JPS5948422A - 新規なポリペプチドおよびその単離および精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、胸腺から単離することができそして免疫系に
対する作用を有し、また５、４８０の分子量、２０５〜
２１０　ｎｍ　Ｋ　４ｉ大を有するＵＶ吸収、３．９５
±０゜１５の等電点、および次のアミノ酸組成すなわち
４アスパラギン酸単位、３スレオニン単位、３セリン単
位、６グルタミン酸単位、１グリシン単位、４アラニン
単位、３バリン単位、１イソロイシン単位、１０イシン
単位、５リジン単位および１アルギニン単位を有し、そ
のＮ末端が場合によ９１〜６個の炭素原子を有するアシ
ル基またはアシル基に１〜６個の炭素原子を有するアシ
ルグリシル基を有する新規なポリはプチド、およびその
はプチド開裂生成物および薬理学的に許容し得る塩に関
する。

仔牛胸腺からの細胞不含蛋白質抽出物（例えば既知の標
準品であるチモシン画分５）が、例えば移植片拒絶の低
下、肺劫発生確率の増大、感染に対する感受性の増大お
よび老化過程の促進のＩＪＪｊ囚となｐイ（Ｉる免疫欠
Ｊ：ｉｉ　１＋Ｍ　（Ｉグを抑１１ｉ１１できることｔ
：Ｊ：知られている。この両分５を特にＩＪｌｉＪ揃患
者に苅して臨床的に用いて成功した１／１１が報告され
ている［Ｉ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔ、　Ｒｅｐ、　
Ｊ　Ｍ”ｒ　６２巻第１７８７〜１７９０負（１９７Ｂ
）参照〕。

所期の作用の阻沓体をも、あるいはｆｆ性化合物さえを
も含有する可能性のある混合物知ではなくて明確かつ再
現性ある活性を有するｑＪ徴伺しｊられた純物鈎を用い
た方が治ｈＣ上望ましいことはいうまでもない。更にま
た、かかるｎｔ台物質の組成は、就中屠殺動物の年令に
依存するために標準化し雛い。混合物から年し、１：さ
れているこのような純物ηの例はチモシンα１、β１、
β４、β８およびβ９であり、前記物％のりも最初のも
のがその生物学的作用に関し最もよく研究されている［
「Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、Ｊ第２５４巻第９８１〜
９８６頁（１９７９）、および「Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　、Ａｃａｄ、　Ｂｃｌ、　ＵＳＡＪ第７８巻第１１
６２〜１１６６頁（１９８１）診照〕。

しかしながら最近になって、ｌｉ令にチモシンα１およ
びβ８に関する報告が現われ［ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
。

Ａｃａｄ、　Ｆ３ａ１．　ＵＳＡＪ　第７９巻第１７０
８〜１７１１頁（１９Ｂ２）参１１’ｄ　）　、そして
本発明のペプチドの単離に関する研究は、両にプチドは
穏和で々く甘だそれ故に＋１４．現しかＩＬい単回Ｆ法
の結果として生成するに過ぎないとのこれらの知見を支
持している（本発明のホルモンの単離においてチモシン
α１は副次的画分中に検出し得なかった）。

それ故、穏和な条件下に純ホルモンを単離しそれによっ
て無傷で天然の活性成分を愼持することが本発明の目的
であった。胸腺にはこのような活性成分が多数存在し、
またこの多様性Ｃ↓もちろん、例えば種々の作用特異住
Ｖこおいて重賜であるので、これらすべての物ａを精製
することは、前述の諸障害の治療のための至適スペクト
ルを与える上で極めて重要である。

本発明によシ単離さノ１．たペプチドは高純Ｕ〔、好ま
しくは９０％を以上の篩純Ｉ徒をイ了し、これは、はプ
チド化学において慣用される方法を用いて容易に示すこ
とができる。これらの方法にはポリアクリルアミドゲル
箱２気泳動法、等′１１Ｌ点電気泳動法およびアミノ酸
分４ｊ＋か肯才！しる。本発明の新規な化合物は、本発
明による後処理方法の拙々の変法で等しく良好な収率カ
一つ同じ高純度で得ることができ、すべての後処理方法
の生成物は相互に同一である。このことし、１、それが
無傷の天然物知であって後処理方法に依存する開裂生成
物でないことをンＪ：　Ｌ、ている。

本発明によるペプチドは白色、無芙、かつ中性溶液中で
は高められた温石“１ケ１１えは８０℃で女定であシ、
また乾燥した形で＋５℃以下の低温で少なくとも６年間
活性を失うことなく貯蔵できる。その化学構造から、そ
れはポリペプチドでちゃ、加水分解により完全に開裂後
はアミノ酸以外の成分は全く検出できない。

アミノ酸組成をＭｏｏｒｅおよび５ｔｅｒｎ両氏の方法
ｒｒＭｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＪ第
■巻第８１９〜８３１頁（１９６３年発行）〕により測
定した場合、次の値が認められる。すなわち４アスパラ
ギン酸単位、３スレオニン単位、３セリン単位、６グル
タミン両年位、１グリシン単位、４アラニン単位、６バ
リン単位、１インロイシン単位、１０イシン単位、５リ
ジン単位および１アルギニン単位である。

本発明によるポリペプチドの特徴的な特色は、メチオニ
ン、システィン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロ
シンおよびトリプトファンが存在しないことである。特
にメチオニンおよび芳香族アミノ酸の不存在は、０縮過
程において１ｔｌｉｉ分の純度のｄ′１′価に用いるこ
とができる。それはまた、検出を慣用される２　５４　
ｎｍの波長で行なった場合に、クロマトグラフィー分１
７ｉ１におけるピーク面積とそのピークから単離された
！吻Ｕの１コニとの間に厳密な相関が存在しないという
事実に対して付加的な説明を与えるものでおる。

分子Ｍ測置には５ＤＳ−ポリアクリルアミドケ゛ル電気
泳動法［ｒＴｅｃｈｎｊｑｕｅｅ　ｉｎ　Ｐｒ０ｔｅ１
ｎ　ａ、ｎｄＦ、ｎｚｙｍｅ　Ｂ１ｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙＪ第１０６巻第１０２頁以下（１９７Ｂ　）　（Ｂｌ
ｏｍｅｄｌｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ発行）参照〕が用イラれ
、ポリにプチドの移動帯域を既知の基準物質例えば大豆
由来トリジチンＩｔ＋１　署物質（分子ｉ６，０００）
ｉ−よびインシュリンＢ鎖（分子を丁２．５００）のそ
れと比較した場合に約３．０００〜４．０００の値が得
られる。この結果はアミノ酸分析の所見と相関する。

ポリアクリルアミドゲルでの塩基性ディスク電気泳動法
［ｒＡｎｎ、　１’Ｊ、ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　、
ｊ　ＮＵ　２１巻第３２１〜３４９頁（１９６４）およ
び同第１２１巻第４０４〜４２７頁（１９６４）参貝（
１〕においては、本発明による生成物は本質的に、０．
５〜０６のＲｆ値を有する単一バンドを示す。Ｈａａｏ
ｌａ氏の方法［ｒＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｊｓＪ　
第１巻第４３〜４６頁（１９８０）参照〕により調製さ
れ、そして２〜９のｐＨ範囲のための両性電解１Ｍおよ
び６Ｍ尿素を含有する０、３胴厚さゲルでの等電点電気
泳動法も同様のパターンを示す。本発明による。（５＋
）はプチドの等−電点すなわち３．９５±０，１５は商
業的に人手し得る試験混合物との比較により確認はれる
。ｋお、与えられた誤差範囲は、試刺訃よび比較対照は
決して全く同一のイオン強度を示すことはないこと、ま
た高分解能を得るに必要な尿素さえもポリペプチドの等
電点に影へ５を及ぼし得ることに帰因している。かかる
ポリアクリルアミドゲルは改敦したクーマシーブルー（
Ｃｏｏｎ＋ａｓｓｌ　ｅｂｌｕｅ）　［ｒＡｎａ、１ｙ
ｔｊｃａｌＢｉｏｃｈｅｍＪｓｔｒｙｊ　第ｓ　２　；
＠ｊｙ５８０〜５８２貞（１９７７）参照］により染色
される。

本発明は更に、胸腺からポリペプチドを沈殿法、ｖ濾過
およびクロマトグラフィーの組合せにより却−離するこ
とよシなるＡ／Ｉ製ポリペプチドの単Ｆｉｌｌ：方法に
Ｉｕ、；Ｉ　ｔ　ル。

胸腺は０５〜９０のｐＨ範囲に緩衝作−用を有する無機
塩、好ましくは燐酸塩、の水性溶液で抽出するのが好ま
しい。不溶性物質は除去しそして得られた抽出液からポ
リペプチドを分離しぞして単離する。

前記単離方法のクロマトクラフィ一段階は、好１しくけ
陽イオンおよび／または陰イオン交換クロマトグラフィ
ー、非特異的、吸着体的−にヒドロキシアパタイトでの
クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、特に一
方が多量の水を含有する２Ｎｉの非混和性媒質間の分配
、またはこれら方法の三者またはそれ以上の組合せよシ
なる。

このクロマトグラフィーには、熱変性に付した抽出液を
用いるのが有利であシ、本発明によるＲプチドは溶液中
に残９その完全な活性を保有する一方、他の蛋白質は沈
降または濾過によシ分離することができる。抽出液を水
に対して混和性の有機溶媒、好ましくはアセトンを添加
することによ多処理した際に沈殿として分離される物質
もまたクロマトグラフィーに用いることができる。同様
にして水溶性無機および／または有機塩好ましくは硫酸
アンモニウムの添加による分別沈殿に付した抽出液を用
いることもでき、その場合、ｋプチドはあるＣ広範囲（
使用した塩に依存する）で沈殿しそして沈降法によシー
縮される。１１１′４１ｐ過および／またはケ゛ル痙ｊ
Ｈによる分別の結果として、ｉｏ、ｏｏｏダルトン以下
の分子Ｊンを有するにプチドのみをなおも含有する抽出
液は更にまたクロマトグラフィーに用いることができる
。

前述の諸方法の２種またはそれ以上の組合せによってイ
ｕられた抽出液ももちろんクロマトグラフィーに用いる
ことができよう。

本発明によるポリはプチドを調ｊＪＩＩするための出発
材料は新鮮な胸腺または層殺後速かに深冷凍結状態で貯
蔵された胸腺利Ａ−１からなる。この材料を更に冷却し
ながら（０〜＋４℃）凍結状態で粉砕しそして塩溶液を
添加することｔｉｃより水性抽出液ｔ−ｐ製する。この
抽出液を迅速加熱によって７０〜９０℃の至適温肛好ま
しくは８０℃に付すのが有利である。何故ならそれによ
って大部分のプロテアーゼが失活しそして沈殿として分
離されるからである。分離は遠心分離およびガーゼでの
濾過により行われる。

他のプロテアーゼ失活力法、例えば化学的失活剤例、ｔ
　ハフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ
）などと比較した結果、熱処理のみによっては収率も活
性も落ちないこと、従ってこの方法はこの目的に対しそ
れ自体で十分であることが示された。

より小容量を得、それによって以後の後処理を容易にす
るためには、問題の蛋白画分を熱処理された抽出液から
沈殿によって濃縮すべきである。この沈殿はその抽出液
を水と混和し得る有機溶媒に添加することにより行なう
ことができる。例えば抽出液容量の数倍、好ましくはそ
の量の５倍のアセトンを用いることができ、そして沈殿
は−１０〜−６０℃の極めて低い温度、好１　Ｌ　＜　
＆；ｉ：　−２０℃で行なわれる。その混合物を可及的
に迅速に濾過または遠心分ｔ′ｇμすることも重要であ
る。何故なら、混合物を長期間放置しておくと他の随伴
物質も沈殿するからである。

この段階においても可能性として溶液中に存在する酵素
は高濃度の有機溶媒によって阻害される。このようにし
て得られた沈殿は凍結状態で活性を失うことなく貯蔵す
ることができる。

前述の方法に代えて、あるいはその後に行なうことので
きる沈殿によるもう一つの濃縮可能性は、中性塩例えば
硫酸アンモニウムの添加である。この沈殿はｐＨ調節に
よりある選択性を達成することができる。硫酸アンモニ
ウムを５０チ飽和度まで添加することによシ、約３．９
５の叫電点を有する本発明のにツチドを３〜５のｐＨ範
囲好ましくはｐＨ４で沈殿させることができるので、多
数の随伴蛋白質は溶液のま１残る。この沈殿もまた冷却
しながら、好ましくはθ〜＋４℃で冷却しながら行なわ
れる。

類似した等電点を有するがより高い分子°１「を有する
他の蛋白質を分離するのに適していることが判明してい
る二つの方法はゲルＦ　ｉｋｋと限外濾過であシ、工業
的規模には後者が特に適している。ゲル濾過はよυ狭い
分子量範囲への分割を可能にするが限外濾過よυは能力
に制約があシ、従ってそれは、比較的多ｊｉｉ’の抽出
液を後処理する過程の後の方の段階、例えば限外濾過ま
たはカラムクロマトグラフィーを行なった後それらの両
分を再精製するのに適していると考えられる。架橋デキ
ストラン、ポリアクリルアミドまたは変性シリカゲル、
例えばバイオゲル（Ｂ１ｏｇｅ１■）、セファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ■）、ウルトロゲ／ｌ／　（Ｕｌｔ
ｒｏｇｒｌ■）、または１０，０００ダルトン以下の分
画範囲を有するポリオールなどに基づく球状粒をゲルＰ
追に用いるのが最良である。本発明Ｖ（よる生成物の％
　’ｌｊ：点の故に、ゲル濾過は（以後のすべての￥１
１１段階についてもそうなのであるが）４〜９ＯｐＨ値
で水性緩衝沿中で行なうのが最良でおる。何故なら、そ
のようにしなければポリペプチドの溶ＢＴＣ度が貨しＩ
トされないからである。

二つの例外（０Ｍセルロースおよびヒドロキシアパタイ
ト、後述）はあるが、Ｚ５〜８５のｐＨ範囲（重炭酸ア
ンモニウムまたけトリス／　１１Ｃ／　）が特に有利で
あることが判明している。

限外濾過は膜の負荷が退京にならないように（細孔が閉
塞されてしまう）２段１′Ｊ）′ｒで１Ｊなうのが最良
である。例えば５０，０００ダルトンの排除限界を有す
る毛細管膜を１０，０００ダルトンのυト除限界を有す
る平坦膜と組合わせて用いると有利であることが判明し
ている。より選択的に働く平坦膜を通る流れを減じてし
まう比較的高分子の物質は毛細管膜によって迅速に除去
される。

これまで用いられた方法に基づいてこのようにして得ら
れた物質はなおポリｇプチドの混合物よシなる。本発明
のポリペブチＦはその僧電点の故に４〜５の慣用ｐＨ範
囲では陽イオン交換体に結合せず、それ故セルロース、
デオストラン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン樹脂
またはシリカゲルに基づくこれら交換体を用いればｐＨ
４〜５よシ高い等を点を不し、従って吸収される多量の
随伴生成物からそれを迅速に分離することができる。こ
の分離はクロマトクラフィーカラムまたはバッチ法で行
なうことができる。

一方、本発明のにプチドは、テキストラン、ポリアクリ
ルアミド、セルロース、ポリスチレン樹脂またはシリカ
ゲ゛ルに基づく陰イオン交換体に５〜９、好ましくは８
のＴ）１７値で結合し、また適当な条件を選択すること
によシ実ａ的に選択的に浴出することができる。このよ
うな条イ′」の例はｐＨｉたは塩ガ、″Ｊ度勾配の適用
である。５０ミリモル濃度のトリス−ＩＣ／　ＫＯ：Ａ
：’ｊｌｌａ（ｐＨ８）オヨびカラム容ＩＢ゛の５〜１
０倍にわたって分布さｉｔた０〜０．５Ｍの塩化ナトリ
ウムｌＩ」度勾配を月１いるのが有利であることがｉｔ
１明［７でいる。このクロマトグラフィー分離を行なう
前ｋｃは、ポリ−ニー２チド混合物は塩基性ゲル’ｔｉ
：気＋（（動においてほとんど解像し得ない多数のバン
ドを示し、°またクーマシープルーで染色すると連続し
た背景色に極めてわずかな明瞭バンドがあるに］１、り
きないという印象を受ける。この段１偕では本発明のペ
プチドは視認でき力い。イオン交腟さ体両分を分析して
ｉｔじめて明確な像が待られる。クロマトグラフィーの
ほとんどすべてのピークｆ！ニア１；、　’Ａ　ｉｋ　
ｆｉｔ力の一定のバンドと相関することができ、従って
本発明のペプチドの局在化は実施例７に記載の濃度勾配
の約６５％において可能１である（第２図参照）。

クロマトグラムが複雑であるため、この第１のクロマト
グラフィ一段階で完全な均一さを達成することは保証さ
れない。それ以上の良好な精製効果は同じ分離系で再度
のクロマトグラフィーを行なうことにより達成すること
ができる。

ゲルミル遍も才た更に少すのよυ−１’］分子の物質を
分離する。しかしながらこの場合純度はほんのわずか増
大するに過ぎない。何故ならその物質はすでにこの分離
原理（限外ｆｐ過）を徹底的に通過してし１つているか
らである。

前記イオン交物体でのＭｌのクロマトグラフィーの前ま
たは後に、全く異なる方法、すなわちヒドロキシアパタ
イトへの吸収を用いるのが有利である。何故なら、この
方法は本発明のポリはプチドが慣用される１０ミリモル
０度の燐酸塩緩１すｆＩｔＪ、中ｐ）］　６．．８にお
いて分ｐ＋：ｔカラムを遅浦することなく通過して流れ
、随イ１−物仙のみが結合するために少ない損失でかつ
迅速に行なわノ１゜るからである（第３図参照）。

ヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフィーは一般に
陰イオン交換体での内庭のクロマトグラフィーによる最
終的精製の前に含められるが、この方法はまた後処理−
計画の他の段階（例えば陽イオン交換体の後）で本同様
に首尾よく用いることができる。陰イオン交換体での再
度のクロマトグラフィ一段階は許容Ｉｐで実俤的により
平坦な０度勾配コースを有するカラムで行なわれる（第
５図参照）。

各精製段階の後に無機分除去および凍結乾燥が続くこと
はいうまでもない。陽イオン交倹体処理から得られする
無機分だけはその塩含量が低いので次の段階に直接用い
ることができる。１誌類は、５００ダルトンまたは１０
，０００ダルトンの排除限界を有する適当々平坦膜での
限外濾過により、または架橋デキストランまたはポリア
クリルアミドに基づく適当々物質、例えばセファデック
スＧ１０またはＧ２５、バイオダルＰ−２またはウルト
ロゲルＡＣａ　２０２々どでのゲル濾過によシ除去され
る。

続く凍結乾燥の間に除去できる緩衝剤例えば重炭酸アン
モニウムなどを用いるのが最良であることはいうまでも
ない。

Ｎ末端が遊離塩基として存在する本発明のポリペプチド
はそれ自体既知の方法により相当するＮ−アシルオたは
Ｎ−アシルグリシル誘導体に変えることができ、その場
合アシルはＢｏｃ　’ＪたはＣ１〜Ｃ６−アルカノイル
であるのが好ましく、アセチルであるのが特に好ましい
。

本発明のにプチドの薬理学的にγＦ容し得る塩に特にア
ルカリ金属およびアルカリ土類金属塩のみ在らず、生理
学的に許容し７得るアミン例えばアルキルアミンおよび
シクロアルキルアミンとの塩などをも意味するものとし
て理解される。）本発明のに゛プチドは各種の（ＦＴ用
の試験管内試験において免疫系に影響を与える作用活性
を有することを尻出した。こ）１．らにはＴ細胞分化が
含まれるが、その程戻幻−１１−ロゼツト試験［ｒ　５
ｃａｎｄ、　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏ　コ２．Ｊ　　第
　３　　巻ａｆ−５２１〜５３２頁（１９７４）参照〕
卦よびフィトへ！・アグルチニン刺激試験（ＰＲＡ刺激
試験）により測定される。

白ｔｆｉ的ロゼツトπＩ（席・さでＶよ、ヒトＩ′ｌ７
１１帯血由来リンパ球の成熟化を、羊赤血球を用いて冷
時にロゼツト形成することによって１−Ｊなう。成熟Ｔ
細胞のみが冷Ｄｉに羊赤血工・Ｆとロゼツトを形成する
ので、これは特異的なＴ細胞試験である。すなわちそれ
はＴ＋ｌＩｎ胞（いわゆるヌル（ｎｕｌｌ）細胞、その
比較的多数が側帯血中に存在する）からＲ＋−Ｔ細胞す
なわち成熟Ｔ細胞への移行のｖ１２　ｆｔ？を可能にす
る。

ヌル細施の数が比較的多いために廁帝血におけるロゼツ
ト形成細胞の正常値は成人の末梢血液におりるよりも小
さい。自己免疫病または１１Φ瘍に罹患している患者の
面数の研死に基づいて小ロゼツト数は低免疫と相関させ
ることができる。ＰＲＡ刺激試％　（ＰＦ’Ａ　＝フイ
トヘムアグルチニン）またはリンパ球転換試験でに＋：
　、成熟リンパ球すなわち刺激され得るリンパ球の数に
関する結論は、自発的ロゼツト試験におけるような表面
構造の研究によるのではなく、’ｌ”ｌ”に成熟Ｔ細胞
に結合する植物レクチンＰＨ，へで刺激され得る能力に
ついての機能試験により得られる。

Ｔリンパ球は、細菌性またはビールス性抗原により惹起
されるのと同Ｅにレクチンによって刺激されて幼若転換
をおこす。これによって、直接か寸たｔよりンホカイン
の分Ｎ１３によって増殖するに到る。その場合、ある時
１１１１内におりる放射性チミジンの取込みは刺激され
た細胞数の尺度となる。成熟し７た９７７９球または免
Ｊザ学的に強力なリンパ球だけが刺激されるので、ＩＩ
Ｍ帯血から後処理されたリンパ球の、物１狛とインキュ
ベーションした後の成熟度をこの試験によって監視する
ことができる。

免疫火打ｊ患者例えげディ・ジョージ症候群の患者のリ
ンパ球を用いた実かで、前述のにプチドはＴ細胞レベ゛
ルの増加に特に有効であるとして認められている。その
際、「画分５」に相当する混合物よシも純粋物質の方が
７５ｒ望のよシ弘；力々効果を有シフ、該効果が実ｔ１
的によｐ低い有効濃度で発現することが明らかと々つた
（第１表参照）。

「画分５」　　　　　本発明のホルモン（μｇ／１ｎＡ
）　　１２５　２５０　５００’　　　　５　　１０　
１００活性矢　３１１　２４４　１１１　　１３３　３
２２　８８薫　画分５または本発明のポリにプチドでイ
ンキュベーションした後のＴリンパ球濃度を標準に対す
るチとして表わしたもの。

驚くべきことに、化学的経路または好ましくはある種の
特異的プロテアーゼ、例えばトリプシン活性またはキモ
トリプシン活性を有するプロテアーゼを用いて無傷の天
然品全断片化しても十分なレベルの免役学的活性が保持
される、。

４種またはそれ以上のアミノ酸を含有する本発明のはプ
チドのはプチド開裂生成物が好ましい。

ＴＰＣＫ　）リゾシンまたはＴＬＣＫキモトリプシンを
用いた消化により得られる断片混合物を検ｄ」した。こ
り、ら二酵累を用いる方法は山気泳動により同一組成の
混合物が常に形成される程に再現性がよい。

本発明は本発明のペプチド、その誘導体および／甘たけ
化学的または酵素的経路により駈り造されるその開裂生
成物を治療１１ζは予防剤として免疫系を鯛整捷たは刺
激するために使用することに関する。

本発明は史に、ビールス感染、免疫欠損症、腫ハ′、ｙ
形成（’ＩｈＫＭ９ｉ症）および諸形態の老化促進プロ
セスの治療ふ・よぴ予防に使用できそして本発明のペプ
チドふ゛よひ／またはそのＮ−アシ／ｌ／性導体および
／または少なくとも一つのその断片を遊離（フリー）の
形でが甘たは処理学的に許容し得る塩の形で含有する免
疫刺激または免疫調節作用を有する医薬に関する。悪性
腫瘍の治療においては、本発明のにプチドは細胞静止剤
〔例えばｒＡｒｚｎｅｉｍｌｔｔｅ１ｗ’１ｒｋｕｎｇ
ｅｎＪ　１９　Ｂ　１年版第５９９〜６０８頁参１（４
）および／−またけ放射線手段と組合わせることもでき
る。

本発明のはプチドは非経口的に（例えば皮下的または静
脈内的に）あるいは粘膜経由で（例えば経鼻的に、また
は経腸的に）用いることができる。

非経−投与のための投与量は疾病のタイプに依存するが
、０．０１〜５０ｘｇ／ｍ２体表面積／日である。重い
症例の場合には、これまで右前な性質は観察されていな
いので、投与量を増大することもできる。特に重い症例
の続合には１週間あた多数回の投与を駐週間にわたって
行なうことが推奨される。経鼻投与の場合には特別な吸
収特性を示すために投与量をそれ相応に高くする必要が
ある。

皮下、静脈内または経゛鼻投与には、本発明の化合物ま
たはその生理学的に許容し得る塩を溶液、ｊ、７１４濁
畝゛または乳濁液に変換するが、所望によシこの変換の
ための慣用物負、例えはＴ′３１溶化剤、乳化剤または
その他の助剤を用いる。本発明の新規な活性化合物およ
び相当する生理学的に許容し得る塩に対して可能なｔ６
媒としてに例えば水、生理学的食塩水溶液またはアルコ
ール例工ばエタノール、プロパンジオール、またはグリ
セロール、および糖溶液例えばグルコースまたはマンニ
トール溶液、またけ前述の各釉溶媒の混合物などが挙げ
られる、。

非経口投与はまた、例えば外部の筐たけ埋込まれた計量
装置、例えば自動ホンプを用いるか、または連続滴下の
形で行なうこともできる。

この場合には変性に対して安定化する添加剤、例えばヨ
ーロッパ特許出願ゐ４１Ｂ、６０９号明細書から知られ
ている添加剤を加えるのが有利である。

本発明の化合物はデポ作用を有する医薬の形で投与する
ことができる。注射６液の場合には、例えば油性ビヒク
ルにその医薬を浴Ｍブたは懸濁し、ｌＡ５度を増加させ
セして浴存医砧の拡散を遅延させる高分子を添加し、適
当な担体分子例えば水酸化アルミニウムなどに吸収させ
、あるいは結晶懸濁液を用いることにより、このような
デポ作用を達成することができる。

経口的に用いる形とするには、活性化合物をこのための
慣用給加剤例えば賦形剤、安定化剤または不活性希釈剤
などと混合し、そして常法によシ、適当な投与剤型例え
ば錠剤、被’Ｍ　＆４、押し嵌め（ｐｕｓｈ−ｆｌｔ）
カプセル剤、アルコール性または油性懸濁液、またはア
ルコール性または油性溶液などに変換する。使用できる
不活性賦形剤としては例えはアラビアゴム、炭酸マグネ
シウム、燐酸カリウム、ラクトース、グルコースまたは
でんぷん特にコーンスターチなどが挙げられる。処方は
乾燥顆粒または湿潤顆粒として行なうことができる。使
用ｈ］能な油性賦形剤または溶媒としてはｌｉｌ植物油
、例えはひまわり油、またはたら肝油などが挙けられる
ｒ１本発明のポリＲプチド、その誘導体および／または
少なくとも一つのその断片の水性滅菌溶液は核溶液を等
張化する剤、例えは釣０９％強度の塩化ナトリウムまた
は１．７％強Ｄりのグリセロール、オよび場合にょシ保
存剤、例えシｊ゛ヒドロキシ安息香酸またはフェノール
など奮含むことができる。

実施例　１ ５００ｔの凍結胸腺をｔＳＺの氷冷した０、０９−強度
塩化す）ＩＪウム溶液および５−のオクタツールと共に
ミキサー中で３分間にわたってホモジナイズする。ｏ′
Ｃおよび１０，００　（ｌｒｐｒｎｆ３０分間遠心分離
した後、依然として濁っている上澄液を２層のガーゼで
濾過することにょシ更に清澄化し、次いで攪拌しながら
１５分間にわたって８０℃に加熱する。得られた沈Ｉ＃
を４層のガーゼで濾過することにょシ分離する。そのｒ
液を水浴内で撹拌することにより＋４℃寸で迅速に冷却
し、そして−２０℃に予冷した７、　５１のアセトンに
注ぐ。新たに生じる沈殿を５分後ガラス吸引フィルター
でＰ別しそして１ｔの冷アセトン（−２０℃）ですすぐ
。真空乾燥後、３２チの蛋白質含ｉｔ　ＣＬｏｗｒｙ法
にょｆ）？１ＩＩＩ定）を有する６１ｔのやや黄色を帯
びた粉末が得られる。

実施例　２ ２５ｆの凍結状態（出発温度−３０Ｃ）の胸腺を破砕ミ
ルで予（６：＋粉砕しそしてミンチ手段で磨砕しく全部
で１５分間）、そして次に、７４５Ｋｙのパイロジエン
不含水、６７５ｆの塩化す）　ＩＪウムおよび０７５２
のフェニルメチルスルホニルクロライドから１製された
７５１の０９％強度塩化ナトリウム溶液と共ＫＯ〜４℃
で５分間１υ［］　ｔ’５スプレーケトル内でホモジナ
イズする。０〜４℃に冷却されたチューブ遠心分離［セ
パ（Ｃｅｐａ”　）　］　ｋ　１５，０００Ｘ　ｙで１
時間にわたって行ない６個のロータに詰才った固体（湿
重量ｉ１５Ｋｇ）を分離し捨てる。８５．６　Ｖｙの上
澄液をガーゼで濾過し、そのＰ液を１００１容スプレー
ケトル内で２０〜２５分間にわたって攪拌しながら＋８
０℃の内部温度に力１！ｉ′品し、そし７て生じる沈殿
（湿重Ｑ　３　Ｋｙ　）を１５分間に、１５，０００Ｘ
ｆでの冷却チューブ遠心分離により分離する。やや濁っ
た上澄液を４層のガーゼで沢過し、そして攪拌しながら
、−２０℃に予冷された３７５１のアセトン中に導入す
る。２分後、生成する沈殿を冷却チューブ遠心分離（１
５，０００Ｘｆ、１５分間）を経て分離する。その遠心
分離残留物（湿重量５００Ｆ）を−２０℃のアセトン６
ｔで洗浄し、ビーカー遠心分離を３．’０ＯＯＸグて１
０分間にわたって行なって遠心外Ｐａ１ｌ　Ｌ　、そし
て夏空デシケータ内で乾燥する。２５％の蛋白ＩＪ１含
量を有する３２５７のやや黄色を帯ひた粉末が得られる
。

実施例　３ 実施例１または２によるアセトン粉末２５０２を２，５
ｔの水に溶解し、そしてその溶液を５Ｎ水酸化アンモニ
ウムでｐ）（８，０とし、セしてＯ〜＋４℃で１時間撹
拌する。不溶性含有分（乾燥後約５０２）を、ビーカー
遠心外ドア（Ｅ器を用い５、０［Ｊ　Ｏｒｐｍで５０分
間にわたって遠心分離する。

１１１用のロウジー法により蛋白勿量を測足後、ｏ、７
ｔの水を冷加−ｊることにより上澄液をｋ、ジ２５１１
９／祠のイ１１白゛Ｕ含１１１４（、Ｍ’４節し、１１
　（１）１ｍ和硫ｆｓ＆−７’　７七ニウム？’＋’ｒ
　７１．Ｍ　（１’姫加［２、ぞしてその混合物を＋４
ｔユで１時１ｆｉｉ　（Ｍ拌−する。生じる沈殿を遠心
外ｕｒｌＬ（５，００ｆｌ　ｒｐｍ、３０多１間）する
。’ｔ　ｆ）　’ｉＡ　明；？ｉニーＩ：　澄ン＋’ｔ
に６２８ノのＧｔＬｔｉノアンモニウムを絵加し、そし
て氷ｆｉ’ｌ４ｍ　’ｉ″用いてｐＨｉ−４，０とする
。その混む物全０〜＋４１〕で１時間攪拌した後、得ら
れる＋ＴＪ　ｌ−液を１Ｊ」度理心分離にかける。それ
によって得らｉするｆｌ、殿は笑知的な址の硫１ンアン
モニウムのほかに約３５ｒＩ１２）蛋白仙（ロウジー法
に上り測足）をａイ４’ｌ−、、またそれ故に乾保して
いないが的接限九ｐ過しく：用いられる。

実施Ｖ／リ　４ ′−Ａ施例６Ｑこ記載リア±トン粉末２５０１がら得ら
れる硫酸アンモニウム沈殿を１．５ｔの０．１Ｎ重炭酸
アンモニウム（ｐＨ８，０）に溶解して透明溶液とし、
そして型式ＨＩＱＸ５０（排除限界ｓｏ、ｏｏｏダルト
ン）のフィルターカートリッジ２個付きのアミコン（Ａ
ｍｉｃｏｎ）中空繊維装置での限外濾過にかける。その
際、前記溶液は３００　ｍｌ！まで濃縮されるが、ｓｏ
、ｏｏｏダルトンよシ小さいすべての蛋白負を完全に除
去するために限外濾過の終了する時点で０．１Ｎ重炭酸
アンモニウム（ｐＨ８，０）を５００−ずつ２回補給す
る。それよりも高い分子量の蛋白質のすべてを含有する
１９８ｔの残留物が疎結乾燥後にイ（Ｉられ、該残留物
は８４％の蛋白質含量（ロウジー法によシ測定）を有す
る。

そのｐ液を改めて限外濾過にかけるが、今度は、５層Ｍ
１０平坦膜（排除限界１０，０００ダルトン）を用いた
２、５ｔアミフンセルで行なう。その際溶液は１５０＋
＋＋ｌ’ｔで濃縮されるが、終了するころに０．１　Ｎ
重炭し、アンモニウム（ｐＩＪ８．０）を４ＪＯｍεず
つ２回補給する。残留物を凍結乾燥してイＵらり、る８
、２ｖは８９％の蛋白り１含量を有する。

セファデックスＧ１０（狛Ｉ）を充Ｊ、Ｉｊｌ　Ｌそし
て０１Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐ）（８，（Ｊ　）で平
衡尊セた「ｊ径２１．５０×長さ１００ｍのカラムな・
用いてそのＰ液から塩類、特に硫ｒ挾アンモニウムを１
・（二去する。ぞれを・イ１ｊ時５１の流速でｊル転す
る。カラム容量の約杓の後、溶出液中に塩不含蛋白１７
ｊが現われ、次に蛋白質と塩類との混イ〕画分（Ｏウリ
−法により１ｌｌ１１定された蛋白含ｆ＝ｔ　Ｉｔ１４
８％）が現われ、そＩｔを同じカラムでの４＋Ｊ　ｒｒ
−のりＣマドグラフィーにかける。このように１７で、
）’ｊ目１゛；＋入燥後に９３俤の蛋白餉含個°をイ〕
する物ケ１５９２がイ；Ｊられる。

実施例　５ 実施例４に記載の限外濾過によって得られる１７ｆの蛋
白質画分を５００−の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ５，５）と共に１３え拌する３、不溶性残留物（乾
燥後１．１５　Ｆ　）を遠心分〜１ｆｆ（２０分間、５
．００Ｏｒｐｍ　）により分離する。同じ緩衝液で平衡
させた３ｔの０Ｍセルロース〔サーバセル（ｓｅｒｖａ
ｃｅｌ）　ＣＭ−２３：］　を可溶性成分に６５加する
。

その混合物を半時間位拌した後、その局、Ｏａ　液をガ
ラス吸引フィルターに通し、そして陽イオン交換体をほ
とんど乾燥するまで吸引枦去しそして２ｔの同−緩衝液
でゆっくりとすすぐ。

そのろ液（２，５１）を凍結乾燥し、ぞして１５０ばの
０．１　Ｍ重炭酸アンモニウム（Ｔ）Ｈ８，［Ｊ）に溶
解し、そしてその溶液を、セファデックスＧ１０（粗）
を充填し、０１ＭＭ炭酸アンモニウム（ｐＨ８，０）で
平衡させた直径５０×長さ４０６ｎのカラムに毎時１５
０−の流速でがＨてｆｔ＋「４４１＆分を除去すイ）１
．この場合にもＪＩＩＡ類不店“０１ｌｉ白Ｉｑを含有
する両分が最初に”ＩＩられ、次いで蛋白ｌＩＩと地と
の混合画分がイ（＃られるが、ぞＪＬ’（ｒニー同一カ
ラムでの用度Ｏ″ノクロマトグラフィーにが０る。この
ようにして凍結乾燥後、９４飴の蛋白躍ｒ”；　’−Ｉ
＋７を有する２１２の物１′Ｊ（以］・「画分」と吋ふ
）が侍らノする。

実施例　６ 実施例４に記載の限夕１沖鍋により１°トられた３゜Ｖ
のｔｌＺ白質両分を１ｔの０．ＵＩＭ酎・１買ナトリウ
ム（ｐｌ＋　５．５　）中に４１７拌混合し、イーして
不溶イ′ト成分（乾燥後１３２）遠心分離（２０分間、
５，０００ｒｐｍ　）により分ス１ｔする。

その６明な溶液を０Ｍセルロース（サーバセルＣＭ−３
２）を充填し１　’０　／１．の０．０１Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５，５）で平衡させた直径Ｉ　Ｕ　ｃｍ　Ｘ
　４Ｑさ４３（７ＩＩのカラムでのクロマトグラフィー
にかけ、試料を注いだ後そのカラムをまず１ｏｌの同一
緩衝液を用い毎時５００　ｍｌの流速で溶出する。それ
によって得られるピーク（第１図参照）を、実施例５に
記載の方法と同様の方法で塩類成分を除去する。凍結乾
燥した後、９５％の蛋白質含量を有する１Ｚ５２の画分
（以下ｒＣ’ＭＩＪで示す）が得られる。

そのカラムを再使用のため緩偵Ｉ液をそれが不含となる
まで０．０１Ｍ酢酸ナトリウムと１．０Ｍ塩化ナトリウ
ム（ｐＨ５，５）に変えることにより洗浄する。それに
よってもう一つのピーク（行！１図参照）が得られるが
、それは常法により無機分を除去し凍結乾燥を行なった
徒、’１１５ｙの（ＪＴ白鷺を与える。

実施例　７ 直径１０ｄ×長さ６２備のカラムを０．０５Ｍトリス／
ＨＣｔ（トリスヒドロキシメチル了ミノメタン）の緩衝
液中で予め膨ｎａｌζせたＤＦ、ＡＩ’！ｉセファセル
（ＳｅｐｈａＣθ１）〔ファルマシア社朝品〕で充填し
、１５Ｌの同一緩衝液を７１４いて４０時５２５　ｍ／
！の流速で平衡させる。

１Ｚ５２のＣＭｌを１ｔの０．０５Ｍ）リス／　ＨＣＩ
（ｐＨ８，５）に溶解しそしてその溶液を毎ｆｆ！ｆ３
２５ｍｌ！でカラムに給送する。同じ速１川でカラムを
１ｔの同一緩衝液ですすぎ、そして最後にＯ〜１．ＯＭ
の塩化ナトリウムの１＃１線＃ＩＷ勾配を３６７、の各
階にわたって適用する。重なりあって大きな主ピークを
与える多数の小ピークが２４５　ｎｍでの検出によシ見
えるようになる（第２図参照）。

これらのピークの各々から常法により蕪機分を除去しそ
して各ピークを塩基性ポリアクリルアミドゲルｉｉ、ｉ
気泳動（ｐＡｏＫ　）によや分析する。この分析から、
０．５〜０．６のＲｆ値を有する目的物質１１１．１５
８Ｑの蛋白質を含有する主ピークの第６ピーク（紀２図
においては２で標識しである）内に見出される。

その物質を含有するビ′−りのＰＡＧＫを前に溶出され
た両分のそ゛れ（第１図の挿入し１参員）と比較すると
、この１１１袈段階では個々のピークの重なりあいはほ
とんど避けられず、そのため個々のピークラ続いてオ青
製することも避けられないことが分かる。

実施例　８ 直径２．６　ｃｍ　Ｘ長さ２５ｍのカラムを００１Ｍ燐
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，８）に懸濁させたヒドロ
キシアパタイト［バイオ−ラド（Ｂｊｏ−Ｒａｄ）　）
で充填し、そして５００　ｍ７！の同一緩衝液を用いて
毎時８０ｍ７！の流速で平衝させる。

目的物質を含有する前述の陰イオン交換クロマトグラフ
ィーからの両分４００■ｆ：５０　ｍｌの０．０１Ｍ燐
酸ナトリ゛ウム緩衝液（Ｔ）Ｈ６，８）に溶解し、そし
て８０ｍ／の同一緩衝液を用いて０．０１〜０．４０Ｍ
燐ｒ：ｖ　ナトリウＡ　（ｐＨ６，８）ｃ７）ｉｃｆｆ
′ｉｊ１．ｔＭＬ’勾配全１．３ｔにわたって適用する
（第３図］１α）、、ｌＪ的物すｌｔよノυ初の（ブレ
イクスルー）ピーク（う１１．３図のピーク１）にあり
、そして常法によ＃）無様分除去および凍結乾燥を行な
うことＶＣよりそのピークから２９０　ｍｙの成上ｊ゛
で若干の（＋Ｕのポリペプチドと共に単離される。

得られる物ａはＰＡＧＩ！ｉにおいて出発混合物に類似
したパントスにクトルを示すが、本発明のポリペプチド
に相当するバンドの強１１Ｊ’　ｌま相当増大している
。

実施例　９ 肉径１．６　ｃｐｓ　Ｘ長さ１２０ｍのカラムを０．１
　Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝。液（ｐａ４８．０　）中
で予め１）、ｅ潤させたウルトロゲルＡ（４Ａ　５４　
（ＬＫＢ）で充填シ、そして７５０−の同一緩衝液を用
いて毎時３０ｍ１の流速で平衡させる。

目的物質を含有する前述の陰イオンクロマトグラフィー
からの両分２９０　Ｑを３０ｍｅの重炭酸アンモニウム
緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解し、そしてその溶液を前記
カラムに毎時３０ｍ７！で給送し、次にそのカラムを更
に同一緩衝液を用いて同一流速ですすぐ（第４回診１１
　）。

少量の高分子蛋白質を含有する小さな最初の（ブレイク
スルー）ピークが現われ、そしてその容量の２倍容量の
溶出後、全容量を通してＰＡＧ］ｌＩｉで同一バンドス
ペクトルを与える幅広の主ピークが現われる。

この主ピークを凍結乾燥すると、出発物餡よシも品質が
ほんのわずか向上した物質２００１１１／が得られる。

実施例　１０ 直径２．５　ｃｍ　Ｘ長さ３５謂のカラム・を０．００
５Ｍ）　’Ｊ　−Ｘ　／　ＨＣＩ　（ｐＨ０，８）中テ
予メｌｌ５Ｊ　ｆｉｇ　サセタＤＦＡＫセファセル（フ
ァルマシア社製品）で充填し、そして５００　ｍ／！の
同一緩衝液を用いてｆＬＦ時６０ｍ１の流速で平衡させ
る。

同じ物偶を含有するヒドロキシルアパタイト画分２２０
　Ｉｆ？　ｆ　５０　ｍＡの０．０５１１リス／ＨＣ１
（ｐａ８．ｏ）に溶解しそして毎時６０−のカ１゛速で
このカラムに給送する。次にそのカラムｆ２ｔの容量に
対して０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムの直線濃度勾配を用
いて同一流速で溶出する（唱５図参照）。

いくつかのヒ′−りからなる主ピークが溶度勾配の略中
夫に現われる。これ′！１Ｉ−５画分に分離すれば（第
５図参Ｉ１１　）　、本発明の物り！ｊは主に画分４に
入る。常法により無機分除去および凍結乾燥を行なうこ
とによシこの両分から本発明の物質を７０■の収量で９
０チを超える純度をもって単離することができる。

実施例１１　（代嵌的な開裂） ０、１　Ｍ　Ｎメチルモルホリンアセテート緩衝液（ｐ
ａ　８．１　）中の基質のフルに度を１叩／ｍ／！とじ
酵素−基彌比を１／１００として酵素開裂を行なう。３
７℃でのインキュベーションをＴＰＣＫ処理トリツ′シ
ンを用いて２時間またはＴＬＣＫ処理α処理上トリプシ
ンを用いて７時間行なった。６Ｎ氷酢酸を用いてｐＨ，
２，５の酸性とした後、その溶液を迅速に８０ゼに加熱
した。２分後、その溶液を再び迅速に冷却しそして遠心
分離した。次に上澄液を凍結乾燥すると塩不含白色粉末
がイ１られた。

実施例１２　（Ｅ−ロゼツト試験） Ａｉｕｔｊ氏の方法［ｒｓｃａＨｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎ’ｏ１．Ｊ第６巻第５２１〜５３２頁（１９７４）俗
間〕により行なわれるこの試験において、リンパ球／赤
血球糸のロゼツト数は媒グｉ中寸たは謀贋＋物ａ中で２
時間インキュベーション（３７℃）した後に測定する。

計１曲ＶＣをまたっては、数えグこ２　Ｅｌ　ｎ　（ｌ
！１．Ｔの泊）１１１凌のうち、少なくとも１１同のリ
ンパ球と３１１・ｉの赤血球とよりなるもののみをロゼ
ツトとして；：ｒ価する。

その際、物ガをＪＴＩいおよび物乃ｆｌｌ＋いないで予
めインキュベーションし／ζ後の［Ｉセット数の割合す
なわち刺激指標Ｓ１が光ｆ；θ物ηによｐ訪２ツノされ
たヌル細胞から成熟Ｔ　ｘｌｌ　ｌ１ｅ（への分化の尺
ｍとなる。結果を次にかす。

２０　　　　　Ｂ’Ｈ＝、１．９　　　　８１＝　３．
１１０　　　　２．６ｉ ５　　　　２．０　　　　　　２．５ ２．５　　　　１．９　　　　　　　／１２５　　　１
．３　　　　　　２．７異なる生物学的活性を有する各
種ｄプチドの混合物としての画分Ｖはｉ、　２５　ｔｒ
　ｇ／／ｍｌの０度でロゼツト数を１７％かられずか２
２％に増加させるにすぎないが、リンパ球を１．２５μ
ｇ／ｒｎｉの本発明のＲプチドと共にインキュベーショ
ンするとロゼツト数は１８．５％から５０，５％に増加
する。

実施例１２ａ　（フイトヘムアクルチニン刺倣試験） 当該物質を細胞懸濁液中に種々の１６拳度で導入し〔１
００μｔのＲＰＭ工１６４０／クリツク（Ｃ１ｉｃｋ）
十ヘーベス（Ｈｅｐｅｓ）　２０　ｍＭ中に１０５１固
の細胞、ペニシリン、ストレプトマイシングルタミンお
よび熱によシ失活させた１０％ＡＢ血菌〕、約１μＣ１
／ウエルのトリチウム標識チミジン’ｉ　４　Ｂ　＋１
＃間後か７２時間後に冷加し、その混合物を８時間イン
キユヘートし、細胞をガラス繊維フィルター上で吸引濾
過しそしてそれらフィルターを後でシンチレーション液
に導入しそしてβ−引数器で割数する。

当該１１勿り！１ｖよ全項−５で時間にわ念つて存Ｙ１
．するので分η′トしたりまたけＪｒＩ］渭寸たＶユリ
ンパ球プロテアーゼにより変化したりするＴ５Ｊ’　（
ｉ＋−′性はわ１除できたい。結果は次表に示す。

２／ ７、／ ／″′ 次に添付図面における電気泳動像と関連して各場合の操
作条件を説明する。

まず限外ｐ過により得られた物質を０Ｍセルロースで分
画した。

０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）中の１０Ｘ４３
ｃｒｎサーバセルＣＭ３２使用 流速：毎時５００ｍ／ 導入される量＝　３０２ １１後：緩衝液交換（今度は０．１Ｍ酢酸ナトリウム、
１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ５，５）ポリアクリルアミド
ゲルでの塩基性電気泳動像は第１図のとおりである。

収量　画分１：１７．５ｆ 画分１１：１１．４Ｍ 上記で得られた画分■をＤＢＩＣ−セルロースで分画し
た。操作条件は次のとおりである。

０．０５Ｍ）リス／ｕｏＪ（ｐＨａ５）中（７）１０Ｘ
６ＺｍＤ刊ｊｌ−セファセル使用 流速：何時５５０　ｙｌ ５６１の容１＾に対し０〜ＩＭＩＬＭ化ナトリウムの濃
度勾配 導入された量：１７．５ｙ ポリアクリルアミドゲルでの塩基ｔＸｔ気泳１１ｉｂ像
を第２図に示す。

収量　画分１ニア２２ｍ９ 両分ＩＩ　：　　１，１５８＋１’＋７ＤＥＪＩ−セル
ロースから得られた画分をヒドロキシルアパタイトで精
製した。この場合の操作条件は次のとおりでおる。

０．０１Ｍｇ！＃酸ナトリウム（ｐＨ６，８）中の２．
６　Ｘ　２５ｃｎＩヒドロキシルアパタイト使用 流速：毎時８０　ｍｌ １．３１の容量に対して０．０１〜０．４０Ｍ隣酸塩酸
塩Ｈ６，８）の濃度勾配 心入される量”、４００ｍ９ ポリアクリルアミドゲルでの塩基性１１Ｌ気泳動像を第
３図に示す。

収量　画分１　：　２９［］ｌｎ９ 画分１１：４０〃！！；’ 両分ｍ：ｑｍｇ ＤＢ！ＡＩ−セルロースから得られた両分を次の条件の
ゲル透過クロマトグラフィーにかけた。

０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８，０）中ノ１．
６Ｘ１２０ｚウルトラゲルＡ（３Ａ　５４使用流速：毎
時３０ｍ／ 上に導入される（ｒ＜　：　２　ｑ　ｏ　ｔｒｔｇポリ
アクリルアミドゲルでの塩基件′亀気泳すｊｂ像を第４
図に示す。

収量　画分Ｉ：２１ｆｆｐ 画分Ｕニア２ｍｙ 画分ｍ：１２Ｂｍ９ ヒドロキシルアパタイトから得られた画分■をＤＫＡＰ
Ｉ−セルロースで再度のクロマトグラフィーにかけた。

０．０５Ｍ）リス／　ｒｌｃＪｌ　（ｐＨ８，０）中の
２．５Ｘ３０ｒｎ１ＤＰＩＩＡＫ−セファセル使用 流速：毎時６０ｍ１ ２１の容量に対し０〜０．３Ｍ塩化す）　ＩＪウムのｉ
Ｑ度勾配 導入された量：２２０１１１１ｉ＋ ポリアクリルアミドゲルでの塩基性？ｌ、気泳１山像を
員（５図に示す。

収量　画分１：２８ｎＴｙ 画分１：５３＃！９ 画分ｍ：４２ｍ９ 画分Ｗニア０ｍ９ 画分Ｖ：　　１２ｍ９

【図面の簡単な説明】

第１〜５図は本発明において得られる生成・吻を種々の
方法で処理した場合におけるぞれそ′れポリアクリルア
ミドゲルでの塩基性電気泳！１：ｂ像を示す模式図であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）３，４８０の分子仰・、２０５〜２１０ｎｍに４１
   ・１（大を持ツＵＶ吸収、３．９５±０．１５の匍’　
   ＩＵ点、および次のアミノラン組成ずなわち４アスパラ
   ギンを技単位、５スレオニン単位、３セリン却１位、６
   グルタミン酸即位、１グリシン単位、４アラニン単位、
   ３バリン単位、１イソロイシン単位、１０イシン単位、
   ５リジン即位訃よび１アルギニン単位を有し、眉合によ
   りそのＮ末端が１〜６個の炭ふｊ皇子を有するアシル基
   またはアシル基に１〜６個の炭拓原子を南する゛　　ア
   シルグリシル基を有することを特徴とする免役系に対す
   る作用を有するポリペプチド、そのにプチド開裂生成物
   および／または＆１≦理学的に許容し得る塩。 ２）９０％以上の純度を有する特許請求の範囲第１項に
   記載のポリにプチド。 ３）ポリペプチドを胸腺から沈殿法、膜沖過およびクロ
   マトグラフィーの組合せを用いて単離し、所望によシ得
   られたペプチドを化学的または酵Ｉ的経路によって断片
   に開裂し、所望により得られたペプチドをそれ自体既知
   の方法によシそのＮ−アシルまたはト丁−アシルグリシ
   ル誘導体に変え、そして所望によシ生酸物を塩に変える
   ことよシなる、特許請求の範囲第１項）たけ第２項に記
   載の精製ポリはプチドの単離方法。 ４）胸腺を５．０〜９０のｐＨ範囲において緩衝作用を
   有する無機塩の水性溶液で抽出し、不溶性物質を分離し
   、そして得られる抽出液からポリペプチドをそれ自体既
   知の分離法により単陪する、特許請求の範囲第３小に記
   載の方法。 ５）クロマトグラフィ一段１ｆ：１が陽イオンおよび／
   ま／ζは１ζ・イオン交換クロマトグラフ−ｆ　−１非
   ！侍冗的吸着体でのクロマトグラフィー、分配クロマト
   グラフィー壕だｉＪこれら方法の二つまたはそれ以上の
   組合せよりなる、４′ｆｈ”Ｉ請求の範囲第３項に記載
   の方７ゾー。 ６）熱変性に付さハ１、特九′１１田京の範囲３ＩＡ１
   項に記載のペプチドを溶ｌｔｂ状ｊ、ｌｊ４　ｔ、乙Ｊ
   １１とする一方他の蛋白質は沈降またｉ」：　濾過によ
   り分離できる抽出液を特許請求の範囲第５ｉＫ記載のク
   ロマトグラフィーに用いる特許請求の範囲第３項に記載
   の方法。 ７）水混和性有機溶媒の添加による特許請求の範囲第４
   項才たけ第６■ｊに記載の抽出ｔし、の処汀において、
   沈殿として分離される１側をクロマトグラフィーに用い
   る、特許ａ１１求の範囲第５項に記載の方法。 ８）水溶性無機および／または有機塩の添加たよる分別
   沈殿に付され、ペプチドを使用塩ね度に依存するある濃
   度範囲において沈殿させそして沈降法により濃縮させた
   抽出液をクロマトグラフィーに用いる、酸゛Ｂ′ト請求
   の範囲第５項に記載の方法。 ９）膜濾過および／またはゲ゛ル濾過による分画の結果
   としてなおも１０，０００ダルトン以下の分子量を有す
   るにプチドのみを含有する抽出液をクロマトグラフィー
   に用いる、特許請求の範囲第５項に記載の方法。 １０）特許請求の範囲第６項ないし第９〕の任意の項に
   記載の二つまたはそれ以上の方法の組合せから得られた
   抽出液をクロマトクラフィーに用いる、特許請求の範囲
   第５項に記載の方法。 １１）特許請求の範囲第１項または第２項に記載のはプ
   チドおよび／′またｔ６１化字的゛ｆた＆ｊ　ｉｆ身１
   −的経路によシ碧ぶ１１さノ１．る（のＩＪＥｉ　’；
   ’７生ＩＬシｑ［・１の、免ＩＩ＆　、！！を調整また
   は刺７Ｉｉ’（するための治療捷たは予防剤としての使
   用１゜ １２）イｊ効方１の特許請求の範囲治り１小首た）」゛
   第２項に記載のはプチドおよび／甘たけ少なくとも一つ
   のその断片を遊ｈ１′１の形笠たＵ′梨稈学的に許存し
   伯Ｉる塩の形で含有する、免役系を刺激または調整する
   ための医薬。 ７１３）等張化剤および所望により保存剤を含有する、
   遊ｎ１１の形または薬理学的ｉｃ：　ｒｒ答し得る塩の
   形の特許請求の範囲第１びＪまたは第２項に記載のｆｌ
   Ｑ製ポリはプチドおよび／甘たけ少ガくとも一つのその
   断片の水１（Ｉ：餞【’ｃ１沿ｒ１’ｉ　０１４）医薬
   として用いるための、Ｊ＋に’ｒ　ｉ−？Ｊ求の範囲第
   １項せたは第２項に記載のペプチド。