ｃｍの
ガードカラムを備えた５、５ｃｍｘ２０ｃｍのカラム）
上に置いた。０〜３．０Ｍ塩化ナトリウムを直線勾配で
含む０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ Ｈ５，５）で１
５５分間にわたり、溶離した。流速は２５軛／分であり
、フラクションを２分毎に採取した。ＴＳＫ ５Ｐ−
５ＰＷカムからの溶離図及び上記の如くミンク肺上皮細
胞を用いて測定されたＴＧＦ−β活性を、第２図に示す
。第２図において、Ａ２８ｏでの相対吸光度（ｒｅｌａ
ｔｌｖｅ ａｂｓｏｒｂａｎｃｃ ）を連続線で示す。
ウム（ｐＨ５，５）で予め平衡化されたプレパラテイブ
ＴＳＫ ５Ｐ−５ＰＷカラム（４，５ｃｍｘ５ｃｍの
ガードカラムを備えた５、５ｃｍｘ２０ｃｍのカラム）
上に置いた。０〜３．０Ｍ塩化ナトリウムを直線勾配で
含む０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ Ｈ５，５）で１
５５分間にわたり、溶離した。流速は２５軛／分であり
、フラクションを２分毎に採取した。ＴＳＫ ５Ｐ−
５ＰＷカムからの溶離図及び上記の如くミンク肺上皮細
胞を用いて測定されたＴＧＦ−β活性を、第２図に示す
。第２図において、Ａ２８ｏでの相対吸光度（ｒｅｌａ
ｔｌｖｅ ａｂｓｏｒｂａｎｃｃ ）を連続線で示す。
黒丸を連結した連続線はＴＧＦ−β活性である。
第２図から明らかなようにＴＳＫ ５Ｐ−５ＰＷカラ
ムからのＴＧＦ−βの溶離は、各主要蛋白質ピークから
良好に分離された領域において、約１．５ＭＮａＣ！！
にて起こることがわかる。（注：血小板１００〜５００
単位も又、ＴＳＫ ５Ｐ−５ＰＷカラムに付した。そ
の結果、一般的な溶離図は、再現性があることがわかっ
た。）第２図におけるフラクション３７−４５ （４５
０ｍｌ）が、最も大きいＴＧＦ−β活性を有しており、
これらをプールしたところ、ＴＧＦ−βを０．９＋ａｇ
含有することがわかった。このプール物中の総蛋白質量
は、５．Ｏａ＋ｇであった。
ムからのＴＧＦ−βの溶離は、各主要蛋白質ピークから
良好に分離された領域において、約１．５ＭＮａＣ！！
にて起こることがわかる。（注：血小板１００〜５００
単位も又、ＴＳＫ ５Ｐ−５ＰＷカラムに付した。そ
の結果、一般的な溶離図は、再現性があることがわかっ
た。）第２図におけるフラクション３７−４５ （４５
０ｍｌ）が、最も大きいＴＧＦ−β活性を有しており、
これらをプールしたところ、ＴＧＦ−βを０．９＋ａｇ
含有することがわかった。このプール物中の総蛋白質量
は、５．Ｏａ＋ｇであった。
Ｃ０疎水性分離
上記のカチオン交換カラムから採取されたＴＧＦ−β活
性を持つプールされたフラクション、即ちフラクション
３７−４５を、６．０Ｍ ＨＣｌでｐＨ２，５に調整
し、Ｃ４（バアイダック（Ｖｄａｃ） 、２１４ＴＰ５
１０）セミプレパラテイブ（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａ
ｔｌｖｅ） ＨＰ Ｌ Ｃカラムに直接供した。バアイ
ダックＣ４ＨＰＬＣは、３００人孔径の１０Ｈ球状シリ
カビーズ上に Ｃａ （（ＣＨ２）３ ＣＨ３）疎水性結合相を有
している。該カラムを、２種の緩衝液、即ち、水中に０
．１％（ｖ／ｖ））リフルオロ酢酸（以下ｒＴＦＡＪと
略記する）を含有する緩衝液（Ａ）及び１００％（Ｖ
／ Ｖ ）アセトニトリル中に０゜１％（ｖ／ｖ）ＴＦ
Ａを含ａする緩衝液（Ｂ）を用いて３． ０１ｌｌｅ／
分の速度で展開した。カラム勾配は、１５分間にわたり
、１００〜７２％緩衝液（Ａ）１０〜２８％緩衝液（Ｂ
）であり、引続き、緩衝液（Ｂ）を０．２５９６／分の
速度で増加し、７２〜６０％緩衝液（Ａ）／２８〜４０
％緩衝液（Ｂ）であった。フラクションを１分毎回収し
、Ａ２ｏ６で吸光度を測定することによりモニターした
。結果を第３図に示す。
性を持つプールされたフラクション、即ちフラクション
３７−４５を、６．０Ｍ ＨＣｌでｐＨ２，５に調整
し、Ｃ４（バアイダック（Ｖｄａｃ） 、２１４ＴＰ５
１０）セミプレパラテイブ（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａ
ｔｌｖｅ） ＨＰ Ｌ Ｃカラムに直接供した。バアイ
ダックＣ４ＨＰＬＣは、３００人孔径の１０Ｈ球状シリ
カビーズ上に Ｃａ （（ＣＨ２）３ ＣＨ３）疎水性結合相を有
している。該カラムを、２種の緩衝液、即ち、水中に０
．１％（ｖ／ｖ））リフルオロ酢酸（以下ｒＴＦＡＪと
略記する）を含有する緩衝液（Ａ）及び１００％（Ｖ
／ Ｖ ）アセトニトリル中に０゜１％（ｖ／ｖ）ＴＦ
Ａを含ａする緩衝液（Ｂ）を用いて３． ０１ｌｌｅ／
分の速度で展開した。カラム勾配は、１５分間にわたり
、１００〜７２％緩衝液（Ａ）１０〜２８％緩衝液（Ｂ
）であり、引続き、緩衝液（Ｂ）を０．２５９６／分の
速度で増加し、７２〜６０％緩衝液（Ａ）／２８〜４０
％緩衝液（Ｂ）であった。フラクションを１分毎回収し
、Ａ２ｏ６で吸光度を測定することによりモニターした
。結果を第３図に示す。
第３図に示されるように、主要蛋白質フラクションの溶
離は、約３６％（Ｖ ／ Ｖ ）アセトニトリルで生じ
た。尚、使用中のカラムの劣化（ｃｏｌｕｍｎｄｅｇｒ
ａｄａｔｉｏｎｓ ）により、生成物の早期溶離及び若
干の汚染が各隣接ピークから認められる。
離は、約３６％（Ｖ ／ Ｖ ）アセトニトリルで生じ
た。尚、使用中のカラムの劣化（ｃｏｌｕｍｎｄｅｇｒ
ａｄａｔｉｏｎｓ ）により、生成物の早期溶離及び若
干の汚染が各隣接ピークから認められる。
第３図に示されるピークからの２つの中心フラクション
をプールし、そのＴＧＦ−β活性をアッセイにしたとこ
ろ、０．５ｍｇのＴＧＦ−βを含有することがわかった
。従って、本発明方法によれば、血小板２００単位を用
いることにより、ＴＧＦ−βの総収率は３０％となり、
血小板１単位につきＴＧＦ−βが２．５μｇであり、ミ
ンク肺上皮細胞を用いるアッセイにおける最高値の５０
％を阻害するポイントは、約ｓ、Ｑｐｍであった。
をプールし、そのＴＧＦ−β活性をアッセイにしたとこ
ろ、０．５ｍｇのＴＧＦ−βを含有することがわかった
。従って、本発明方法によれば、血小板２００単位を用
いることにより、ＴＧＦ−βの総収率は３０％となり、
血小板１単位につきＴＧＦ−βが２．５μｇであり、ミ
ンク肺上皮細胞を用いるアッセイにおける最高値の５０
％を阻害するポイントは、約ｓ、Ｑｐｍであった。
この結果を、従来の単離方法による同様の活性を何する
血小板１単位あたりのＴＧＦ−βの収量０．５μｇと比
較すると、本発明の回収世は、従来の方法［アソシアン
、アール、ケー。
血小板１単位あたりのＴＧＦ−βの収量０．５μｇと比
較すると、本発明の回収世は、従来の方法［アソシアン
、アール、ケー。
（Ａｓｓｏｃｉａｎ 、 Ｒ，Ｋ、 ）等、Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ。
ｌ。
Ｃｈｅｗ、、２５８．７１５５〜７１６０ （１９８
３）及びプリンク、アール、 （Ｄｅｒｙｎｃｋ、
Ｒ，）等、ネイチ−？ −（Ｎａｔｕｒｅ ） 、
３１６．７０１〜７０５ （１９８５）参照］で得られ
るものに比べ５倍も増加したものである。
３）及びプリンク、アール、 （Ｄｅｒｙｎｃｋ、
Ｒ，）等、ネイチ−？ −（Ｎａｔｕｒｅ ） 、
３１６．７０１〜７０５ （１９８５）参照］で得られ
るものに比べ５倍も増加したものである。
Ｄ、純度分析
第３図に示されるプールされたピークからのアリコート
（蛋白質５．０Ｈｇに相当）を、５．０％（ｖ／ｖ）２
−メルカプトエタノールにより還元した。次いで還元さ
れた試料と還元されなかった同様の試料を、レムリ、ニ
ー、ケー。
（蛋白質５．０Ｈｇに相当）を、５．０％（ｖ／ｖ）２
−メルカプトエタノールにより還元した。次いで還元さ
れた試料と還元されなかった同様の試料を、レムリ、ニ
ー、ケー。
（Ｌａｅｍ＋ｇｌｉ、 Ｕ、 Ｋ、 ） 、ネイチ
’ｒ −（Ｎ ａｔｕｒｅ）。
’ｒ −（Ｎ ａｔｕｒｅ）。
２２７．６８０〜６８５ （１９７０）に記載の方法に
より調製された１２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル上で電気泳動させた。該ゲルを、クーマシー
ブリリアントブルーＲ−２５０［Ｃｏｏｍａｓｉｅ
ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ−２５０，つエバー
、ケー、（Ｗｃｂｃｒ、 Ｋ、 ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ。
より調製された１２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル上で電気泳動させた。該ゲルを、クーマシー
ブリリアントブルーＲ−２５０［Ｃｏｏｍａｓｉｅ
ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ−２５０，つエバー
、ケー、（Ｗｃｂｃｒ、 Ｋ、 ）等、Ｊ、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｓ、、２４４．４４０６〜４４１２ （１９６
９）］で染色するか又は銀染色（バイオラド（Ｂ ｉｏ
Ｒａｄ）社製の試薬使用）した。クーマシーブルー染色
でも銀染色でも汚染物は認められなかった。該ゲル中こ
の蛋白質濃度では、汚染物は、１０％よりはるかに小さ
いものである。上記ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により、本発明方法により得られたＴＧＦ−βが
均質で、純度９０％以上であることが判明した。
９）］で染色するか又は銀染色（バイオラド（Ｂ ｉｏ
Ｒａｄ）社製の試薬使用）した。クーマシーブルー染色
でも銀染色でも汚染物は認められなかった。該ゲル中こ
の蛋白質濃度では、汚染物は、１０％よりはるかに小さ
いものである。上記ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により、本発明方法により得られたＴＧＦ−βが
均質で、純度９０％以上であることが判明した。
実施例を挙げ、本発明の詳細な説明したが、当業者にと
って、本発明の精神及び範囲を逸脱することな（、種々
の変更及び修正を行い得ることは自明のものである。
って、本発明の精神及び範囲を逸脱することな（、種々
の変更及び修正を行い得ることは自明のものである。
第１図は、ＴＧＦ−βにより惹起されたミンク肺−ヒ皮
細胞（ＡＴＣＣ阻ＣＣＬ−６４）中への３Ｈ−チミジン
取込みの°阻害を示すグラフである。 第２図は、血小板の酸−エタノール抽出物についてのＴ
ＳＫ ５Ｐ−５ＰＷカラム上でのカチオン交換クロマ
トグラフィー結果を示す。 第３図は、第２図のＴＳＫ ５Ｐ−５ＰＷカラムから
得られたＴＧＦ−β含有フラクションについてのバアイ
ダック（Ｖｙｄａｃ） ｃ４セミープレパラティブＨＰ
ＬＣカラム上での疎水性クロマトグラフィー結果を示す
。 （以 上） ＦＩＧ、Ｉ ＴＧＦ−β（ｐｍ） ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ０ 晴聞陣）５０
細胞（ＡＴＣＣ阻ＣＣＬ−６４）中への３Ｈ−チミジン
取込みの°阻害を示すグラフである。 第２図は、血小板の酸−エタノール抽出物についてのＴ
ＳＫ ５Ｐ−５ＰＷカラム上でのカチオン交換クロマ
トグラフィー結果を示す。 第３図は、第２図のＴＳＫ ５Ｐ−５ＰＷカラムから
得られたＴＧＦ−β含有フラクションについてのバアイ
ダック（Ｖｙｄａｃ） ｃ４セミープレパラティブＨＰ
ＬＣカラム上での疎水性クロマトグラフィー結果を示す
。 （以 上） ＦＩＧ、Ｉ ＴＧＦ−β（ｐｍ） ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ０ 晴聞陣）５０
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ［１］（１）血小板を酸−エタノール抽出する工程、（
２）工程（１）で得られる抽出物をカチオン交換分離に
供してトランスフォーミンググロウスファクター−β（
ＴＧＦ−β）活性含有フラクションを単離する工程、及
び （３）工程（２）のＴＧＦ−β活性含有フラクションを
疎水性分離に供し、ＴＧＦ−β活性含有フラクションを
単離し、こうしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により測定した場合に均質となるまで精製されたＴ
ＧＦ−βを得る工程 を包含するＴＧＦ−βの精製方法。 ［２］血小板を１００〜５００単位の量で用いる請求項
１に記載の方法。 ［３］血小板を１００〜３００単位の量で用いる請求項
２に記載の方法。 ［４］酸−エタノール抽出をｐＨ約４．０未満で行なう
請求項１に記載の方法。 ［５］酸−エタノール抽出をｐＨ約３．５〜２．０で行
なう請求項４に記載の方法。 ［６］酸−エタノール抽出を約５０％（ｖ／ｖ）以上の
エタノール濃度で行なう請求項１に記載の方法。 ［７］酸−エタノール抽出を約８０〜７０％（ｖ／ｖ）
以上のエタノール濃度で行なう請求項６に記載の方法。 ［８］（１）トランスフォーミンググロウスファクター
−β（ＴＧＦ−β）を含有する馴化培地をカチオン交換
分離に供し、ＴＧＦ−β活性含有フラクションを単離す
る工程、及び （２）工程（１）のＴＧＦ−β活性含有フラクションを
疎水性分離に供し、ＴＧＦ−β活性含有フラクションを
単離し、こうしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により測定した場合に均質となるまで精製されたＴ
ＧＦ−βを得る工程 を包含するＴＧＦ−βの精製方法。 ［９］馴化培地が無血清馴化培地である請求項８に記載
の方法。 ［１０］馴化培地がヒト黒色腫セルラインＭ３８２７（
ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ−９１９３）、アフリカミドリザ
ル（Ａｆｒｉｃａｎｇｒｅｅｎｍｏｎｋｅｙ）腎上皮セ
ルラインＢＳＣ−１及び正常ラット腎セルラインＮＲＫ
−４９Ｆ（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ−１５７０）よりなる
群から選ばれる細胞により馴化された請求項９に記載の
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14138288A | 1988-01-07 | 1988-01-07 | |
| US141,382 | 1988-01-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01230522A true JPH01230522A (ja) | 1989-09-14 |
Family
ID=22495453
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1001906A Pending JPH01230522A (ja) | 1988-01-07 | 1989-01-06 | トランスフォーミンググロウスファクター―βの精製方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0323842A3 (ja) |
| JP (1) | JPH01230522A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999061474A1 (en) * | 1998-05-25 | 1999-12-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Purified human activin and process for producing the same |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5043431A (en) * | 1989-09-11 | 1991-08-27 | Codon | Method and apparatus for the production of TGF-β |
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1989
- 1989-01-05 EP EP89100148A patent/EP0323842A3/en not_active Ceased
- 1989-01-06 JP JP1001906A patent/JPH01230522A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| EP0323842A2 (en) | 1989-07-12 |
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