JPH01247096A - モノクローナル抗体の回収方法 - Google Patents
モノクローナル抗体の回収方法Info
- Publication number
- JPH01247096A JPH01247096A JP7455988A JP7455988A JPH01247096A JP H01247096 A JPH01247096 A JP H01247096A JP 7455988 A JP7455988 A JP 7455988A JP 7455988 A JP7455988 A JP 7455988A JP H01247096 A JPH01247096 A JP H01247096A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- monoclonal antibodies
- cln
- exchange resin
- human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、モノクローナル抗体の回収方法に関するもの
である。
である。
［従来の技術及び発明が解決しようとする課題１１９７
５年にに６ｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎがハイブリドー
マ法を確立して以来、マウス×マウスハイブリドーマや
ヒト×ヒトハイブリドーマ等の産生ずる種々の抗原特異
性をもったモノクローナル抗体が作製されている。また
、ヒトリンパ球をＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ
ｖｉｒｕｓ）により形質転換した細胞によってもモノク
ローナル抗体が作製されている。
５年にに６ｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎがハイブリドー
マ法を確立して以来、マウス×マウスハイブリドーマや
ヒト×ヒトハイブリドーマ等の産生ずる種々の抗原特異
性をもったモノクローナル抗体が作製されている。また
、ヒトリンパ球をＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ
ｖｉｒｕｓ）により形質転換した細胞によってもモノク
ローナル抗体が作製されている。
モノクローナル抗体の用途として、医薬や診断薬等が考
えられ、現在数多く開発されつつある。
えられ、現在数多く開発されつつある。
医薬として用いるには高純度のものが要求される。
これらの用途に用いるため、モノクローナル抗体を大量
調製するには、バイブリドーマ等をスピンナーフラスコ
等の培養装置で培養し、もしくはマウス等の腹腔内で腹
水培養し、これらの培養液中にモノクローナル抗体を産
生させ、培養液より精製し、回収することにより行う、
培養液よりモノクローナル抗体を回収するには、培養液
中のハイブリドーマや他の固形分を除去し、ａ縮、脱塩
後、プロティンＡや抗ＩｇＧ抗体等をリガンドとしたア
フィニティークロマトグラフィー又はイオン交換クロマ
トグラフィーにより行う。その後、モノクローナル抗体
の純度向上や脱塩のために、ゲル濾過等を行う場合もあ
る。
調製するには、バイブリドーマ等をスピンナーフラスコ
等の培養装置で培養し、もしくはマウス等の腹腔内で腹
水培養し、これらの培養液中にモノクローナル抗体を産
生させ、培養液より精製し、回収することにより行う、
培養液よりモノクローナル抗体を回収するには、培養液
中のハイブリドーマや他の固形分を除去し、ａ縮、脱塩
後、プロティンＡや抗ＩｇＧ抗体等をリガンドとしたア
フィニティークロマトグラフィー又はイオン交換クロマ
トグラフィーにより行う。その後、モノクローナル抗体
の純度向上や脱塩のために、ゲル濾過等を行う場合もあ
る。
モノクローナル抗体を培養液より回収するためにアフィ
ニティークロマトグラフィーを用いる場合には、以下の
ような問題点がある。モノクローナル抗体と特異的に結
合するプロティンＡ又は抗ＩｇＧ抗体等をリガンドとし
てクロマトグラフィーを行う場合、モノクローナル抗体
をアフィニティーグルに吸着させた後、アフィニティー
ゲルの洗浄を充分行ったとしても、培養液中にモノクロ
ーナル抗体と共存する蛋白質の溶離液への混入が避けに
くく、高純度なモノクローナル抗体を得にくい。これら
の共存蛋白質は培地に予め添加゛したものや腹水中にも
とより含まれるもので、例えばアルブミン、トランスフ
ェリン等である。また、リガンドのプロティンＡや抗Ｉ
ｇＧ抗体等は生物由来で高価でありコスト高となる。更
に、モノクローナル抗体の溶出条件は通常低ｐ Ｈで行
うため、モノクローナル抗体の活性低下が危具される。
ニティークロマトグラフィーを用いる場合には、以下の
ような問題点がある。モノクローナル抗体と特異的に結
合するプロティンＡ又は抗ＩｇＧ抗体等をリガンドとし
てクロマトグラフィーを行う場合、モノクローナル抗体
をアフィニティーグルに吸着させた後、アフィニティー
ゲルの洗浄を充分行ったとしても、培養液中にモノクロ
ーナル抗体と共存する蛋白質の溶離液への混入が避けに
くく、高純度なモノクローナル抗体を得にくい。これら
の共存蛋白質は培地に予め添加゛したものや腹水中にも
とより含まれるもので、例えばアルブミン、トランスフ
ェリン等である。また、リガンドのプロティンＡや抗Ｉ
ｇＧ抗体等は生物由来で高価でありコスト高となる。更
に、モノクローナル抗体の溶出条件は通常低ｐ Ｈで行
うため、モノクローナル抗体の活性低下が危具される。
一方、モノクローナル抗体をイオン交換クロマトグラフ
ィーを用いて回収する場合には、以下のような問題点が
ある。現在、陰イオン交換クロマトグラフィーによりモ
ノクローナル抗体を回収する方法については数多く利用
されている。また。
ィーを用いて回収する場合には、以下のような問題点が
ある。現在、陰イオン交換クロマトグラフィーによりモ
ノクローナル抗体を回収する方法については数多く利用
されている。また。
陽イオン交換クロマトグラフィーの利用は例が少なく、
いずれもｐＨ６，３以下の条件で行われている（Ａ、
Ｆｒｅｊ ｅｔ ａｌ、： Ｂ １０／ＴＥＣＨ，、Ｓ
ｅｐ、 ７７７−７８１．１９８４． Ｍ、 Ｃａｒｌ
ｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ、： Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、。
いずれもｐＨ６，３以下の条件で行われている（Ａ、
Ｆｒｅｊ ｅｔ ａｌ、： Ｂ １０／ＴＥＣＨ，、Ｓ
ｅｐ、 ７７７−７８１．１９８４． Ｍ、 Ｃａｒｌ
ｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ、： Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、。
Ｖｏｌ、７９．８９−９８．１９８５１．イオン交換ク
ロマトグラフィーによる回収方法はモノクローナル抗体
を培養液中のアルブミンやトランスフェリン等の共存蛋
白質とともにイオン交換樹脂に吸着させ、その後、例え
ば、塩濃度を徐々にあるいは段階的に上げることにより
モノクローナル抗体と共存蛋白質とを溶離時間の差で分
離するものである１以上のように行ったイオン交換クロ
マトグラフィーによる方法は、一般に分離が不充分であ
ることが多く、モノクローナル抗体に培養液中の共存蛋
白質が不純物として混入する。また、モノクローナル抗
体とともに共存蛋白質の大部分を吸着した後。
ロマトグラフィーによる回収方法はモノクローナル抗体
を培養液中のアルブミンやトランスフェリン等の共存蛋
白質とともにイオン交換樹脂に吸着させ、その後、例え
ば、塩濃度を徐々にあるいは段階的に上げることにより
モノクローナル抗体と共存蛋白質とを溶離時間の差で分
離するものである１以上のように行ったイオン交換クロ
マトグラフィーによる方法は、一般に分離が不充分であ
ることが多く、モノクローナル抗体に培養液中の共存蛋
白質が不純物として混入する。また、モノクローナル抗
体とともに共存蛋白質の大部分を吸着した後。
分離を行うために、モノクローナル抗体と共存蛋白質の
合計量に見合うイオン交換樹脂量が必要であり、樹脂コ
ストは割高となる。
合計量に見合うイオン交換樹脂量が必要であり、樹脂コ
ストは割高となる。
そこで、本発明者らは、培養液中のモノクローナル抗体
を高純度でかつ安価に回収する方法について鋭意研究を
重ねた結果、本発明を完成するに至った。
を高純度でかつ安価に回収する方法について鋭意研究を
重ねた結果、本発明を完成するに至った。
［課題を解決するための手段］
本発明は、モノクローナル抗体を含む培養液をｐｉ（ｅ
、５〜８．５の範囲に調整し、陽イオン交換樹脂で処理
することを特徴とするモノクローナル抗体の回収方法に
関するものである。
、５〜８．５の範囲に調整し、陽イオン交換樹脂で処理
することを特徴とするモノクローナル抗体の回収方法に
関するものである。
本発明に適用されるモノクローナル抗体は、ヒト型やマ
ウス型を含め特定の動物型を問わない。
ウス型を含め特定の動物型を問わない。
また、ハイプリドーマ他、ＥＢＶにより形質転換した細
胞より産生されるモノクローナル抗体、例えばヒト×ヒ
トハイプリドーマＣＬＮ／５ＵＺＨ１１株（特開昭５９
−１３７４９７号公報：ＡＴＣＣＡＢ ８３０７）の
産生ずるヒト型モノクローナル抗体（ＣＬＮ−Ｉ ｇＧ
と命名されている。）も適用しつる。ＣＬＮ／５ＵＺＨ
１１株は子宮頚癌患者のＢ細胞を用いて作成されたもの
で、ＣＬＮ−Ｉ ｇＧはＩｇＧ１型で癌組織結合特異性
が高い。
胞より産生されるモノクローナル抗体、例えばヒト×ヒ
トハイプリドーマＣＬＮ／５ＵＺＨ１１株（特開昭５９
−１３７４９７号公報：ＡＴＣＣＡＢ ８３０７）の
産生ずるヒト型モノクローナル抗体（ＣＬＮ−Ｉ ｇＧ
と命名されている。）も適用しつる。ＣＬＮ／５ＵＺＨ
１１株は子宮頚癌患者のＢ細胞を用いて作成されたもの
で、ＣＬＮ−Ｉ ｇＧはＩｇＧ１型で癌組織結合特異性
が高い。
モノクローナル抗体を調製するには、ハイブリドーマ又
はＥＢＶにより形質転換した細胞を培養し、培養液中に
モノクローナル抗体を産生させ、培養液より精製し、回
収することにより行う。
はＥＢＶにより形質転換した細胞を培養し、培養液中に
モノクローナル抗体を産生させ、培養液より精製し、回
収することにより行う。
ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養は、培養フラスコ等による静
置培養、又はスピンナーフラスコ等による撹拌培養によ
り行う。培地は糖、アミノ酸、ホルモン、無機塩等の入
った合成培地に牛血清又はサブリメントを加えたものを
用いる。牛血清にはアルブミン、トランスフェリン等の
蛋白質や微量な有効成分を含む、また、牛血清の代わり
にサブリメントを入れた培地を無血清培地といい、サブ
リメントはアルブミン、トランスフェリン等の蛋白質や
微量のホルモン、無機塩等よりなる。例えば、ヒト型モ
ノクローナル抗体ＣＬＮ−Ｉ ｇＧを産生するヒト×ヒ
トハイブリドーマＣＬ Ｎ／Ｓ Ｕ ＺＨ１１株の培養
はＲＤＦ培地（村上浩紀他二日本農芸化学会誌 Ｖｏｌ
、 ５８．５７５−５８３．１９８４１にサブリメント
として牛血清アルブミン、トランスフェリン、インシュ
リン、２−メルカプトエタノール、モノエタノールアミ
ン及び亜セレン酸ナトリウムを加えた培地を用いる。更
に雑菌汚染防止用に抗生物質を入れることもある。一方
、１ｎｖｉｖｏの培養は、ヌードマウス又はヌードラッ
ト等の腹腔にハイブリドーマ等を移植し、腹水中にハイ
ブリドーマを増殖させることにより行う。
置培養、又はスピンナーフラスコ等による撹拌培養によ
り行う。培地は糖、アミノ酸、ホルモン、無機塩等の入
った合成培地に牛血清又はサブリメントを加えたものを
用いる。牛血清にはアルブミン、トランスフェリン等の
蛋白質や微量な有効成分を含む、また、牛血清の代わり
にサブリメントを入れた培地を無血清培地といい、サブ
リメントはアルブミン、トランスフェリン等の蛋白質や
微量のホルモン、無機塩等よりなる。例えば、ヒト型モ
ノクローナル抗体ＣＬＮ−Ｉ ｇＧを産生するヒト×ヒ
トハイブリドーマＣＬ Ｎ／Ｓ Ｕ ＺＨ１１株の培養
はＲＤＦ培地（村上浩紀他二日本農芸化学会誌 Ｖｏｌ
、 ５８．５７５−５８３．１９８４１にサブリメント
として牛血清アルブミン、トランスフェリン、インシュ
リン、２−メルカプトエタノール、モノエタノールアミ
ン及び亜セレン酸ナトリウムを加えた培地を用いる。更
に雑菌汚染防止用に抗生物質を入れることもある。一方
、１ｎｖｉｖｏの培養は、ヌードマウス又はヌードラッ
ト等の腹腔にハイブリドーマ等を移植し、腹水中にハイ
ブリドーマを増殖させることにより行う。
増殖したハイブリドーマが産生ずるモノクローナル抗体
は腹水中に蓄積される。培養の終了した腹水中にはモノ
クローナル抗体以外に、ヌードマウス又はヌードラット
等由来のアルブミン、トランスフェリン等の蛋白質やホ
ルモン、無機塩等が含まれる。
は腹水中に蓄積される。培養の終了した腹水中にはモノ
クローナル抗体以外に、ヌードマウス又はヌードラット
等由来のアルブミン、トランスフェリン等の蛋白質やホ
ルモン、無機塩等が含まれる。
本発明では、培養液よりモノクローナル抗体を精製し、
回収する際に、陽イオン交換樹脂を用いる。一般にモノ
クローナル抗体も、モノクローナル抗体以外の培養液中
の共存蛋白質も水溶性であり、水溶液中で解離している
。陽イオン交換樹脂へは、それぞれの蛋白質によりｐＨ
１塩濃度等の吸着及び溶離条件が異なるので、条件を最
適化することにより、モノクローナル抗体の精製に有効
に利用できる０本発明に使用する陽イオン交換樹脂はス
ルホプロピル基、カルボキシメチル基等の交換基を有す
るものがある。陽イオン交換樹脂の使用方法として、連
続処理によるクロマトグラフィーでもよく、また回分処
理による操作でもよい。
回収する際に、陽イオン交換樹脂を用いる。一般にモノ
クローナル抗体も、モノクローナル抗体以外の培養液中
の共存蛋白質も水溶性であり、水溶液中で解離している
。陽イオン交換樹脂へは、それぞれの蛋白質によりｐＨ
１塩濃度等の吸着及び溶離条件が異なるので、条件を最
適化することにより、モノクローナル抗体の精製に有効
に利用できる０本発明に使用する陽イオン交換樹脂はス
ルホプロピル基、カルボキシメチル基等の交換基を有す
るものがある。陽イオン交換樹脂の使用方法として、連
続処理によるクロマトグラフィーでもよく、また回分処
理による操作でもよい。
本発明者らは、従来の陽イオン交換樹脂を用いる方法の
問題点を解決するために種々検討した結果、ある種のモ
ノクローナル抗体を培養液より回収する方法において、
陽イオン交換樹脂にモノクローナル抗体以外の蛋白質の
大部分を吸着させずにモノクローナル抗体を吸着し、そ
の後、溶離する条件を見出した。本条件はｐＨ６，５以
上のｐＨで達成できる。本発明に適用できるモノクロー
ナル抗体はｐＨ６，５以上のｐＨで陽イオン交換樹脂に
吸着し得る条件を有するものである。例えば、ヒト型モ
ノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧはｐＨ８，５以下で陽
イオン交換樹脂に吸着し、培養液中のアルブミン、トラ
ンスフェリンの大部分はｐＨ６，５以上のｐＨで吸着し
ない。
問題点を解決するために種々検討した結果、ある種のモ
ノクローナル抗体を培養液より回収する方法において、
陽イオン交換樹脂にモノクローナル抗体以外の蛋白質の
大部分を吸着させずにモノクローナル抗体を吸着し、そ
の後、溶離する条件を見出した。本条件はｐＨ６，５以
上のｐＨで達成できる。本発明に適用できるモノクロー
ナル抗体はｐＨ６，５以上のｐＨで陽イオン交換樹脂に
吸着し得る条件を有するものである。例えば、ヒト型モ
ノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧはｐＨ８，５以下で陽
イオン交換樹脂に吸着し、培養液中のアルブミン、トラ
ンスフェリンの大部分はｐＨ６，５以上のｐＨで吸着し
ない。
したがってｐＨ６，５〜８．５の範囲でヒト型モノクロ
ーナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧは陽イオン交換樹脂に吸着す
るが、培養液中に共存するアルブミ・ン、トランスフェ
リンの大部分は未吸着であり、本発明の効果が達成され
る。また、陽イオン交換樹脂よりのＣＬＮ−ＩｇＧの溶
離はＮａＣｆ２の濃度を上げることにより行う。好まし
くはｐＨ７，４の生理条件下、陽イオン交換樹脂を用い
て精製すればモノクローナル抗体の活性維持に有効であ
る。
ーナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧは陽イオン交換樹脂に吸着す
るが、培養液中に共存するアルブミ・ン、トランスフェ
リンの大部分は未吸着であり、本発明の効果が達成され
る。また、陽イオン交換樹脂よりのＣＬＮ−ＩｇＧの溶
離はＮａＣｆ２の濃度を上げることにより行う。好まし
くはｐＨ７，４の生理条件下、陽イオン交換樹脂を用い
て精製すればモノクローナル抗体の活性維持に有効であ
る。
本発明により回収したモノクローナル抗体は純度が高く
、例えば、医薬品として有用である。また、アフィニテ
ィークロマトグラフィーのリガンドやゲルが高価である
のに比して、本発明では陽イオン交換樹脂が安価であり
、コスト的に有利である。本発明の条件以外でのイオン
交換クロマトグラフィーに比して、本発明では陽イオン
交換樹脂量はほぼモノクローナル抗体吸着量を考慮すれ
ばよいので、コスト的により一層有利である。
、例えば、医薬品として有用である。また、アフィニテ
ィークロマトグラフィーのリガンドやゲルが高価である
のに比して、本発明では陽イオン交換樹脂が安価であり
、コスト的に有利である。本発明の条件以外でのイオン
交換クロマトグラフィーに比して、本発明では陽イオン
交換樹脂量はほぼモノクローナル抗体吸着量を考慮すれ
ばよいので、コスト的により一層有利である。
更に、本発明の陽イオン交換クロマトグラフィーは培養
液よりのモノクローナル抗体の精製における抗体回収の
主工程とすることはもとより、−旦精製回収したモノク
ローナル抗体の純度向上のため再精製工程にも用いるこ
とができる。
液よりのモノクローナル抗体の精製における抗体回収の
主工程とすることはもとより、−旦精製回収したモノク
ローナル抗体の純度向上のため再精製工程にも用いるこ
とができる。
［実施例］
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。
実施例
殺菌した１５Ｉ２容スピンナーフラスコにＩＯ℃の培地
を無菌を濾過して入れ、ヒト×ヒトハイブリドーマＣＬ
Ｎ／ＳＵＺ ８１１株の種培養よりｌＸｌ０’個接種
し、３７℃、５％Ｃ０２通空気条件下で培養した。使用
した培地はＲＤＦ培地にサブリメントとして牛血清アル
ブミンＩｇ／β、トランスフェリンｌｏｍｇ／β、イン
シュリン１０ｍｇ／β、２−メルカプトエタノール１０
−’Ｍ、モノエタノールアミン１０−’Ｍ、亜セレン酸
ナトリウム１０−９Ｍを加え、更に抗生物質のペニシリ
ンＧ ５万Ｕ／Ｉ２、アンピシリン５０ａｇ／Ｉ２、ス
トレプトマイシン５０ ｍｇ／βを加えたものである。
を無菌を濾過して入れ、ヒト×ヒトハイブリドーマＣＬ
Ｎ／ＳＵＺ ８１１株の種培養よりｌＸｌ０’個接種
し、３７℃、５％Ｃ０２通空気条件下で培養した。使用
した培地はＲＤＦ培地にサブリメントとして牛血清アル
ブミンＩｇ／β、トランスフェリンｌｏｍｇ／β、イン
シュリン１０ｍｇ／β、２−メルカプトエタノール１０
−’Ｍ、モノエタノールアミン１０−’Ｍ、亜セレン酸
ナトリウム１０−９Ｍを加え、更に抗生物質のペニシリ
ンＧ ５万Ｕ／Ｉ２、アンピシリン５０ａｇ／Ｉ２、ス
トレプトマイシン５０ ｍｇ／βを加えたものである。
６日間培養後、培養液を３００Ｏｒｐｍで２０分間遠心
分離することによりハイブリドーマを除去した。この培
養液に硫酸アンモニウムを７０％飽和となるよう入れ、
−夜４℃に放置した。生じた沈殿をＩＯ，ｏｏｏｒｐＩ
Ｉ＋で２０分間遠心分離して集め、純水２０ｍ１に溶解
後、そのうちｌ０Ｉ１１１を１０ｍＭＰＨ緩衝液（ｐＨ
７，４）２１２で透析した。４時間後、透析外液２Ｊ２
を取り換え一夜４℃で透析を継続した。
分離することによりハイブリドーマを除去した。この培
養液に硫酸アンモニウムを７０％飽和となるよう入れ、
−夜４℃に放置した。生じた沈殿をＩＯ，ｏｏｏｒｐＩ
Ｉ＋で２０分間遠心分離して集め、純水２０ｍ１に溶解
後、そのうちｌ０Ｉ１１１を１０ｍＭＰＨ緩衝液（ｐＨ
７，４）２１２で透析した。４時間後、透析外液２Ｊ２
を取り換え一夜４℃で透析を継続した。
透析液を０．２μのフィルターにより濾過後、Ｐｒｏｔ
Ｐａｋ−５Ｐ （ウォーターズ社）カラムを装着したＨ
ＰＬＣ装置を用いて精製した。毎分０．５ｍｌで１０ｍ
ＭＰＢ緩衝液（ｐＨ７，４）を１時間流した後、濾過し
た透析液２０ｍ１を毎分０．５ｍｌで流した。その後、
ｌｏｎ＋ＭＰＢ緩衝液（ｐＨ７，４）を毎分０．５ｍｌ
で流した。３０分後より、毎分トータル０．５ｍｌを保
ちながら４０分後にＩＭ ＮａＣＪ２含有１０含有１
０援濃度勾配をつけて通液し，溶離した．溶離液はＵＶ
モニターにより２８０ｎｍの吸光度を連続的に測定した
。また、溶離液は１分間隔でフラクションコレクターに
より分画採取した．溶離液の吸光度ピーク画分をＥＬＩ
ＳＡ法により測定し、ＣＬＮ−１ｇＧｇＧ画分を決定し
た，ＥＬＩＳＡ法は同相側の一次抗体として羊抗ヒトＩ
ｇＧ（Ｆｃフラクション特異性、カッベル社）を用い、
二次抗体としてペルオキシダーゼ結合羊抗ヒトＩｇＧ（
Ｆａｂフラクション特異的、カッベル社）を用いたサン
ドイツチ法によった。
Ｐａｋ−５Ｐ （ウォーターズ社）カラムを装着したＨ
ＰＬＣ装置を用いて精製した。毎分０．５ｍｌで１０ｍ
ＭＰＢ緩衝液（ｐＨ７，４）を１時間流した後、濾過し
た透析液２０ｍ１を毎分０．５ｍｌで流した。その後、
ｌｏｎ＋ＭＰＢ緩衝液（ｐＨ７，４）を毎分０．５ｍｌ
で流した。３０分後より、毎分トータル０．５ｍｌを保
ちながら４０分後にＩＭ ＮａＣＪ２含有１０含有１
０援濃度勾配をつけて通液し，溶離した．溶離液はＵＶ
モニターにより２８０ｎｍの吸光度を連続的に測定した
。また、溶離液は１分間隔でフラクションコレクターに
より分画採取した．溶離液の吸光度ピーク画分をＥＬＩ
ＳＡ法により測定し、ＣＬＮ−１ｇＧｇＧ画分を決定し
た，ＥＬＩＳＡ法は同相側の一次抗体として羊抗ヒトＩ
ｇＧ（Ｆｃフラクション特異性、カッベル社）を用い、
二次抗体としてペルオキシダーゼ結合羊抗ヒトＩｇＧ（
Ｆａｂフラクション特異的、カッベル社）を用いたサン
ドイツチ法によった。
ＣＬＮ−ＩｇＧ含有画分を集め、次のようにゲル濾過を
行った．ゲル濾過は七フアクリル５３００（ファルマシ
ア社）１０ｍＭをカラムに入れ、１０ｍＭＰＢＳを毎分
０．２ｍｌで流し、１５０分後から、上記画分１ｍｌを
毎分０．２ｍｌで５分間流し、更に１０ｍＭＰＨ３を毎
分０．２ｍｌで１２０分間流すことにより行った。流出
液をＵＶモニターで２８０ｎｍの吸光度を連続的に測定
した。また、流出液は５分間隔でフラクションコレクタ
ーで分画採取した。ＥＬ Ｉ ＳＡ法によりＣＬＮ−Ｉ
ｇＧ画分を決定し、集めたところ２、 ２ｍｇ／ｍｌ
のＣＬＮ−Ｉ ｇＧ含有溶液２．５Ｉ１１１を得た。
行った．ゲル濾過は七フアクリル５３００（ファルマシ
ア社）１０ｍＭをカラムに入れ、１０ｍＭＰＢＳを毎分
０．２ｍｌで流し、１５０分後から、上記画分１ｍｌを
毎分０．２ｍｌで５分間流し、更に１０ｍＭＰＨ３を毎
分０．２ｍｌで１２０分間流すことにより行った。流出
液をＵＶモニターで２８０ｎｍの吸光度を連続的に測定
した。また、流出液は５分間隔でフラクションコレクタ
ーで分画採取した。ＥＬ Ｉ ＳＡ法によりＣＬＮ−Ｉ
ｇＧ画分を決定し、集めたところ２、 ２ｍｇ／ｍｌ
のＣＬＮ−Ｉ ｇＧ含有溶液２．５Ｉ１１１を得た。
この液の０．５ｍｌをＮＡＰ−５ （ファルマシア社）
を用いて、１０ｍＭ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ）１
９．５）でバッファー交換した。その後、０、２μのフ
ィルターでｔ濾過し、ＰｒｏｔＰａｋ−ＤＥＡＥ （ウ
ォーターズ社）カラムを付けたＨＰＬＣ装置を用いて純
度を測定した．毎分０、５ｍｌで１０ｍＭ 炭酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ９、５）を１時間流した後、上記炉
液０．５ｍｌを同流速で流した．１分後より１０ｍＭ
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を同流速で流し
た。
を用いて、１０ｍＭ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ）１
９．５）でバッファー交換した。その後、０、２μのフ
ィルターでｔ濾過し、ＰｒｏｔＰａｋ−ＤＥＡＥ （ウ
ォーターズ社）カラムを付けたＨＰＬＣ装置を用いて純
度を測定した．毎分０、５ｍｌで１０ｍＭ 炭酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ９、５）を１時間流した後、上記炉
液０．５ｍｌを同流速で流した．１分後より１０ｍＭ
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を同流速で流し
た。
３０分後より、毎分トータル０．５ｍｌを保ちながら４
０分後にＩＭ ＮａＣｌ２含有１０ｍＭ 炭酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ９．５）となるように、直線的にＮ
ａＣβ濃度勾配をつけて溶離した．溶離液をＵＶモニタ
ーで２８０止の吸光度を連続的に測定し、吸光度ピーク
画分をＥＬＩＳＡ法により、ＣＬＮ−ＩｇＧ含有量を決
定し、その吸光度から純度を計算した．その結果この吸
光度画分は９５％以上の純度でＣＬＮ−ＩｇＧを含むこ
とが判明した。
０分後にＩＭ ＮａＣｌ２含有１０ｍＭ 炭酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ９．５）となるように、直線的にＮ
ａＣβ濃度勾配をつけて溶離した．溶離液をＵＶモニタ
ーで２８０止の吸光度を連続的に測定し、吸光度ピーク
画分をＥＬＩＳＡ法により、ＣＬＮ−ＩｇＧ含有量を決
定し、その吸光度から純度を計算した．その結果この吸
光度画分は９５％以上の純度でＣＬＮ−ＩｇＧを含むこ
とが判明した。
比較例
上記実施例で得た硫安沈殿の純粋溶解液１０ｍ１をｌｏ
ｍＭ ＰＢＳ ２Ｉ２で透析した．４時間後、透析
外液２βを取り換え一夜４℃で透析を継続した６ 透析液をプロティンＡ結合セファロース（ファルマシア
社）カラムによりＣＬＮ−Ｉ ｇＧを精製した。毎分０
．２ｍｌでｌｏｍＭＰＢｓを４時間、プロティンＡ結合
セファロース５ｍｌを充填したカラムに流した後、透析
液１０ｍ１を毎分０．２ｍｌで流した。その後２時間、
ｌｏｍＭＰＢｓを流し、更に０．１Ｍ グリシン塩酸液
（ｐＨ３，０）を５時間流し、溶離した。溶離液を５分
間隔で０．５Ｍ１−リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）０．
３ｍｌを入れた試験管で受け、フラクションコレクター
を用いて分画した。ＥＬ Ｉ ＳＡ法によりＣＬＮ−Ｉ
ｇＧ含有画分を決定し集めると１１．７ｍｌであった
。この液の１．ｏｍｌを実施例と同方法によりゲルか過
を行った。その結果、０、４ｍｇ／ｍｌのＣＬＮ−Ｉｇ
Ｇ含有溶液２．５ｍｌを得た。
ｍＭ ＰＢＳ ２Ｉ２で透析した．４時間後、透析
外液２βを取り換え一夜４℃で透析を継続した６ 透析液をプロティンＡ結合セファロース（ファルマシア
社）カラムによりＣＬＮ−Ｉ ｇＧを精製した。毎分０
．２ｍｌでｌｏｍＭＰＢｓを４時間、プロティンＡ結合
セファロース５ｍｌを充填したカラムに流した後、透析
液１０ｍ１を毎分０．２ｍｌで流した。その後２時間、
ｌｏｍＭＰＢｓを流し、更に０．１Ｍ グリシン塩酸液
（ｐＨ３，０）を５時間流し、溶離した。溶離液を５分
間隔で０．５Ｍ１−リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）０．
３ｍｌを入れた試験管で受け、フラクションコレクター
を用いて分画した。ＥＬ Ｉ ＳＡ法によりＣＬＮ−Ｉ
ｇＧ含有画分を決定し集めると１１．７ｍｌであった
。この液の１．ｏｍｌを実施例と同方法によりゲルか過
を行った。その結果、０、４ｍｇ／ｍｌのＣＬＮ−Ｉｇ
Ｇ含有溶液２．５ｍｌを得た。
この液の０．５ｍｌをＰｒｏｔＰａｋ−ＤＥＡＥを用い
て実施例と同方法により純度を測定した。
て実施例と同方法により純度を測定した。
その結果高々９０％程度の純度でＣＬＮ−Ｉ ｇＧを含
むことが判明した。
むことが判明した。
［発明の効果］
本発明によれば、培養液中のモノクローナル抗体を高純
度でかつ安価に回収することができる。
度でかつ安価に回収することができる。
手系完ネｍ正書
昭和６３年８月１８日
特許庁長官 吉 １）文 毅 殿
１、ｌＧ件の表示
昭和６３年特許願第７４５５９号
２、発明の名称
モノクローナル抗体の回収方法
３．７＋ｌｉ正をする者
事件との関係 特許出願人
名称 （８０５）三菱油化株式会社
４、代理人
５、補正命令の日付 自発
６、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄７、補
正の内容 明細書第６頁第３行目に記載のｒＡＴＣＣＡＢ−ロ９Ｑ
−
正の内容 明細書第６頁第３行目に記載のｒＡＴＣＣＡＢ−ロ９Ｑ
−
Claims (3)
- （１）モノクローナル抗体を含む培養液をｐＨ６．５〜
８．５の範囲に調整し、陽イオン交換樹脂で処理するこ
とを特徴とするモノクローナル抗体の回収方法。 - （２）モノクローナル抗体がヒト×ヒトハイブリドーマ
ＣＬＮ／ＳＵＺＨ１１株が産生するＣＬＮ−ＩｇＧであ
る請求項１記載のモノクローナル抗体の回収方法。 - （３）陽イオン交換樹脂がスルホン酸基又はカルボキシ
ル基を交換基として有するものである請求項１記載のモ
ノクローナル抗体の回収方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7455988A JPH01247096A (ja) | 1988-03-30 | 1988-03-30 | モノクローナル抗体の回収方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7455988A JPH01247096A (ja) | 1988-03-30 | 1988-03-30 | モノクローナル抗体の回収方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01247096A true JPH01247096A (ja) | 1989-10-02 |
Family
ID=13550706
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7455988A Pending JPH01247096A (ja) | 1988-03-30 | 1988-03-30 | モノクローナル抗体の回収方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01247096A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5110913A (en) * | 1990-05-25 | 1992-05-05 | Miles Inc. | Antibody purification method |
-
1988
- 1988-03-30 JP JP7455988A patent/JPH01247096A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5110913A (en) * | 1990-05-25 | 1992-05-05 | Miles Inc. | Antibody purification method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5886154A (en) | Chromatographic method for high yield purification and viral inactivation of antibodies | |
| Karlsson et al. | Purification of a neurotoxin from the venom of Naja nigricollis | |
| AU2001273907B2 (en) | A method of producing IgG | |
| Smith et al. | An affinity purified ovine antivenom for the treatment of Vipera berus envenoming | |
| EP0374625B1 (en) | Viral inactivation process | |
| CA2282843C (en) | Purification of von willebrand factor by cation exchange chromatography | |
| JP2644946B2 (ja) | ＩｇＧ− モノクロナール抗体の精製方法及びその使用方法 | |
| JPH0231689A (ja) | 百日咳トキシンの精製法 | |
| JP2001501595A (ja) | 免疫グロブリンの単離 | |
| DE3342870A1 (de) | Digitalis-antikoerper, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur therapie von digitalis-intoxikationen | |
| JPH06107561A (ja) | 静脈内相容性免疫グロブリン− ｇ− 製剤の製造方法 | |
| JPS6262153B2 (ja) | ||
| US4670543A (en) | Process for obtaining complex FVIII/vWF of therapeutical use and resulting products | |
| JPH01106828A (ja) | 高純度のウイルス保護された生物学的に活性なトランスフェリン調製物を調製する方法 | |
| US4806346A (en) | Method for isolation of antigen specific immunoglobulin | |
| AU725134B2 (en) | Method of producing an IgM preparation for intravenous application | |
| US4774086A (en) | Process for the purification, solubilization and/or detoxification of protein antigens of bacteria of the Bordetella genus using a carbonate buffer and an acellular anti-whooping cough vaccine | |
| BRPI0616199A2 (pt) | mÉtodos para produzir proteÍna a vegetariana, proteÍna a vegetariana, composiÇÕes farmacÊuticas e mÉtodo para ligar anticorpos ou fragmentos de anticorpos a uma resina de cromatografia de proteÍna a vegetariana | |
| CN112375142A (zh) | 静注新型冠状病毒人免疫球蛋白的制备方法 | |
| JP2007039454A (ja) | ベジタリアンプロテインａ調製物およびその方法 | |
| WO1992014832A1 (fr) | Procedes pour la purification de fdlb humains | |
| CN116355085A (zh) | 一种破伤风抗毒素生产方法 | |
| JP2519561B2 (ja) | 酸性糖タンパク質 | |
| CN114539416A (zh) | 一种双特异性抗体的层析纯化工艺 | |
| JPH01165393A (ja) | 組換えヒトエリスロポエチンの精製方法 |