JPH01165393A - 組換えヒトエリスロポエチンの精製方法 - Google Patents
組換えヒトエリスロポエチンの精製方法Info
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- JPH01165393A JPH01165393A JP32491087A JP32491087A JPH01165393A JP H01165393 A JPH01165393 A JP H01165393A JP 32491087 A JP32491087 A JP 32491087A JP 32491087 A JP32491087 A JP 32491087A JP H01165393 A JPH01165393 A JP H01165393A
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- erythropoietin
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は、ヒトエリスロポエチンの製造方法に関する。
〈従来技術及び問題点〉
ヒトエリスロポエチンは、腎で産生されると考えられて
いる分子量的３６，０００の糖蛋白質で赤血球系へ４と
方向づけられた幹細胞に働き、前赤芽球に分化させるこ
とにより赤血球産生を促進させ、赤血球の産生量を調節
する作用をもつ一種のホルモンであり、赤血球数を一定
に保つのに必須の物質である。
いる分子量的３６，０００の糖蛋白質で赤血球系へ４と
方向づけられた幹細胞に働き、前赤芽球に分化させるこ
とにより赤血球産生を促進させ、赤血球の産生量を調節
する作用をもつ一種のホルモンであり、赤血球数を一定
に保つのに必須の物質である。
一般に、生体が貧血状態に陥ると、貧血の程度に応じて
血中エリスロポエチン濃度が増加し、貧血を改善させよ
うとする生体の恒常性機能が働く。
血中エリスロポエチン濃度が増加し、貧血を改善させよ
うとする生体の恒常性機能が働く。
しかし、慢性腎不全に伴う貧血症においては、腎の破壊
によりエリスロボエチンの産生が認められず、血中エリ
スロボエチン濃度は増加しない。このため、慢性腎不全
患者に不足のエリスロボエチンを捕う意味でエリスロポ
エチンを投与すれば、慢性腎不全に伴う貧血が改善され
ることが期待されており、エリスロポエチンは臨床的に
慢性腎不全に伴う貧血の治療薬としての用途を有するも
のである。
によりエリスロボエチンの産生が認められず、血中エリ
スロボエチン濃度は増加しない。このため、慢性腎不全
患者に不足のエリスロボエチンを捕う意味でエリスロポ
エチンを投与すれば、慢性腎不全に伴う貧血が改善され
ることが期待されており、エリスロポエチンは臨床的に
慢性腎不全に伴う貧血の治療薬としての用途を有するも
のである。
エリスロボエチンの製造方法としては、再生不良性貧血
患者の尿やエリスロポエチン産生細胞を培養しその培養
液から天然型のエリスロボエチンを単離精製する方法、
さらには、近年ヒトエリスロポエチン遺伝子を導入した
細胞を培養しその培養液から組換えヒトエリスロポエチ
ンを単離精製する方法がある。
患者の尿やエリスロポエチン産生細胞を培養しその培養
液から天然型のエリスロボエチンを単離精製する方法、
さらには、近年ヒトエリスロポエチン遺伝子を導入した
細胞を培養しその培養液から組換えヒトエリスロポエチ
ンを単離精製する方法がある。
貧血患者圧からのエリスロボエチンの純化は１９７７年
に報告された（Ｊ、 Ｒｉａｌ、 Ｃｈｅｍ、、２５２
巻、 ５５５８頁、１９７７年）が、この文献によれば
、４種類のカラムクロマトグラフィーを含む７ステツプ
もの煩雑な精製工程を経てようやく純化が達成されてい
る。一方、精製効率の高いアフィニーティークロマトグ
ラフィーも検討されており、ヒト尿由来のエリスロボエ
チンの精製にレクチン固定化カラム（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７４巻、 ４６３３頁１９
７７年）や抗エリスロボエチン抗体固定化カラム（Ｊ。
に報告された（Ｊ、 Ｒｉａｌ、 Ｃｈｅｍ、、２５２
巻、 ５５５８頁、１９７７年）が、この文献によれば
、４種類のカラムクロマトグラフィーを含む７ステツプ
もの煩雑な精製工程を経てようやく純化が達成されてい
る。一方、精製効率の高いアフィニーティークロマトグ
ラフィーも検討されており、ヒト尿由来のエリスロボエ
チンの精製にレクチン固定化カラム（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７４巻、 ４６３３頁１９
７７年）や抗エリスロボエチン抗体固定化カラム（Ｊ。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、２５９巻、 ２７０？頁、１９
８４年）の利用が報告されている。
８４年）の利用が報告されている。
エリスロポエチンを医療目的に大量生産する場合、貧血
患者圧からの大量の純化精製は原料面での制約から実際
的とはいえず、組換えＤＮＡ技術によりエリスロボエチ
ンを大量発現するように形質転換した細胞の培養液から
の精製が唯一の方法といえる。エリスロボエチンはその
生理活性発揮のためには糖鎖が付加されていることが必
須である。したがって、形質転換する細胞としては、糖
鎖の付加が可能な真核細胞、特に哺乳動物細胞を用いる
必要がある。動物細胞の培養においては通常ウシ血清を
含む培地を用いるために、発現したエリスロポエチンの
精製は、貧血患者圧を出発材料とする場合に比べ夾雑蛋
白質の量が著しく高く、より一層の困難を伴う。それゆ
え、より効率の高い精製法の確立が望まれるのである。
患者圧からの大量の純化精製は原料面での制約から実際
的とはいえず、組換えＤＮＡ技術によりエリスロボエチ
ンを大量発現するように形質転換した細胞の培養液から
の精製が唯一の方法といえる。エリスロボエチンはその
生理活性発揮のためには糖鎖が付加されていることが必
須である。したがって、形質転換する細胞としては、糖
鎖の付加が可能な真核細胞、特に哺乳動物細胞を用いる
必要がある。動物細胞の培養においては通常ウシ血清を
含む培地を用いるために、発現したエリスロポエチンの
精製は、貧血患者圧を出発材料とする場合に比べ夾雑蛋
白質の量が著しく高く、より一層の困難を伴う。それゆ
え、より効率の高い精製法の確立が望まれるのである。
しかし、前述のレクチン固定化カラムはエリスロボエチ
ンに対する特異性が高いとはいえず、精製効率は満足で
きるものではない。また、抗エリスロボエチン抗体固定
化カラムについては、精製効率は極めて高いといえるが
、抗エリスロボエチン抗体の調整は容易ではなく、さら
に工業的規模での実用化に至るには解決されなければな
らない問題点が残されている。
ンに対する特異性が高いとはいえず、精製効率は満足で
きるものではない。また、抗エリスロボエチン抗体固定
化カラムについては、精製効率は極めて高いといえるが
、抗エリスロボエチン抗体の調整は容易ではなく、さら
に工業的規模での実用化に至るには解決されなければな
らない問題点が残されている。
〈発明の背景〉
本発明者らは、工業的規模での精製にも対応して得る簡
便かつ効率的な、組換え動物細胞培養液からのエリスロ
ポエチンの精製法を鋭意研究した。
便かつ効率的な、組換え動物細胞培養液からのエリスロ
ポエチンの精製法を鋭意研究した。
この結果、わずか３種類のカラムクロマトグラフィーを
組み合わせることにより組換えエリスロポエチンを純化
することに成功し、本発明を完成するに至った。
組み合わせることにより組換えエリスロポエチンを純化
することに成功し、本発明を完成するに至った。
く問題解決の手段〉
本発明は、ヒトエリスロポエチンを発現する組換え動物
細胞の培養液から、組換えヒトエリスロポエチンを純化
精製する方法を提供するものである。
細胞の培養液から、組換えヒトエリスロポエチンを純化
精製する方法を提供するものである。
これまでに遺伝子工学的にヒトエリスロポエチンを生産
させるために利用されている宿主動物細胞としては、Ｃ
ＯＳ細胞（Ｎａｔｕｒｅ、 ３１３巻、８０６頁。
させるために利用されている宿主動物細胞としては、Ｃ
ＯＳ細胞（Ｎａｔｕｒｅ、 ３１３巻、８０６頁。
１９８５年）、チャイニーズハムスター卵巣（ＧＨＱ）
細胞（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、 ８２巻、 ７５８０頁。
細胞（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、 ８２巻、 ７５８０頁。
１９８５年）、ナマルバ細胞（特開昭６２−１７１６９
６）、マウスＬ９２９細胞（特開昭６２−１９８３８８
）などが知られているが、いずれの細胞の培養液も本発
明による組換えヒトエリスロポエチン純化精製のための
出発材料とすることができる。
６）、マウスＬ９２９細胞（特開昭６２−１９８３８８
）などが知られているが、いずれの細胞の培養液も本発
明による組換えヒトエリスロポエチン純化精製のための
出発材料とすることができる。
本発明によれば、次の３種類のカラムクロマトグラフィ
ーを組合せることにより、組換えヒトエリスロポエチン
の純化精製が達成される。すなわち、１）カルボキシメ
チル基およびチバクロンプル（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌ
ｕｅ） Ｆ ３ Ｃ；Ａ色素を結合した担体を用いたカ
ラムクロマトグラフィー、２）ヒドロキシアパタイトカ
ラムクロマトグラフィーおよび３）ゲル濾過クロマトグ
ラフィーにより純化精製が行われる。
ーを組合せることにより、組換えヒトエリスロポエチン
の純化精製が達成される。すなわち、１）カルボキシメ
チル基およびチバクロンプル（Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌ
ｕｅ） Ｆ ３ Ｃ；Ａ色素を結合した担体を用いたカ
ラムクロマトグラフィー、２）ヒドロキシアパタイトカ
ラムクロマトグラフィーおよび３）ゲル濾過クロマトグ
ラフィーにより純化精製が行われる。
カルボキキシメチル基およびチバクロンブルーＦ３ＧＡ
色素を結合した担体としては、例えば０Ｍアフィゲルブ
ルー（バイオランド・ラボラトリ−社）を用いることが
できる。
色素を結合した担体としては、例えば０Ｍアフィゲルブ
ルー（バイオランド・ラボラトリ−社）を用いることが
できる。
尿由来エリスロポエチンの精製に０Ｍアフィゲルブルー
を適用した例はすでに報告されている（Ｂ１ｏｏｄ＋
６７巻、７１頁、 １９８６年）。それによると、０．
１５Ｍ ＮａＣ１を含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，
２で平衡化したＣＭアフィゲルブルーカラムにエリスロ
ボエチン含有尿を通すとエリスロボエチンはカラムに吸
着し、ＮａＣ１の濃度勾配溶出により０．９ＭＮａＣ１
でエリスロボエチンの溶出がみられる。一方、この条件
では血清アルブミンもカラムに吸着し、１．４Ｍ Ｎａ
Ｃ１で溶出することが知られている。したがって、ウシ
血清アルブミンを大量に含む動物細胞培養液からの組換
えエリスロポエチンの精製においては、この報告に記載
の方法では血清アルブミンも同時に回収されてしまい、
エリスロポエチン純度の向上は期待できない。
を適用した例はすでに報告されている（Ｂ１ｏｏｄ＋
６７巻、７１頁、 １９８６年）。それによると、０．
１５Ｍ ＮａＣ１を含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，
２で平衡化したＣＭアフィゲルブルーカラムにエリスロ
ボエチン含有尿を通すとエリスロボエチンはカラムに吸
着し、ＮａＣ１の濃度勾配溶出により０．９ＭＮａＣ１
でエリスロボエチンの溶出がみられる。一方、この条件
では血清アルブミンもカラムに吸着し、１．４Ｍ Ｎａ
Ｃ１で溶出することが知られている。したがって、ウシ
血清アルブミンを大量に含む動物細胞培養液からの組換
えエリスロポエチンの精製においては、この報告に記載
の方法では血清アルブミンも同時に回収されてしまい、
エリスロポエチン純度の向上は期待できない。
精製出発材料の組換え動物細胞培養液中に最も大量に存
在する夾雑蛋白質はウシ血清アルブミンであり、組換え
エリスロボエチンの精製にあたっては、ウシ血清アルブ
ミンとの分離が最大の課題といえる。 この点を解決す
べく鋭意研究した結果、限外濾過または透析することに
よりトリス−ＨＣｌ緩衝液に置換した組換えエリスロポ
エチン産生細胞培養上清をトリス−ＨＣｌ緩衝液で平衡
化した０Ｍアフィゲルブルーを用いたカラムクロマトグ
ラフィーに付した場合、トリス−ＨＣ１１衝液で平衡化
した０Ｍアフィゲルブルーはエリスロポエチンを吸着す
るが、ウシ血清アルブミンはその大部分が吸着されず、
かつ、吸着されたエリスロポエチンを食塩含有緩衝液で
溶出させることが可能なことを見出した。 しかし、
このようにして得たエリスロボエチン含有溶出液中には
、まだウシ血清アルブミンの混入が見られるため、さら
に検討を加えた結果、ＣＭアフィゲルブルーカラムの平
衡化および洗浄の緩衝液に界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を
添加することにより、はぼ完全にウシ血清アルブミンを
含まないエリスロボエチン含有？容出液を得ることがわ
かった。
在する夾雑蛋白質はウシ血清アルブミンであり、組換え
エリスロボエチンの精製にあたっては、ウシ血清アルブ
ミンとの分離が最大の課題といえる。 この点を解決す
べく鋭意研究した結果、限外濾過または透析することに
よりトリス−ＨＣｌ緩衝液に置換した組換えエリスロポ
エチン産生細胞培養上清をトリス−ＨＣｌ緩衝液で平衡
化した０Ｍアフィゲルブルーを用いたカラムクロマトグ
ラフィーに付した場合、トリス−ＨＣ１１衝液で平衡化
した０Ｍアフィゲルブルーはエリスロポエチンを吸着す
るが、ウシ血清アルブミンはその大部分が吸着されず、
かつ、吸着されたエリスロポエチンを食塩含有緩衝液で
溶出させることが可能なことを見出した。 しかし、
このようにして得たエリスロボエチン含有溶出液中には
、まだウシ血清アルブミンの混入が見られるため、さら
に検討を加えた結果、ＣＭアフィゲルブルーカラムの平
衡化および洗浄の緩衝液に界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を
添加することにより、はぼ完全にウシ血清アルブミンを
含まないエリスロボエチン含有？容出液を得ることがわ
かった。
次いで、ＣＭアフィゲルブルーカラムより溶出したエリ
スロポエチン含有画分をヒドロキシアパタイトで更に精
製する方法を検討した。ヒドロキシアパタイトをエリス
ロボエチンの精製に適用した例はすでに報告されている
（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 ＣｈｅｎＩ。
スロポエチン含有画分をヒドロキシアパタイトで更に精
製する方法を検討した。ヒドロキシアパタイトをエリス
ロボエチンの精製に適用した例はすでに報告されている
（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 ＣｈｅｎＩ。
２５２巻、 ５５５８頁、 １９７７年； Ｊ、 Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒ、 ４１７巻。
ｒｏｍａｔｏｇｒ、 ４１７巻。
１７８頁、 １９８７年）。いずれも０．５ｍＭリン酸
緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトにエリスロポ
エチンを吸着させ、２〜５ｍＭリン酸緩衝液で溶出する
というものである。一般に、リン酸塩濃度が低い条件は
どヒドロキシアパイトに強（吸着が起こり、リン酸塩濃
度を上昇させることにより吸着した物質が溶離する。本
発明者らは、ＣＭアフィゲルブルーカラムよりＮａＣ１
含有緩衝液で溶出されたエリスロボエチン含有画分をヒ
ドロキシアパタイトで精製する方法を種々検討した結果
、０Ｍアフィゲルブルーからの？容出液と同じ組成のリ
ン酸塩を含まない緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタ
イトカラムに、ＣＭアフィゲルブルー溶出画分を直接通
すことにより、大部分の夾雑蛋白質をヒドロキシアパタ
イトに吸着させ、エリスロポエチンを非吸着画分に再現
性良く回収できることを見出した。
緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトにエリスロポ
エチンを吸着させ、２〜５ｍＭリン酸緩衝液で溶出する
というものである。一般に、リン酸塩濃度が低い条件は
どヒドロキシアパイトに強（吸着が起こり、リン酸塩濃
度を上昇させることにより吸着した物質が溶離する。本
発明者らは、ＣＭアフィゲルブルーカラムよりＮａＣ１
含有緩衝液で溶出されたエリスロボエチン含有画分をヒ
ドロキシアパタイトで精製する方法を種々検討した結果
、０Ｍアフィゲルブルーからの？容出液と同じ組成のリ
ン酸塩を含まない緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタ
イトカラムに、ＣＭアフィゲルブルー溶出画分を直接通
すことにより、大部分の夾雑蛋白質をヒドロキシアパタ
イトに吸着させ、エリスロポエチンを非吸着画分に再現
性良く回収できることを見出した。
ヒドロキシアパタイト非吸着画分に得られたエリスロポ
エチンはさらに濃縮後、ゲル濾過クロマトグラフィーに
より精製される。ヒドロキシアパタイトまでの操作で得
られたエリスロポエチンには、分子量約１０万、５〜６
万および３万以下に様々な分子量の夾雑蛋白質がポリア
クリルアミドゲル電気泳動により観察されるが、ゲル濾
過クロマトグラフィーを行うことにより、エリスロボエ
チンとこれら夾雑蛋白質とが分離できる。 ゲル濾過担
体としては、セファデックスやセファアクリル（いずれ
もファルマシア社）などのゲル粒子も利用できるが、処
理速度や再現性といった面から、ＴＳＫ Ｇ３０００Ｓ
Ｗ （東洋曹達）やスーパーローズ（ファルマシア社）
などの高速液体クロマトグラフィー用担体を用いるのが
良い。 エリスロボエチンの分子量は約３６．０００で
あるが、ゲル濾過を行なうと夾雑蛋白質よりも先にカラ
ムから溶出し、これらの夾雑蛋白質との分離が可能であ
る。
エチンはさらに濃縮後、ゲル濾過クロマトグラフィーに
より精製される。ヒドロキシアパタイトまでの操作で得
られたエリスロポエチンには、分子量約１０万、５〜６
万および３万以下に様々な分子量の夾雑蛋白質がポリア
クリルアミドゲル電気泳動により観察されるが、ゲル濾
過クロマトグラフィーを行うことにより、エリスロボエ
チンとこれら夾雑蛋白質とが分離できる。 ゲル濾過担
体としては、セファデックスやセファアクリル（いずれ
もファルマシア社）などのゲル粒子も利用できるが、処
理速度や再現性といった面から、ＴＳＫ Ｇ３０００Ｓ
Ｗ （東洋曹達）やスーパーローズ（ファルマシア社）
などの高速液体クロマトグラフィー用担体を用いるのが
良い。 エリスロボエチンの分子量は約３６．０００で
あるが、ゲル濾過を行なうと夾雑蛋白質よりも先にカラ
ムから溶出し、これらの夾雑蛋白質との分離が可能であ
る。
ゲル濾過により精製されたエリスロボエチンはポリアク
リルアミドゲル電気泳動で単一バンドを呈し、ここに１
０％血清を含む動物細胞培養液から組換えヒトエリスロ
ポエチンをＣＭアフィゲルブルー、ヒドロキシアパタイ
ト、ゲル濾過の３つのカラムクロマトグラフィーの組合
せにより純化精製する方法を確立することができたので
ある。
リルアミドゲル電気泳動で単一バンドを呈し、ここに１
０％血清を含む動物細胞培養液から組換えヒトエリスロ
ポエチンをＣＭアフィゲルブルー、ヒドロキシアパタイ
ト、ゲル濾過の３つのカラムクロマトグラフィーの組合
せにより純化精製する方法を確立することができたので
ある。
次に実施例により本発明を更に詳しく説明する。
しかし、本発明はこれのみに限定されるものではなく、
本発明の技術分野において通常行われる変更をすること
ができる。
本発明の技術分野において通常行われる変更をすること
ができる。
以下の実施例において、エリスロポエチン活性はマウス
胎児肝細胞を用いた定量法（Ｅｘｐ、 Ｈｅｍａｔｏｌ
。
胎児肝細胞を用いた定量法（Ｅｘｐ、 Ｈｅｍａｔｏｌ
。
、３巻、６５頁、 １９７５年）により測定し、蛋白量
はウシ血清アルブミンを標準物質としてバイオランド社
製プロティンアッセイキットを用いて測定した。
はウシ血清アルブミンを標準物質としてバイオランド社
製プロティンアッセイキットを用いて測定した。
〈工程 １〉
ＣＭアフィゲルブルーカラムクロマトグラフィー組換え
ヒトエリスロポエチン産生ナマルバ細胞（特開昭６２−
１７１６９６）を１０％牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６
４０培地で同明細書に開示の培養条件と同一条件にて培
養し、得られた培養上清２２５０ｍｊ！を、ＣＭアフィ
ゲルブルーカラムクロマトグラフィーに先立ち、アミコ
ン社ホローファイバーシステムＣＨ２分画分子量１０．
０００）により限外濾過濃縮し、緩衝液を２ｏｌｎＭト
リスＩＩｃＩ（ｐＨ７，５）に置換した。 この試料２
００ｍ ｌ中のエリスロポエチン活性は３７４ 、００
０単位、蛋白量は９３７０■（比活性３９．９単位／■
蛋白）であった。 この試料に２０％Ｔｗｅｅｎ２０を
１０戚加え、４°Ｃで一晩静置した。
ヒトエリスロポエチン産生ナマルバ細胞（特開昭６２−
１７１６９６）を１０％牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６
４０培地で同明細書に開示の培養条件と同一条件にて培
養し、得られた培養上清２２５０ｍｊ！を、ＣＭアフィ
ゲルブルーカラムクロマトグラフィーに先立ち、アミコ
ン社ホローファイバーシステムＣＨ２分画分子量１０．
０００）により限外濾過濃縮し、緩衝液を２ｏｌｎＭト
リスＩＩｃＩ（ｐＨ７，５）に置換した。 この試料２
００ｍ ｌ中のエリスロポエチン活性は３７４ 、００
０単位、蛋白量は９３７０■（比活性３９．９単位／■
蛋白）であった。 この試料に２０％Ｔｗｅｅｎ２０を
１０戚加え、４°Ｃで一晩静置した。
この試料を２０ｍＭ ）リスＨＣＩ （ｐＨ７，５）
、 １％Ｔｗｅｅｎ２０で平衡化したＣＭアフィゲルブ
ルー（４，４ｃｍ Ｘ ２６ｃｙｎ）に添加した。 １
％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２ｏＩＩＩＭトリスｌｌＣｌ
（ｐＨ１７，５） 、 次いで、２０ｍＭ ）リス
−ＨＣｌ （ｐＨ１７，５） ８００ｄでカー１ｙムを
洗浄した後、０．６Ｍ ＮａＣ１を含む２゜１トリスＨ
ＣＩ （ｐＨ７，５） ４００ｄ、２．５Ｍ ＮａＣ１
を含む２０１トリスＨＣＩ （ｐＨ７，５）８００ ａ
ｔ！で蛋白質を段階的に溶出した。
、 １％Ｔｗｅｅｎ２０で平衡化したＣＭアフィゲルブ
ルー（４，４ｃｍ Ｘ ２６ｃｙｎ）に添加した。 １
％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２ｏＩＩＩＭトリスｌｌＣｌ
（ｐＨ１７，５） 、 次いで、２０ｍＭ ）リス
−ＨＣｌ （ｐＨ１７，５） ８００ｄでカー１ｙムを
洗浄した後、０．６Ｍ ＮａＣ１を含む２゜１トリスＨ
ＣＩ （ｐＨ７，５） ４００ｄ、２．５Ｍ ＮａＣ１
を含む２０１トリスＨＣＩ （ｐＨ７，５）８００ ａ
ｔ！で蛋白質を段階的に溶出した。
カラムに添加した蛋白質の大部分は素通り画分に回収さ
れ、エリスロボエチン活性の大部分は最後に２．５Ｍ
ＮａＣ１を含む緩衝液によって溶出した両分（画分Ａと
する）に回収された。両分Ａ （５４０ｄ）に回収され
たエリスロボエチンは３３５．０００単位（回収率８９
．６％）、蛋白量は３８８■であった。
れ、エリスロボエチン活性の大部分は最後に２．５Ｍ
ＮａＣ１を含む緩衝液によって溶出した両分（画分Ａと
する）に回収された。両分Ａ （５４０ｄ）に回収され
たエリスロボエチンは３３５．０００単位（回収率８９
．６％）、蛋白量は３８８■であった。
また、比活性は８６３単位／■蛋白となり、この操作で
約２０倍上昇した。
約２０倍上昇した。
〈工程 ２〉
ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー上記の
様に得られた画分Ａ （１３０，０００単位、１９７ｍ
ｇ）を用いて、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグ
ラフィーを行った。試料の電気伝導度を測定し、ＮａＣ
ｌｆｉ度を２．２５Ｍに調整した。この試料を２．２５
Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ｌ−リスｌｌＣｌ （ｐ
Ｈ７，５）で平衡化したバイオゲルＨＴ （バイオラン
ド、ラボラトリ−社）カラム（２，６Ｘ １２ｃｍ）に
添加した。平衡化に用いた緩衝液３００ＩＩ１１で洗浄
後、２ｍＭ’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，８）１００１１１
１．０．４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）５００戚でそ
れぞれ蛋白質を段階的に溶出した。その結果、エリスロ
ポエチン活性の大部分は、素通り、及び洗浄液の両分に
回収された。両両分を混合して画分Ｂとした。一方、カ
ラムに添加した蛋白質の６６％が０．４Ｍリン酸緩衝液
の両分に回収された。画分Ｂ （５９０ＩＩｄｌ）に回
収されたエリスロポエチンは９１，６００単位（回収率
７０．５％）、蛋白量は６．１ｍｇであった。また、比
活性は１５，０００単位／ｍｇ蛋白となり、この操作で
約２３倍上昇した。
様に得られた画分Ａ （１３０，０００単位、１９７ｍ
ｇ）を用いて、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグ
ラフィーを行った。試料の電気伝導度を測定し、ＮａＣ
ｌｆｉ度を２．２５Ｍに調整した。この試料を２．２５
Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ ｌ−リスｌｌＣｌ （ｐ
Ｈ７，５）で平衡化したバイオゲルＨＴ （バイオラン
ド、ラボラトリ−社）カラム（２，６Ｘ １２ｃｍ）に
添加した。平衡化に用いた緩衝液３００ＩＩ１１で洗浄
後、２ｍＭ’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，８）１００１１１
１．０．４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）５００戚でそ
れぞれ蛋白質を段階的に溶出した。その結果、エリスロ
ポエチン活性の大部分は、素通り、及び洗浄液の両分に
回収された。両両分を混合して画分Ｂとした。一方、カ
ラムに添加した蛋白質の６６％が０．４Ｍリン酸緩衝液
の両分に回収された。画分Ｂ （５９０ＩＩｄｌ）に回
収されたエリスロポエチンは９１，６００単位（回収率
７０．５％）、蛋白量は６．１ｍｇであった。また、比
活性は１５，０００単位／ｍｇ蛋白となり、この操作で
約２３倍上昇した。
く工程 ３〉
ゲル濾過クロマトグラフィー
工程 ２で得られた画分Ｂ （２７，０００単位、 １
．８８ｓａｇ）を、アミコン社闘１０メンブレンを用い
た限外濾過により２０Ｏｕｌ＆’Ｊｉ、縮し、ＴＳＫ
Ｇ３０００ＳＷ （７５Ｘ６００ｍｍ、 ２本連結）に
よるゲル濾過クロマトグラフィーの試料とした。ＴＳＫ
Ｇ３０００ＳＷノ溶雛液は５０ｍＭ ＮａＣ１を含
む２０ＩＩＭトリスＨＣＩ （ｐＨ７，５）を用い、流
速は０．６１ｒｄｌ／ｍｉｎとし、２８０ｎｍの吸光度
でクロマトグラフイーをモニターした。溶出時間４８〜
５８分にみられる単一ピークを分取し、５０％グリセリ
ンを含む０．２５ｍＭ ＨＥＰｔｉＳ（ｐＨ７，５）に
対して透析した。透析後の試料の１．５７ｄ中のエリス
ロポエチン活性は２２゜５００単位（回収率８３．３％
）であり蛋白質は１１１μｇであった。また比活性は２
０３０００Ｕとなり、この操作で約１４倍上昇した。こ
のようにして精製した試料を５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行ない、銀染色により蛋白質を染色し
たところ、エリスロボエチンは分子量３４−４０ＫＤａ
に単一バンドとして検出された（第１図）。
．８８ｓａｇ）を、アミコン社闘１０メンブレンを用い
た限外濾過により２０Ｏｕｌ＆’Ｊｉ、縮し、ＴＳＫ
Ｇ３０００ＳＷ （７５Ｘ６００ｍｍ、 ２本連結）に
よるゲル濾過クロマトグラフィーの試料とした。ＴＳＫ
Ｇ３０００ＳＷノ溶雛液は５０ｍＭ ＮａＣ１を含
む２０ＩＩＭトリスＨＣＩ （ｐＨ７，５）を用い、流
速は０．６１ｒｄｌ／ｍｉｎとし、２８０ｎｍの吸光度
でクロマトグラフイーをモニターした。溶出時間４８〜
５８分にみられる単一ピークを分取し、５０％グリセリ
ンを含む０．２５ｍＭ ＨＥＰｔｉＳ（ｐＨ７，５）に
対して透析した。透析後の試料の１．５７ｄ中のエリス
ロポエチン活性は２２゜５００単位（回収率８３．３％
）であり蛋白質は１１１μｇであった。また比活性は２
０３０００Ｕとなり、この操作で約１４倍上昇した。こ
のようにして精製した試料を５ＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行ない、銀染色により蛋白質を染色し
たところ、エリスロボエチンは分子量３４−４０ＫＤａ
に単一バンドとして検出された（第１図）。
第１図は本発明により精製された組換えヒトエリスロポ
エチンのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果
を示す図である。 レーンｌは分子量マーカー、レーン
２はエリスロボエチンの電気泳動結果である。 （完） 図面の浄書 第１図 （ｋＤａ） ｌ ２ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６２年 特許願 第３２４９１０号２、発明の名称 組換えヒトエリスロポエチンの精製方法３、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 大阪市東区北浜５丁目１５番地 （２０９）住友化学工業株式会社 、−。 ４、代理人 大阪市東区北浜５丁目１５番地 連絡先 置 （０６）２２０−３４０４５、補正命令の
日付（全送日） 昭和６３年３月２９日 ６、補正の対象 図面 ７、補正の内容 第１図を別紙の通りに補正する。
エチンのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果
を示す図である。 レーンｌは分子量マーカー、レーン
２はエリスロボエチンの電気泳動結果である。 （完） 図面の浄書 第１図 （ｋＤａ） ｌ ２ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６２年 特許願 第３２４９１０号２、発明の名称 組換えヒトエリスロポエチンの精製方法３、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 大阪市東区北浜５丁目１５番地 （２０９）住友化学工業株式会社 、−。 ４、代理人 大阪市東区北浜５丁目１５番地 連絡先 置 （０６）２２０−３４０４５、補正命令の
日付（全送日） 昭和６３年３月２９日 ６、補正の対象 図面 ７、補正の内容 第１図を別紙の通りに補正する。
Claims (2)
- （１）ヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡでヒト
エリスロポエチンを生産するように形質転換された動物
細胞の培養液を、カルボキシメチル基およびチバクロン
ブルーＦ３ＧＡを結合した不溶性担体と接触させ、組換
えヒトエリスロポエチンを該担体に吸着させた後、これ
を塩類溶液で溶離し、次いでこれをヒドロキシアパタイ
トに接触させることにより該組換えヒトエリスロポエチ
ンに含まれる夾雑物を該ヒドロキシアパタイトに吸着さ
せ、組換えヒトエリスロポエチンを非吸着画分として回
収し、これをさらにゲル濾過クロマトグラフィーにより
精製することを特徴とする組換えヒトエリスロポエチン
の精製方法。 - （２）カルボキキシメチル基およびチバクロンブルーＦ
３ＧＡ色素を結合した担体がＣＭアフィゲルブルーであ
り、ゲル濾過クロマトグラフィー担体がセファデックス
やセファアクリル、ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ或いはスー
パーローズであることを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32491087A JPH01165393A (ja) | 1987-12-21 | 1987-12-21 | 組換えヒトエリスロポエチンの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32491087A JPH01165393A (ja) | 1987-12-21 | 1987-12-21 | 組換えヒトエリスロポエチンの精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01165393A true JPH01165393A (ja) | 1989-06-29 |
Family
ID=18170985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32491087A Pending JPH01165393A (ja) | 1987-12-21 | 1987-12-21 | 組換えヒトエリスロポエチンの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01165393A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001511343A (ja) * | 1997-07-23 | 2001-08-14 | ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー | 内因性遺伝子活性化によるエリスロポエチンの製造 |
| JP2014532080A (ja) * | 2011-10-18 | 2014-12-04 | チョン クン ダン ファーマシューティカル コーポレーション | 低い等電点を有するエリスロポエチン類似体の精製方法 |
| EP3613486A1 (de) * | 2018-08-24 | 2020-02-26 | UGA Biopharma GmbH | Verfahren und anlage zur reinigung von epo und/oder einem epo-derivat |
-
1987
- 1987-12-21 JP JP32491087A patent/JPH01165393A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001511343A (ja) * | 1997-07-23 | 2001-08-14 | ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー | 内因性遺伝子活性化によるエリスロポエチンの製造 |
| JP2014532080A (ja) * | 2011-10-18 | 2014-12-04 | チョン クン ダン ファーマシューティカル コーポレーション | 低い等電点を有するエリスロポエチン類似体の精製方法 |
| EP3613486A1 (de) * | 2018-08-24 | 2020-02-26 | UGA Biopharma GmbH | Verfahren und anlage zur reinigung von epo und/oder einem epo-derivat |
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