JPH012585A - チトクロームｐ−４５０遺伝子を含有するｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はストレプトミセス属に存在し、水酸化酵素活性
を有するチトクロームＰ−４５０の生成に関与する遺伝
子部分を含有するＤＮＡの単離およびその利用に関する
。さらに詳しくはストレグトミセス属に存在しＭＬ−２
３６Ｂナトリウム（以下、「几−２３６Ｂ　Ｎａ　Ｊと
いう）を６β−ヒドロキシ−虱−２３６Ｂナトリウム（
以下、「Ｃ８−５１４」という）−へ変換する水酸化酵
素活性を有するチトクロームＰ−４５０を包含する蛋白
質の生成に関し、制限酵素Ｍｂｏ　ｌの部分消化によっ
て生成され、約７．１　ｋｂからなるＤＮＡ断片中に存
在し水酸化酵素活性を有するチトクロームＰ−４５０遺
伝子を含有することを特徴とするＤＮＡに関する。

従来の技術 微生物を用いるＤＮＡ組み換え実験は特に大腸菌を中心
として枯草菌、酵母において発展してきた。なかでも大
腸菌のＤＮＡ組み換え実験の発展はめざましく１種々の
遺伝子の解析のみならずある種の有用ペプチドの工業生
産にまで応用されるに至っている。一方、放線菌は抗生
物質や生理活性物質などの二次伏線産物の生産に関して
多種多様な能力を有すること、あるいは微生物変換にお
いて種々機能を発揮することから、ｆ１酵工業の分野で
は古くから重要視されてきている。にもかかわらず放線
菌の育種の手法は限られており、この限られた′手法の
中で生産性向上などに成果をあげてきた。。このような
状況のもとて放線菌の育種改良研究の１つの手法として
、ＤＮＡ組み換え実瑣系の確立か望まれ、その手法を用
いての生産性向上や新規物質の生産が期待されるように
なってきた。現在。

放ｍＷの特定菌、＠　（Ｓ、ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　Ａ
　１３１２　。

Ｓ、１ｉｖｉｄｌｎａ　などンでは宿主・ベクター系が
確立され種々の放線菌遺伝子かクローニングされている
。それらは例えば抗生物質の生産に関する遺伝子として
のアクチノロジン生合成遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ、３０９
．４６２（１９８４））　、エリスロマイシン生合成遺
伝子（ＢｉＯｔｅｏｈｎｏｌｏｇ７　、２　。

８０８（１９８６））などである。アクチノロジン生合
成遺伝子を同類の抗生物質であるメデルマイシンの生産
菌ストレプトミセス・ニス・ビーに導入すると新規抗生
物質のメデルロジンか生産されたとの報告かある（　Ａ
ｎｔｉｌｎｉＯｒＯｌ）、ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍＯｔｈ
ｅｒ　、ユ９，１３（１９８６））。　また放線菌の酵
素遺伝子もエンドグリコシダーゼＨ遺伝子（Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、０ｈｅｃｎｉ、、２５６．１０６４０（１９８１）
）をはじめとしていくつかの報告かある。

発明が解決しようとする問題点　□ 上述のごとく放線菌の遺伝子のクローニングに関する報
告は増えつつあるものの、抗生物質生産、生理活性物質
生産１ｗＬ生物変換能など放＃Ｍ菌の能力の多様性７ｉ
−考直するとこれらの研究ははじまったばかりである。

特に放線菌を用いての微生物変換に関与する酵素の遺伝
子については一工業上の重要性にも拘わらずいまだにク
ローニングされた例がない。従って、放線菌の組み換え
ＤＮＡ技法をこのような放線菌の育種改良に用いること
が望まれている。

問題点を解決する手段 本発明者らは、微生物変換に用いられるストレプトミセ
スの特定の酵素の産主に係る遺伝子を含むＤＮＡを提供
すべく研究した。その結果。

ＭＬ−２３６ＢＮａの６β位を水酸化し０８−５’１４
へと変換させ得る水酸化酵素遺伝子を含むＤＮＡ％スト
レプトミセス属に属する菌株から分離することに成功し
た。ＭＬ−２３６ＢＮａからａＳ−５１４への水酸化活
性を欠失しているか、または活性の低い例えばストレプ
トミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｓｓ　１ｉ
ｖｉｄａｎりに、該ＤＮＡを組み込んだプラスミドを導
入することにより。

係る遺伝子が発現し、ＭＬ−２３６ＢＮａからａｓ−５
１４への変換か可能であることから該ＤＮＡを含有する
組み換えプラスミドを工業生産に用いられる例えばスト
レプトミセス・カルボフィラスに導入することにより、
その遺伝子の増幅効果によって、変換効率の良い株才た
は単位基質（ＭＬ−２３６ＢＮａ）あたりの変換時間の
短い株の造成が期待できることを見出し１本発明を完成
した。

本発明によれば、　ＭＬ−２３６Ｂ　　Ｎａ　の６β位
を水酸化してＯ８−５１４へ変換しつる水酸化酵素活性
を有するチトクロームＰ−４５０遺伝子に関し、該遺伝
子のＤＮＡ断片を含有する組み換えプラスミドが提供さ
れる。

本発明のチトクロームＰ−４５０遺伝子を含むＤＮＡ＠
片は、ＭＬ−２３６ＢＮａｔ基質とし。

Ｃ！　Ｓ−５１４へ変換する水酸化酵素活性を有するチ
トクロームＰ−４５０の遺伝子を含むものであれば、そ
れが他の種類の基質をも水酸化するものであってもよい
。また、チトクロームｐ−４５０遺云子を含むＤＮＡ断
片の起源としては、＃にその宿類を問わず、ＭＬ−２３
６ＢＮａの６１位を水酸化しＯ８−５１４を生成する能
力を有する放線菌の染色体ＤＮＡに白米するものか好適
に用いられる。そのようなものとしては例えばストレプ
トミセス・フラボビレンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
　ｆｌａｖｏｖｉｒｅｎりなどを挙げることが出来る。

他方、ベクタープラスミドとしては放線菌内にあって自
律増殖可能であり、かつ宿主細胞の分裂に際して安定に
娘細胞に受は継がれていく安定保持性に優れたものであ
ればよく、使用する宿主によって自由に選ぶことか出来
る。ベクタープラスミドの具体的なものとしては例えば
公知のｐＩｆｆ　７０２　（ＫａｔＺ　ａｔ　ａｌ、、
Ｊ、Ｇｅｎ１Ｍ１ｃ　−ｒｏｂｉｏｌ、、１２９．２７
０３（１９８３）　）等を挙げることができる。

しかしながら、ベクタープラスミドは本発明のＤＮＡ１
含む組み換えプラスミドを含有する形質転換体のスクリ
ーニングに適した特定の抗生物質耐性を付与する遺伝子
を有し、且つ挿入失活によって組み供えプラスミドであ
ることか確認でき、宿主域の広いプラスミドかよい。

従って、そのようなプラスミドとしてはチオ線菌におい
てもメラニン産生遺伝子を発現できるように設計され、
広い宿主で用いることの可能な例えばプラスミドｐＭＫ
Ｌ１６　、　ｐＭＥＬｌ　８゜ｐＭＥＬ２５（特願昭６
１−１９３３１６号）か好適である。

本発明で提供するチトクロームＰ−４５０遺伝子を含む
ＤＮＡはベクタープラスミドにチトクロームＰ−４５０
遺伝子を含むＤＮＡを含有したものであればよく１例え
ば本発明者の命名するところの後述するプラスミドｐＨ
ＹＯ１や宿主菌の中でプラスミドｐＨＹＯ　１か組み換
えられた結果生じたプラスミドｐＨＹＯ２またはそれか
ら誘導されるプラスミドｐ）！ＹＯ２１を挙げることか
出来る。

ここにＭＬ−２３６ＢＮａの６β位を水酸化しＯＳ−５
１４の生成に関与する水酸化酵素活性を有するチトクロ
ームｐ−４５０遺云子は下図で示されるようにＭＬ−２
３６Ｂ　Ｎａ　　の６β位の水酸化反応を触媒する水酸
化酵素産生に関与するＤＮＡをいう。

本発明のチトクロームＰ−４５０遺伝子を含むＤＮＡを
含有する組み瑛えプラスミドの調製はそれ自体公知の方
法で行なうことが出来る（例えばり、Ａ、ＨＯｐＷＯＯ
ｄら”Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆ
　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ”、　ａ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＴｎｅＪｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ
　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　、　１９８５人ベクタープラ
スミドとしては上述のように放線菌で安定に複製増殖を
維持出来るものであれば、何でも用いることが出来るが
、それらから使用目的に応じて誘導されるものも含まれ
る。

例えばストレプトミセス・リビダンス５ＡＮＫ６８１８
２［微工研条寄第１１４１号（ＦＥＲＭＢＰ　　１１４
１）］を用いてそれ自体公知の方法（例えばり、Ａ　Ｈ
ＯｐＷＯＯｄら、　”Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌ
ａ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳｔｒｅｐｔＯｍ７Ｃｅｓ”、Ａ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎ工ｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、
　１９８５　）により採取出来るプラスミドル工Ｊ７０
２をベクターとして用いることが出来る。また、プラス
ミドｐｍ、Ｔ７０２　　のメラニン産生遺伝子を発現出
来ない放線菌宿主でも使用出来るように調製されたプラ
スミドｐＭＥＬ　１　Ｂ　、　ｐＭＥＬ　１８　、　ｐ
ＭＥＬ　２５　　も同様に用いることか出来る。これら
のプラスミドは選別標識（マーカー〕としてチオストレ
プトン耐性（以下、　［ＴｎｉｏｒＪというンとメラニ
ン並生（以下、　［Ｍｅｌ　Ｊ　　という）か付与され
ており。

Ｔ１’１ｉＯｒｌ＠　Ｍｅｌ−を示す形質転換株を選別
するととにより組み換えプラスミドの調製に有第１」に
用いることが出来る。

上述°のＭＬ−２３６ＢＮａ　　の６β位を水酸化しＯ
８−５１４に変換する水酸化酵素活性を有するチトクロ
ームＰ−４５０遺云子を含む放線Ｍ（例えばストレプト
ミセス・フラボビレンスなど〕の菌体より染色体ＤＮＡ
１公知の方法１例えばＭａ　ｒ　ｍｕｒの方法（Ｊ、Ｍ
ｏ１．Ｂｔｏｌ、、　３　、２０８　（１９ｅ　１））
で渭出する。抽出された染色体ＤＮＡ１適当な制限酵素
により切断すれば、目的のチトクロームＰ−’４５０遺
云子を含むＤＮＡ断片が他のＤＮＡ断片と共に得られる
。このようにして得られるＤＮＡ断片の混合物から目的
の遣云子を含むＤＮＡを含有する組み換えプラスミド７
ｉ−調製するには、まずチトクロームＰ−４５０遣云子
を含むＤＮＡ断片の不端と頑合し得るように処理された
ベクタープラスミドへ該ＤＮＡＰｔｒ片を組み込む。次
に生成された６橿の組み侠えプラスミドによる宿主菌の
形質転換を行なった後。

例えば’ｒｈｉｏｒ”Ｍｅｌ−を示す組み換えプラスミ
ド゛含有形質転換体を選別する。次いで選別された形質
転換体から目的の形質を発現する形質転換体を選別する
ことにより行なうことが出来る。

前述のプラスミドｐＭＥＬ　１　ｇをベクターとして使
用する場合を１例として挙げれば１次の通りである。即
ち、染色体ＤＮＡを制限酵素Ｍｂｏ工　　により３〜２
０　ｋｌ）のＤＮＡ断片となるよう部分分解（例えば’
ｊ’、Ｍａｎｉａｔｉａら、　”ＭＯｌｅＣｕｌａｒ　
Ｃ１ｏｎ−１ｎｇ　’　、　　Ｃｏ１ａ　Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｔ）ＯｒａｔＯｒ７゜２８２頁、１
９８２）　　し、得られる該ＤＮＡ断片を、Ｂｇｌｌｌ
により切Ｉｆｒｕ環したｐＭＫＬ　１８と混合し、さら
にＴ４ＤＮＡＩＪガーゼで連結処理する。

これによって、染色体ＤＮＡの断片が導入された目的の
組み換えプラスミドを含有する連結混合物を得る。連結
混合物から目的の組み換えプラスミドモ選別するには、
該混合物％ＭＬ−２３６ＢＮａ　　の６β位を水酸化し
Ｏ８−５１４へ変換する能力を本来持たないかもしくは
極めて低い側力しか持たない放線菌のプロトプラストに
導入し。

寒天平板上に塗抹する。次いで培養した寒天平板上、チ
オペプチンを加えた軟寒天培地を重層する。重層後、該
寒天平板を培養すると’ｒｈ　ｉ　Ｏｒを示す°形質転
換株が生育してくる。このなかで組み換えプラスミドを
有する形質転換株はメラニンを産生しないので容易に判
別可能である。

次いで選別されたメラニンを産生しない形質転換株はＭ
Ｌ−２３６Ｂ　Ｎａ　　を添加した寒天平板上に移植し
て培養し、コロニーを十分に生育させる。

このコロニーヲトロツカーで打抜き寒天プラグを作製す
る。このようにして作製した寒天プラグ１０個を１つの
集団としてマイクロチューブに入れ、エタノール水溶ｇ
を加えよく攪拌、抽出した後、遠心分離しその上清を高
速液体クロマトグラフィー（以下、ｌ’−ＨＰＬ（！Ｊ
というつに付す。次いでＣ９−５１４に由来するピーク
の存在の有無を判別するという一次スクリーニンクに供
した。

二久スクリーニングは一医スクリーニンつてＣ８−５１
４に由来するピークの存在が認められた集団に含まれる
コロニーから夫々をチオペプチンを含む培地に接種し振
盪培養する。次いでＭ　、Ｌ−２３８Ｂ　Ｎａを添加し
さらに振盪培養を継続した後、その培養液をマイクロチ
ューブに採取し、遠心分離し上清を採取する。採取した
上清ｙＢ　Ｈｐ：ｃ、ｃに付しＭＬ−２３６ＢＮａの６
β位を水酸化しＣ８−５１４に変換しているクローンを
選別する。このようにＣ８−５１４％生成するクローン
か本発明の水酸化酵素活性を有するチトクロームＰ−４
５０遺伝子を含むＤＮＡを含有する組み換えプラスミド
を保持する。従ってこれを前述のプラスミド抽出法によ
って抽出すればベクタープラスミドにＭＬ−２３６ＢＮ
ａの６β位を水酸化しＯ８−５１４へ変換する水酸化酵
素活性を有するチトクロームＰ−４５０遣云子を含むＤ
ＮＡか含有された組み換えプラスミドを取得出来る。こ
のようにして得られた組み換えプラスミドとして例えば
具体的にはプラスミドｐＨＹＯ１またはプラスミドｐＨ
ＹＯ２７ｉ：挙げることか出来（３１組み換えプラスミ
ドの具体的説明上述の方法によって得られる組み換えプ
ラスミドｐＨＹ引およびプラスミドＩ）ＨＹＯ２（実施
例並びに第・２図および第３図参照）、更にプラスミド
ｐＨＹＯ２から誘導されるプラスミドｐＨＹＯ　２１（
第４図参照）について、具体的に述べる。

（１）　　プラスミドｐＨＹＯ１による水酸化酵素活性
の確認 プラスミドｐＨＹＯ１の含有する挿入Ｄ　Ｎ　Ａ断片が
、ＭＬ−２３６ＢＮａの６β位を水酸化してＯ８−５１
４へ変換する水酸化酵素活性を有するチトクロームＰ−
４５０遺云子を含むことは次のことから理解される。即
ちプラスミドｐ　ＨＹＯｆを含有する組み換え株からこ
のプラスミドを除去することによって生ずるプラスミド
除去法はチオペブチン感受性となり、同時に水酸化活性
の消失とｃｏ　Ｍスペクトルによる４ＳＱｎｍ付近の吸
収極大の消失を伴うことから理解される。さらに該プラ
スミド除去法を宿主としてプラスミドｐＨＹＯ１を用い
て再形質転換すると得られる再形質転換株はすべてＴｈ
１ｏｒとなると共に水酸化活性の復帰およびＣＯ差スペ
クトルによる４　５０　ｎｆｆ１付近の吸収１犬の復帰
が認められることおよびこの再形質転換株からプラスミ
ドｐＨＹＯ１が分離できることから確認される。しかし
ながら、このプラスミドｐＨＹＯ１は第２図から明らか
の如く。

小型化するには不都合である。小型化の研究には以下に
述べるプラスミドｐＨＹ○２を用いたつ（ｎ）　　プラ
スミドｐＨＹＯ２の存在確認とプラスミドｐＨＹＯ２１
の誘導 ブラスミ＋′ｐＨＹＯ１の形質転換によって、ＭＬ−２
３６Ｂ　Ｎａ’ｉ’Ｃ８−５１４へ変換する能力を示す
形質転換株の１株から分離された組み換えプラスミドは
、プラスミドｐＨＹＯ１以外にほぼ同じ大きさのプラス
ミドｐＨＹＯ２か存在していることか判明した。即ち、
プラスミドｐＨＹＯ１はＳａｃ　ｌ消化によって約１０
　ｋｌ）および約５．８ｋｂのＤＮＡ断片を生成するこ
とかわかつているが（第２図参照）、該プラスミド混合
物はＳａｃ　ｌは消化によってプラスミドｐＨＹＯ１に
由来する約１０ｋｂおよび約５．８ｋｂのＤＮＡ断片の
他にプラスミドｐＨＹＯ２に由来する約１３．１ｋｌ）
および約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を生成する。そこで該
プラスミド混合物を用いてストレプトミセス拳リビダン
スを形質転換し、　Ｓａｃ　ｌ消化によって約１３．１
ｋｌ）と約２４ｋｌ）のＤＮＡ断片を生ずるプラスミド
のみを含む形質転換株を分離することによってプラスミ
ドｐＨＹＯ２を単独に含む形質転換株か得られる。この
形質転換株はＭＬ−２ｓ　６　Ｂ　Ｎａ７１）ら（：！
Ｓ−５１４へ変換する能力を有していることからプラス
ミドｐＨＹＯ２もプラスミドｐＨＹＯ１と同様にＭＬ−
２３６ＢＮａの６β位を水酸化してＣ６−５１４へ変換
する水酸化酵素活性を有するチトクロームＰ−４５０遣
云子を含む挿入ＤＮＡ断片を持っていることになる。プ
ラスミドｐＨＹＯ２は該プラスミドを単独に含む形質転
侠株から調製することか出来る。

第３図に示すプラスミドｐＨＹＯ２の制限酵素切断地図
を作成することにより、該プラスミドのベクタ一部分に
存在するＳｐｈ　ｌサイトを含む約３００１）１）が欠
失していること、水酸化酵素活性を有するチトクローム
Ｐ−４５０遺云子を含む約１０ｋｌ）の挿入ＤＮＡ断片
において宿主函体内において、少なくともｓａｃ　Ｉか
らＳｐｈ　１サイトまでの約６．７ｋｌ）を含む約Ｌ１
ｋｂ　のＤＮＡ断片が組み換えを受け、　ｐＨＹＯｌの
挿入ＤＮＡ断片における当該部分と相同域か逆向きに配
位されたものであることが理解される。このように少な
くとも約６．７ｋｌ）のＤＮＡ［片が逆向きに配位され
たにも拘わらすＭＬ−２３６３ＮユがＣ！Ｓ−５１４へ
の変換を受けることは、ＭＬ−２３６ＢＮａをＯ８−５
１４へ変換する水酸化酵素活性を一有するチトクローム
Ｐ−４５０遺伝子か、少なくともＳａｃ　、１からＳｐ
ｈ　ｌサイトまでの約６．７ｋｌ）を含む約７．１ｋｋ
）のＤＮＡ断片内に位置していること、および該チトク
ロームＰ−４５０遺云子のプロモーター領域も含有され
ていることを示唆する。

前述のごとくプラスミドｐＨＹＯ２において。

Ｓａｃ　ｌからＳｐｈ　ｌサイトまでの約６．７　ｋｂ
　４含む約７．１　ｋｔ）のＤＮＡ断片内に水酸化酵素
活性を有するチトクロームＰ−４５０道云子が含まれて
いるということは、　Ｓａｃ　ｌ消化によって生ずる約
２．４　ｋｂのＤＮＡ断片は水酸化酵素活性の発現には
不要であることを示す。従ってこの約１４　ｋｌ）のＤ
ＮＡ断片を除去することによってプラスミドの小型化か
可能であることは容易に理解される。まずプラスミドｐ
ＨＹＯ２をＢａａ　ｌで消化し、約１３．１ｋｂと約１
４ｋｌ）のＤＮＡ断片を得１次いで加熱処理したのちＴ
４ＤＮＡＩＪガーゼで連結し連結混合物を得る。次いで
ストレプトミセス−リビダンスのプロトプラストに導入
し、前述の方法によって形質転換株を得る。さらにこれ
らの形質転換株は前述の二次スクリーニングと同じ方法
によって培養されＨＰ　ＬＣにてＣ８−５１４，ｉ生成
するクローンを選別する。次いで選別されたクローンに
ついて前述のプラスミド抽出法によってグラスミドを抽
出取得出来る。かくして得られる具体的なものとしては
第４図に示す約１３．１　　　′ｋｂから成りＳａｃ　
Ｉ切断サイトが１ケ所となったプラスミドｐＨＹＯ２１
を挙げることが出来る・第４図はグラスミドｐＨＹＯ　
２１の制限酵素切断地図を示すが、該プラスミドはグラ
スミドｐＨＹＯ２におけるＳａｃ　ｌ消化によって生ず
る約２．４ｋｂのＤＮＡ断片に　　１相当する領域が除
去されたこと以外はプラスミドｐＨＹＯ２と同一である
ことが示される。

（ＩＯＩ　　チトクロームＰ−４５０遺伝子局在領域の
決定グラスミドｐ）ｒＹＯ２１の挿入ＤＮＡ断片約７．
１ｋｂ内にＭＬ−２３６８ＮｍからＣＳ−５１４へ変換
する水酸化酵素活性を有するチトクロームＰ−４５０が
位置している　　１ことはすでに述べた。次に、この約
７．１ｋｂ挿入ＤＮＡ断片内のどの領域にチトロームＰ
−４５０遺伝子が局在するかを検討した。その検討方法
は挿入ＤＮＡ断片内にある制限酵素部位を利用して行な
った。即ち、ｐ）ｒＹｏ　２１をＳｐｈ　ｔで完全に消
化した後、　・アがロース・グル電気泳動すると約１１
．６ｋｂと約１、５　ｋｂのＤＮＡ断片に切断されてい
ることがわかる。

この約１１．６　ｋｂ　ＤＮＡ断片を含むグルを切出し
、電気溶出法によって該ＤＮＡ断片を得、これをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結処理した後、ストレプトミセス・リ
ビダンスのプロトプラストに導入する。

かくして得られた形質転換株はプラスミドｐＨＹＯ２１
の約７．１ｋｂ挿入ＤＮＡ断片から約１．５ｋｂの５ｐ
ｈｔ断片を欠失した約５．６ｋｂの挿入ＤＮＡ断片を含
む約１１．６ｋｂのプラスミドｐＨＹ０２２を含有して
いる。

またプラスミドｐＨＹＯ２１をＭｌｕｌで完全に消化し
た試料をアがロース・グル電気泳動すると約８．６ｋｂ
、約３．６　ｋｂ　（ベクターＤＮＡ断片の約０．３ｋ
ｂを含む）および約０．９ｋｂのＤＮＡ断片に切断され
ていることがわかる。このなかの約８．６ｋｂのＤＮＡ
断片を含むグルを切出し、電気泳動法によって該ＤＮＡ
断片を得、これ’１Ｔ４ＤＮＡ！ｊガーゼで連結処理し
た後、ストレプトミセス・リビダンスのプロトプラスト
に導入する。かくして得られた形質転換株はｐＨＹＯ２
１の約７．１　ｋｂの挿入ＤＮＡ断片からＭｌｕ■消化
によって生ずる約４．２ｋｂのＤＮＡ断片を欠失した約
２．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片を含む約８．６ｋｂのプラ
スミドｐＨＹＯ　２３を含有している。

次に、これらのプラスミドｐＨＹＯ　２２およびプラス
ミドｐＨＹＯ　２３を含有する形質転換株について前述
の二次スクリーニングと同じ方法によって培養されＨＰ
ＬＣにてＣ８−５１４の生成量を調べると同時に、菌体
を超音波破砕したのち遠心分離して得られる無細胞抽出
液についてＯｈｍｕｒａらの方法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　２３９　、２３７０　、１９６４）に従
い、還元ｇｃ。

差ヌベクトルによりチトクロームＰ−４５０の有無を判
定した。

第７図はその結果を示すがチトクロームＰ−４５０遺伝
子はｐＨＹＯ　２３の挿入ＤＮＡ断片約２．９　ｋｂ内
て局在することが示される。また、ＭＬ−２３６Ｂ　Ｎ
ａからＣ８−５１４への十分な変換活性を宿主ストレプ
トミセス・リビダンスに与えるためには約７゜１　ｋｂ
の全域が必要であることが示される。

なお、本発明において使用される放線菌の詳細な説明は
次の通りである。

１、　ストレプトミセス・フラボビレンス５ＡＮＫ　６
３６８４本発明に用いたＭＬ−２３６Ｂ　ＮｍからＣ８
−５１４ヘの変換能を有するストレプトミセス・フラボ
ビレンス５ＡＮＫ　６３６８４の形態的諸性質及び生理
的諸性質は次の通りである。なお各種寒天培地の調製、
種培養、本培養及び結果の観察はＩＳＰ基準、応用微生
物工業審査基準、ワックスマンの勧告などに従った。

各種培地上の生育色調は「色の基準」（日本色彩研究新
版）に従った。

ｌ）形態学的特徴 形態学的特徴は光学顕微鏡観察のほか、下記の要領で調
製したサンプルを用いた電子顕微鏡観察も行った。

菌株の固定には２％オスミウム酸を用い、室温下約ｌＯ
時間蒸気固定した。固定サンプルを寒天培地のまま、５
０，７０，８０，９０．９５゜１００％の各濃度のエタ
ノールで１５分間脱水し、媒介液酢酸インアミルでｒＩ
ｔ換した。乾燥は、臨界点乾燥装置ＨＣＰ−１を使用し
、液体炭酸を移行液として用いた臨界点乾燥を行った。

乾燥サンプルにはイオンコーターｆＢ−３盟を用い、金
の膜の厚さが約２００Ｘになる様に蒸着した。観察は走
査電子頂微鏡ＭＳＭ−４型（日立明石）によった。この
時の加速電圧は２５　ｋＶである。

表１　形態的特徴　（２８℃、１０日間観察）７−・′ ５、／ ／′ ２、各種培地上の培養性状 表　　２　　　　　（２８℃、１４日目観察）Ｇ：生育
　ＡＭ：気菌糸　Ｒ：裏面　ＳＰ：可溶性色素３．生理
的性質 表　　３ スターチの加水分解　　　　　　陽　性１培地１　：　
トリプトン・イーストエキスブロス（ＩＳＰＩ）２ニー
２７Ｄトン・イーストエキス・鉄寒天（ＩＳＰ　６　）
３：テロシン寒天　（ＩＳＰ７） ４：イースト・麦芽エキス寒天　（ＩＳＰ　２　）４、
炭素源の資化性 表　　４ 廿：良く資化する　＋：資化する　−二資化しない５、
細胞壁化学組成 りｅ　ｃｋｅ　ｒらの方法（Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ、　１２　、２３６＊１９６５）に依る分析の結
果、細胞壁主要構成物質としてＬＬ−ジアミノピメリン
酸およびグリシンを検出した。細胞壁型はＩ型である。

以上の結果を要約すると、５ＡＮＫ　６３６８４は直状
〜曲状の胞子柄を示し、その先端に５０個以上の胞子連
鎖を形成する。胞子表面は平滑である。基土菌糸は薄オ
リーブ〜オリーブ黄〜明るい茶味灰の生育をし、灰味白
〜オリーブ灰〜灰色の気菌糸を着生する。気菌糸は粉状
であシ培養後期に湿潤化（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃ）に
伴う黒い斑点が見られる場合もある。また、可溶性色素
およびメラニン様色素は産生じない。細胞壁型はＬＬ　
−ＤＡＰとグリシンを含む！型である。

これらの諸性状から、Ｓ虚６３６８４はストレプトミセ
ス属に属することは明らかである。既知ストレプトミセ
ス属の中でも特に近緑の種としてストレプトミセス・７
ラポビレンスが挙げられる。そこで、ストレプトミセス
・フラボビレンスＩＳＰ　５０６２株と本菌株の同時比
較培養を行った。その結果、両画株間には形態的諸性状
および生理的諸性質において、はとんど差異は認められ
なかった。従っテ、　５ＡＮＫ　６３６８４　ハストレ
グトミセス・フラボピレンと同一種と考えられ、本菌株
をストレプトミセス・フラボビレンス５ＡＮＫ６３６８
４と同定した。

２、ストレプトミセス・リビダンス５ＡＮＫ　６８１８
２〔微工研条寄第１１４１号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１１４
１）　）Ｅ、　Ｋａｔｚによって構築されたプラスミド
ｐＩＪ７Ｑ２を保持するストレプトミセス・リビダンス
３１３１である（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
−１２９，２７０３〜２７１（＋１９８３）。

ストレプトミセス・リビダンスＴＫ　２１である。

本菌株は”　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ＃＊Ａ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎ　Ｉ
ｎｎｅａ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ＋１９８５　Ｋ記載さ
れており、放線菌の宿主として世界中で用いられている
。

本発明者らによって構築されたプラスミドｐＭＥＬ　１
８　（特開昭６２−１２２５８５　＃　Ｊ、Ａｎｔｉｂ
ｉｏｔｉｃｇ。

笠、　１４４０〜１４４７．１９８７　）を保持するス
トレプトミセス・リビダンスＴＫ２１株である◎ＢＰ−
１１４０）　］ 本菌株の形態学的諸性質及び生理的諸性質につに述べて
いる。

ストレプトミセス・フラボビレンス５ＡＮＫ６３６８４
（微工研菌寄第９１７０号）をＧＧＣｙ液体培地（０，
４チグリセロール、０．１％グリシン、０．４％カデミ
ノ酸、０．１％硫酸マグネシウム、０．０１％塩化カル
シウム、０．１％酵母エキス、微量金属塩溶液４ｍＶｌ
）に接種し、２８℃で３日間振盪培養した。これを種と
し、新鮮な ラスコに５％量接種し２８℃で２４時間往復振盪機で培
養した。この培養液から低速遠心で菌糸体を得、この菌
糸体からＭａｒｍｕｒの方法（Ｊ。

Ｍｏｌ・Ｂ１０１・、ユ・２０８．（１９６１））に準
じて全Ｄ　ＮＡを抽出、精製し、ＤＮＡ溶解用緩衝液（
１０ｍＭＴｒｉ日（ｐＨ７，５）　、　１０　ＩｎＭ　
ＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ）で透析して供与体ＤＮＡと
した。

このようにして得られた供与体ＤＮＡ５μｇを　ｔ　ｕ
のＭｂｏ　Ｉを用いて３７℃で反応させ。

３〜２０　ｋｂ　のＤＮＡ断片になるよう部分分解した
。この反応液は７０℃で１０分間処理することによって
Ｍｂｏｌを加熱失活させた。次いで２５倍容量の一２０
℃のエタノールを加え一７０℃で３０分間放置後、　１
５，０００　ｒｐｍで３分間遠心してＤＮＡを沈澱させ
た。

他方、ベスターブラスミドｐＭＥＬ１８（参考側参照。

本プラスミドはストレプトミセス・リビダンス５ＡＮＫ
６０５８７　（微工研菌寄第９１６８号〕からり、Ａ、
Ｈｏｐｗｏｏｄら”Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａ
ｔｉｏｎ　ｏｆｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ″、Ａ　　Ｌ
ａｂｏ１４ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、ＴｈｅＪｏｈｎ　
Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　（１９８５）に記
載の方法によって採取される。）の１μｍを５　の８ｇ
１■によって３７℃、２時間反応させ完全に切断した。

このＢｇｌ　ＩＩで切断されたｐＭＥＬ　１８は７０℃
で１０分間加熱してＢｇｌ　ｌを失活させた後。

前述と同じくエタノール沈澱させた。

以上のようにして調製したＭｂｏ　■で部分分解した供
与体ＤＮＡとＢｇｌ　Ｉ［で完全切断したｐＭＫＬ１８
とを、３５μｌの蒸留水に溶解した。これに１０倍濃度
のりガーゼ反応用緩衝液（８６０１ｎＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ、　６ｇ１■Ｍ　ＭｇＣｌ２．ｐＨ７，６）５ｆｉｌ
　、　　５０ｍＭのジチオスリトール５μｌおよび１０
　ｆｆ１ＭのＡＴＰ５μｌを加え全ｉ１を５０μｌとし
、これに’ｒ４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ６ｕを加え、１４
℃で１６時間反応させた。このようにしてｐＭＫＬ　１
８とストレプトミセス・フラボビレンス５ＡＮＫ６３６
８４染色体ＤＮＡきの組み換えプラスミド混合物ヲ調製
した。

この組み侠えプラスミド混合物から目的の７組み換えプ
ラスミド７ｉ：Ａ別するため、ＭＬ−２３６ＢＮａ　％
Ｏ８−５１４へ変換する能力を本来持たないかもしくは
極めて低い能力しか持たない放線菌であるストレプトミ
セス−リビダンス５ＡＮＫ６３０８６　（微工研菌寄９
１６９号）のプロトプラストに該組み換えプラスミド混
合物を導入した。

即ち、３４％ｇ糖を含有するＧＧＣ７培地で２８℃で３
日間培養したストレプトミセス・リビダンス５ＡＮＫ６
３０８８の菌糸体を含む培養液を種とし、新鮮な３４％
蔗糖を含有するＧＧＣｙ培地１００ｍ１（５００ｍｌ容
坂ロフラスコ）に５％量接種し２８℃で２４時間往復振
盪培養した。該培養液から低速遠心で菌糸体のペレット
を得。

これ＞７；；　２０　ａｔのＰ培地（３２０ｍｕｇ糖、
２５ｍＭＴＫＳ緩衝ｉｈ７０　ｍＭ　ＮａＣｌ、　　１
０　ｆｆ１Ｍ　ＭｇＣｌ２．６Ｈ２０゜２０　ｍＭ　Ｃ
ａＣｌ２・２Ｈ２０）に懸濁し洗浄した。次いで遠心し
得られた菌糸体を２０ｔｕｌのＰ培地に懸濁した。この
菌糸体懸濁液に４０　ｍｙ　／ｒｔｔｌａＫのリゾチー
ム溶液１ｆｆｉｅを加え、２８℃で１時間卵重するとス
トレプトミセス・リビダンス５ＡＮＫ６３０Ｂ６株のプ
ロトプラストか生成した。このプロトプラストと未溶解
の菌糸体の混合物をグラスフィルター（３Ｇ３　）にて
自然ろ過しプロトプラストを多量に含有したプロトプラ
スト液を得た。これを低速遠心しペレットを再びＰ培地
に懸濁した。この操作を３回繰返し十分洗浄することに
より所望のプロトプラスト数を含有するプロトプラスト
液を調製した。

得られたプロトプラスト液を遠心してペレットヲ得た。

これに先に得られている組み換えプラスミド混合物を加
えおだやかに攪拌しプロトプラストを均一に分散させた
。これに２０％ポリエチレングリコール１５４０％含む
Ｐ培地０５ゴを加え１分間静置した後、更に４　ｒｕｇ
のＰ培地を加えた。この形質転換操作はすべて０℃で行
なわれた。形質転換後、遠心してプロトプラストペレッ
トを得た。これに５　ｒｕｇのＰ培地を加え十分攪拌・
洗浄し遠心した。この操作は少なくとも３回行ない所望
量のＰ培地に形質転侠テのプロトプラストを懸濁し再生
培地（Ｒ２ＭＰ　寒天平板）上に塗抹した。

Ｒ２ＭＰ　培地（蔗糖１２　Ｏｆ　、　Ｋ２Ｓ０ａ　０
１２５ｆ。

Ｋ２ＨＰＯ４０，０５ｆ　、　ＭｇＲ２＃　６　Ｒ２０
１０，１２ｆ　、　ＣａＣ１ｚ”２Ｈ２０２，９５ｆ　
、グル：Ｉ−ス４ｆ、カザミノ酸０．１り、Ｌ−プロリ
ン３ｆ、ＤＬ−ノルロイシン０．０５ｆ、チロシン０．
５Ｆ、酵母エキス２ｆ、麦芽エキス５　ｊ、　２５０ｍ
ＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７，２）１０’０ｒｔｔｌ　、微
量金属塩溶＠　２　ａｔ　、寒天２０ｆ７ｚ加え１００
０Ｉ１１１とする）はメラニン様色素の産生を強調する
ために調製した培地である。Ｒ２ＭＰ　寒天平板上に塗
抹後、２８℃で２０時間培養したＲ２ＭＰ寒天平板上に
最終濃度５０μｆ　／　ｍｅとなるようにチオペプチン
を加えた軟寒天Ｒ５培地（蔗糖１２０り、　Ｋ２ＨＰＯ
４０，２ｆ　、　ＭｇＲ２”６　Ｒ２０＆　１　ｆ、　
ＣａＣｌ２　・２Ｈ２０１２ｆ　、　２５０ｍＭＴｌ！
Ｓ緩衝液（ｐＨ７，２）　１００　ｍｌ、グル：ｌ−ス
１０　ｆ、　＃母エキス４　ｆ、ポリペプトンａｆ、Ｋ
ｃｌｏ、５ｆ。

寒天５ｆを加え１ｏｏｏａｇとする）を３　ｔｕｇ重層
した。重層後、該寒天平板を２８℃で培養７ｉ−継続の
中でメラニンを産生しない株（Ｍｅｌ−株）が組み換え
プラスミドを持っている形質転換株であるので＆Ｍｅｌ
−株を選別した。

−次スクリーニングは次の通り実施した。即ち１Ｍｅニ
ーを示す選別された形質転換株を最終濃度３００μり／
ｌｎｌのＭＬ−２３ａＢＮａｚ添加したＧＰＹ寒天平板
（２チグルコーヌ、１チボリペプトン、０．１％酵母エ
キス、２チ寒天、ｐＨ７，０）に移植し、２Ｂ’（で７
〜１０日間培養しコロニーｉ十分生育させた。これらの
コロニーＧ　トロツカ−で打抜き、直径１．５咽の寒天
プラグを作製した。このようにして各々のコロニーを打
抜き作製した寒天プラグ１０個を１つの集団として１．
５　ｍｌ容マイクロチューブに入れ、２０％エタノール
２００μｌ！ヲ加えよく１丸拌、抽出した。

次いで１５．００　Ｏｒｐｍで５分間遠心分４した上滑
をＨＰＬＣにか１す、Ｏ８−５１４に白米するピークの
存在の有無を判別し一次スクリーニングと゛した。ＨＰ
ＬＣはカラムとしてラジアルパックＣＩ８を用い移動相
として２５％アセトニ）　ＩＪルおよび０．１％トリエ
チルアミン（ｐＨ３，２；リン酸によって調製した）の
混合溶剤を用い、流速は２ｍｌ　／分で行なった。

二次スクリーニングは、−次スクリーニングでＯ８−５
１４に白米するピークの存在が認められた集団に含まれ
る１０個のコロニーから夫々をチオペプチン２５μｆ／
ｍｅ’ｆ−含有するＧＰＹ液体培地に接種し２８℃で３
日間振盪培養した。

次いでＭＬ−２３６ＢＮａを３００μｆ／ｍｌ濃度にな
るよう添加し、さらに２８℃で２〜３日間振盪培養を継
続した。該培養液を１．５　ｎｔｌ容マイクロチューブ
に採取し、１５．００Ｏｒｐｍで５分間遠心分離して上
清を採取しＨＰ、ＬＣにかけ、ＭＬ−２３６ＢＮａ　の
６β位を水酸化し０Ｓ−５１４に変換しているクローン
を選別した。ＨＰＬＣの榮件は一次スクリーニングと同
じであるが状況に応じて移動相％３０％アセトニトリル
および０．１％トリエチルアミン（ｐＨ３，２；リン酸
によって調製した）の混合溶剤、流速を１ｍｌ／分に変
えて行なった。

転換 実施例２に記載されたスクリーニング方法によって、Ｍ
Ｌ−２３６ＢＮａの６β位を水酸化し。

Ｏ８−５１４へ変換する能力を付与された形質転換株ス
トレプトミセス・リビダンスＭＬＲ−１５２８Ｎｏ、　
４１６株が選択された。これは、この株か特定のプラス
ミド（プラスミドｐＨＹＯ１）ｉ含有しているためにＭ
Ｌ−２３６ＢＮａ７ｉＣ８−５１４へ変換できるように
なったものと考えられる。このプラスミドｐＨＹＯ１ｉ
調製し、ストレプトミセス・リビダンスを再形質転換し
てその確認を行なった。

即ち、３４％蔗糖を含有するＧＧＣ７培地２０ｍ１　ｌ
ｚ　５０　ｒｘｌ容枝つきフラスコに入れ、これにＭＬ
Ｒ−１５２８Ｎｏ、４１６株の菌糸体を接種後。

２４〜２８℃で約７２時間、１２０ｒｐｆｆｌの往復振
盪機上で培養した。次いで５００　ａｔ容坂ロフラスコ
に入った。３４％蔗糖を含有するＧ　Ｇ　Ｃｙ培地１ｏ
ａａｌに上記種培養の懸濁液を培地の１〜５％相当量を
接種し、２４〜２８℃で２４−４８時間往復損振盪上で
培養した。

この培養液から低速遠心（例えば１０，０ＯＯｆ。

４℃、２０分ンで菌糸体を集菌し、上澄液を傾斜で除い
て菌糸体ペレットヲ得た。菌糸体ペレットを２０ｍ／の
ＴＥＳ緩衝液（２５ｍＭ）リスヒドロキシメチル　アミ
ノメタン（トリス］、２５ｍＭ　Ｉ！ＤＴＡおよび２５
　ｍＭ食塩、ｐＨ＝７．５）に再懸濁し１次いでこの再
懸濁物に４０ｍｑ／ｍｅの濃度のリゾチーム溶液を１　
ｍｌ卯え、この混合物を３７℃で５〜１５分緩（攪拌し
ながら加温し。

次にこれに３　ｍｌの１０％ドデシル硫酸ナトリウム（
ＳＤＳ）溶液を加え、緩く混合したのち３７℃で５分間
加温して溶菌した。

次いでこの溶菌物を４０．０００′ｉ、４℃、３０分遠
心することで粗製溶菌物を上澄として得。

これに１／４容量の５Ｍ食塩を加えて最終食塩濃度を１
’Ｍとし、０℃で２〜３時間冷却すると先に加えたＳＤ
Ｓが沈澱してくるので、３０００Ｓ’　。

０℃、１５分の遠心を行ない、　ＳＤＳを除いた。

この上澄液にリボヌクレアーゼを加えて３７℃で２０分
更にプロナーゼを加えて３７℃で２０分消化を行なった
。この消化液に４０チポリエチレングリコール（ＰＫＧ
）　６０００溶液を最終濃度１０％になるよう添加し、
この混合物を０℃で１晩保つと、　ＤＮＡか沈澱してく
るので、緩い遠心（３０００ｆ、０℃、１５分）後上澄
を捨て。

沈澱物を４．７　ｍｌのＴＥＳ緩衝液に懸濁して十分に
溶かし、　ＴＥＳ緩衝液中で透析し、　ＤＮＡ抽出サン
プルを得た。

このようにして得たＤＮＡ抽出サンプルに塩化セシウム
を混合し、更に蛍光発色剤エチジウム・プロミド（Ｆ：
ＴＢｒ　）　ｉ加え、混合して１．６２０の密度の溶液
を調製した。この溶液は１５０，０００ｆ。

１８℃で４０時間平平衡度勾配遠心を行ない。

この遠心管に３２０ｎｍの紫外線を照射すると。

遠心管中で染色体由来の線状ＤＮＡの強い蛍光帯の下に
、閉環状のプラスミドｐＨＹＯ１のＤ　Ｎ　Ａが蛍光帯
として分離しているのか見いだせた。

閉環状のプラスミドＤＮＡの蛍光帯部分を採取し、これ
を等量のｎ−ブチルアルコールで３回抽出してエチジウ
ム・プロミドを除去し１次に水層を適当な緩衝液（例え
ば＋　１０ｆｆ１Ｍ　）　ＩＪス。

ｔｏｍＭ食塩および１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ＝７
．５　）で透析して純粋な組み換えプラスミドｐＨＹＯ
１を得た。

このようにして得られた純粋な組み換えプラスミドｐＨ
ＹＯ　１は紫外！２６ｏｎｍの吸光度から濃度か求めら
れた。

組み換えプラスミドｐＨＹＯ１における挿入ＤＮＡ断片
の大きさはアガロース・ゲル電気泳動によって算出され
た。即ち１組み換えプラスミド０．５μｍを制限＃累Ｂ
ｃｌ　ｌで切断することにより。

ベクタープラスミドｐＭＫＬ　１８に挿入されているＤ
ＮＡ断片の大きさが判別出来る。挿入ＤＮＡ断片の大き
さは約１０　ｋｂ　であることが判明した。

分子量マーカーと゛してラムダＤＮＡのＨｉｎｃｌ　［
ｉ切断片またはφｘ１７４ＤＮＡのＨａｑ　ｍ切断片を
用い、電気泳動の移動度からＢｃｌ　Ｉ消化によって生
成する５つのＤＮＡ断片の大きさを測定した。これらの
総和（約１５Ｊｋｂ）とベクタープラスミドｐＭＥＬ　
１８の大きさ（約５．１！１ｃｌ））との差を挿入ＤＮ
Ａ断片の大きさとした。

なお、このようにして得られた組み換えプラスミドｐＨ
ＹＯ１（第２図参照）を用いて実施例１に記載した方法
でストレプトミセス・リビダンス　５ＡＮＫ６３０８６
　（微工研薗寄第９１６９号〕を再形質転換した。この
再形質転換によって得られた形質転換株５０株について
ＭＬ−２３６ＢＮａ　　のＣ８−５１４への変換能につ
いて検討したところ、すべての株で変換能か認められた
。咳だこれらの休から分離されたプラスミドはｐＨＹＯ
ｌであった。

からのプラスミドｐＨＹＯ１の除去とｐＨＹＯｌによる
形質転換 プラスミドｐ）ｆＹＯｌか導入されたこ七によってＭＬ
−２３６ＢＮａを０８−５１４へ変換する能力か付与さ
れた形質転換株ＭＬＲ−１５２８Ｎｏ、　４１６からア
クリフラビンまたはプロトプラスト再生によってプラス
ミドｐＨＹＯ１が脱落、除去された４１６Ｆ−７株を取
得した。この株はプラスミドｐＨＹＯ１の除去に伴って
チオペプチンに感受性であった。また、この株は実施例
２に記載された二次スクリーニングと同じ方法によって
Ｏ８−５１４への変換能の有無を調べたところ、変換活
性は認められなかった。さらにこの株について先に述べ
た無細胞抽出液を用いてＣＯ差スペクトルを測定したと
ころ４５０　ｎｍ付近の極大吸収か消失していた。一方
、対照法の１ラスミドｐＨＹＯ１’ｚ保持したＭＬＲ−
１５２８Ｎｏ、　４１６株においては変換活性およびＣ
Ｏ差スペクトルにおける４５０ｎｆｆｌ付近の極大吸収
か認められた。

次いてプラスミドｐＨＹ０１７ｉ−用いてこのプラスミ
ド除去株４１６Ｆ−７％実施例１に記載した方法で形質
転換した。この形質転換で得られた形質転換株はチオペ
プチンに耐性となっており。

また実施例２に記載された二次スクリーニングと同じ方
法によってＯ８−５１４への変換活性を調べたところ変
換活性は復帰していた。さらにＣＯ差スペクトルを測定
したところ４５Ｏｎｆｆｌ付近の極大吸収もまた復帰し
ていた。このことはＭＬ−２３６ＢＮａの６β位を水酸
化しＯ８−５１４へ変換する変換酵素、即ち水酸化酵素
はチトクロームＰ−４５０である可能性を示し、かつこ
の子トクロームＰ−４５０遺云子はプラスミドｐＨＹＯ
１の挿入ＤＮＡ断片中に存在していることを示すもので
ある。

実施例３に記載したようにプラスミドｐＨＹＯ１によっ
て再形質転換して得られた形質転換株５０株にはすべて
プラスミドｐＨＹＯ　＋か存在していることが確認され
たが、これらのうちの１株がプラスミドｐＨＹＯ１’ｉ
−含むほぼ同じ大きさの２種類のプラスミドを含有して
いるプラスミドの混合物であることがＳａｃ　Ｉの消化
によって生成するＤＮＡ断片の解析から判明した。

即ち、　ｐＨＹＯＩはＳａｃ　ｌ消化によって約１０ｋ
ｌ）および約５．８ｋｔ）のＤＮＡ断片を生成するが、
該混合物はＳａＣｌ消化によってプラスミドｐＨＹＯ１
に由来する約１０ｋｌ）と約５．８ｋｌ）のＤＮＡ断片
以外にｐＨＹＯ２と命名したプラスミドに由来する約１
３．１ｋｌ）と約１４　ｋｂのＤＮＡ断片を生成してい
た。そこでプラスミドｐＨＹＯ２７ｚ分離するために該
混合物を用いて実施例１に記載した方法によって形質転
換を実施し、生育した形質転換株から実施例３に記載し
た方法でプラスミドを調製した。次いで該プラスミド７
＜　Ｓａｃ　ｌで消化することによって約１３．１ｋｔ
）と約１４ｋｂｃｒ）ＤＮＡ−断片を生ずるものを選択
して、プラスミドｐＨＹＯ２を単独に含む形質転換株か
得られた。プラスミドｐＨＹＯ２を単独ｉこ含む形質転
換株のＭＩ、−２３６ＢＮａ　からＯ８−５１４への形
質転換能は実施例２に記載した二次スクリーニングの方
法によって測定し、形質転換能を保持していることを確
認した。

実施例６．　プラスミドｐＨＹＯ２１の調製プラスミド
ｐＨＹＯ２はその制限酵票切所地図から、水酸化酵素活
性を有するチトクロームｐ　−４５０遺云子を含む約１
０ｋｂの挿入ＤＮＡ断片において宿主菌体内において少
なくともＳａＣｌからｓｐｈ　ｌサイトまでの約６．７
ｋｌ）を含む約７．１ｋｂ　　のＤＮＡ断片か組み換え
をうけプラスミドｐＨＹＯ　１の挿入ＤＮＡ断片におけ
る轟該部分との相同域が逆向きに配位されたものてあっ
た（第３図参照）。このよう）こ少なくともＥｌａｃ　
ｌからＳｐｈ　ｌサイトまでの約６．７ｋｂを含む約７
．１に′ｂのＤＮＡ断片か逆回きに配位されたにも拘わ
らずＭＬ−２３６ＢＮａがＣ９−５１４への変換を受け
たことは、　ＭＬ−２３６’Ｂ　Ｎａを０６−５１４へ
ａｍする水酸化酵素活性を有するチトクロームＰ−４５
０遺云子かこの約７．１ｋｂのＤＮＡ断片断片内位置し
ＤＮＡ断片を除去した小型化プラスミドｐＨＹ。

：Ｌ′！の調製は以下の通りに行なわれた。

プラスミドｐＨＹＯ２のｌμｆ％５ｕの５ａｃｌを用い
て３７℃で２時間消化した。次いで７０℃にて１０分間
加熱しＳａｃ　ｌを失活させた後、エタノール沈澱を行
なった。次いでこのＳａＣｌ消化エタノール沈澱物を乾
燥後、３５μｌの蒸留水に溶解し、これに１０倍＠度の
リガーゼ反応用緩衝液５μｌ、５０ｍＭ、ジチオスリト
ール５μｌおよび１０　ｍＭ　ＡＴＰ　５１ｔｌを加え
全量を５０　ｔｔｌｌとした。これにＴ４ＤＮＡリガー
ゼ２ｕ　　、１加え。

１４℃で１６時間反応させた。このようにしてプラスミ
ドｐＨＹＯ２のＳａｃ　ｌ消化ＤＮＡｖｇｒ片をセルフ
ライゲーションし、これを実施例３に記載したプラスミ
ドｐＨＹＯ　１の除去体（４１６Ｆ−７株）のプロトプ
ラストへ実施例１に記載した方法によりて導入しｓ　Ｔ
ｈ１ｏｒを示す形質転換株を得た。次いでこれらの形質
転換株から実施例３に記載された方法によってプラスミ
ドを抽出し約２．４　ｋｂＤＮＡ断７片を失ったプラス
ミド、即ち約１３．１　ｋｂの大きさを有するプラスミ
ドを選択した。このようにして得られたプラスミドはＳ
ａｃ　ｌ切断部位を１ケ所持つ約１３．１　ｋｂのプラ
スミドｐＨＹ。

２１（第４図参照）である。このプラスミドはｐＨＹＯ
　２と同じようにＭＬ　−２３６Ｂ　Ｎａの６β位を水
酸化しＣ８−５１４へ変換する水酸化酵素活性を有する
チトクロームＰ−４５０遺伝子を含有する。

少なくともＳａｃ　ｌからｓｐｈ　ｌサイトまでの約６
．７ｋｂ部分を含む約７．１　ｋｂのＤＮＡ断片を持っ
ており。

プラスミドｐＨＹＯ１およびｐ）ｔＹＯ２と同じく宿主
細胞にＭＬ−２３６ＢＮａからＣ８−５１４へ変換する
能力を付与する。

実施例７．　プラスミドｐＨＹＯ２２の調製プラスミ）
’ｐＨＹＯ２１０５μ、９　ｆ　１５ｕ＋７）Ｓｐｈ　
Ｉ　ヲ用いて３７℃で２時間消化した。次いで７０℃に
１０分間加熱しｓｐｈ　ｌ　を失活させた後、０．８４
７　カｅｒ　−ス・グル電気泳動にかけた。アがロース
・グル電気泳動では約１１．６ｋｂと約１．５ｋｂのＤ
ＮＡ断片が生成しており、このうち約１１．６　ｋｂの
ＤＮＡ断片を含むグルを切出し、電気溶出法によって該
ＤＮＡ断片を溶出した。溶出液３５μｌに１０倍濃度の
りガーゼ反応用緩衝液５μ／　、５０ｍＭジチオスリト
ール５μ！、および１０　ｍＭ　ＡＴＰ　５ｆｉｌを加
え全量を５０μｌとし、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ２　
ｕ　ｔ、加え１４℃で１６時間反応させた。このように
してグラスミドｐＨＹＯ２１のＳｐｈ　１消化によりて
生ずる約１１．６ｋｈのＤＮＡ断片をセルフライｒ−シ
、ンし、これを実施例３に記載した４１６Ｐ−７株のプ
ロトプラストへ実施例１に記載した方法によって導入し
、Ｔｈ１ｏ’を示す形質転換株を得た。次いでこの形質
転換株から実施例３に記載された方法によってプラスミ
ドを抽出した。このよう疋して得られたプラスミドはＳ
ｐｈ　ｌ切断部位を１ケ所持つ約１１．６ｋｂのプラス
ミドＰＨＹＯ２２（第５図°参照）である。

このプラスミドはｐＨＹＯ２１の持つ約７．１　ｋｂの
挿入ＤＮＡ断片からｓｐｈ　ｌ消化によって生成する約
１．５ｋｂが除かれた約５．６ｋｂの挿入ＤＮＡ断片を
持っているが、宿主細胞（４１６Ｐ−７株）にＭＬ−２
３６Ｂ　ＮａからＣ８−５１４へ変換する能力を付与し
得ない。

実施例８．　プラスミドｐＨＹＯ２３の調製デラスミｌ
’ｐＨＹ０２１０５μ、９Ｔ！１５ｕ（ＤＭｌｕ　Ｉを
用いて３７℃で２時間消化した。次いで７０℃に１０分
間加熱しＭｌｕ　ｌを失活させた後、０．８４アガロー
ス・グル電気泳動にかけた。アがロース・グル電気泳動
では約８．６　ｋｂ　、約３．６　ｋｂ　（ベクター　
ＤＮＡ断片の約０．３ｋｂを含む）および約０．９ｋｂ
のＤＮＡ断片が生成しており、このうち約８．６ｋｂの
ＤＮＡ断片を含むグルを切り出し、電気溶出法によって
該ＤＮＡ断片を溶出した。この溶出液３５μｌに１０倍
濃度のりが一ゼ反応用緩衝液５μ！！、５０ｍＭジチオ
スリトール５μｇおよび１０ｍＭ　ＡＴＰ　５μｇを加
え全量を５０μｌとしこれにＴ４ＤＮＡ　１ガーゼ２ｕ
を加え１４℃で１６時間反応させた。このようにしてプ
ラスミドｐＨＹＯ２１のＭｌｕ　ｌ消化によって生ずる
約８．６ｋｂのＤＮＡ断片をセルフライｒ−シ目ンし、
これを実施例３に記載した４１６Ｐ−７株のプロトプラ
ストへ実施例１に記載された方法によって導入しＴｈ　
ｉ　ｏ　’を示す形質転換株を得た。次いでこの形質転
換株から実施例３に記載された方法によってプラスミド
を抽゛出した。とのようにして得うれたプラスミドはＭ
ｌｕ　１部位を１ケ所持つ約８．６ｋｂのプラスミド１
）ＨＹＯ２３（第６図参照）である。

このプラスミドはｐＨＹＯ２１の持つ約７．１ｋｂの挿
入ＤＮＡ断片からＭｌｕ　ｌ消化によって生成する約０
．９ｋｂおよびベクターＤＮＡ断片の約０．３ｋｂを含
む約３．６ｋｂが除かれた約２．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断
片を持ち、宿主細胞（４１６Ｐ−７株）　Ｋ　ＭＬ−２
３６Ｂ　ＮａからＣ８−５１４へ変換する能力を付与す
る。しかしその能力はｐＨＹＯ２１によりて付与される
能力に比べると約１／３程度である。

試験例１゜ 換する能力の付与 それぞれ次の菌株 （ａ）　　ストレプトミセス・リビダンス５ＡＮＫ６３
０８６（微工研菌寄第９１６９号）；（１））　　ベク
タープラスミドｐＭＥＬ　１８　ｉ含むストレプトミセ
ス−リビダンス５ＡＮＫ　６３０８６であるストレプト
ミセス・リビダンス ５ＡＮＫ、　６０５８７（微工研薗寄第９１６８号）；
（Ｃ）　　ストレプトミセス・リビダンス５ＡＮＫ６３
Ｇ８６株の本発明によるＭＬ−２３６ＢＮａをＣＢ−５
１４へ変換する水酸化酵素活性を有するチトクロームＰ
−４５０遺伝子を含むＤＮＡ％含有する組み換えプラス
ミドｐＨＹＯ１による形質転換株であるＭＬＲ−１５２
８・ＮＯ４１６株； （（Ｌ）　　ＭＬＲ−１５２８−ＮＯ４１６味からプラ
スミドｐ）ｉＹｏ　１を除去した株である４１１１Ｆ−
７株；（ｅ）　　４１６Ｆ−７株のプラスミドｐＨＹＯ
１１ｃよる再形質転換株であるＲＴＦ−８５株； （ｆ）　　４１６Ｐ−ｙ株のブラスミｌ’　ｐＨＹＯ２
１ｉｃヨる再形質転換株であるＲＴＦ−１８２株；〉ざ
らのうち（ａ）のストレプトミセス・リビダンス５ＡＮ
Ｋ６３０８６株と（ｄ）の４１６Ｐ−７株はＧＰＹ培地
に接種し、（ｂ）のストレプトミセス・リビダンス５Ａ
ＮＫ６０５８７株、（Ｃ）のＭＬＲ−１５２８Ｎ０．４
１８株、（ｅ）のＲＴＦ’−８５株および（ｆ）のＲＴ
Ｆ’−１８２株はチオペプチン２５μｆ／ａｔを含むＣ
）ＰＹ培地ｊこ接種し。

２８℃３日間振盪培養した。次いで、これを種として新
鮮なＧＰＹ培地にこれを５％量接種した。次いで、２ｇ
’ｌ：で１日振盪培養した培養液にＭＬ−２３６ＢＮａ
を５００μｆ／ｆｆｉ／＠度になるように添加し更に２
８℃で３日間振盪培養した。次いで１．５　ａｌｌ容マ
イクロチューブに各培養液を採取し１５．Ｇｏ。

ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を採衆しＨＰＬＣ
によって生成したＣ８−５１４を測定した。

Ｃ８−５１４の生成量は（ａ）は１ｐｆ／ａｔ、　（ｂ
）は５μ２／ＩＩｔｌ＆（Ｃ）は３５９μｆ／ｄ、（ｄ
）は１ａｆ　／　ｍｌ　、（ｅ）は３４０　ｙｔｌａｔ
、　（ｆ）は３９０μｆ　７１１ｇであった。このこと
はプラスミドｐＨＹＯ１およびプラスミドｐＨＹＯ　２
１か本来ＭＬ−２３６ＢＮａの６β位を水酸化しＣＳ−
５１４へ変換する能力を持たないかもしくン は極めて低い能力しか持たない宿主、ストレプトミセス
・リビダンス５ＡＮＫ６３０８６株にＭＬ−２３６Ｂ　
）ＪａからＯ８−５１４へ変換する能力を付与している
ことを示すものである。

プラスミドｐＨＹＯ１及びプラスミドｐＨＹＯ　２１に
よるストレプトミセス・リビダンスの形質モ換５ＡＮＫ
６３０８６およびストレプトミセス・リヒダンス５ＡＮ
Ｋ６Ｇ５８７等の［ＭＬ−２３６ＢＮａｉＣ８−５１４
へ変換する水虐化＃累活性の１ｉｌＪ定」と「チトクロ
ームＰ−４５０の測定」のための無細胞抽出液の調製法
は次のように行なった。

ＧＰＹ培地で前培養した菌株を新鮮なＧＰＹ培地ｔ　ｏ
　Ｏｘ／（５０ｏａｔ容三角フラスコに入ったもの）に
５％量接種し２８℃で２４時間回転振盪培養した。

ＭＬ−２３６ＢＮａを５００μｆ／ｍｌになるよう添加
し、さらに２８℃で２４時間回転振盪培養を継続した。

培養液を０℃で５．ＱＯＯＸｆにて１５分間遠心分離し
て集菌した。水中で冷却した０、８５％食塩水で３回洗
浄後、湿菌体重量の倍量の冷２０％（ｖ／ｖ）グリセロ
ール、２ｆｆ１ＭジチオスＩＪ　ｌ−−ルを含む８０ｍ
Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４，以下「Ａ緩衝液」
という）を加え。

水冷下層音波破砕した。次いで２Ｇ、ＱＯＯＸｆで３０
分間遠心分離し、上清を採取し無細胞抽出液とした。

ＭＬ−２３６ＢＮａから（、ｔ−５１４への水酸化酵素
活性測定法は６抹の無細胞抽出液を仄の条件（反応ａ組
成〕 無細胞抽出液　　　　　　　　０．８ｍ／ＮＡＤＰＨ再
生系 ＮＡＤＰ　　　　　　　　　　　０．２６ａ／グルコー
ス・６−リン酸　　　　　１４ｍＭグルコース１１６−
リン酸脱水素酵Ｗ０．５ｕニコチン酸アミド　　　　　
　　　１０ｍＭ塩化マグネシウム　　　　　　　　　ｚ
ｓｍＭフェレドキシン旬ＮＡＤＰ＋−還元酵素　　０．
０２５ｕ（ホウレン草） フェレドキシン（クロストリジウム、　　５　　μタハ
ストイリアヌム） ホフファチジルコリン　　　　　　　　　２Ｉｎ９硫酸
第１鉄　　　　　　　　　１　　　ｆｎＭ最終容量　　
　　　　　　　１　　ｙｔｌで３０℃１時間振虚；、な
から反応させた、次いで５Ｎ−ＮａＯＨ５０μｌｉ添加
しｐＨ％Ｍｆ４１ｍしたのち、ＨＰＬＣ（カラム：ウォ
ターズラジアルパックカートリッジＣ１８，溶出条１４
：２７Ｌ％アセトニトリル１０．１％Ｈ３ＰＯ４、Ｔ　
ＴＦ２　Ａ　（ｐＨ３，２）　）チトクロームＰ−４５
０は　５ｍｕｒａ　らの方法（、ｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｃｎ　、　、　３３−コ１．２３７０　、（１９６４ン
）に従い還元型ＣＯ差スペクトルにより同定した。

またチトクロームＰ−４５０は下式に従って定量した。

チトクロームＰ　　４５０　（ｎｍｏｌＡｌ）　＝（０
，Ｄ４５Ｇ　−０、Ｄ４９０）Ｘ１００Ｏ／９１第１表
より、　ＭＬ−ｚｓｓＢｍａのＣ８−５１４への変換酵
素活性は宿主（ストレプトミセス・リビダンス５ＡＮＫ
６３０８６　）及びベクタープラスミドによる形質転換
株（ストレプトミセス・リビダンス５ＡＮＫ６０５８７
　）では検出されないがプラスミドｐＨＹＯ１による形
質転換株では変換酵素活性か出現し、同時にチトクロー
ムＰ−４５０の産生も認められる。プラスミド除去株で
は変換酵素活性と共にチトクロームＰ−４５０の産生は
認められなくなり、該菌株をプラスミドｐＨＹＯ１また
はプラスミドｐＨＹ○２１によって形質転換することに
よって変換酵素活性か再び出現し、同時にチトクローム
Ｐ−４５０も産生されるようになる。

挿入方向の異なるＤＮＡ断片を有するプラスミ　ドｐＨ
ＹＯ１、ｐＨＹＯ　２１かともに１本来ＭＬ−２３６Ｂ
　　ＮａをＯ８−５１４へ変換する能力を持たないか、
または侍っていても極めて低い能力の宿主であるストレ
プトミセス・リビダンス５ＡＮＫ６３０８６またはスト
レプトミセス・リビダンス４１６Ｐ−７に、核変換能と
同時にチトクロームＰ−４５０の産生能をも付与するこ
とは、これらの組み換えＤＮＡに含有される挿入ＤＮＡ
断片に水酸化酵素活性を有するＰ−４５０遺伝子がプロ
モーター領域を持ってクローン化されたことを示す。

域の検討 プラスミドｐＨＹＯ　２１　、　ｐＨＹＯ　２２及びｐ
ＨＹＯ２３によるストレプトミセス−リビダンス４１６
Ｐ−７の形質転換株（ＲＴＦ−２５８、ＲＴＦ−２８６
及びＲＴＦ”−２８８）、対照法としてストレプトミセ
ス・リビダンス５ＡＮＫ６０５８７等のｒ　ＭＬ−２３
６ＢＮａｉＣ８−５１４ヘ変換する水酸化酵素活性の測
定」と「チトクロームＰ−４５０の測定」のための無細
胞抽出液の調製法、ｒＭＬ−２３６ＢＮａｉＣ８−５１
４へ変換する水酸化酵素活性の測定」および「チトクロ
ームＰ−４５０の測定」は試験例２に従って行なった。

第７図よりチトクロームＰ−４５０生米には少なくとも
５ｐｈＩ消化によって生じる約１．５ｋｂの５ｐｈｌ断
片を含むＢｇｔ［Ｉ／Ｍｂｏ　Ｉのベクターと神大ＤＮ
Ａ　！！ｆｒ片の連結部位からＭｌｕｌ切断部位までの
約２．９　ｋｂのＤＮＡ断片が必要であることが示され
る。即ちチトクロームＰ−４５０遺伝子はプラスミドｐ
ＨＹＯ　２３の挿入ＤＮＡ断片とＢｇｔ［／Ｍｂ　ｏ　
ｌの連結部位からＭｔｕｌ切断部位までの約２．９　ｋ
ｂに存在していることになる。しかしながら宿主にＭＬ
　−２３６ＢＮａからＣ８−５１４への十分な変換活性
を付与するためにはｐＨＹＯ　２１の持つ挿入ＤＮＡ断
片約７．１ｋｂが必要であると考えられる。

プラスミドＰＩＪ　７０２　（Ｋａｔｚ　ｅｔ　ａｌ、
、、Ｌ　Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、１２９．２７０３（１９８３）
）上に存在するチロシナーゼ遺伝子（ｍａｌ　ｇｅｎａ
）はすべての７トレデトミセスで発現されるものではな
い。そこで該ｍａｌ　ｇｅｎｅを発現し得ないストレプ
トミセスにおいてもメラニン産生を指標としてクローニ
ング出来るよう設計されたプラスミドｐＭＥＬ　１８　
ｅ構築した。ＰＩＪ７０２のｍａｌ　ｇｅｎｅを発現し
得ない宿主ストレプトミセスとしてストレプトミセス・
ジ。

−モンジネンシス［１６］−８・５ＡＮＫ６１１８５（
以下、［１６］−８・５ＡＮＫ６１１８５株）（微工研
条寄第１１４０号（ＦＥＲＭ　ａｐ−ｔ　１４０）　）
を用いた◎ＰＩＪ７０２のｍｓｌ　ｇｉｎｓを発現し得
ない宿主（１６〕−８−ＳＡＮＫ６１１８５株に、該ｍ
ｅ１ｇｅｎｅ　ｉ発現させ得る能力を付与するＤＮＡ断
片は全てのストレプトミセスの染色体ＤＮＡから分離す
ることが可能であるが、ここではストレプトミセス・ニ
ス・ピー５ＡＮＫ６１１８４の培養菌糸体からＭａｒｍ
ｕｒ　法（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、上。

２０８（１９６１））によって抽出したＤＮＡを外来性
ＤＮＡとして供試した。

ストレプトミセス・ニスΦピーＥｉＡＮＫ６１１８４の
ＤＮＡ５μ２　とプラスミドＰ工Ｊ７０２の１μ２を混
合し１次いで４倍濃度の制限酵素反応液１／３容量およ
び制限酵素Ｓｐｋ工９ｕ％加えた。

ＤＮＡ１完全に切断するため３７℃で２時間培養した後
、７０℃で１０分間加熱し制限酵素を失活させた。この
試料に１／１０容量の３Ｍ酢酸すｌ−ＩＪウムを加え撹
拌し１次いで２５倍量の−２０℃で冷却したエタノール
を加えた後、　−７０℃で１０〜２０分間冷却した。こ
の試料Ｇ　ｇ量遠心機にて遠心し上清を捨てＤＮＡ沈ｊ
ｔＬを一２０℃のエタノールで洗浄した。次いて真空中
で乾燥し滅菌蒸留水にて溶解後、１００倍濃に調製した
りガーゼ反応液（６６Ｏｆｆ１Ｍ）リス・ＨＣｉ　。

６６ｆｆ１Ｍ　ＭｇＣｌ２　・Ｈ２Ｏ，Ｉ　Ｇｏ　ｊｎ
Ｍ　ＤＴＴ、　　１．１　ｍＭＡＴＰ、　　ｐＨ７，６
）を１７９容量加えた。さらにこれにＴ４ＤＮＡリガー
ゼを加え、１４℃で１６時間インキュベート後、６５℃
で１０分間加熱しりガーゼを失活させた。これを形質転
換用試料として用いた。該形質転換用試料を用いての（
１８）−ＩＩ・５ＡＮＫ６１１８５株の形質転換は次の
通りに行なった。即ち、５０ｕｔｅ容枝つきフラスコに
ａＧｃｙ培地２０ｄを入れこれに０６〕−８・５ＡＮＫ
６１１８５　　株の菌糸体を接種後、２４〜２８℃で７
２時間、１２０　ｒｐｍの往復振盪機上で培養した。こ
れを種としＧＧＣ７培地１培地１０ハ５００ａｇ容坂ロ
フラスコに５％量接種し２４〜２８℃で２４時間往復振
盪機上で培養した。この培養液から低速遠心で歯糸体の
ペレットを得。

これヲ２　０　ｒｔｔｌのＰ培地（　３２０　ｍＭｇ糖
，２５ｍＭＴＥＳ緩衝液，？Ｏｆｆ１Ｍ食塩，　１　０
　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、　２　０ｍＭｃ４ｃ１２）に懸
濁し洗浄後．遠心し得られた菌体ペレットヲ再び２０ａ
ｅのＰ培地に懸濁した。

この菌体懸濁液に４０η／Ｉ！ｔｌ濃度のリゾチーム溶
液を１　ｍｅ加え、２８℃で１時間加温して〔１Ｂ〕−
８・５ＡＮＫ　６１１１１５株のプロトプラストが生成
した。プロトプラストと未溶解の菌糸体の混合物は、こ
れをグラスフィルター（３Ｇ３）にて自然ろ過しプロト
プラストを多量に含有したプロトプラスト液を得、これ
を低速遠心しペレットを再びＰ培地に懸濁した。この操
作を３回繰返し十分洗浄することにより所望のプロトプ
ラスト数を含有するプロトプラスト液を調製した。

形質転換は、先に調製した形質転換用試料を用いて、実
施例１に記載した方法によって行なった。形質転換操作
を終了したプロトプラストを適宜懸濁しＲ２ＭＰ再生培
地（培地組成は実施例１に記載）上に塗抹した。Ｒ２Ｍ
Ｐ　寒天平板上に塗抹後、２８℃で２０時間培養したＲ
２ＭＰ寒天平板上に鍛終濃度５０μり／　ｍｅとなるよ
うにチオペプチンを加えた軟寒天Ｒ５培地（培地組成は
実ｄ例１に記載）を３　ｍ１重層した。重Ｊｌ後。

該寒天平板を２８℃で培養を継続するとチオペプチンに
耐性を示す３００の形質転換株の生育がみられた。その
中でメラニン色素を産生ずる株が７法認められた。これ
らの株から分離したプラスミドは１３０から１５４０ベ
ース・ペア（Ｊ））のＤＮＡ断片を保持しており、それ
ぞｎｐＭＩｌｃＬ１８からｐＭＥＬ　２４までに命名さ
れた。なおこれらのプラスミドｐＭＥＬ１８からｐＭＥ
Ｌ２４までが宿主の（：１６３−＋１・５ＡＮＫ　６１
１８５株にメラニン色素産生を付与することは再形質転
換によって確認された。

これらの７つのプラスミドのうちｐＭＥＬ　１８は１３
０１）ｐのＤＮＡ断片をもち、且つこの１３０ｂｐ　の
断片中にはＢｇｌ　ｌ［もしくはＳａｃ　ｌの制限酵素
認識部位か認められないことから、この部位を用いたク
ローニングベクターとして、Ｐ工Ｊ７０２を用いること
の出来ない宿主にも使用出来る。純粋なプラスミドｐＭ
ＥＬ１ｇの抽呂、梢製のための培養は、ｐＭＥ１１８を
保持する形質転侠体（ＭＥＬ　１８株）を用いて以下の
通り行なわれた。

培地組成かグルコース０．４　％　、麦芽エキス１．０
％及び酵母エキス０．４チであってチオペプチンを２５
μグ／　ｍｅになるよう添加した培地２０ａｔ；１５０
ｄ容枝つきフラスコに入れ、これにＭＥＬ１８株の菌糸
体を接種後、２４〜２８℃で約７２時間１２０　ｒｐｍ
の往復振盪機上で培養した。次に菌糸体回収用培地組成
かグリセロール０．４％、カザミノ酸０．４％、酵母エ
キス０．０５％、麦芽エキス０．１％、　Ｍｇ５Ｏａ　
０．１　％　、　ＣａＣｌ２−２Ｈ２００，０１％、　
ＫＨ２Ｐ０４Ｇ、　２％及びＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２
００，８チ（ｐＨ７，２に調整）であって、チオペプチ
ンを２５μグ／　ｔｔｔｌになるよう添加した培地１０
０ｍ１ｌｚ５００ＩＩＬｌ容坂ロフラスコに入れこれに
上記種培養の懸濁液を培地の１〜５％相当ｔを接種し、
２４〜２８℃で２４−４８時間往復振盪機上で培養した
。

この培養液から低速遠心（例えば１０．ＧＯＯ５’。

４℃、２０分）で菌糸体を巣画し、上澄液を傾斜で除い
て菌糸体ペレット７、得た。プラスミドｐＭＩｃＬ１８
の抽出精製は、該菌糸体ペレットを再懸濁したものより
実施例３に記載した方法に基ずいて行ない純粋なプラス
ミドｐＭＥＬ　１８７ｉ：得た。

組み換えプラスミドにおける挿入Ｄ　Ｎ　Ａ断片の大き
さはアガロース・ゲル電気泳動によって算出された。即
ち１組み換えプラスミド０．５μグを制限酵素Ｓｐｈ　
ｌで切断することにより、ベクタープラスミドとして用
いたＰ工、Ｔ７０２の線状化した５、８キロベースの断
片と１３０１）ｐの挿入ＤＮＡ断片の２本のバンドか生
成した。分子量マーカーとしてラムダＤＮＡのＨｌｎｄ
［［切断断片またはφＸ１７４　　ＤＮＡのＨａｅ　■
切断断片を用い。

挿入ＤＮＡ断片の大きさによってアガロース・ゲルの濃
度を０．８％、１．２％、２％と変えて電気泳動し分子
量マーカーの移動度から挿入ＤＮＡ断片の大きさを測定
した。

このようにして得られた）゛ラスミドｐＭＥＬ＋８はス
トレプトミセス・リビダンスＳＡ　Ｎ　Ｋ　６３０８６
に導入し、ストレプトミセス・リビダンスＳ　Ａ　Ｎ　
Ｋ８０５８７として寄託されている（微工研＝−Ｖ第９
１６８号）。

【図面の簡単な説明】

第１図はＭＬ−２３６ＢＮａの６β位を水酸化しＣ８−
５１４へ変換する水酸化酵素活性を有するチトクローム
Ｐ−４５０の遺伝子を含有する約７、１　ｋｂのＤＮＡ
断片の制限酵素切断地図である。 図中、　Ｓａは５ａＣ１，３はＫｐｎＩ、ＰはＰｓｔｌ
。 ＭはＭｌｕｌ、Ｓｐは５ｐｈｌ、ＸはＸｈｏｌ、ＩＩ：
はＥωＲ）およびＢｅはＢｃｌ　■による切断点を示す
。 数字は各制限酵素切断位置間の距離を示しＫｂで辰わし
ている。 第２図は組み換えプラスミドｐＨＹＯ１の制限酵素切断
地図である。数字はベクタープラスミド（細線で表わさ
れている）として用いたｐＭＫＬｌ　８に存在するＢａ
０ＩＨｌ　　切断点を座標点とした場合の各制限酵素　
切断位置を表わしている。 斜線部分はプラスミドｐＨＹＯ２およびプラスミドｐＨ
ＹＯ　２１の挿入ＤＮＡ断片との相同領域を表わしてい
る。 第３図は組み換えプラスミドｐＨＹＯ２の制限酵素切断
地図である。数字はベクタープラスミド（細線で表わさ
れている）に由来するＤＮＡ断片上のＢａ　ｍＷ　Ｉ切
断点を座標点とした場合の各制限酵素の切断位置を表わ
している。斜線部分はプラスミドｐＨＹＯ　１の挿入Ｄ
ＮＡ断片との相同領域を表わしている。 第４図は組み換えグラスミドｐＨＹＯ　２１の制限酵素
切断地図である。数字はベクターグラスミド（細線で表
わされている）に由来するＤＮＡ断片上のＢａｍＨＩ切
断点を座標点とした場合の各制限酵素の切断位置を表わ
している。本プラスミドはプラスミドｐＨＹＯ　２のｓ
ａｃ　ｌ消化で生じる約２．４　ＫｂのＤＮＡ断片を除
去したものである。斜線部分はプラスミドｐＨＹＯ　２
の斜線部分と同一である。 第５図は組み換えグラスミドｐＨＹＯ　２２の制限酵素
切断地図である。数字はベクターグラスばド（細線で表
わされている）に由来するＤＮＡ断片上のＢａｍＨＪ切
断点を座標点とした場合の各制限酵素の切断位置を表わ
している。本グラスばドはプラスミドｐＨＹＯ　２１の
ｓｐｈ　ｌ消化で生じる約１．５ＫｂのＤＮＡ断片を除
去したものである。 第６図は組み換えプラスミドｐＨＹ０２３の制限酵素切
断地図である。数字はベクターグラスミド（細線で表わ
されている）に由来するＤＮＡ断片上のＢａｍ）（Ｉ切
断点を座標点とした場合の各制限酵素の切断位置を表わ
している。本プラスばドはプラスミドｐＨＹＯ２１のＭ
ｔｕＩ消化で生じる約３．６Ｋｂと約０．９ＫｂのＤＮ
Ａ断片を除去したものである。 第７図はプラスミドｐＨＹＯ　２１の持つ挿入ＤＮＡ断
片約７．ＩＫｂにおけるチトクロームＰ−４５０遺伝子
の局在部位の検討結果を示したものである。各グラスミ
ドによって形質転換された宿主、ストレフトばセス・リ
ビダンスにおける変換酵素活性とチトクロームＰ−４５
０産生との関係が示されている。図中、黒線はベクター
ＤＮＡ断片、白線は挿入ＤＮＡ断片を表わし、点線は除
去されたＤＮＡ断片の領域を表わしている。 特許出題人三共株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、放線菌のチトクロームＰ−４５０遺伝子を含み水酸
   化活性を宿主に付与しうるＤＮＡ断片。 ２、Ｐ−４５０遺伝子を含み水酸化活性を宿主に付与し
   うるＤＮＡが、ＭＬ−２３６Ｂナトリウム塩（ＭＬ−２
   ３６ＢＮａ）をＣＳ−５１４へ変換する能力を有する放
   線菌の染色体に由来する約７．１ｋｂのＤＮＡ断片であ
   って下図で表わされる制限酵素切断地図を有する特許請
   求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 （ＢｇｌII／Ｍｂｏｌ） ▲数式、化学式、表等があります▼ ３、Ｐ−４５０遺伝子を含む領域が約２．９ｋｂのＤＮ
   Ａ断片であって下図で表わされる制限酵素切断地図を有
   するＤＮＡ断片。 （ＢｇｌII／Ｍｂｏｌ） ▲数式、化学式、表等があります▼ ４、ＤＮＡがプラスミドｐＨＹＯ１、ｐＨＹＯ２または
   ｐＨＹＯ２１である特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ
   。 ５、特許請求の範囲第３項記載のＤＮＡ断片を含むプラ
   スミドｐＨＹＯ２３であるＤＮＡ。 ６、ＤＮＡとしてプラスミドｐＨＹＯ１、ｐＨＹＯ２、
   ｐＨＹＯ２１またはｐＨＹＯ２３を含有する微生物。