JPH01232974A - ＩｇＥ吸着装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 練１ｆ（７肩上１分μｍ 本発明は、イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）吸着装置なら
びに該装置を組み込んでなるＩｇＥ除去装置に関する。

従来の技術 ＩｇＥはアレルギー性鼻炎、アトピー性気管支喘息、各
種レアギン型（■型）過敏症の原因として考えられてい
る。特定のアレルゲンに対するＩｇＥの持続的産生はい
わゆる■型アレルギーの特徴的な所見であるが、肥満細
胞や好塩基球の細胞表面にあるリセプターとＩｇＥ分子
のＦｃ部分とが結合し、これにアレルゲンの再侵入があ
り、ＩｇＥ分子のＦａｂ部分と結合するとりセブターの
凝集反応が進み、該細胞は種々の化学伝達物質を遊離し
て多様な組織障害を引き起こすと考えられている。

そこでアレルギー性症例の血中ＩｇＥを特異的に除去す
ることにより上記反応を阻止、防止することが可能とな
り、アレルギーの治療に対して有効な手段になり得る。

従来の技術としては、例えば抗ヒトＩｇＥ抗体を不溶性
担体に結合させてなる［ｇＥ吸着剤（特開昭５９−１５
１９６４号公報）や疎水性アミノ酸を不溶性担体に結合
させてなるＩｇＥ吸着剤（特開昭６２−１５５８６０号
公報）があり、また抗体固定カラムと、同カラムからリ
ークする抗体を選択的に捕捉しうる物質を固定したカラ
ムとからなる血液および体液物質の除去装置（特開昭５
８−９７３６６号公報）などがある。

発明が解決しようとする課題 トリプトファンやフェニルアラニンのような疎水性アミ
ノ酸を不溶性担体に結合した吸着剤は疎水性アミノ酸と
病因物質との疎水的相互作用を利用した吸着であるため
、特異性に乏しい。また、ＩｇＥとの抗原抗体反応を利
用した抗ヒトＩｇＥ抗体に比べてＩｇＥとの親和性１吸
着能力は非常に小さいので大量の吸着剤が必要となり実
用性に乏しい。これに対し、抗ヒ）ＩｇＥ抗体を不溶性
担体に結合した吸着剤はＩｇＥの吸着能力ら大きく、形
状もコンパクトなものが実用に供せられつつあるが、こ
れらＩｇＥ吸着剤が対象としている疾患はＩｇＥ抗体依
存性過敏症と考えられているアレルギー性鼻炎やアトピ
ー性気管支喘息などのアナフィラキシ−型過敏症である
ため、通常の抗体結合吸着剤からの微量なリーク抗体に
よる異種タンパクとしての抗原性の問題とは比較になら
ないような超微量な抗ヒトＩｇＥ抗体のリークがアナフ
ィラキシ−シタツクをも含めた急性のアレルギー反応を
惹起する危険性があることが判明した。

−船釣な悪性因子除去用抗体結合カラムからリークした
抗体を血液もしくは体液由来の物質、又は生体にとって
きわめて副作用の少ない生体外物質を結合した吸着剤に
より捕捉するという方法が特開昭５８−９７３６６号公
報に開示されているが、ここで問題としている点はリー
ク抗体がいわゆる異種動物由来であるが故に患者体内に
侵入した場合、アレルギー反応、腎炎等の悪影響が出る
ということである。このリーク抗体を捕捉する物質とし
て生体より取り出した悪性因子を硫安分画。

イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、電気泳動等
で部分的に、又は完全に精製したものを用いている。し
かしながら、該公報に示されている方法は、上記目的の
ためであり、除去率はせいぜい８３．３％であってアナ
フィラキシ−型過敏症患者を対象とするＩｇＥ吸着剤の
場合のように、抗体のリークを５ｎｇ／ｌｎ１．以下の
量に抑えなければならないというシステムに対しては、
捕捉用吸着剤を作製するための操作の繁雑さや量的確保
の点などから実用性に乏しいという欠点がある。

課題を解決するための手段 上記諸問題について種々検討を重ねた結果、抗ヒトＩｇ
Ｅ抗体を共有結合法により非圧縮性の不溶性担体を結合
させて十分に洗浄したＩｇＥ吸着剤と、該吸着剤から微
量にリークする抗ヒトＩｇＥ抗体を効率よく吸着除去す
るためのヒトＩｇＥ産生細胞由来のＩｇＥを共有結合法
により非圧縮性の不溶性担体に結合させて十分に洗浄し
た抗ヒト■ｇＥ抗体吸着剤とを直列に組み合わせること
により血中からヒトＩｇＥを特異的に効率よく安全に吸
着除去できることを見い出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は抗ヒトＩｇＥ抗体を不溶性担体に結
合させた吸着剤とその下流にヒト［ｇＥを不溶性担体に
結合させた吸着剤とを直列に組合せたヒトＩｇＥ吸着装
置、および該吸着装置を体外循環型システムに組み込ん
でなる血液または血漿のヒトＩｇＥ除去装置を提供する
ものである。

本発明で用いられる抗ヒトＩｇＥ抗体としてはヒトＩｇ
Ｅを異種動物、例えばウサギ、ヤギ、ウマなどに免疫し
て抗血清を得て、それを公知の抗体精製方法、例えば硫
安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィクロマトグラフィー等で精製して得られるポリクロー
ナル抗ヒトＩｇＥ抗体あるいは細胞融合技術を利用して
得られるモノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体などが挙げら
れる。特にアフィニティ精製抗体とすることで、単位抗
体タンパク量あたりの活性が高まり、高性能化、小型化
、しいては低リーク特性につながる。

また、抗ヒトＩｇＥ抗体の吸着除去用に用いられるヒト
ＩｇＥは、ヒトＩｇＥ産生細胞を大量培養して得られた
ヒトＩｇＥで、前記抗ヒトＩｇＥ抗体の免疫原として用
いたヒトＩｇＦと同じものが挙げられる。

本発明の抗ヒトＩｇＥ抗体およびヒトＩｇＥを結合させ
る不溶性担体としては、水に不溶で平均孔径が１００Å
以上、あるいはタンパク質に対する平均排除限界分子量
がｌＸｌ０’以上であるような多孔性のものが好ましく
、さらに吸着効率等を検討した結果から平均孔径が４０
０Å以上あることが好ましい。また粘性のある血漿等に
対して良好な流動特性（高流量、低圧損等）を得るため
には圧縮性のあるデキストランやアガロース等の担体よ
りら、多孔性ガラスピーズ、セルロースビーズ等の非圧
縮性の粒子状担体が好ましく、さらに抗体タンパクの固
定化効率や担体からのリーク等を検討した結果から多孔
性ガラスピーズが最も好ましい。抗ヒ）ＩｇＥ抗体やＩ
ｇＥを上記不溶性担体に結合させる方法としては共有結
合法、イオン結合法、包理法等の公知の手段を用いるこ
とができるが、担体からのリーク等の点から共有結合法
がより好ましい方法である。

前記多孔性ガラスピーズへの共有結合法としては、ガラ
スピーズにアミノプロピル基、長鎖アミノアルキル基、
ｐ−アミノアリル基、カルボキシル基、グリセリル基等
を導入し、水溶性カルボジイミド類試薬やグルタルアル
デヒド等で活性化したのち抗体タンパク等を共有結合さ
せる方法等が知られており、いずれの方法を用いてもよ
い。

多孔性ガラスピーズｃｐｃ−１０（ヌクレオエレクトロ
ニック社製）に抗ヒトＩｇＥ抗体を上述した方法により
高濃度に共有結合させしかも高い■ｇＥ吸着能を有する
ための条件検討を行ったところ、平均孔径として４００
Å以上あるＣＰＧ−１０が良好であることが判明し、さ
らに好ましくは５００〜１０００人の平均孔径がよい。

このようなＣＰＧ−１０１ｇ（乾燥重量）には約３０〜
８０ｍｇもの抗ヒト■ｇＥ抗体を結合させることが可能
となり、非常にＩｇＦ吸着能のすぐれたコンパクトな抗
ヒＩ−１ｇＥ抗体結合不溶性担体充填容器（ＩｇＥ吸着
剤カラム）の製品化が可能となる。

このＩｇＥ吸着剤カラムを用いて高１ｇＥ患者の血中１
８Ｅ濃度を１０，０ＯＯＵ／−から３，０００Ｕ／ｄに
まで低減させる場合的１０ｇのＩｇＥ吸着剤（抗ヒトＩ
ｇＥ抗体含量４０　ｍｇ／ｇ　−ＣＰ　Ｇの場合）を充
填するだけでよく、その充填容量はわずかに３０−であ
る。　このカラムからリークしてくる微量の抗ヒトＩｇ
Ｅｔｉ’ｉ、体を吸着除去するためのＩｇＥ結合不溶性
担体充填容器（抗ヒトＩｇＥ抗体吸着カラム）にはＩｇ
Ｅ吸着剤カラムに結合している抗ヒトＩｇＥ抗体の０．
０２％以下の１を吸着するだけのヒト■ｇＥを結合させ
るだけでよく、上記患者における吸着例の場合２０〜３
０ｍｇのヒト１８Ｅを含んだ吸着剤カラムを直列に組み
合わせればよい。

すなわち、抗ヒトＩｇＥ抗体結合不溶性担体の下流に分
離層を介してヒトＩｇＥ結合不溶性担体を充填した一つ
の容器として使用してもよく、また上記それぞれの担体
を別個の容器に充填して組合せて使用してもよい。

これらのＩｇＥ吸着装置は通常滅菌が必要である。滅菌
方法としてガス滅菌、放射線滅菌、加熱滅菌、薬剤滅菌
等が挙げられる。しかし、ガス滅菌。

薬剤滅菌等では残留ガスや残留薬剤の問題があり、放射
線滅菌や加熱滅菌では適用材質の制約や変性の問題があ
るため、抗体タンパク等を結合させた免疫吸着剤にこれ
らの方法を適用するには安全性や毒性の而で十分な配慮
が必要である。

このような免疫吸着剤を効率良く滅菌する方法として特
開昭６１−９０６７３号公報で開示されたプロピレンオ
キサイド水溶液による滅菌法があるがやや滅菌に要する
時間が長すぎるなど改良の余地が残されている。

また、滅菌後の製品形態として乾燥状態の免疫吸着剤が
製品重量の軽減や流通過程でのハンドリング面、また保
管中における微生物の再汚染の危険が少ないという面で
すぐれていることを考えあわせてエチレンオキサイド（
ＥＯ）ガスによる滅菌方法についてさらに研究した結果
、次のような方３５℃、相対湿度（ＲＨ）４０〜６０％
、ガス濃度２０％の　ＥＯガスを前記カラム内部に強制
的に流通させながら滅菌を行い、滅菌終了後十分量の無
菌空気を該カラムに内部に強制的に流通させることによ
り残留ＥＯガスを大巾に低減でき、しかも吸着活性の低
下を最小限にとどめることができる滅菌方法を見い出し
た。

本発明のヒトＩｇＥ吸着装置は通常体外循環型システム
に組み込んで使用する。すなわち、人体から血液ポンプ
を用いて取り出された流量２０〜１００ｎｅ／ｓｉｎの
血液を血漿分離器により血球成分と血漿成分とに分離し
、該血漿を特異的吸着装置に導入するようになっている
装置が一般的である。

本発明の血中１ｇＥの体外循環型特異的吸着装置を用い
て血液中からＩｇＥを効率よく安全に除去するためには
、血漿分離器により分離された血漿を５〜４０ａＪ／ｍ
ｉｎの流量で抗ヒトＩｇＥ抗体を結合した吸着剤を充填
したＩｇＥ吸着カラムに通し、血液中の［ｇＥを抗ヒト
ＩｇＥ抗体と反応させて吸着除去したのち、該ＩｇＥ吸
着カラムと直列に組合わせた抗ＩｇＥ抗体吸着カラム（
ヒトＩｇＥを結合した吸着剤を充填）に通して該ＩｇＥ
吸着カラムから微量にリークする抗ヒトＩｇＢ抗体をＩ
ｇＥと反応させて吸着除去する。このようにして処理さ
れた血漿は血漿分離器からの血球成分と合流させて人体
に戻す。

本発明の抗ヒト■ｇＥ抗体結合吸着剤とヒトＩｇＥ結合
吸着剤とを組み合わせたＩｇＥ吸着装置は血液中の［ｇ
Ｅを特異的に効率よく安全に吸着除去することができ、
ＩｇＥ抗体依存性過敏症と考えられているアレルギー性
鼻炎やアトピー性気管支喘息などの治療に対して有力な
手段となりうる。

作用および実施例 以下に参考例及び実施例を挙げて本発明を具体的に説明
する。

参考例１ ヒトＩｇＦ産生ミエローマを細胞培養法により大量培養
して得られたＩｇＥを含んだ培養上清液をろ退役、硫安
塩析法によりγグロブリンを分取した。さらに得られた
γグロブリンを抗ヒトＩｇＥ抗体を結合したカラムに通
じ０．２Ｍ酢酸（０，１５Ｍ　ＮａＣ１含有）で溶出し
て、溶出物を捕集、透析、濃縮してヒトＩｇＦ溶液を得
た。

参考例２ 参考例１の方法で得られたヒトＩｇＥを抗原とし、これ
を１回に１ｍｇをフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ
）と−緒にヤギの皮下に投与する免疫操作を２週ごとに
計５回行い抗血清を得た。この抗血清から硫安塩析法に
よりγグロブリンを分取し、さらにＤＥＡＥセルロース
イオン交換体を結合したカラムに通し、カラムからの溶
出物を捕集、透析、濃縮してヤギＩｇＧ分画を得た。こ
のヤギＩｇＧ分画を前記ヒトＩｇＥを結合したカラムに
通してアフィニティ精製して抗ヒトＩｇＥ抗体溶液を得
た。

実施例１ （イ）Ｒ親方法 血中１ｇＥを吸着除去するためのＩｇＥ吸着剤としては
多孔性ガラスピーズＣＰＧ−１０−５００人（ヌクレオ
エレクトロニック社製）を１０％γ−アミノブロピルト
リエトキシシラン溶液中で８０℃２時間反応させてアミ
ノプロピル化したのち２．５％グルタルアルデヒド溶液
中で室温１時間反応させた。

Ｌ＃＄ＪＪｚ−ｒ″゛°°″“°“′°“°°”ハｂｎ
、ｔｍ九１トρｐＣじ加テ零息ア９時闇ｉ広六せたのち
、得られたシッフ塩基生成物に対し夏％水素化ホウ素ナ
トリウム溶液で還元した。さらにそれぞれＩＭ　ＮａＣ
１を含んだｐＨ４の酢酸バッファとｐＨ８のホウ酸バッ
ファを用いて交互に３回洗浄を行い遊離、溶出する抗ヒ
トＩｇＥ抗体を十分に除いた。このようにしてＣＰＧ　
　Ｉｇ当り抗ヒトＩｇＥ抗体４０ｍｇが結合したＩｇＥ
吸着剤を得た。

参考例！で得られたヒトＩｇＥを上述した方法と全く同
じ操作によりＣＰＧ　　Ｉｇ当り２．６ｍｇを結合させ
た抗ヒトＩｇＦ吸着剤を得た。

（ロ）吸着実験１ 上述した方法で作製したＩｇＥ吸着剤０．３ｇを内径０
　、５　ｃｍ充填高さ３　、５　ｃｍのミニカラムに充
填してヒトＩｇＥ　　１０，０ＯＯＵ／−を含んだウシ
プラズマ溶液８０７ＩＩＩ２を０．６７／ｍｉｎで２時
間循環処理したところ３０００　Ｕ／ｄにまで低減させ
ることができた。この実験は臨床使用でＩＯｇの吸着剤
カラムに２０ｍ／ｍｉｎで２時間吸着処理を行う場合を
想定したものである。

（ハ）吸着実験２ 吸着実験ｌの場合、ＩｇＥ吸着剤カラムからリークして
くる抗ヒトＩｇＥ抗体は約２０ｎｇ／Ｍｌであり、２時
間の循環処理でのリーク量は４８μｇとなりＩｇＥ吸着
剤カラムに結合した抗ヒトＩｇＥ抗体量の約０．０１２
％であった。この抗ヒトＩｇＥ抗体を（イ）の方法で作
製した抗ヒトＩｇＥ抗体吸着剤で処理したところ２ｎｇ
／＋＋Ｊ以下、すなわち９０％以上の吸着除去が達成で
きた。

実施例２ 健常人の右腕静脈より血液ポンプを用い血液を約３０旙
／ｍｉｎで抜き出し、クラレ（株）製膜型血漿分離器プ
ラズマ・キュアに導入し、血漿ポンプを用い、ろ過血漿
を約９ｍ１２／ｎ＋ｉｎの流量で得た。

該血漿を実施例１の（イ）で調製し、ＥＯガス滅菌（温
度３０℃、ＲＨ５０％、ガス濃度２０％）を行ったＩｇ
Ｅ吸着剤１０ｇに、次いで同じく抗ヒトＩｇＥ抗体吸着
剤１０ｇにオン・ラインで流した。抗ヒトＩｇＥ抗体吸
着剤より出た血漿は模型血漿分離器より出た血液と合流
し、左腕静脈に返血された（約１時間３０分連続施行し
た）。血漿中のｒｇＥ濃度の時間的変化は次のとおりで
あった。

第１表 開始時１ｇＥ濃度　４５０　Ｕ／威 ＩｇＥ濃度（Ｕ／成） 時間（分）ＩｇＥ吸着剤入口側　　ＩｇＥ吸着剤出口側
３０　　　　　３９０　　　　　　　　検出せず６０　
　　　　３５０　　　　　　　　検出せず９０　　　　
　２９５　　　　　　　　検出せずまた血漿中にリーク
した抗ヒトＩｇＥ抗体の濃度の時間的変化および抗ヒト
ＩｇＥ抗体吸着削出吸着剤人口側　　　吸着剤出口側 ３０　　　　　４３　　　　　　　　２．４６０　　　
　　２８　　　　　　　　２．９９０２４２．２ 発明の効果 本発明のヒトＩｇＥ吸着装置は、ヒトＩｇＥを効果的に
除去し、抗ヒトＩｇＥ抗体のリークも極めて少なく、ア
レルギー疾患の治療などに有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のヒト１呂Ｅ除去装置の一例を示す概
念図であり、第２図はヒトＩｇＥ吸着装置の組合せの例
を示す。各図中Ａは抗ヒトｔｇＥ抗体結合吸着剤を、Ｂ
はヒトＩｇＥ結合吸着剤を示す。 特許出願人　　　　　工業技術院長　　飯塚幸−第１図 第２図 ↓

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗ヒトＩｇＥ抗体を不溶性担体に結合させた吸着
   剤とその下流にヒトＩｇＥを不溶性担体に結合させた吸
   着剤とを直列に組合せたヒトＩｇＥ吸着装置。
2. （２）請求項（１）記載の吸着装置を体外循環型システ
   ムに組み込んでなる血液または血漿のヒトＩｇＥ除去装
   置。