JPH01240185A - アンジオテンシン変換酵素の精製方法 - Google Patents
アンジオテンシン変換酵素の精製方法Info
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- JPH01240185A JPH01240185A JP6471488A JP6471488A JPH01240185A JP H01240185 A JPH01240185 A JP H01240185A JP 6471488 A JP6471488 A JP 6471488A JP 6471488 A JP6471488 A JP 6471488A JP H01240185 A JPH01240185 A JP H01240185A
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- ace
- iminodiacetic acid
- converting enzyme
- angiotensin converting
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）゛
アンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥと略す）は、生
体内においてアンジオテンシンＩに作用してそのカルボ
キシル末端のヒスチジル−ロイシンジペプチドを氷解遊
離し、アンジオテンシン■に変換する酵素である。この
アンジオテンシン■は、末梢動脈のレセプターに作用し
て血管を収縮させ血圧上昇を促すとともに、副腎皮質に
作用してアルドステロンの分泌を促すという非常に重要
な生理活性を示す、またＡＣＥはブラジキニンに作用し
て、フェニルアラニン−アルギニン及びセリン−プロリ
ンジペグチドを氷解遊離し、プラジキニンを不活性化さ
せる働きもある。
体内においてアンジオテンシンＩに作用してそのカルボ
キシル末端のヒスチジル−ロイシンジペプチドを氷解遊
離し、アンジオテンシン■に変換する酵素である。この
アンジオテンシン■は、末梢動脈のレセプターに作用し
て血管を収縮させ血圧上昇を促すとともに、副腎皮質に
作用してアルドステロンの分泌を促すという非常に重要
な生理活性を示す、またＡＣＥはブラジキニンに作用し
て、フェニルアラニン−アルギニン及びセリン−プロリ
ンジペグチドを氷解遊離し、プラジキニンを不活性化さ
せる働きもある。
この様に、ＡＣＥはレニン−アンジオテンシン系及びキ
ニン−カリクレイン系において重要な役割を担う酵素で
ある。
ニン−カリクレイン系において重要な役割を担う酵素で
ある。
本発明はこのＡＣＥの精製方法に関するものである。
（従来の技術）
ＡＣＨの精製法として、例えば、アナリティカル・バイ
オケミストリー（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、１１１巻、２２７〜２３４頁、１９８１年
）に記載された方法（以下第１の方法と略す）、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ２５７巻、１４１２８〜１４１３３頁、１９８２
年）に記載された方法（以下第２の方法と略す）、プラ
センタ（Ｐｌａｃｅｎｔａ ６巻、５４３〜５４９頁
、１９８５年）に記載された方法（以下第３の方法と略
す）等が知られている。
オケミストリー（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、１１１巻、２２７〜２３４頁、１９８１年
）に記載された方法（以下第１の方法と略す）、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ２５７巻、１４１２８〜１４１３３頁、１９８２
年）に記載された方法（以下第２の方法と略す）、プラ
センタ（Ｐｌａｃｅｎｔａ ６巻、５４３〜５４９頁
、１９８５年）に記載された方法（以下第３の方法と略
す）等が知られている。
第１の方法は、ヒト血清からＡＣＥ含有ポリエチレング
リコール沈澱を得、この沈澱物懸濁液をイオン交換体で
処理してＡＣＥの粗精製を行い、再びポリエチレングリ
コール沈澱を行った後、懸濁液中のＡＣＥをハイドロキ
シアパタイトを用いて吸着させる方法である。
リコール沈澱を得、この沈澱物懸濁液をイオン交換体で
処理してＡＣＥの粗精製を行い、再びポリエチレングリ
コール沈澱を行った後、懸濁液中のＡＣＥをハイドロキ
シアパタイトを用いて吸着させる方法である。
第２の方法は、ウサギ精巣を界面活性剤で処理してＡＣ
Ｅ含有試料を得、この試料に硫酸ストレプトマイシンを
添加して核酸を除去した後、Ｎ−α［１−（Ｓ）−力ル
ボキシ−３−フェニルプロピル］−Ｌ−リジル−し一プ
ロリンを結合した樹脂に吸着させ、さらにゲル濾過を行
う方法である。
Ｅ含有試料を得、この試料に硫酸ストレプトマイシンを
添加して核酸を除去した後、Ｎ−α［１−（Ｓ）−力ル
ボキシ−３−フェニルプロピル］−Ｌ−リジル−し一プ
ロリンを結合した樹脂に吸着させ、さらにゲル濾過を行
う方法である。
第３の方法は、ヒト胎盤から調製した膜画分を、トリプ
シン処理により可溶化した後、カプトグリルを結合した
樹脂に吸着させ、さらにゲル濾過を行ってＡＣＥを精製
する方法である。
シン処理により可溶化した後、カプトグリルを結合した
樹脂に吸着させ、さらにゲル濾過を行ってＡＣＥを精製
する方法である。
（発明が解決しようとする課題）
従来用いられてきたＡＣＢの精製方法には、いくつかの
課題がある０例えば第１の方法では、２度に渡るポリエ
チレングリコール沈澱操作、イオン交換クロマトグラフ
ィー及びハイドロキシアパタイト吸着等、操作が複雑で
時間がかかる等の課題がある。また例えば第２、第３の
方法では、Ｎ−α［１−（Ｓ）−力ルボキシ−３−フェ
ニルグロピル］−Ｌ−リジル−し一プロリンあるいはカ
プトグリル等のＡＣＥ阻害剤として作用し得る物質を用
いたアフィニティークロマトグラフィーにおいて、アル
ブミン等の夾雑蛋白質がＡＣＥと共存する場合には、Ａ
ＣＥの精製が不完全になり易い等である。
課題がある０例えば第１の方法では、２度に渡るポリエ
チレングリコール沈澱操作、イオン交換クロマトグラフ
ィー及びハイドロキシアパタイト吸着等、操作が複雑で
時間がかかる等の課題がある。また例えば第２、第３の
方法では、Ｎ−α［１−（Ｓ）−力ルボキシ−３−フェ
ニルグロピル］−Ｌ−リジル−し一プロリンあるいはカ
プトグリル等のＡＣＥ阻害剤として作用し得る物質を用
いたアフィニティークロマトグラフィーにおいて、アル
ブミン等の夾雑蛋白質がＡＣＥと共存する場合には、Ａ
ＣＥの精製が不完全になり易い等である。
本発明者らは、以上の様な課題について鋭意検討を行っ
た結果、イミノジ酢酸基とＡＣＥの親和性を利用するこ
とでこれらの課題を解決し、本発明を完成させるに至っ
た。
た結果、イミノジ酢酸基とＡＣＥの親和性を利用するこ
とでこれらの課題を解決し、本発明を完成させるに至っ
た。
即ち本発明は、
（ａ） 固定化されたイミノジ酢酸基と亜鉛イオンを
結合させ、 （ｂ） 未結合の亜鉛イオンを除去し、（ｃ） 続
いて該イミノジ酢酸基に試料中のアンジオテンシン変換
酵素を結合させ、 （ｄ） 試料中の夾雑物を除去し、 （ｅ） 次いで、結合したアンジオテンシン変換酵素
を遊離させる ことをからなる精製方法であり、更には前記（ａ）〜（
ｃ）の操作をイミノジ酢酸基を有機又は無機系担体に固
定化して充填したカラムにおいて行う方法を提供するも
のである。また、本発明は前記（ａ）〜（ｅ）の操作を
ＡＣＥ阻害剤を用いたアフィニティークロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィーの中から選ばれる少なくとも１種以上のクロ
マトグラフィーと組み合わせて行う方法をも提供する。
結合させ、 （ｂ） 未結合の亜鉛イオンを除去し、（ｃ） 続
いて該イミノジ酢酸基に試料中のアンジオテンシン変換
酵素を結合させ、 （ｄ） 試料中の夾雑物を除去し、 （ｅ） 次いで、結合したアンジオテンシン変換酵素
を遊離させる ことをからなる精製方法であり、更には前記（ａ）〜（
ｃ）の操作をイミノジ酢酸基を有機又は無機系担体に固
定化して充填したカラムにおいて行う方法を提供するも
のである。また、本発明は前記（ａ）〜（ｅ）の操作を
ＡＣＥ阻害剤を用いたアフィニティークロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィーの中から選ばれる少なくとも１種以上のクロ
マトグラフィーと組み合わせて行う方法をも提供する。
以下、本発明の詳細な説明する。
（課題を解決するための手段）
ＡＣＦ、を含有する試料は、例えばウサギ、ブタ。
ヒト等の、肺、胎盤、精巣等をホモジナイズ等した後遠
心分離等して得られる細胞膜両分等を調製して得れば良
い、調製方法としては、例えばトリプシン等の酵素によ
る処理方法、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ １００等
の界面活性剤処理法あるいは凍結融解法等ＡＣＥを失活
させない方法であれ′ば制限はない。
心分離等して得られる細胞膜両分等を調製して得れば良
い、調製方法としては、例えばトリプシン等の酵素によ
る処理方法、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ １００等
の界面活性剤処理法あるいは凍結融解法等ＡＣＥを失活
させない方法であれ′ば制限はない。
イミノジ酢酸基は、ＡＣＦ、とその夾雑物の分離の為、
固・ｍに化学的に結合させて固定化しておく。
固・ｍに化学的に結合させて固定化しておく。
この時、イミノジ酢酸基と固相との化学的結合は、イミ
ノジ酢酸基が亜鉛イオンとキレート結合することを妨害
しないものであれば良い。
ノジ酢酸基が亜鉛イオンとキレート結合することを妨害
しないものであれば良い。
固相の基材は、通常の生化学反応で用いられるものであ
れば制限はなく、例えばガラス、シリカ等の無機系、ス
チレン系、エチレングリコール系。
れば制限はなく、例えばガラス、シリカ等の無機系、ス
チレン系、エチレングリコール系。
メタクリレート系等のポリマー系及びこれらのコポリマ
ー系、デキストラン、アガロース、デンプン等の多糖類
等を使用すれば良い。
ー系、デキストラン、アガロース、デンプン等の多糖類
等を使用すれば良い。
本発明は、例えば前記した基材を用いて反応容器を構成
し、その内壁全体を固相としてイミノジ＃酸基を固定化
して行っても良いが、迅速性等の観点から、例えば、前
記した基材を用いてビーズ状の担体を構成し、担体表面
にイミノジ酢酸基を結合させ、これら担体をカラムに充
填して行うことが好ましい。
し、その内壁全体を固相としてイミノジ＃酸基を固定化
して行っても良いが、迅速性等の観点から、例えば、前
記した基材を用いてビーズ状の担体を構成し、担体表面
にイミノジ酢酸基を結合させ、これら担体をカラムに充
填して行うことが好ましい。
以下、イミノジ酢酸基を結合させた担体をカラムに充填
した場合のカラムクロマトグラフィーについて述べる。
した場合のカラムクロマトグラフィーについて述べる。
イミノジ＃酸基とＡＣＥは１対１の割合で結合する。こ
の為、試料中のＡＣＥ濃度が予想されない場合には、大
量のイミノジ酢酸基を用いれば良い０本発明では、まず
、イミノジ酢酸基とＡＣＥを結合させる為に、前もって
イミノジ酢酸基に亜鉛イオンを結合させておく、イミノ
ジ酢酸基、亜鉛イオン及びＡＣＥの相互作用については
明らかではない８本発明者らの検討によれば、コバルト
イオンでは、ＡＣＨのイミノジ酢酸基への結合はｔ１１
察されなかった。
の為、試料中のＡＣＥ濃度が予想されない場合には、大
量のイミノジ酢酸基を用いれば良い０本発明では、まず
、イミノジ酢酸基とＡＣＥを結合させる為に、前もって
イミノジ酢酸基に亜鉛イオンを結合させておく、イミノ
ジ酢酸基、亜鉛イオン及びＡＣＥの相互作用については
明らかではない８本発明者らの検討によれば、コバルト
イオンでは、ＡＣＨのイミノジ酢酸基への結合はｔ１１
察されなかった。
亜鉛イオンをイミノジ酢酸基と結合させるには、例えば
塩化亜鉛（ＺｎＣβ２）溶液等をカラムに添加すれば良
い、亜鉛イオンとイミノジ＃酸基は１対１の割合でキレ
ート結合する。このため、用いる亜鉛イオンは、イミノ
ジ酢酸基に対して過剰であれば良い。
塩化亜鉛（ＺｎＣβ２）溶液等をカラムに添加すれば良
い、亜鉛イオンとイミノジ＃酸基は１対１の割合でキレ
ート結合する。このため、用いる亜鉛イオンは、イミノ
ジ酢酸基に対して過剰であれば良い。
次に、イミノジ酢酸基と結合していない予刺の亜鉛イオ
ンを分離する。これは、イミノジ＃酸基と結合した亜鉛
イオンを遊離させない様な性質の洗浄液をカラムに添加
して行えば良い。
ンを分離する。これは、イミノジ＃酸基と結合した亜鉛
イオンを遊離させない様な性質の洗浄液をカラムに添加
して行えば良い。
続いて、前記した様にして調製されたＡＣＥ含有料を亜
鉛イオンと結合したイミノジ酢酸基に接触させる。これ
は、カラムに試料を添加すれば良い、この時、イミノジ
酢酸基、亜鉛イオン及びＡＣＨの相互作用は定かではな
いが、これらの間の反応に平衡化を生じさせる様にする
ことが、ＡＣＥの収率等のために良い、平衡化のための
時間は、試料中のＡＣＥ濃度、カラムの液温等により変
動するため、例えば本発明を実施した後、この場面でイ
ミノジ＃酸基に結合せず溶出した画分中のＡＣＨの活性
を測定する等して、検討すれば良い。
鉛イオンと結合したイミノジ酢酸基に接触させる。これ
は、カラムに試料を添加すれば良い、この時、イミノジ
酢酸基、亜鉛イオン及びＡＣＨの相互作用は定かではな
いが、これらの間の反応に平衡化を生じさせる様にする
ことが、ＡＣＥの収率等のために良い、平衡化のための
時間は、試料中のＡＣＥ濃度、カラムの液温等により変
動するため、例えば本発明を実施した後、この場面でイ
ミノジ＃酸基に結合せず溶出した画分中のＡＣＨの活性
を測定する等して、検討すれば良い。
以上の様にして、イミノジ酢酸基に結合したＡＣＢを遊
離させ、カラムより溶出させる。イミノジ酢酸基と結合
したＡＣＥを遊離させるものとしては、例えばグリシン
等のキレート拮抗剤を含有する溶出用液を用いれば良い
、ここで、試料中に、ＡＣＥ以外にイミノジ＃酸基と結
合し得る夾雑物が存在していると予想される場合には、
該夾雑物とＡＣＥのイミノジ酢酸基への親和力の違いを
利用すると良い、このためには、前記した様な溶出用液
をカラムに添加する時、キレート拮抗剤濃度勾配を与え
、カラムからの溶出液を分画して得れば良い、キレート
拮抗剤濃度勾配は、直線的なもめ（いわゆるグラデイエ
ンド）であっても段階的なもの（いわゆるステップ）で
あっても良い、より精製度の高いＡＣＥを得るためには
、溶出液の分画量を小さくし、ゆるやかなキレート拮抗
剤濃度勾配を与えた溶出用液でＡＣＥを溶出させること
が好ましい、キレート拮抗剤の濃度勾配の範囲。
離させ、カラムより溶出させる。イミノジ酢酸基と結合
したＡＣＥを遊離させるものとしては、例えばグリシン
等のキレート拮抗剤を含有する溶出用液を用いれば良い
、ここで、試料中に、ＡＣＥ以外にイミノジ＃酸基と結
合し得る夾雑物が存在していると予想される場合には、
該夾雑物とＡＣＥのイミノジ酢酸基への親和力の違いを
利用すると良い、このためには、前記した様な溶出用液
をカラムに添加する時、キレート拮抗剤濃度勾配を与え
、カラムからの溶出液を分画して得れば良い、キレート
拮抗剤濃度勾配は、直線的なもめ（いわゆるグラデイエ
ンド）であっても段階的なもの（いわゆるステップ）で
あっても良い、より精製度の高いＡＣＥを得るためには
、溶出液の分画量を小さくし、ゆるやかなキレート拮抗
剤濃度勾配を与えた溶出用液でＡＣＥを溶出させること
が好ましい、キレート拮抗剤の濃度勾配の範囲。
分画量等の条件は用いる試料等を考慮した上で予備的な
実験を行って決定すれば良い。
実験を行って決定すれば良い。
ＡＣＥの活性は、例えばジャーナル・オブ・クロマトグ
ラフ４−（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ）２３３巻。
ラフ４−（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ）２３３巻。
１２３〜１３０頁に記載されたＨｏｒｉｕｃｈｉらの方
法に従って測定すれば良い。
法に従って測定すれば良い。
以上説明した方法は、従来知られた例えばＡＣＥ阻害剤
を用いたアフィニティークロマトグラフィー、ゲルｒ過
クロマ１へグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
と組み合わせて用いても良い、これらのクロマトグラフ
ィーは、イミノジ酢酸基を用いた本発明に先立って行っ
ても良いし、本発明で得られたＡＧＥ分画を試料として
行っても良い。
を用いたアフィニティークロマトグラフィー、ゲルｒ過
クロマ１へグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
と組み合わせて用いても良い、これらのクロマトグラフ
ィーは、イミノジ酢酸基を用いた本発明に先立って行っ
ても良いし、本発明で得られたＡＧＥ分画を試料として
行っても良い。
（発明の効果）
本発明によれば、簡便な操作により精製度の高いＡＣＥ
を得ることが出来る。特にカラムクロマトグラフィーと
して本発明を行えば、より簡便で迅速なＡＣＥの精製を
行うことが出来る０本発明は、ＡＣＥとイミノジ酢酸基
の親和力を利用するものであるが、ＡＣＢの他の物理的
性質を利用したクロマトグラフィーと本発明を組み合わ
せて行うことでより精製度の高いＡＣＥを得ることが出
来る。
を得ることが出来る。特にカラムクロマトグラフィーと
して本発明を行えば、より簡便で迅速なＡＣＥの精製を
行うことが出来る０本発明は、ＡＣＥとイミノジ酢酸基
の親和力を利用するものであるが、ＡＣＢの他の物理的
性質を利用したクロマトグラフィーと本発明を組み合わ
せて行うことでより精製度の高いＡＣＥを得ることが出
来る。
以下、本発明を更に詳細に説明するため、実施例を示す
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例）
ヒト胎盤１ｋＩｒを細かく切断した後、４１の０．９％
ＮａＣβ溶液に浸して血液を洗浄し２Ｊ２の０．２５Ｍ
ショ糖を含む２０ｍＭリン酸カリウム＃１街液（ｐＨ７
，８）中でホモジナイズした。
ＮａＣβ溶液に浸して血液を洗浄し２Ｊ２の０．２５Ｍ
ショ糖を含む２０ｍＭリン酸カリウム＃１街液（ｐＨ７
，８）中でホモジナイズした。
これを７００ｘｇ、３０分、４℃で遠心分離して上清を
回収した。上清を０．１Ｍ酢酸を用いてｐＨを５．２に
調製して５分間数１した。その後、１５．０００ｘｇ、
３０分、４℃で遠心分離して膜画分を沈澱に回収した。
回収した。上清を０．１Ｍ酢酸を用いてｐＨを５．２に
調製して５分間数１した。その後、１５．０００ｘｇ、
３０分、４℃で遠心分離して膜画分を沈澱に回収した。
膜画分は、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，８
）に懸濁した。
）に懸濁した。
この時の膜画分の蛋白質量は３８１０ｎｇであった。
゛なお、蛋白質量はロウリー（Ｌ ｏ ｗ ｒ ｙ ）
法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９３巻、２６５頁（１９５１
年）を参照）を用いて測定した。
゛なお、蛋白質量はロウリー（Ｌ ｏ ｗ ｒ ｙ ）
法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９３巻、２６５頁（１９５１
年）を参照）を用いて測定した。
膜画分に、１ｍＭＣａＣβ２存在下で、７．６２■トリ
プシンを添加し、３７℃水浴中で１２０分間インキュベ
ーションした後、１５、ＯＯＯｘｇ、３０分、４℃で遠
心分離を行い、上清に可溶性画分を回収した。可溶性画
分の蛋白質量は２，６４０■で、ＡＣＥ活性は４９．８
５μｍｏ！２／ｍｉｎであった。この可溶性画分を試料
として、ＤＥＡＥ基を用いたイオン交換クロマトグラフ
ィー、カプトグリルを用いたアフィニティクロマトグラ
フィー及び本発明の方法により、ＡＣＥの精製を行った
。まず、この可溶性画分をあらかじめ２０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７゜８）で平衡化しておいたＤＥＡ
Ｅ−トヨパール６５０ｓ （東ソー■製）を充填したカ
ラム（１，５Ｘ１５ａｎ）に添加し、同緩衝液１．０１
で洗浄した。その後、吸着したＡＣＥは０〜０．５Ｍ
ＮａＣβの直線的濃度勾配（５００ｍｌ ）を用いて
７ ｍｌずつ溶出分画した。へ〇Ｅ活性は、Ｎ ａ Ｃ
／ｌ濃度１２５ｍＭ付近をピークとして溶出された。こ
の両分を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，８）
を用いて透析し、脱塩した。
プシンを添加し、３７℃水浴中で１２０分間インキュベ
ーションした後、１５、ＯＯＯｘｇ、３０分、４℃で遠
心分離を行い、上清に可溶性画分を回収した。可溶性画
分の蛋白質量は２，６４０■で、ＡＣＥ活性は４９．８
５μｍｏ！２／ｍｉｎであった。この可溶性画分を試料
として、ＤＥＡＥ基を用いたイオン交換クロマトグラフ
ィー、カプトグリルを用いたアフィニティクロマトグラ
フィー及び本発明の方法により、ＡＣＥの精製を行った
。まず、この可溶性画分をあらかじめ２０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７゜８）で平衡化しておいたＤＥＡ
Ｅ−トヨパール６５０ｓ （東ソー■製）を充填したカ
ラム（１，５Ｘ１５ａｎ）に添加し、同緩衝液１．０１
で洗浄した。その後、吸着したＡＣＥは０〜０．５Ｍ
ＮａＣβの直線的濃度勾配（５００ｍｌ ）を用いて
７ ｍｌずつ溶出分画した。へ〇Ｅ活性は、Ｎ ａ Ｃ
／ｌ濃度１２５ｍＭ付近をピークとして溶出された。こ
の両分を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，８）
を用いて透析し、脱塩した。
次にカプトプリル６０■をカルボジイミド法によりＡＨ
−セファロース４Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃ ｉ ａ社製）と結合させたカプトプ
リル−ＡＨ−セファロース４Ｂ （１，ＯＸ６．０Ｇｌ
ｌ）を用いてアフィニティーカラムクロマトグラフィー
を行った。あらかじめ２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（
ｐ）（’７．８）で平衡化しておいたカラムに上記画分
を添加し、同緩衝液２００ｍ１で洗浄した。その後、吸
着したＡＣＥは０〜０．５Ｍ ＮａＣ１ｆ）直線的濃
度勾配（２００ｍｌ ）を用いてＪ ｃＱｌずつ溶出分
画しな、ＡＣＥ活性は、ＮａＣｆ１濃度２５０ｍＭ付近
をピークとして溶出された。この画分を濃縮した後、イ
ミノジ酢酸基を有するＴＳＫ−ｇｅｌ Ｃｈｅｌａｔ
ｅ−５ＰＷ（東ソー■製） ＜ ７ 、５ ｍｍ Ｘ
７ 、５ ｃｍ ）を用いてさらに精製した。あらか
じめ、１００μｍｏβのＺ ｎ Ｃ１２溶液を添加し、
さらに０．５ＭＮａＣ１を含む２０ｍＭ−トリス塩酸緩
？Ｒ液（ｐＨ８，０）で平衡化しておいたカラムに、上
記試料を添加し、同緩Ｗ！液で洗浄した後に、吸着した
ＡＣＥを０〜０．２Ｍグリシンの直線的濃度勾配（６０
ｍｌ ）を用いて４ｍｌずつ溶出分画しな。
−セファロース４Ｂ （Ｐｈａｒｍａｃ ｉ ａ社製）と結合させたカプトプ
リル−ＡＨ−セファロース４Ｂ （１，ＯＸ６．０Ｇｌ
ｌ）を用いてアフィニティーカラムクロマトグラフィー
を行った。あらかじめ２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（
ｐ）（’７．８）で平衡化しておいたカラムに上記画分
を添加し、同緩衝液２００ｍ１で洗浄した。その後、吸
着したＡＣＥは０〜０．５Ｍ ＮａＣ１ｆ）直線的濃
度勾配（２００ｍｌ ）を用いてＪ ｃＱｌずつ溶出分
画しな、ＡＣＥ活性は、ＮａＣｆ１濃度２５０ｍＭ付近
をピークとして溶出された。この画分を濃縮した後、イ
ミノジ酢酸基を有するＴＳＫ−ｇｅｌ Ｃｈｅｌａｔ
ｅ−５ＰＷ（東ソー■製） ＜ ７ 、５ ｍｍ Ｘ
７ 、５ ｃｍ ）を用いてさらに精製した。あらか
じめ、１００μｍｏβのＺ ｎ Ｃ１２溶液を添加し、
さらに０．５ＭＮａＣ１を含む２０ｍＭ−トリス塩酸緩
？Ｒ液（ｐＨ８，０）で平衡化しておいたカラムに、上
記試料を添加し、同緩Ｗ！液で洗浄した後に、吸着した
ＡＣＥを０〜０．２Ｍグリシンの直線的濃度勾配（６０
ｍｌ ）を用いて４ｍｌずつ溶出分画しな。
なお、流速は１ｍｌ／ｍｉｎで行った。ＡＣＥ活性は、
グリシン濃度５０ｍＭ付近をピークとして溶出された。
グリシン濃度５０ｍＭ付近をピークとして溶出された。
得られたＡＧＥ画分中の蛋白質量は０．５３■であり、
比活性は３９．５１μｍｏβ／ｍｉｎ／ｑであった。こ
のＡＧＥ画分は５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に
おいて単一バンドを示した。トリプシン処理後及び各ク
ロマトグラフィー後に得られたＡＣＥ画分の全活性（μ
ｍｏ１／ｍ１ｎ）、全蛋白質量（■）、比活性（μｍｏ
β／ｍｉｎ／■）及び比活性をもとに求めた可溶化処理
後を１としたときのＡＣＨの精製度すなわちＡＣＥ純度
（倍）を表１に示す。
比活性は３９．５１μｍｏβ／ｍｉｎ／ｑであった。こ
のＡＧＥ画分は５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に
おいて単一バンドを示した。トリプシン処理後及び各ク
ロマトグラフィー後に得られたＡＣＥ画分の全活性（μ
ｍｏ１／ｍ１ｎ）、全蛋白質量（■）、比活性（μｍｏ
β／ｍｉｎ／■）及び比活性をもとに求めた可溶化処理
後を１としたときのＡＣＨの精製度すなわちＡＣＥ純度
（倍）を表１に示す。
Claims (3)
- （１）（ａ）固定化されたイミノジ酢酸基と亜鉛イオン
を結合させ、 （ｂ）未結合の亜鉛イオンを除去し、 （ｃ）続いて該イミノジ酢酸基に試料中のアンジオテン
シン変換酵素を結合させ、 （ｄ）試料中の夾雑物を除去し、 （ｅ）次いで、結合したアンジオテンシン変換酵素を遊
離させる ことを特徴とするアンジオテンシン変換酵素の精製方法
。 - （２）請求項（１）の方法においてイミノジ酢酸基を有
機又は無機系担体に固定化して充填したカラムを用いる
ことを特徴とする方法。 - （３）請求項（１）又は（２）の方法に、アンジオテン
シン変換酵素阻害剤を用いたアフィニティークロマトグ
ラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィーの中から選ばれる１種以上のクロマト
グラフィーを行うことを特徴とするアンジオテンシン変
換酵素の精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6471488A JPH01240185A (ja) | 1988-03-19 | 1988-03-19 | アンジオテンシン変換酵素の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6471488A JPH01240185A (ja) | 1988-03-19 | 1988-03-19 | アンジオテンシン変換酵素の精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01240185A true JPH01240185A (ja) | 1989-09-25 |
Family
ID=13266094
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6471488A Pending JPH01240185A (ja) | 1988-03-19 | 1988-03-19 | アンジオテンシン変換酵素の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01240185A (ja) |
-
1988
- 1988-03-19 JP JP6471488A patent/JPH01240185A/ja active Pending
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