JPH01257262A - 均質なｔ−４取込み分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は診断上の分析、特に甲状腺の取込みについての
分析に関する。

〔従来技術〕

活性な甲状腺ホルモンは、Ｔ−４およびＴ−３と呼称さ
れる。血液中では、Ｔ−４およびＴ−３は、はとんど全
部血漿タンパク質と結合している。

サイロキシン結合グロブリン（ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ　ｂ
ｉｎｄｉｎｇｇｌｏｂｕｌｉｎ　；　ＴＢＧ）は、常態
ではＴ−４の全結合強度の主要な決定因子である。Ｔ−
４とそれの結合タンパク質との間の相互作用は、可逆的
な結合平衡にある。少量のＴ−４（普通約０．０３％）
だけが血液中で遊離型である。しかし、Ｔ−３は容易に
結合せず、そして結果として、遊離型のＴ−３の正常な
割合はＴ−４のそれより８〜１０倍大きい。

遊離（未結合）のホルモンだけが組織にとって有と密接
に関係がある。

甲状腺ホルモン−血漿タンパク質の相互作用の妨害には
２つの概括的なタイプがある。妨害の第１のタイプでは
、ＴＢＧもしくは他の血清結合タンパク質の量の増加ま
たは異常な血清結合タンパク質の出現が遊離のホルモン
のレベルの低下を引き起こす。遊離のホルモンの濃度が
正常に戻るまで、血清中の全ホルモン濃度が増加するか
もしれない。妨害の第２のタイプでは、サイロキシン結
合グロブリン（ＴＢＧ）の濃度は正常であるが、甲状腺
ホルモンの量が異常である。このタイプの障害において
は、遊離のホルモンの比率がホルモン補給における変化
と同じ方向に変化する。

遊離のＴ−４の量が低すぎる場合、患者は合成のＴ−４
（レボサイロキシン）で治療され得る。

その場合、患者を治療する上で未結合のホルモンだけが
有効であるので、、Ｔ−４の投与後の全サイロキシン濃
度よりもむしろ、投与された合成Ｔ−４がＴＢＧにより
どれ位結合されるかを測定することが重要である。

ホルモン濃度および血液中での結合に関する多くの分析
法が開発された。遊離のＴ−４の濃度は、ラベル化した
少量のＴ−４で富化された血清の平衡透析法により決定
され得る。透析ノホであり従って遊離型であるＴ−４の
割合が決定される。その数値から結合している割合を計
算することができる。しかしながら、その透析法は厄介
であり、そして一般に臨床目的において有用でない。ラ
ベル化されたＴ−４またはＴ−３と共に血清をインキュ
ベートし、次いで不溶性粒状物質、例えば遊離のホルモ
ンと非特異的に結合する樹脂または活性炭、と共にイン
キュベートすることにおける試験管内の取込み試験は既
に開発されている。その粒状物質と結合したラベル化ホ
ルモンの割合は、血清タンパク質に占有された部位の濃
度およびラベル化ホルモンに対する親和性と反対に変化
する。

ＴＢＧの取込み値をより正確に測定する方決は、非−甲
状腺疾病の低いＴ−４状態を甲状腺機能低下症の明白な
サイロキシン欠損から区別することにおいて臨床家を援
助するであろう。そのような方法はまた、甲状腺機能低
下症により生じる症状を緩和するために投与するべき合
成Ｔ−４の量をより正確に決定することを可能にするで
あろう。

〔関連文献の記載〕

Ｋａｐｔｅｉｎら、Ｊ、ｏｆ　Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｒｏｃ
ｒｉｎｏｌ、ａｎｄ　Ｍｅｔａｂ。

（１９８１）　５２　：　１０７３は、遊離型サイロキ
シンの評価の８つの方法の比較を提供する。その文献は
、甲状腺機能低下症および視床下部下垂体機能低下症に
より生じる低いＴ−４レベルを非甲状腺の疾病により生
じるものから区別する分析能力を記載している。評価さ
れた分析方法は、平衡透析法、エンザイムイムノアソセ
イ（＾ｂｂｏｔｔ）、抗体でコートされたチューブ（ｃ
１ｉｎｉｃａｌ　Ａｓ５ａｙ）、抗体でコートされた微
細シリカ（ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｓｅ）
　、マイクロカプセル化抗体（Ｄａｍｏｎ）　□、およ
びＴ−３取込み率またはサイロキシン結合グロブリン法
を使った遊離のＴ−４取込みである。

〔発明の概要〕

本発明は、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）の活
性を直接測定することにおけるサイロキシン取込み測定
の改良方法を提供する。試料中のＴＢＧによるサイロキ
シン取込みを測定する方法は、有効な（ａｖａｉｌａｂ
ｌｅ）サイロキシン結合グロブリン部位に結合するポリ
ヨードサイロニン類似体と接合した酵素供与体（Ｅ　Ｄ
）を水溶液中の試料と混合することを含んで成る。Ｔ−
４に対するＴＢＧの親和性が有意に変化しないようにＥ
ＤへのＴ−４の付着が調節される。試料は、ＴＢＧ活性
量に関連して変化する酵素活性を提供することにより特
徴づけられる、酵素供与体（Ｅ　Ｄ）および酵素受容体
（ＥＡ）と−緒にされる。そして既知量の有効なＴＢＧ
結合部位を有する対照溶液と比較して酵素活性の量が決
定される。

実際的な方法は、実施するのに迅速で、より正確でそし
て簡単であり、加えて抗体を使って結合を測定する間接
測定法よりもより正確でありそして経済的である。

〔特定態様の記載〕

サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）活性を直接測定
することにおけるサイロキシン取込み測因するかに関し
て、確かな情報を提供する。

本性は、有効なサイロキシン結合グロブリン部位と結合
するポリヨードサイロニンの類似体と接合した酵素供与
体と水溶液中の試料奎−緒にすることを含んで成る。酵
素受容体、酵素供与体および酵素基質を試料と一緒にし
て分析媒体を形成せしめる。試料を酵素供与体接合体ま
たは酵素受容体のどちらかとブレインキュベートしても
よい。

また、試料の不在下で酵素供与体と酵素受容体とを混合
しない限りは、分析媒体の全ての成分を一緒にしてもよ
い。酵素受容体は、部分的には、該接合体と結合する時
にＴＢＧ活性の量に関連して変化する酵素活性を提供す
ることにより特徴づけられる。即ち、試料のＴＢＧ活性
が増加すると酵素活性の量は減少する。酵素活性の量は
、ＴＢＧによる既知のサイロキシン取込み量を有する対
照溶液と比較される。

この分析方法は、サイロキシン結合グロブリンを含有す
る試料に関して使用され得る。通常、試料は患者の血清
または血脩であろう。微粒子物の除去以外には、通常、
即時の分析法のために試料の他の前処理は全く行われな
いだろう。

酵素供与体および酵素受容体は、β−ガラクトシダーゼ
の部分配列であり、酵素供与体の方がより小さい。酵素
供与体および酵素受容体は変異していてもよい。β−ガ
ラクトシダーゼ酵素供与体フラグメントは、実質的にβ
−ガラクトシダーゼ単量体のＮ端部分と同じアミノ酸配
列を有し、酵素受容体は、実質的にβ−ガラクトシダー
ゼ単量体分子の５０％より多いＣ端部分と同じアミノ酸
配列を有する。β−ガラクトシダーゼ活性は、β−ガラ
クトシダーゼ酵素受容体単量体フラグメントと酵素供与
体接合体との相補性に由来する。

該酵素受容体は、酵素供与体接合体と結合して複合体を
提供することにより特徴づけられ、複合体の酵素活性は
、分析条件下でサイロキシン結合グロブリン活性の量に
関係して変化する。即ち、酵素供与体接合体がＴＢＧと
結合すると、測定時間の間、酵素活性は、酵素供与体接
合体が未結合の時の酵素活性に比べて実質的に減少する
。

酵素供与体フラグメントは、サイロキシン結合グロブリ
ン結合部位に結合するポリヨードサイロニンのｌ１ｌ（
Ｊｕ体と接合される。その類似体は、−ｉにＴ−４であ
るかまたはＴ−４に関連するものである。Ｔ−３もまた
利用されるが、ＴＢＧはＴ−３に対して非常に低い親和
性を有しており、使用されるＥＤに依存して、あまり正
確でない測定値を導く。はとんどの場合、該類似体は４
−（３’。

５′，５′−ジヨード−４′−ヒドロキシフェノ−１′
−オキシ）−３，５−ジヨードフェニル基を有するであ
ろう。

β−ガラクトシダーゼ酵素供与体および受容体は、米国
特許第４．７０８，９２９号（１９８５年４月８日に出
願された出願番号第７２１　、２６７号）において記載
されており、その開示は引用により、本明細書に組み入
れられる。前記出願明細書中に記載された分析条件は、
本発明に適用できる。

水溶液および分析条件は、酵素供与体と酵素受容体との
相補体形成に備える。一般に、リン酸ナトリウム緩衝液
のような生理的緩衝液が有用である。好ましい緩衝液は
、１０〜３０ｗＭ　ＮａＰＯａ　、　　５〜１０ｍＭ　
ＥＧＴＡ　、および１０〜２０ｍＭ　ＮａＮ５から成り
、６〜８のｐＨを有する。温度は普通少なくとも２５℃
であり、好ましくはより高められた温度であるが、６０
℃以下、普通７０℃以下であろう。エンザイムアッセイ
は、一般に室温く２５℃）から４０℃未満、普通約３７
℃で行われる。その分析は大気圧にて実施される。

分析媒体中の酵素供与体接合体の濃度は、普通約１〜６
０ｎＭ、より普通には５〜２５ｒ＋Ｍの範囲であり、一
方酵素受容体濃度は４〜２００単位／−１普通８０〜１
２０単位／ｍＺの範囲であろう。酵素供与体接合体対酵
素受容体のモル比は、普通１：３０〜１：８０、より普
通には１：５０〜１：６０であろう。

ＴＢＧ結合部位の定量のために重要の有用な範囲は、２
０〜５０％取込みであろう。

分析媒体中の酵素活性量は、β−ガラクトシダーゼ活性
を測定するための標準的な技術に従って測定されるであ
ろう。酵素基質は、該酵素により分解された時に分析媒
体の吸光または発光の量に変化を生じるものが使用され
る。即ち、基質の分解が着色生成物または蛍光生成物の
出現または消失をもたらす。好ましい酵素基質は、オル
ト−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）で
あり、これは酵素で分解されてオルト−ニトロフェノー
ル（ＯＮＰ）を形成する。ＯＮＰの吸光度は４２０ｎｍ
で測定される。他の同等の酵素基質も商業的に入手可能
である。

既知量のＴＢＧ活性を有する試料と比較してＴＢＧ活性
量を決定することは、多数のやり方で行われ得る。１つ
または複数の未知試料、および対照試料（標準試料）、
普通２つまたは３つの標準試料を分析する。次のように
して、試料および対照を平行して処理する。試料を混合
した後約３分〜約４分で最初の読みを行う。該試料をさ
らに１〜２分間分間インキュトートそして第２の吸光度
を読む。標準試料における吸光度または発光度の値の変
化は、標準曲線を作成するのに使用され得る。このよう
にして、試料中のＴ−４取込み率がその曲線から決定さ
れ得る。

本発明を容易にする試薬を含有するキットもまた期待さ
れる。そのキットは、少なくとも１つの容器、普通別々
の容器の中に、前述したようなβ−ガラクトシダーゼ酵
素供与体接合体および酵素受容体を含んで成る。別々の
容器に詰める時、酵素供与体または酵素受容体がさらに
酵素基質を含んでもよい。酵素供与体接合体および酵素
受容体並びに基質は凍結乾燥された形であってもよい。

該キットは普通、試薬類を復元するのに適する緩衝液を
含み、その緩衝液を酵素成分と共にまたは別々に詰めて
もよい。該キットはまた、サイロキシン結合グロブリン
による既知のサイロキシン取込み量を有する血清を含ん
で成る、１つまたは複数の対照試料を含有してもよい。

該キットは、自動分析での使用のために特に考案され得
る。

下記の例は、明晰の目的で例示のために提供されるもの
であり、そして限定のためのものではない。

ｍ舛 ＥＤｆｆ衝液［２０ｍｔｌ　ＮａＰＯ４；　１０ｍＭ　
ＥＧＴＡ（エチレン−ビスーオキシエチレンニトリロ四
酢酸）　：　２０ｍＭＮａＮ３；　０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０　；　６．２５ｍｇ／　ｍ！　０ＮＰＧ　；　０
．９％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、ｐｌ＋
７．０）中の１１ｎＭ酵素供与体接合体（ＥＤ４−　Ｔ
、、出願番号第７２１，２６７号、上記、を参照のこと
）の緩衝化された溶液およびＥＡＩ、１衝液（２１）ａ
Ｍ　ＮａＰＯａ　；　１０ｍＭＥＧＴＡ　；　２０ｍＭ
　ＮａＮｉ　；　５ｍＭ　　シＥｌ　糖；　２ｍＭ　Ｍ
ｇ（ＯＡｃ）　２　・４１１□Ｏ；　０．２％　β−シ
クロテ゛キストリン；３．６％グリセロール、ｐＨ７，
０’）中の２２単位の酵素受容体（Ｅ＾−２２）の緩衝
化された溶液を調製した。両温液を使用まで氷上に保存
した。また、対照の血清試料を検量線作成用として使っ
た。その検量線作成用の数値は２０　、３５および５０
％のＴ−取込みであった。未知のＴＢＧ活性を有する２
人の患者の試料を同様に分析した。

既知の血清標準試料各１４ｕｌを、９６ウエルのミクロ
タイタープレートのラベルを付したウェルにピペットで
加えた。蒸留水１４Ｊｌｌを１つのウェルに入れてブラ
ンクとした。蒸留水３６ｔｔｌを各ミクロタイターウェ
ルに加えた。ブランクを除く各ウェルに酵素受容体溶液
１６０μｌを加え、ブランクには蒸留水１６０μｌを加
えた。該プレートを軽くたたくことによりまたは回転す
ることにより、溶液を混合した。その後、各ウェルに酵
素供与体溶液４０１１１を入れた。プレートを軽くたた
くことによりまたは回転することにより、その溶液を混
合した。そのプレートを３７℃のインキュベーター中に
４分間置いた。インキュベーターからミクロタイタープ
レートを取り出し、そして適当なフィルターを有するミ
クロタイタープレートリーダーを使って、各試料につい
て４２０ｎｍの吸光度を読みとった。８亥ブレートを読
みとった後すぐに１．それをインキュベーターに戻した
。２回目の読取りは、１回目の読取りの１分後に行い、
全体で５分間かかった。そして数値間の差異を決定した
。Ｙ軸として既知の取込み量およびＹ軸として１分の速
度を使って、既知の標準試料についての検量線を作成し
た。未知の試料の速度をその曲線から読みとってＴ−取
込みの割合を決定した。

上記の結果は、ＴＢＧの有効な結合部位の容易な、正確
なそして迅速な直接測定を証明する。この方法は、検体
を平均化させるための過剰のサイロキシンを含む間接測
定および全結合部位の測定加えて全サイロキシンの測定
を必要とせず、放射性同位体も使用しない。ＴＢＧは酵
素供与体接合体と結合することができ、そのため有効な
ＴＢＧ部位の直接測定を可能にする。

本発明を今まで十分に記載したので、当業者には、上記
の特許請求の範囲の精神または範囲からはずれることな
く、多くの変更および改良を行うことができることは明
らかであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中の有効なサイロキシン結合グロブリン部位を
   直接測定する方法であって、前記方法は酵素の２つのフ
   ラグメント、即ち前記部位についてサイロキシンと交差
   反応性である部分と結合して酵素供与体接合体を形成す
   る酵素供与体フラグメントおよび酵素受容体フラグメン
   トを使い、前記両フラグメントは複合体化して活性酵素
   を形成し、その活性はサイロキシン結合グロブリン部位
   との結合に応じて変化し、前記方法は、 （ａ）分析溶媒中で、酵素基質、前記試料、前記酵素受
   容体フラグメントおよび前記酵素供与体接合体を一緒に
   して分析媒体を形成せしめ、ただし前記試料の不在下で
   は前記酵素供与体および前記酵素受容体を一緒にしない
   ものとし； （ｂ）前記分析媒体における酵素活性量を、既知量の有
   効なサイロキシン結合グロブリン部位を有する分析媒体
   と比較して決定する； ことを含んで成る方法。 ２、前記酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、そして前
   記酵素供与体フラグメントが小さい方のフラグメントで
   あり且つβ−ガラクトシダーゼのＮ端配列と実質的に同
   じ配列を含んで成る、請求項１に記載の方法。 ３、前記成分がポリヨードサイロニンである、請求項２
   に記載の方法。 ４、前記試料が血清または血漿である、請求項２に記載
   の方法。 ５、試料中の有効なサイロキシン結合グロブリン部位を
   直接測定する方法であって、前記方法はβ−ガラクトシ
   ダーゼの２つのフラグメント、即ち小さい方のフラグメ
   ントであり且つβ−ガラクトシダーゼのＮ端と実質的に
   同じ配列を含んで成る酵素供与体フラグメントおよびβ
   −ガラクトシダーゼのＣ端と実質的に同じ配列を含んで
   成る酵素受容体フラグメントを使用し、前記両フラグメ
   ントは複合体化して活性酵素を形成し、その活性はサイ
   ロキシン結合グロブリンとの結合に応じて変化し、前記
   方法は、 （ａ）水性溶液中で、 （ｉ）前記試料； （ｉｉ）前記酵素受容体フラグメント； （ｉｉｉ）前記部位についてサイロキシンと交差反応性
   である成分と結合した前記酵素供与体フラグメントから
   成る酵素供与体接合体； （ｉｖ）酵素触媒反応を受けそして吸光生成物または発
   光生成物を生成する酵素基質； を混合して分析媒体を形成せしめ； （ｂ）複合体化が起こるのに十分な時間の間前記分析媒
   体をインキュベートし； （ｃ）２つの異なる時点に吸光または発光を測定しそし
   てその差異を決定し； （ｄ）前記差異を、既知量の有効なサイロキシン結合部
   位を有する分析媒体と比較する； ことを含んで成る方法。 ６、前記２つの異なる時点が１分間隔である、請求項５
   に記載の方法。 ７、前記基質がｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトシド
   である、請求項５に記載の方法。 ８、前記交差反応性である成分が、４−（３′，５′−
   ジヨード−４′−ヒドロキシフェノ−１′−オキシ）−
   ３，５−ジヨードフェニル基を含んで成る、請求項５に
   記載の方法。 ９、（１）サイロキシン結合グロブリン部位についてサ
   イロキシンと交差反応性である成分に結合したβ−ガラ
   クトシダーゼのＮ端アミノ酸配列と実質的に同じアミノ
   酸配列を含んで成る酵素供与体接合体；（２）β−ガラ
   クトシダーゼのＣ端配列と実質的に同じ配列を含んで成
   る酵素受容体（前記酵素供与体接合体と前記酵素受容体
   との複合体化で活性酵素が形成され、その酵素の活性は
   サイロキシン結合グロブリンの前記酵素への結合により
   変化する）；および（３）既知量のサイロキシン結合グ
   ロブリン部位を含む対照物；を含んで成るキット。 １０、前記成分がポリヨードサイロニン成分である、請
   求項９に記載のキット。 １１、前記（１）および（２）が凍結乾燥される、請求
   項９に記載のキット。