JPH01254204A - ウイルス除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、蛋白質水溶液中に存在するウィルス除去方法
に関する。

本発明の好ましい適用例として下記のような用途が挙げ
られる。

（１）　　ヒト血漿あるいは血液中からのウィルス除去
（輸血用血景の製造法） （２）プール血漿中あるいは血漿分画製剤の製造工程中
での蛋白質水溶液からのウィルス以外（血漿分画製剤の
製造） （３）遺伝子工学で使用される蛋白質を含む薬剤あるい
は水溶液からのウィルス除去 （４）細胞培養液中のウィルス除去 （５）蛋白質を含む臨床検査試薬中のウィルス除去 （６）蛋白質を含む注射用試薬中からのウィルス除去 （７）　　ワクチン製造工程中での目的のウィルス以外
のウィルスの混入防止 この他、本発明は医学、生物化学、畜産分野等において
広く利用できる。特に生物由来の原料から有用物質を回
収する際、生物に混入する既知のウィルスあるいは将来
発見されることが予想されるウィルス、あるいは感染原
因物質の存在は認められるが、その物質がウィルスかど
うか明らかでない物質（例えばクロイッフエルト・ヤコ
プ病原因物質）の除去に本発明は利用できる。

〔従来の技術〕

水溶液中のウィルスを除去する方法として特開昭６０−
１４２８６０号公報、特開昭６０−１４２８６１号公報
に記載された方法がある。これらの方法に用いられる膜
は実効膜厚つが５μｍ以上で均質な膜構造を持つ膜、特
にポリオレフィンで構成表され、孔の形はスリット状（
短冊状）でしかも答礼は規則的に、かつ、平行に配列し
ている。例えば孔の相対的な位置関係は、はぼ繊維軸方
向に対して垂直な方向に隣接し、しかもスリットの長軸
方向と繊維軸方向とは一致し、孔の長軸方向の端はほぼ
一直線上に配列した構造を有する。この膜を用いた濾過
方法（特開昭６０−１４２８６０号公報）ではウィルス
の培養液の上澄を塩類溶液で１０倍希釈したいわばウィ
ルスを含む、蛋白質濃度が１％以下の蛋白質の低濃度水
溶液で膜間差圧（八Ｐ）が　１００鶴Ｈｇ以下での濾過
が開示されているのみである。蛋白質濃度が１％以上で
、△Ｐが２００ｗｍＨｇと大きくなれば濾過速度の経時
的な減少が顕著となり、上記の公知の方法では、濾過速
度及び濾過容量の点で蛋白質やアミノ酸等を溶解する水
溶液中のウィルス除去の工業的手段として利用すること
は困難であった。また得られた濾液の生物活性は濾過前
のそれに比べて著しく低下する。

特開昭６１−２５４２０２号公報には、最小の面内平均
孔径が０．０２〜０．２μｍで、かつ分離すべき微生物
粒子の最小の粒子直径の１．１倍以下、０．３倍以上で
あり、最小の面内空孔率が１０％以上の銅アンモニアセ
ルロース多孔性中空繊維を用いたウィルス除去法が示さ
れている。具体例としてアルブミン水溶液中のタバコモ
ザイクウィルスを除去しアルブミンの透過率が０．４３
でウィルスの除去率が９９％の結果を得ている。ただし
タバコモザイクウィルスの大きさは直径０．１５８μｍ
であり最小の面内平均孔径は０．１３μｍでありウィル
ス径よりも小さい、ここで注意すべきことは、最小の面
内平均孔径は走査型電子顕微鏡法で測定される。この方
法で得られた平均孔径は本発明で採用される水濾過速度
法での平均孔径２ｒｆの約３倍である。この方法に従う
と、直径０．０４２μｍのＢ型肝炎ウィルスを除去する
には、最小の面内平均孔径（この公報では単に平均孔径
）　０．０４８４μｍ以下の中空糸を利用しな（ではな
らない。この際アルブミンの透過率は０．２以下である
。本公報にはタバコモザイクウィルスより直径がはるか
に小さな大腸菌ファージφｘ１７４　（該ファージの直
径２５ｎｍ）を用いた例は示されていない。このウィル
スを除去するには、最小の面内平均孔径が０．０２７５
μｍ以下でなくてはならない。この場合、アルブミンの
透過率は０．１以下であることが予測できる。蛋白質と
ウィルスとが共存する液体を本公報に示された方法で濾
過しても、濾液中の蛋白質濃度は著しく低く、また濾過
速度の経時的な低下が大きい。

一方、特開昭６１−１６８３６７号公報にはＢ型肝炎ウ
ィルス除去フィルターが開示されている。

本公報によればＨＢｓ抗原陽性のヒト新鮮血漿を濾過し
た濾液中には０．０４２μｍのゾーン粒子は電子顕微鏡
観察では認められず、またアルブミンの透過率１００％
、ｒ−グロブリンの透過率９６％であった。しかしその
際採用された濾過条件は膜間圧力（△Ｐ）が５０ｍＨｇ
以下である。そのため濾過速度が著しく小さく、工業的
に血漿中のウィルスを除去する用途には利用できない。

濾液中の蛋白質の生理活性を保持するためには、短時間
で濾過を終了する必要がある。濾過速度を大きくする一
つの方法として膜間圧力差を１００鶴Ｈｉ以上にするこ
とが推測できる。しかし本公報に開示されているフィル
ターでは、この圧力を高めるほど蛋白質水溶液の濾過速
度の経時的な低下が著しく、同時に蛋白質の透過率が減
少する。

このような挙動は被濾過流体が純水または無機塩類のみ
を含む水溶液では認められなかった点である。これはこ
の除去フィルターを構成する高分子素材のアルブミンの
吸着量が１００μｇ／ｒｄをはるかに越えることに原因
しているものと考えられる。

さらに、実施例によれば、ゾーン粒子の阻止率は９９％
程度（電子顕微鏡法によるウィルスの観察法を採用して
いるため、この方法での検出限界）であるから、ゾーン
粒子に比べて直径が約１７２にすぎない大腸菌ファージ
φｘ１７４の阻止係数は２未満である。

ここで阻止係数は次式で定義される。

ただし、被濾過液体はφｘ１７４の培養液からφｘ１７
４を濃縮し、滅菌水で設定濃度１０”ＰＦＵ／−以上の
液体を意味する。

高分子多孔膜で平均孔径を小さくすればウィルスの除去
率は上昇するが濾過速度が減少し、濾液中の蛋白質濃度
が減少する。平均孔径が大きくなればウィルス除去率は
９９％未満となりウィルス除去用膜として実用的には利
用できなくなる。

〔本発明が解決しようとする問題点〕

蛋白質水溶液中のウィルスを除去して、蛋白質を回収す
る場合、ウィルス除去の要求達成レベルは、蛋白質回収
のそれに比べて格段に高い。多孔膜を用いてウィルス除
去を行う場合、蛋白質の透過率〔（濾液中の蛋白質濃度
７元液中の蛋白質濃度）ｘｌｏＯ］は１〜９９％の範囲
での議論が一般的であるのに対して、期待されるウィル
スの除去率（（１−（濾液中のヘイルス濃度／元液中の
ウィルス濃度））　Ｘ１００　）は９９．９９〜９９．
９９９９９９％である。そこで、先ずウィルスの除去に
着目するならば、膜の孔径を小さくするか、孔径の代替
としてポリスチレンラテックス粒子のような特定粒子の
阻止係数を大きくすることによってウィルスの除去率は
向上するであろう、しかし、ウィルスの除去率の向上に
伴って蛋白質の透過率が低下すると共に、透過速度が低
下する、ウィルス除去前後における蛋白質組成の変化が
大きくなる、といった問題が生じる。

本発明は、蛋白質水溶液からウィルスの除去と蛋白質の
回収という相反する問題点を高レベルで解決する方法を
提案するものである。即ち、本発明の目的は、 （ａ）蛋白質の透過率および回収率が大きい。

（ｂ）ウィルス除去前後で蛋白質の組成変化が少ない。

（Ｃ）ウィルスの除去率が大きい。

（ｄｌ上記（ａ）〜（Ｃ）が短時間で行われる。

＋ｅｌ上記（ａ）〜（Ｃ）の状態が長時間維持される（
経時変化が少ない） という要求を達成できるウィルス除去方法を提案するこ
とである。

〔問題を解決するための手段〕

本発明の目的は、大腸菌ファージφｘ１７４の阻止係数
（Ｔ）が２以上で、かつ、５重量％のヒト血清アルブミ
ン水溶液の濾過速度（Ｊｐ）と純水の濾過速度（Ｊｗ）
の比（Ｊｐ／Ｊ譬）が１１５０以上の高分子多孔膜に、
蛋白質水溶液を通して、蛋白質水溶液中に存在するウィ
ルスをこの膜で捕捉することにより達成される。

本発明で使用する高分子多孔質は、大腸菌ファージφｘ
１７４の阻止係数（Ｔ）が２以上で、かつ、５重量％の
ヒト血清アルブミン水溶液の濾過速度（Ｊｐ）と純水の
濾過速度（Ｊ鍔）の比（Ｊｐ／九）が１１５゜以上であ
ることが必要である。

Ｔが２以上の場合ウィルス種とは無関係にヒト血漿中の
既知ウィルスの除去率が９９．９％以上となる。除去前
の蛋白質水溶液、中のウィルス濃度が極めて低い場合に
は透過率が９９％以上であれば、ライスル除去の目的が
達成される場合もある。しかし、利用範囲を一層広げる
ためにはＴが３以上であることが好ましい。

ウィルスを除去すると同時に蛋白質を効率良く回収する
ためにはＪｐとＪ−の比を考慮することが必要である。

本発明者らは、Ｊｐ／Ｊｗの異なる各種の高分子多孔膜
を用いて検討を行った結果、Ｊｐ／Ｊｗが大きくなるに
伴ってウィルスの除去と蛋白質の回収が短時間で行われ
ると共に、ウィルス除去前後に於いて蛋白質の組成変化
が少なく、しかも、これらの経時変化を少なくすること
ができることを見だした。かかる観点がら、Ｊｐ／Ｊｗ
は１１５０以上であることが必要であり、好ましくは１
／２０以上、より好ましくは１　／１０以上である。

このような高分子多孔膜ではＴが２以上であればヒト血
漿中の既知ウィルスの除去率が９９．９％以上となる。

Ｊ　１）　／　Ｊ　ｗ　　が１１５０未満ではウィルス
除去と蛋白質の回収の効率が低いのみならず、時間の経
過と共に多孔膜表面に蛋白質のケーク層が形成され、−
層これらの効率が低下する。

高分子多孔膜のアルブミン透過率（アルブミンを５重量
％溶解した水溶液を高分子多孔膜で濾過した際に濾過１
０分後のアルブミン透過率）が６０％以上の場合には、
蛋白質のケーク層が形成され難くなり、蛋白質の回収率
７０％以上、ウィルス除去率９９．９９％以上が達成可
能になる。

高分子多孔膜のアルブミン吸着率（アルブミン濃度５０
０ｐｐｍの０．９重量％の生理的食塩水溶液からの２５
℃におけるアルブミン吸着量）が１００μｇ／Ｉ以下の
場合には、ウィルス除去前の蛋白質水溶液の蛋白質濃度
が１重量％以上であっても、ウィルス除去と蛋白質回収
の効率の経時的な低下を防止できるので好ましい。

高分子多孔膜の平均孔径は、水濾過法による平均孔径で
０．０１〜０．２０μｍが好ましい。多孔膜の形態は、
平膜、チェープ状膜、中空糸膜等が挙げられる。膜厚は
１０〜２００μｍが好ましい。さらに好ましくは２０〜
８０μｍである。中空糸膜の場合、内径は１００μｍ〜
ｌ　ｍｍが好ましい。

高分子膜の素材としては、例えば、ポリビニルアルコー
ル、エチレン・ビニルアルコール共重合体、再生セルロ
ース、ポリウレタン、ムコ多糖類、低置換度酢酸セルロ
ース、低置換度酪酸セルロース、硫酸セルロース、ポリ
メチルメタアクリレート、ポリアクリル酸、ポリスチレ
ン等が挙げられる。一般には、アルブミン吸着量の低い
親水性高分子や疎水性高分子に親水化を施したものが好
ましく、ｍアンモニア法再生モルロース、ポリビニルア
ルコールを主成分とする高分子、部分ケン化セルロース
が好ましい。濾液の生体への影響が小さい点からは、銅
アンモニア再生セルロースが最適である。

蛋白質水溶液としては、特に限定されるものはないが、
家畜やヒト血漿、家畜やヒト血漿由来の蛋白質を溶解し
た水溶液が本発明では好適に採用される。本発明は、蛋
白質とウィルスの濃度の比が１０以上（重量比）の蛋白
質水溶液からウィルスを除去する際に、特に有効である
。また各種アミノ酸等が共存しても差し支えない。

ウィルス除去に際して、蛋白質水溶液を膜面に沿って、
並行に流しながら濾過を行う方法（平行濾過）と、蛋白
質水溶液をほぼ静止状態下で膜に接触させて濾過を行う
方法（垂直濾過）がある。

本発明の目的を効率良く達成するうえからは、濾過対象
となる水溶液の透明度が低い場合の工業的用途及び比較
的安定な蛋白質の回収の場合は平行濾過が好ましい。平
行濾過に際して、蛋白質水溶液の平均流れ速度は１０ｍ
ｇ／ａｎ！・分収上が好ましく、６０ｍｇ／ｃｒＡ・分
収上がより好ましく、１４０ｍ１　／　ｃｎｌ・分が最
も好ましい。平均流れ速度が１０ｍ１　／　ｃａｔ・分
収上では、濾過速度の経時変化が極めて小さくなる。単
位膜面積あたりの濾過量が１０１／ｒｄ以下で特に短時
間の濾過が要求される場合には垂直濾過が好ましい。

高分子多孔膜としては中空糸膜を用いる場合、蛋白質水
溶液を中空糸の外側から内側に通過させてもよいし、そ
の逆でもよい。

除去すべきウィルスは限定されない。本発明はエイズウ
ィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、成人Ｔ細胞白血病ウィルス
、ポリオウィルスその他人、および家畜を宿主とするあ
らゆるウィルスの除去に適用できる。

ヒト血漿中のウィルスを平行濾過方式で除去する場合、
水濾過法による平均孔径を０．０１５〜０．１１μｍと
し、濾過速度変動率が１０％以内になるように膜間差圧
を制御しつつ濾過することが工業的な目的の場合には好
ましい。また血漿中から一度の濾過によりウィルスの除
去された血漿を得る目的では、膜表面における血漿の流
れ速度がひずみ速度表示で１０ｓｅｃ−’以上であるこ
とが好ましい。

被分離液体として血液を遠心分離で得られたヒト血漿、
または、血液から高分子膜によって作製したヒト血漿を
採用した場合でヒト血漿を人間の体内へ輸注することを
目的としている場合、即ち輸血用血漿の製造を目的とす
る場合には、水濾過速度法による平均孔径は０．０３〜
０．０６μｍ１膜厚はこの平均孔径の８００〜３０００
倍、垂直濾過方式で、膜間差圧は０．０５〜０．３気圧
の範囲が好ましい。

蛋白質水溶液、ウィルスの種類に応じて、高分子多孔膜
の平均孔径、膜厚、蛋白質水溶液の流れ速度および濾過
方法を適宜設定することにより、最適の効果が達成され
る。例えば、血漿中のエイズウィルスを除去する場合、
水濾過速度法の平均孔径を０．０１５〜０．１１μｍ、
膜厚はこの平均孔径の１０２〜１０３倍、膜表面におけ
る血漿の平均流れ速度をひずみ速度表示で２０００ｓｅ
ｃ−’以下、好ましくは濾過の初期は膜間差圧を低く設
定し、徐々にこの圧力を増加させるのが好ましい。血漿
中のＢ型肝炎ウィルスを除去する場合、水濾過法の平均
孔径を０．０１５〜ｏ、ｏａｏμｍ、膜厚はこの平均孔
径の５００〜２００００、膜表面における血漿の流れ速
度をひずみ速度表示で１０００ｓｅｃ−’以下とするの
が好ましい。

蛋白質の回収率および透過率を低下させることな（ウィ
ルスの阻止係数をさらに高めるには、問分子多孔膜の孔
構造として下記のような特別な構造を与えることが好ま
しい。即ち多孔膜の表裏面の孔構造がネットワーク構造
であり、かつ、膜厚方向にはネットワークが積層した多
層構造をとっている。ここでネットワーク構造とは高分
子が網目状の凝集体を構成し、網の目に対応するのが孔
である構造である。多層構造とは（ａｌ高分子多孔膜の
表面あるいは裏面に平行な面内では注目する面内の場所
に依存せず、はぼ同一の孔径分布と花形状を持ち、この
−枚の面では濾過性能の点で一枚のスクリーンフィルタ
ーとして近似できる。（ｂ）核子面内での相互の位置関
係は実質的には無秩序かあるいは多孔膜が中空糸の場合
には、繊維軸方向へのみ配列する規則性が認められ、（
Ｃ１この面内ではある特定された孔径分布と平均孔径、
面内空孔率が測定でき、（ｄ）膜表面からの厚さ方向で
の距離を異にする面の相互の間には、平均孔径、孔径分
布、面内空孔率の何れもが膜表面からの距離に依存して
変化し、各層間の孔には相互に事実上相関性は無い。層
状構造を持つ多孔膜は、液体窒素中で破断し、その断面
を電子顕微鏡で観察すると、直径０．１〜２μｍの粒子
（粒子径を２ｓｚとする）の堆積物で近似される。層状
構造の層数は、膜厚をＴとすると層数は〆「〒／４Ｓ２
で与えられる。

層数を１０以上にするとウィルスの除去率は極端に大き
くなる。高分子素材として親水性高分子を採用し、さら
に、該高分子多孔膜の形状として内径が１００μｍ〜１
ｍ、膜厚が１０〜１００μｍである中空糸を採用すれば
、被分離液体に対して蛋白質の透過性、蛋白質の回収率
、ウィルス阻止係数の何れも高性能で安全な分離特性を
与えることができる。

本発明で示された孔構造の特徴を持つ膜はｆａ）ミクロ
相分離を発生させ（ｂ）該分離で発生した粒子（高分子
濃厚相が粒子となる場合が大部分であが、高分子希薄相
が粒子となる場合もある）の直径が５０ｎｍｍ以上１１
０００ｎ以下となるように成長させ（Ｃ，１該分離が膜
の表裏面に沿って同時に発生し、膜厚方向に進行させる
ために、厳密に原液および凝固液組成および温度が制御
されている条件下で製膜される。

銅アンモニア法再生セルロース多孔膜を例にして本発明
で示した多孔膜の製法を説明する。セルロース濃度を２
〜１０％の範囲内で設定した銅アンモニア溶液を調整す
る。紡糸原液から未溶解成分、および気泡を除去する。

紡糸原液は１０〜４０℃の設定された温度に厳密に制御
（通常±０．１℃以内に）されている。２重紡口の中央
紡出口より厳密に温度と組成が制御された凝固（中空剤
）を吐出する。吐出された紡糸原液は直ちに凝固浴を通
過する。この際の凝固浴には中空剤と類似の組成液を採
用すればよい。ただし凝固浴の液組成と液温度とは厳密
に制御されていることが必要である。

中空剤と凝固浴中の液体とによりミクロ相分離が発生す
る。凝固浴の長さ、紡速、中空剤の吐出速度、巻取り速
度を制御することにより原液中に粒子を発生させ、直径
５０ｎｍ〜１１０００ｎの範囲で最終の中空糸内部の粒
子径を定めることができる。かくして得られた中空糸を
稀硫酸で再生後水洗し、緊張下で乾燥する。

被分離液体としてヒト血漿を、あるいは、ヒト血漿から
血漿分画製剤を製造する工程におけるヒト血漿由来の蛋
白質を溶解した水溶液を採用し、水濾過速度法による平
均孔径が１１０ｎｍ以下で１５ｎＩｍ以上の本発明の高
分子多孔膜を採用して濾過速度が一定となるように、か
つ膜間差圧をある一定圧以下となるように制御しつつ濾
過すると、濾液中のエイズウィルス濃度を１０−Ｓ以下
にし、かつ、総蛋白の質の濃度をヒト血漿中のそれの７
０％以上で、かつ、濾過容量を大きくできる。この一定
濾過速度の値が小さいほど、濾液中の蛋白質濃度が高く
、また濾過容量（膜面積当たりの有効濾過量）も大きく
なる。濾過速度として、ヒト血漿の場合には平均孔径（
ｎｍ単位での）ｘ２／／ｎｆ・ｈｒ以下に設定するのが
好ましく、ヒト血漿由来の蛋白質を溶解した水溶液の場
合には、ヒト血漿の場合の２倍以上の濾過速度を最大値
として設定するのが好ましい。本発明方法の工業的な実
施には以下の装置を組み合わせることが好ましい。即ち
、被分離液体を貯蔵するための冷却ジャケット付タンク
部と、本発明の高分子多孔膜で構成される濾過部と、濾
液を回収する回収部と、被分離体を濾過部に輸送するた
めの送液ポンプ部と少なくとも４部で構成され、それぞ
れの部がサニタリ配管で連結され、かつ、少なくとも送
液ポンプ部を中心としたサニタリ配管部には該配管内の
温度を制御するための冷却装置が付加される。これらの
一連の装置により、濾過によりウィルスを除去する過程
中での蛋白質の生理活性の低下が防止できるのみ・でな
く、蛋白質の透過率が増大する。これは被分離液体中の
蛋白質の溶解状態にもそれぞれの装置が影響を与えてい
るかもしれい。被分離流体としてプール血漿が採用され
た場合、上記装置に加えて濾過部に対して被分離液体が
流動下での濾過（即ち、平行濾過）が可能なように被分
離体の循環回路を付加し、更に膜間差圧を与えるための
該循環回路の流体制御装置付加し、かつ、股間差圧を制
御するかあるいは一定の濾過速度を与えるための加圧（
あるいは、減圧）あるいは、定量送液ポンプを付加すれ
ば、３０００１のように大容量のプール血漿よりウィル
スを除去した血漿が作製出来る。

図−１に本発明に採用できる濾過装置の一例を示す。Ｔ
、は冷却ジャケット付貯蔵タンクで、通常４℃の温度に
制御されている０本タンク内に被濾過血漿を貯蔵する。

本タンクは大気圧へ水面下で解放できるように除菌フィ
ルターＦが付属されている。該タンク内、あるいは、回
路Ｃ１あるいは、循環用送液ポンプＰ＋、ｈ間の流体の
総蛋白質濃度、あるいは、粘度が一定に保たれるように
タンクＴ２に希釈用液体を貯蔵する。希釈用液体として
は、生理的食塩水、あるいは、緩衝液が採用される目的
によっては、電解質溶液やエタノール溶液を用いても良
い。タンクチ２内の圧力を大気圧下に解放できるように
、除菌フィルターＦが付属している。希釈用液体は送液
ポンプＰ、によって、タンクＴ１へ送液される。Ｍには
本発明の高分子多孔膜を装着され、該膜に負荷される圧
力は供給ポンプ　ｐ、、ｐ２によって定めることが出来
る。高分子多孔膜表面における被濾過液体の速度はＰ＋
、ｈとで厳密に制御される。この際入口、出口の圧力は
、圧力ゲージＧ＋、Ｇｚで計測される。被濾過流体が流
れる回路Ｃはサニタリ配管され、かつ、冷却ジャケット
が付属している。送液ポンプＰＩ、Ｐ２によって、温度
が上昇するのを防止する工夫をすることが望ましい。高
分子多孔膜で濾過された濾液は貯蔵タンクＴ３に保存さ
れる。該タンクを大気圧下、または、真空ラインへの接
続が可能なように、出口には除菌フィルターＦが↑３に
付属している。

高分子多孔膜の表面における蛋白質濃度が１０％を超え
る場合には、図−２に示す透析装置を利用するのが良い
。

図−１の装置と同様に貯蔵タンクＴ＋、Ｔｚ、’ｈは大
気圧へ解放が可能なように、除菌フィルターＦが付属し
ている。貯蔵タンクＴ、Ｔ２．Ｔ３のそれぞれ被濾過液
体、透析液、透析液と高分子多孔膜Ｍによる濾液との混
合液が貯えられる。高分子多孔膜へ負荷される膜間圧力
は、送液ポンプＰ、と貯蔵タンクＴ、内の液レベルによ
る静水圧、および透析液の圧力制御のための流量コント
ロールバルブＳＩによって設定される。膜間圧力は圧力
ゲージＧ２と＋Ｇ、ｌとによって計測される。送液コン
トロールバルブＳ２によって被濾過液体の高分子多孔膜
Ｍの表面の流れ速度が設定される。

ヒト血漿あるいは、蛋白質濃度が５％以上で蛋白質とし
て分子量３０万以上の物質が多量に混在する場合、ある
いは、ウィルス以外の微粒子が多量に混在している場合
において目的とする蛋白質の回収率を上げるには以下の
ような工夫を行えば良い。（１）蛋白質の変性が顕著で
無い限り出来るだけ高温で濾過する。（２）溶液中の微
粒子の直径を多孔膜の水濾過速度法における平均孔径の
１００倍以上になるようにする。（３）溶液の粘度を低
下させる。（４）プレフィルタ−で前段濾過をする。（
１）−（４）の工夫のほかに平均孔径を異にする多孔膜
を組み合わせて多段の濾過をすれば蛋白質の透過率は上
昇し、ウィルスの阻止係数は上昇する。

以下に本発明で測定される種々の物性値の測定方法をま
とめて示す。

アミノ酸濃度：反応液体クロマトグラフィを用いて各種
アミノ酸の濃度をそれぞれ単独に測定した蛋白質濃度：
アルブミンの場合は紫外吸収スペツクルの波長２８０ｎ
ｍの透過率より予め定めた検量線を用いて算出した。

大腸菌ファージφｘ１７４の濃度：ファージ原液と大腸
菌培養液とを混合し、大腸菌にファージを感染させる。

この液を平均孔径０．２２μｍのフィルターで濾過し、
濾液を凍結乾燥後、濃縮倍率に応じて滅菌水を添加する
。これを濾過前の原液とする。大腸菌懸濁液と原液、ま
たは、濾液と寒天借地を混合し、寒天プレート上に均一
に広げ寒天を固化させる。固化後３７℃の恒温培養液中
に１２〜１８時間倒置しプラークを形成させる。このプ
テーク数を硅酸し、ファージ濃度を通常の方法で計測し
た。

アルブミン透過率：ヒト血清アルブミンを５重量％の濃
度で純水中に溶解する。得られた溶液を用いて股間差圧
２００ｍｍＨｇで膜の有効濾過面積１Ｍあたり、０．１
１の濾過をした際、濾過前、および、濾液のアルブミン
濃度（それぞれＣ０および、Ｃｒ）より次式で透過率を
算出する。

透過率＝Ｃｒ／ＣｏＸ　１００　　（χ）純水、および
、５重量％のアルブミン水溶液の濾過速度：純水、およ
び、５重量％のヒト血清アルブミン水溶液を２０℃で膜
間差圧２００ｍＨｇで濾過する。濾液量で０．０５１／
ｒｒｌにおける平均の濾過速度を算出しこれを濾過速度
とする。アルブミン吸着量：ヒト血清アルブミンを０．
９％の生理食塩水に所定濃度（５００ｐｐｍ）で溶解さ
せる。この水溶液（２５℃）中にＢＥＴ法で計測した表
面積既知の高分子多孔膜を２４時間浸せきする。浸せき
前後のアルブミン濃度変化とから吸着量を算出する。高
分子多孔膜の構造：高分子多孔膜を樹脂（例えば、アク
リル樹脂）で包埋後、ウルトラミクロトーム（スエーデ
ンＬＫＢ社製Ｌｌ　ｌ　ｔｒａ　ｔｏｍｅ　ｍ８８００
型）に装着したガラスナイフを用いて表面（中空糸の場
合、外壁面）から膜厚方向に沿って厚さ０．５〜１μｍ
の試料を順に切りだす。その試料切片を溶媒（例えば、
クロロホルム）で脱包埋後、それぞれの切片の電子顕微
鏡写真を撮る。注目する切片のＩＣｌ１１当たり、孔半
径がｒ−ｒ＋ｄｒに存在する孔の数をＮ（ｒ）ｄｒと表
示する。面内空孔率（Ｐｒｅ）は次式で与えられる。

Ｐｒｅ（％表示）＝　（ｙｃ　Ｓｒ”　Ｎ（ｒ）ｄｒ）
ＸＩＯ水濾過速度法による平均孔径（２ｒｒ）：純水を
あらかじめ平均孔径０．２μｍのフィルターを用いて濾
過し、微粒子を除去した純水を作製する。

この純水を２０℃で膜間差圧（△Ｐ）２００ｍＨＨの一
定圧力下で濾過速度Ｊｖを測定する。ただし、Ｊｖの単
位は（ｍ１／分）である。測定に使用し高分子多孔膜の
有効面積をＡとし、見掛は密度法で得られた該多孔膜の
空孔率をＰｒｅとすると、２ｒｒ　　（ｎｍ単位）は次
式で与えられる。

２　Ｆｒ　＝２．ＯＪｖ−ｄ　　・７７／△Ｐ−Ａ・Ｐ
ｒｅここで、ｄは膜厚（μｍ単位）、ηは純水の粘度（
センチボイズ単位） 肝炎ウィルス濃度：ＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原はＲＰＨＡ
法で、ＨＢＶ　：　ＤＮＡはＢＥＲＮ　ＩＮＧＥＲ等の
方法に準じた。即ち、検体２５μｍをＰＲＯＴＥＩＮＡ
ＳＥＫで処理し、ＤＮＡを抽出した。硝酸セルロース膜
に抽出ＤＮＡとＨＢＶ−ＤＮＡ標準（国立予防衛生研究
断裂ＬｏｔＤ１）とを同時にスポットした。ニツクトラ
ンスレーションはＢＲＬ社製キットを用いてｆｆ２ｐで
ラベルしたＨ　Ｂ　Ｖ　−Ｄ　Ｎ　Ａをハイブリダイゼ
ーションに用いた。

実施例１ 精製したセルロースリンターを銅アンモニア溶液中に９
．８重量％の濃度で溶解後、該溶液にアセトンを１３重
重量添加し、撹拌して均質な溶液を作製した。２５．０
±０．２℃で制御されたアセトン蒸気雰囲気（２０，０
℃における飽和蒸気圧の７０％の分圧のアセトンと窒素
との混合物）中で該溶液をガラス板上に５００μｍの厚
さに流延し、流延物を該蒸気雰囲気中に放置した。この
際アセトン蒸気と窒素との混合気体は流延膜上を層流状
で流れている。１００分間放置後、得られた膜を２０．
０±０．１℃の２％硫酸水溶液にほぼ水平状態で１５分
間浸せきした。浸せき後水洗し、しかる後該膜中の水分
を徐々に２０．０℃のメタノールへ置換した。

水分が完全にメタノールに置換された後、該膜を濾紙に
挾んで１０ｇ重／ｄの荷重を該膜に負荷しつつ真空乾燥
し、厚さ６０μｍの平面状の多孔膜を得た。該多孔膜の
走査型電子顕微鏡観察によれば膜の両面はネットワーク
構造をとり、また、ネットワークが積層した多層構造を
とっていた。また粒子直径（２３２）は０．４５μｍ　
：　２　Ｆ、は５５　ｎｍ、Ｐ、。は５５％であった。

Ｊｐ／Ｊ−は１／８でありアルブミンの透過率は９９．
９％以上でアルブミンの吸着量は８μｇ／ｎｒであった
。

この膜の大腸菌ファージφ×１７４の阻止係数は４．５
である。この膜を用いてエイズウィルスのモデルウィル
スとして大腸菌ファージをＴ４を採用した場合でファー
ジの培養液からのファージの阻止率は９９．９９９９９
９以上であり、濾液中の該ファージの濃度は検出限界以
下であった。この膜を多孔性の平板支持体に保持し、膜
間の隙間を１１ｍとし膜面上での血液流れ速度を２００
　ｄ／ｃｆｆｌ・分とした流動状態で、Ｂ型肝炎ウィル
スを含む血液を膜間差圧２００ｎＨｇで濾過した。得ら
れた濾液中のウィルス濃度は検出限界以下であった。ま
た濾液中の総蛋白質は血漿中それぞれの９０％以上であ
った。濾過速度は３．５ｊｌ！／ｍ・ｈｒ　　であり、
濾過速度の経時的減少量は濾過時間１時間以内では２０
％であった。

比較例１ 結合酢酸量（酸化度’）　５４．０％、重合度１６７の
セルロースジアセテート４５ｇをアセトンとメタノール
との混合溶媒（混合重量比５対１）／Ｃａｃｌ□・２Ｈ
２０／シクロヘキサノール（１２０ｇ／２５ｇ／６０ｇ
）中に溶解させ、濾過・脱泡して流延用原液を得た。該
原液を実施例−１と同様に硝子板上で厚さ５００μｍで
流延し、窒素気流中で製膜した。該膜をメタノールで洗
浄後実施例−１と同様に乾燥し、厚さ７５μｍ平面状の
多孔膜を得た。

該多孔膜の走査型電子顕微鏡観察によれば膜の両面ネッ
トワーク構造をとり、また、ネットワークの積層構造は
認められず３次元に均質なネットワーク構造に近い構造
を持つ。粒子直径２３ｚは０．６０μｍであり、２　ｒ
ｌは１５０μｍＳＰｒｅは６５％であった。Ｊｐ　／Ｊ
−は１／６０でありアルブミンの透過率は９２％で、ア
ルブミンの吸着量は１２０μｇ／ｒｄで大腸菌ファージ
φｘ１７４の阻止係数は０．５であった。この膜を用い
て実施例−１と同様にＢ型肝炎ウィルスを含む血液を濾
過した。濾液中のウィルス濃度は濾過前の血漿中それの
１／８であり、濾液中の総蛋白質濃度は血漿中のそれの
４０％であった。濾過速度は濾過初期の３．０１／ｒｒ
Ｌｈｒ、　　１時間後には１．０１／ｒｄ−ｈｒに減少
した。実施例−１に比較して平均孔径が約２倍であるに
もかかわらず、濾液中の総蛋白質濃度は低く、かつ、血
漿の濾過速度も小さく、かつ、濾過速度の経時的な減少
が著しいことがわかる。

実施例２ セルロースリンターを精製しこれを公知の方法で調整し
た銅アンモニア溶媒（銅アンモニア／水の重量比が３．
１／６．８　／９０．１）中に８．５重量％で溶解し、
濾過後脱泡し紡糸原液とした。この紡糸原液を２５．０
±０．１℃で制御しつつ環状紡糸口の外側紡出口（外径
２１１φ、内径１．２龍φ）より１．９ｄ／分で吐出さ
せた。−力水／アセトン／アンモニア比１００．０／６
８．０１０．９９　（重量比）で厳密組成が制御された
溶液（以下中空剤と略称）を採用し、これを２５．０±
０．１℃で温度制御しつつ中央紡出口（径０　、６　ｓ
ｘφ）より４．９ｄ／分で吐出させた。吐出された糸状
物を水／アセトン／アンモニア比１００・Ｏ／７０．０
／１．０　　（重量比）で厳密に組成が制御された２５
．０±０．１の混合溶液中に直接導き該溶液中で６．９
ｍ／分の速度で巻き取った。

なお吐出直後の透明青色状の繊維状物は次第に白色化し
、ミクロ相分離を生起し、引きつずいて凝固が起こり、
繊維としての形状が維持されていた。

その後、２０．０±０．１℃で２重量％の硫酸水溶液で
定長で再生し、その後水洗し、水を徐々にメタノールに
置換した。メタノールに置換後の中空糸を２０．０℃で
真空乾燥した。かくして得られた中空糸の外径は３００
μｍ１膜厚は３２μｍ１内径は２３６μｍであった。該
中空糸の内外壁面の走査型電子顕微鏡観察によれば、両
壁面は何れもネットワーク構造をとり、また、該ネット
ワークが積層した積層構造を示す。粒子直径２Ｓ、は０
．３０μｍ１２　ｒｒは３　ＱｎｍＸＰｒｅは４５％で
あった。φ×１７４の阻止係数は７．２であり、Ｊｐ／
Ｊｗは１／１０でありアルブミン透過率は９９．９％以
上で、アルブミン吸着量は９μｇ／ｒｄあった。

この中空糸を約５００本束ねて有効濾過面積を約０．０
３　ｎｆの円筒上の濾過層モジュールを組み立てた。こ
のモジュールを図−１の濾過装置内に設置し、図−１の
タンク部Ｔ−１にＢ型肝炎ウィルスを含む血漿（ウィル
ス濃度ＩＱ１２個／ａｄ）８０ｍｌと該ウィルスを含ま
ない血漿３００−を混合して注入する。温度は４℃に制
御されている。送液ポンプＰ、、　Ｐ、＋７）流量をそ
れぞれ１４０＋＋ｄ／分、１３８ｍ／分とする。得られ
た濾液中の肝炎ウィルス濃度は検出限界以下であり、ま
た、総蛋白濃度は血漿中のそれの８０％であった。ただ
し希釈用液体として生理的食塩水を注入すると総蛋白質
の回収率は９８％以上であった。濾過開始直後および、
濾過開始後２時間のい、および、Ｇ２の圧力はソＦＬツ
レＧ、　＝０．１１気圧、Ｇ、　＝０．０９気圧、およ
び、Ｇ＋　＝０．５気圧、Ｇ、　＝０．４８気圧であっ
た。

実施例３ 実施例２で作製した中空糸モジュールを図−２の透析装
置に装着する。タンクＴＩにＢ型肝炎ウィルスを含んだ
新鮮凍結血漿を解凍して得た４℃のヒト血漿２００−を
注入する。中空糸モジュール内部で中空糸の外側を透析
液が流れ、中空糸の内部を血漿が流れる。ポンプＰ、と
バルブＳとを制御し圧力ゲージＧ、の圧力とく透析液＋
血漿の濾液）速度とを制御する。Ｇ２とＧ、の圧力差△
Ｐを零に近ずければ拡散によって血漿中の蛋白質成分の
みがタンクＴ、に回収される。△Ｐ＝１００ＨＨｇで、
人工臓器用透析を用いて３時間透析した。

透析後更に、△Ｐ＝４０（ｌｎＨｇとしてヒト血漿を濾
過した。回収タンク内の液体中のＢ型肝炎ウィルス濃度
は検出限界以下であった。一方、血漿中の蛋白質の回収
率は９９％以上であまた。

（効　果） 本発明により蛋白質水溶液中に混入したウィルスを高い
除去率たとえば９９．９９％以上で除去できると共に、
水溶液中の蛋白質の透過率が６０％以上で、かつ回収率
が７０％以上が可能になる。また濾過速度が大きく、濾
過速度の経時的な減少が少ないため工業的規模でのウィ
ルス分離・除去が可能となる。さらにウィルスの除去前
後での蛋白質の組成変化が少ないため、人血漿に本発明
を適用すれば臨床用にも利用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法を用いたウィルス除去用の濾過装
置の例を示す。第２図は本発明の方法を用いた濾過およ
び透析によるウィルス除去用装置の例を示す。Ｇ、は入
口側圧力測定ゲージ、Ｇ２は出口側圧力測定ゲージ、Ｇ
３は透析液出口側圧力ゲージ１、Ｃは冷却ジャケット付
サニタリー配管、Ｐ＋、　ＰＺ＋　ｐ３は流量制御用送
液ポンプ、Ｔ、、Ｔ、。 Ｔ、は冷却ジャケット付貯蔵タンク、Ｍは中空糸モジュ
ール、Ｆは除菌フィルター、Ｓ、、Ｓ、は流量コントロ
ールバルブ、である。 特許出願人　旭化成工業株式会社 第１図 第２図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 大腸菌ファージφｘ１７４の阻止係数（Ｔ）が２以上で
   、かつ、５重量％のヒト血清アルブミン水溶液の濾過速
   度（Ｊｐ）と純水の濾過速度（Ｊｗ）の比（Ｊｐ／Ｊｗ
   ）が１／５０以上の高分子多孔膜に、蛋白質水溶液を通
   して、蛋白質水溶液中に存在するウィルスをこの膜で捕
   捉することを特徴とする蛋白質水溶液中のウィルス除去
   方法