JPH01237452A - 染色液組成物、その製造法及びそれを用いるプレパラートの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規な染色液組成物、その製造法及びそれを
用いるプレパラートの製造法に関する。

従来の技術及びその課題 プレパラートは、光学顕微鏡等により微細構造を観察す
るために標本をスライドガラス上に固定したものである
。例えば、病理組織標本等の検鏡用プレパラートは、通
常法のようにして製造されている。即ち、検査すべき組
織をホルマリン固定する→アルコール次いでキシレンに
て脱水する→パラフィン包埋する→ミクロトームで組織
切片を調製する→該切片をスライドガラスに載せ伸展す
る→キシ−２次いでアルコールにて脱パラフィンする→
各種の染色をする→アルコールにて脱水する→キシレン
に浸漬して透徹する→必要に応じてレジンコーテイング
後封入する、という工程により製造されている。

上記工程の内、染色は、従来へマドキシリン−エオシン
、ＲＡＳ　（過ヨウ素酸シッフ）、トルイジンブルー、
アルシアンブルー等の染色液を用いて行なわれているが
、２等従来使用の染色液では同時には殆んど或いは全く
染色できない組織例えばシアロムチン、メラニン等があ
り、染色液の染色性の改善が病理組織検査等においての
重要な課題とされている。

一方、生体成分等に対する優れた染色性を有する染料と
して、下記式で表わされる１−エチル−２−（３−（１
−エチルナフト（１，２−ｄ）チアゾリン−２−イリデ
ン）−２−メチルプロペニル）−ナフト（１，２−ｄ）
チアゾリウム　ブロマイド（慣用名：ステインズーオー
ル（ＳｔａｉｎＳ−八ｌｌ）、以下ステインズーオール
という）が知られティる（Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、、４
１，１３９（１９６９）、ＪＨｉ　ｓｔｏｃｈｅｍ、　
Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　、　２２．７６７（１９７４）　
）。

即ち、上記式のステインズーオールは、核酸、蛋白、複
合蛋白類等の染色性に優れ、例えば蛋白を赤色、リン蛋
白を青色、核酸を紫色、ムコ蛋白及びムコ多糖類等を種
々の色に染色することが知られており（Ｊ、　Ｈｉ　ｓ
ｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　、　２２．７６
７（１９７４））　、病理組織等の組織用の染料として
期待されている。

しかしながら、従来、ステインズーオールをプレパラ−
１〜上の標本の染色に使用する試みとして、ボルムアミ
ド、エチレングリコール等に溶解して使用することがな
されているが（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

１０、５９８５（１９８５）等）、その溶解度はせいぜ
い０．５重量％迄であり、そのため充分な濃度の染色が
できないという欠点があった。また、之等の溶媒を用い
た場合、染色物の光による退色が著しく例えば日光に曝
露した場合僅か数分程度で完全に退色してしまい保存性
が極めて悪いという欠点があった。更に、染色した標本
は、染色濃度が薄いのみならず透徹工程で常法どおりキ
シレンを用いるとステインズーオールが溶出して染色濃
度が更に薄くなり殆んど消えてしまうという欠点があっ
た。

以上の様に、上記種々の欠点のためステインズーオール
をプレパラート用染色液として用いることは、実際上で
きないのが、現状であった。

課題を解決するための手段 本発明者は、上記現状に鑑み、ステインズーオールのプ
レパラート用染色液としての種々の欠点を解消するべく
鋭意研究した。その結果、スティンズーオールを特定の
混合溶媒に溶解するときにはプレパラート用染色液とし
て充分な濃度の染色液とできること、該染色液は特定の
方法により好適に製造できること、該染色液を用いれば
標本を充分な濃度に染色できしかも意外なことに光によ
る退色が殆んどなく保存性が良いこと、透徹工程でキシ
レンに代えて特定の混合溶媒を用いるとステインズーオ
ールの溶出が殆んどないこと等を見い出し、本発明を完
成するに至った。

即ち本発明は、ニトロパラフィン及び低級アルコールの
混合溶媒に、スティンズーオールを溶解してなる染色液
組成物、 ステインズーオールを二１〜ロバラフインに懸濁し、次
いで低級アルコールを添加して溶解することを特徴とす
る上記染色液組成物の製造法、並びにプレパラートを製
造するに当り、染色に上記染色液組成物を用い、且つ透
徹にｐ−シメンとシクロヘキサンの混合溶媒を用いるこ
とを特徴とするプレパラートの製造法に係る。

本発明染色液組成物は、ニトロパラフィン及び低級アル
コールの混合溶媒に、ステインズーオールを溶解してな
るものである。

ここで、ニトロパラフィンとしては、例えばニトロメタ
ン、ニトロエタン、１−ニトロプロパン、２−ニトロプ
ロパン、１−ニトロブタン、２−二トロブタン等を挙げ
ることができ、之等の少なくとも一種を用いる。之等の
内、低級アルコールとの混合溶媒としてのステインズー
オールに対する溶解性が高い点から、ニトロメタン及び
ニトロエタンが好ましい。また、低級アルコールとして
は、例えばメタノール、エタノール、ｎ−ブタノール、
イソブタノール、ｎ−プロパツール、イソプロパツール
等を挙げることができ、之等の少なくとも一種を用いる
。之等の内、メタノール又はエタノールを用いるのが好
適である。

また、使用するニトロパラフィンと低級アルコールとの
比率は、容量比で前者：後者が通常３ニア乃至６：４程
度好ましくは４：６乃至５：５程度とするのが良い。

また、本発明染色液組成物のステインズーオールの濃度
としては、通常２重量％程度迄のプレパラート用染色液
として充分な濃度とすることができる。ステインズーオ
ールは、ニトロパラフィン又は低級アルコールの単独の
場合には殆んど溶解しないのに対して、之等の混合溶媒
には上記の如き高′ａ麿に溶解するのであり、かかる事
実は本発明者により始めて見出されたことである。

本発明染色液組成物は、ステインズーオールをニトロパ
ラフィンに懸濁し、次いで低級アルコールを添加して溶
解することにより、好適に調製することができる。これ
は、ニトロパラフィンで前処理しておくと、元来低級ア
ルコールに微溶であったステインズーオールが、ニトロ
パラフィンと低級アルコールとによる溶媒和効果により
易溶となるためと推定される。より具体的には、先ず所
定量のステインズーオールをニトロパラフィンに懸濁し
、特に制限はないが、通常１０分〜２４時間程度、好ま
しくは１５分〜２時間程度混合撹拌し、次いで低級アル
コールを加え、特に制限はないが、通常１０分〜２４時
間程度、好ましくは１５分〜３時間程度撹拌することに
より、２重量％程度迄の所望の濃度の本発明染色液組成
物を調製することができる。

斯くして得られる本発明染色液組成物は、プレパラート
用染色液として充分な濃度を有していること等により標
本を充分な濃度に染色できしかも意外なことに光による
退色が殆んどなく、例えば後記実施例にも示されるよう
に、本発明組成物を用いて得たプレパラートは充分な保
存安定性を有している。これは、ニトロパラフィンが何
らかの光退色防止作用等を有しているためと推定される
。

また、本発明染色液組成物は、それ自体としても保存安
定性に優れている。例えば、後記実施例２に示される様
にスティング−オール２重量％のものを褐色瓶中で保存
した場合５ケ月放置しても濃度変化は全くない。

本発明染色液組成物を用いてプレパラートを製造する場
合、染色液として当該組成物を用いることを除いて前記
従来の製造工程と同様に行なうことができる。

従って、本発明染色液組成物を用いればプレパラート上
の標本を充分な濃度に染色できるので、透徹にキシレン
を用いることも染色濃度が薄くなるものの可能である。

しかし、本発明染色液組成物を用いて標本を染色した場
合には、透徹工程でキシレンに代えてｐ−シメンとシク
ロヘキサンの混合溶媒を用いることが好ましい。これに
より、染色濃度が薄くならずしかも充分に透徹ができる
。

該混合溶剤は、今まで透徹剤として用いられたことがな
く、本発明者が始めて見出したものである。

ｐ−シメンとシクロヘキサンとの混合比率は、容量比で
前者：後者が通常３ニア乃至７：３程度好ましくは揮発
性を考慮して４：６乃至５：５程度とするのが良い。

また、本発明染色液組成物を用いて標本を染色した場合
、プレパラートの封入工程において、バルサム等の従来
公知の封入剤を何れも使用できるが、本発明者が先に開
発に成功し、特願昭６１−２４０６６６号として出願し
た封入剤を用いることが好ましい。

即ち、一般式 ［式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基を示ず。

Ｒ２及びＲ３は同−若しくは異なって低級アルキル基を
示すか、又は一方が低級アルキル基で他方が−ＣＨ２Ｃ
Ｒ’基若しくは −ＣＨ２ＣＨ２Ｃ−Ｒ’基を示す。ここで、Ｒ４はメチ
ル基又はフェニル基を示す。］で表わされる１、３−ジ
オキソラン誘導体を有効成分とする光硬化型のプレパラ
ート用封入剤を用いるときには、スライドガラス上の標
本上に該封入剤を載せ嫌気状態下に光照射するのみで、
簡易且つ迅速に耐光性、保存性に優れたプレパラートを
製造できる。

上記一般式（Ｉ）の１．３−ジオキソラン誘導体の好ま
しい具体例としては、例えばく２−メチル−２−アセト
ニル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチルアクリ
レート、〈２−メチル−２−アセトニル−１，３−ジオ
キソラン−４−イル）メチルメタクリレート、（２−メ
チル−２−（β−アセチルエチル）−１，３−ジオキソ
ラン−４−イル）メチルアクリレート、（２−メヂルー
２−（β−アセチルエチル）−１，３−ジオキソラン−
４−イル）メチルメタクリレート、（２−メチル−２−
ベンゾイルメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）
メチルアクリレート、（２−メチル−２−ベンゾイルメ
チル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチルメタク
リレート等を挙げることができる。また、上記プレパラ
ート用封入剤においては、例えば１−ヒドロキシシクロ
へキシルフェニルケトン、ペンチルジメチルケタール、
ベンゾインイソブチルエーテル、ベンゾインエチルエー
テル、２，２−ジェトキシアセトノエノン、ベンゾイン
イソプロピルエーテル、ベンゾフェノン等の芳香族ケト
ン系化合物等の光重合開始剤を上記１，３−ジオキソラ
ン誘導体１００重量部に対して通常０．００５〜２重量
部程度添加することが望ましい。

本発明染色液組成物を用いてプレパラートを製造する場
合の標本としては、特に限定はされないが、例えばヒト
の病理又は正常組織標本、細胞診標本、動植物の病理又
は正常組織標本、微生物標本等を挙げることができる。

発明の効果 本発明によれば、従来プレパラート用染色液として実際
上実用できなかったステインズーオールを染料とする染
色液組成物、その製造法及びそれを用いるプレパラート
の好適な製造法が始めて提供されるという顕著な効果が
奏される。

本発明染色液組成物を用いることにより、プレパラート
において従来得られなかった染色性を得ることができる
。例えば、ヒト等の動物病理組織標本の場合、光学顕微
鏡で観察するとシアロムチンは青色に染色される。また
、メラニン顆粒は紫色に染色されるものや青黒く染色さ
れるものや染色されないものに分れる。また、マスト細
胞は、紫色に染色される。また、蛍光顕微鏡下ではアミ
ロイドがサンゴ色の蛍光を発する。

実　　施　　例 以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。

実施例　１ 下記配合により、本発明染色液組成物イ〜トを調製した
。調製は、所定量のスティンズーオールを先ず所定量の
ニトロパラフィンと室温で混合し、１５〜３０分間撹拌
し、次いで所定量の低級アルコールを加えて１５分〜１
時間撹拌して溶解することにより行なった。

０染色液イ ステインズーオール　　　　　　２ｇ ニトロメタン　　　　　　　　５０ｍ１エタノール　　
　　　　　　　５０ｍ１Ｏ染色液口 ステインズーオール　　　　　　２ｇ ニトロエタン　　　　　　　　５０ｍ１エタノール　　
　　　　　　　５０ｍｌ０染色液ハ ステインズーオール　　　　　　２ｇ ニトロメタン　　　　　　　　４０ｍ１エタノール　　
　　　　　　　６０ｍｌ０染色液二 ステインズーオール　　　　　　１ｇ ニトロメタン　　　　　　　　５０ｍ１エタノール　　
　　　　　　　５０ｍｌ０染色液ホ ステインズーオール　　　　０．５０ ニトロメタン　　　　　　　　５０ｍ１エタノール　　
　　　　　　　５０１ ０染色液へ ステインズーオール　　　　　　２ｇ ２−ニトロプロパン　　　　　５０ｍ１エタノール　　
　　　　　　　５（ＩＩＯ染色染色 ストインズーオール　　　　　　２ｑ ２−ニトロプロパン　　　　　５０ｍ１メタノール　　
　　　　　　　５０ｍ１実施例　２ 実施例１で得た染色液イを褐色瓶中で密閉保存したとこ
ろ、５ケ月後においても濃度変化は全くなかった。尚、
濃度変化は、５７０ｎｍにおける吸光度により調べた。

実施例　３ スライドガラス（厚さ１．２ｍｍ、横７６ｍｍ。

縦２５ｍｍ）上で病理組織標本の通常の作製手順に従っ
てマウスの虫垂組織を処理し、実施例１で調製した染色
液イに室温で１０分間浸漬して染色し、脱水後、ｐ−シ
メンとシクロヘキサンを前者：後者＝２：３の容量比で
混合した透徹液で透徹した組織切片（３Ｘ５ｍｍ＞の上
に、特願昭６１−２４０６６６号記載の（２−メチル−
２−アセトニル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メ
チルアクリレート１００重量部に１−ヒドロキシシクロ
へキシルフェニルケトンを０．５重量部配合した封入剤
を滴下し、その上にカバーガラス（，０，１５Ｘ２４ｘ
２４ｍｍ）を気泡が入らないように重ねた。カバーガラ
スの上を綿棒で軽く押えた後、光照射を行なって、本発
明による組織標本のプレパラートを得た。

比較のため、ヘマトキシリン−エオシン染色し、且つキ
シレン透徹した以外は上記と同様にして、比較の組織標
本のプレパラートを得た。

得られた各プレパラートを、光学顕微鏡を使用して弱拡
大（１〜９９倍）、中等度拡大（１００〜２００倍）、
強拡大（２０１〜４００倍）及び油浸レンズ使用の場合
（１０００〜２０００倍）について観察した。第１図は
、本発明による組織標本のプレパラートの顕微鏡写真（
２００倍）の−例である。また、第２図は、比較の組織
標本のプレパラートの顕微鏡写真（２００倍）の−例で
ある。第１図と第２図とを比較して明らかな通り、本発
明組成物による染色ではシアロムチン（球状部分）が染
色（実際の色は青色）されているが、ヘマトキシリン−
エオシン染色ではシアロムチンが染色されず白く抜けて
見える。

尚、之等第１図及び第２図のカラー写真を参考図面の第
１図及び第２図として添附した。

また、本発明により得られたプレパラートについての保
存安定性試験を１医薬製造指針１９８６ｊ（日本公定書
協会績、薬事時報社発行）に記載の安定性の加速試験条
件に従って行なったところ、全く変化を認めず極めて安
定であった。

実施例　４ 病理組織標本としてリール黒皮症の皮膚病理組織を用い
、染色液として実施例１で調製した染色液へを用い、且
つ透徹液としてｐ−シメンとシフロヘキサンとの等容量
混合液を用いた以外は実施例３と同様にして、本発明に
よる組織標本のプレパラートを得た。

比較のため、ヘマトキシリン−エオシン染色し、且つキ
シレン透徹した以外は上記と同様にして、比較の組織標
本のプレパラートを得た。

得られた各プレパラートを、光学顕微鏡を使用して、実
施例３と同様にして観察した。第３図は、本発明による
組織標本のプレパラートの顕微鏡写真（２００倍）の−
例である。また、第４図は、比較の組織標本のプレパラ
ートの顕微鏡写真（２００倍）の−例である。第３図と
第４図とを比較して明らかな通り、本発明組成物による
染色ではメラニンが濃く染色（実際の色は青黒色）され
ているが、ヘマトキシリン−エオシン染色ではメラニン
は殆んど染色されていない。

尚、之等第３図及び第４図のカラー写真を参考図面の第
３図及び第４図として添附した。

また、本発明により得られたプレパラートについての保
存安定性試験を、実施例３と同様にして行なったところ
、全く変化を認めず極めて安定であった。

実施例　５ 病理組織標本として色素性母斑（真皮母斑）皮膚病理組
織を用い、４染色液として実施例１で調製した染色液へ
を用い、且つ透徹液としてｐ−シメンとシクロヘキサン
との等容量混合液を用いた以外は実施例３と同様にして
、本発明による組織標本のプレパラートを得た。

比較のため、ヘマトキシリン−エオシン染色し、且つキ
シレン透徹した以外は上記と同様にして、比較の組織標
本のプレパラートを得た。

得られた各プレパラートを、光学顕微鏡を使用して、実
施例３と同様にして観察した。第５図は、本発明による
組織標本のプレパラートの顕微鏡写真（２００倍）の−
例である。また、第６図は、比較の組織標本のプレパラ
ートの顕微鏡写真（２００倍）の−例である。第５図と
第６図と比較して明らかな通り、本発明組成物による染
色ではメラニンが濃く染色（実際の色は青黒色）されて
いるが、ヘマトキシリン−エオシン染色ではメラニンは
殆んど染色されていない。

尚、之等第５図及び第６図のカラー写真を参考図面の第
５図及び第６図として添附した。

また、本発明により得られたプレパラートについての保
存安定性試験を、実施例３と同様にして行なったところ
、全く変化を認めず極めて安定であった。

【図面の簡単な説明】

第１図、第３図及び第５図は、実施例３〜５において、
本発明染色液組成物を用いて得たプレパラートの顕微鏡
写真である。 第２図、第４図及び第６図は、実施例３〜５において、
比較の染色液を用いて得たプレパラート＝　２２− の顕微鏡写真である。 （以　上） 第１図 第３図 第２図 第４図 第５図 第６図 ］　事件の表示 昭和６３年特許願第６４９０６号 ２　発明の名称 染色液組成物、その製造法及びそれを用いるプレパラー
トの製造法 ３　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 株式会社三宝化学研究所 ４代理人 昭和６３年６月２８日 ６　補正の対象 補正の内容 １　明細書中国面の簡単な説明の項の記載を下記の通り
訂正する。 ［第１図、第３図及び第５図は、実施例３〜５において
、本発明染色液組成物を用いて得たプレパラートの生物
の形態を示す顕微鏡写真である。 第２図、第４図及び第６図は、実施例３〜５において、
比較の染色液を用いて得たプレパラートの生物の形態を
示す顕微鏡写真である。」 （以　　　」二）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ニトロパラフィン及び低級アルコールの混合溶媒
   に、１−エチル−２−〔３−（１−エチルナフト〔１，
   ２−ｄ〕チアゾリン−２−イリデン）−２−メチルプロ
   ペニル〕−ナフト〔１，２−ｄ〕チアゾリウムブロマイ
   ドを溶解してなる染色液組成物。
2. （２）１−エチル−２−〔３−（１−エチルナフト〔１
   ，２−ｄ〕チアゾリン−２−イリデン）−２−メチルプ
   ロペニル〕−ナフト〔１，２−ｄ〕チアゾリウムブロマ
   イドをニトロパラフィンに懸濁し、次いで低級アルコー
   ルを添加して溶解することを特徴とする請求項１記載の
   染色液組成物の製造法。
3. （３）プレパラートを製造するに当り、染色に請求項１
   記載の染色液組成物を用い、且つ透徹にｐ−シメンとシ
   クロヘキサンの混合溶媒を用いることを特徴とするプレ
   パラートの製造法。