JPH012599A - クレアチニン分析用多層分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明は、液体試料中のクレアチニンを測定するための
多層分析素子に関する。

〔従来の技術］ クレアチニンの測定は、近年腎機能検査の一環としてま
すますその重要性が増している。クレアチニンの測定は
、ヤッフェ（Ｊａｆｆｅ）　　法等の化学的な方法が多
用されているが、これらは高アルカリ溶液を用い、更に
除タンパク質操作を必要とする煩雑なものであシ、また
体液中に存在するクレアチンが陽誤差として測定されて
しまうという欠点を有している。

一方、より反応特異性の高い酵素を用いる測定方法も、
操作上は多少簡便になってはいるが、用いる酵素によっ
て各々内因性の物質による影響は免れ得す、特に血液の
ごとき存在する濃度が著しく小さい試料を測定する際内
因性物質の除去操作の煩雑さとあいまって誤差が大きい
ことが知られている。

近年、盛んになりだした乾式分析の分野でも、この問題
は全く変らない。例えば、特開昭５２−３４８８号及び
同５６−７２６９２号各公報に開示された方法を用いて
、クレアチニンの測定を行う場合にも明らかである。前
記公報の記載に従えば、支持体上に第一の試薬層、半透
膜層、第二の試薬層から構成されている。通常の使用形
態においては、更に多孔性展開層が積層されている。第
一の試薬層には、ｐＨ指示薬、第二の試薬層にはクレア
チニンデイミナーゼが含有され、多孔性展開層から供給
された液体試料は下記反応式に従って分解される。

クレアチニン この際生成するアンモニアとＮ−メチルヒダントインを
半透膜層でアンモニアのみ第一の試薬層に透過させ、こ
のアンモニアがｐＨ指示薬と反応して検知可能な応答を
示すというものである。

［発明が解決しようとする課題〕 これは−見、単純な方法であるが、体液中のアンモニア
も同様に測定されてしまうためにクレアチニンの測定に
は必ず、アンモニアも測定し、その結果の差から真のク
レアチニンの値を出さねばならないという欠点を有して
いる。

これは、過酸化水素を測定するクレアチニナーゼ、クレ
アチナーゼ、ザルコシンオキシダーゼを用いる反応でも
同様であり、内因性のクレアチンを何らかの方法で除去
する必要がある。

本発明の目的は、これら従来の技術における欠点のない
クレアチニン分析用多層分析素子を提供することにある
。

［課題を解決するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明はクレアチニン分析用多層
分析素子忙関する発明であって、支持体上に試薬層、そ
の上方に多孔性展開層を有し、少なくともクレアチニナ
ーゼ、クレアチナーゼ、ザルコシンオキシダーゼ及び過
酸化水素検出用組成物を含有する、液体試料中のクレア
チニンを分析するための多層分析素子において、該クレ
アチナーゼが、クレアチニナーゼ含有層よりも該展開層
により近い層及び／又は展開層に含有され、かつ素子内
にクレアチナーゼに比△ べてクレアチナーゼの活性が高くなるのに十分な緩衝剤
が含有されていることを特徴とする。

本発明に用いられる反応は下記反応弐忙従う。

クレアチニナーゼ クレアチニン□クレアチン クレアチナーゼ クレアチン　　　　　　　　ザルコシン士尿素デヒド 前記のように、クレアチニンから生成するクレアチンと
液体試料、例えば血液中に存在するクレアチンを分別す
る必要がある。

本発明においては、このため、多孔性展開層から供給さ
れた液体試料が第一に接触する酵素をクレアチナーゼと
し、反応の初期だおいて、内因性のクレアチンを反応さ
せることを目的とする。

そして本発明の素子内には、クレアチニナーゼに比べて
クレアチナーゼの活性が高くなるのに十分な緩衝剤が含
有されており、それによって好適なｐＨに調整される。

そのｐＨは、４５〜ａＯの範囲が好ましく、それによっ
て、クレアチニナーゼに比べてクレアチナーゼの活性を
高くし、内因性のクレアチンの除去を効果的に行うこと
ができる。

本発明の素子においては、クレアチナーゼの含有量を、
クレアチニナーゼの含有量より多くすることが好ましい
。

そして、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼの反応を遅
滞なく進行させるためには、クレアチニナーゼ及びクレ
アチナーゼの分析素子内の含有量が、国際単位で、クレ
アチニナーゼを１とすると、クレアチナーゼは１．２倍
〜５．０倍ノ活性を得るようにすることが好ましい。

これは、クレアチニナーゼによって触媒される酵素反応
が平衡反応であり、クレアチニナーゼによって液体試料
中のクレアチニンがクレアチンに変換され、このクレア
チンがクレアチナーゼにより速かにザルコシン及び尿素
に分解されないと反応が逆方向に進み、反応全体が進み
難くなり、結果として貧弱々応答しか示さないことにな
るからである。

また、別の長所としてクレアチナーゼがクレアチニナー
ゼの１．２倍から５．０倍の国際単位を含有することで
、内因性のクレアチンの除去が更に短時間に達成できる
。

本発明の分析素子は、好ましくは透明な水不浸透性支持
体上に積層した形で提供される。本発明のかかる支持体
は、透明でかつ水不浸透性であるのが好ましいが、例え
ば、ガラスや合成樹脂シート、例えば、ポリエチレンテ
レフタレート、ポリカーボネート、セルロースアセテー
ト、ポリスチレン、ポリエチレン等が挙げられる。用い
られる支持体の膜厚は約５０μｍから約５００μｍまで
必要に応じて適宜選択することが可能である。

本発明に係る支持体の積層される面には、必要に応じて
層との接着性を改善するための処理を行うことが好まし
い。例えば、火炎処理、コロナ放電処理等の物理的処理
や、接着性向上のための下塗り層の塗布、更にこれらの
組合せ等が挙げられる。

本発明においては、クレアチナーゼをクレアチニナーゼ
より、展開層及び／又はクレアチニナーゼよりも展開層
によシ近い層に含有させる。

すなわち、支持体側から第一の試薬層、第二の試薬層及
び多孔性展開層と積層された場合の本発明の分析素子で
は、第一の実施態様として、支持体及び、クレアチニナ
ーゼを含有する第一の試薬層、クレアチナーゼを含有す
る第二の試薬層及び多孔性展開層から成る。

第二の実施態様として、支持体上にクレアチニナーゼを
含有する第一の試薬層、クレアチナーゼを含有する第二
の試薬層及びクレアチナーゼを含有する多孔性展開層か
ら成る。

別の実施態様として、支持体上にクレアチニナーゼを含
有する試薬層及び、クレアチナーゼを含有する多孔性展
開層から成る。試薬層に含有される他の試薬としてザル
コシンオキシダーゼ及び過酸化水素検出用組成物がある
。過酸化水素検出用組成物は、ペルオキシダーゼ作用を
有する物質及び色原体、例えば、水素供与体及びカプラ
ーから成る。ペルオキシダーゼ作用を有する物質として
は、ペルオキシダーゼ、ヘモグロビン、ヘマチン等が挙
げられるが好ましいのはペルオキシダーゼである。

他に含有される酵素としては、ザルコシンオキシダーゼ
、及びべ〃オキシダーゼがあるが、これらは前記のいず
れの層に含有しても良いし、また、更に別の層を設けて
その層に含有することもできるが、クレアチニナーゼと
共忙含有されることが好ましい。

本発明に用いられるクレアチニナーゼ、クレアチナーゼ
、ザルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼは、目的
に応じて幅広い含有量を選択することが可能である。

クレアチニナーゼは、５千国際単位（以下、工σと略記
する）７ｍ２から５０万工Ｕ／ｍ”％クレアチナーゼは
、６千工Ｕ／ｍ″から２５０万工Ｕ／ｍ”、ザルコシン
オキシダーゼは、５千工σ、４！から５万工Ｕ／ｍ　”
　、ペルオキシダーゼは、５千工Ｕ／、、ｊから１０万
Ｉ　Ｕ　／ｒｎ　”の範囲で選択することができる。

但し、単位時間当りの濃度でみる、いわゆる初速撹流（
レート法）の場合、クレアチニナーゼは５千工Ｕ　／　
ｍ”から１０万工Ｕ／ｍ”　、クレアチナーゼは６千工
Ｕ　／　ｍ”から５０万工Ｕ／ｍ”が好ましい。

また、終点測定法（エンドポイント法）の場合は、クレ
アチナーゼが１２万Ｉ　Ｕ　／ｒｎ　”から２５０万工
Ｕ／ｍ”　、りＶアチニナーゼは１０万工Ｕ／ｍ鵞から
５０万工Ｕ　７ｍ　”が好ましい。

試薬層のバインダーとしては、親水性コロイド物質が好
ましい。親水性コロイド物質の例としては、ゼラチン、
ゼラチン誘導体（例えば、フタル化ゼラチン等）、アガ
ロース、アルギン酸、水溶性七Ｖロース誘導体（例えば
、とドロキシエチルセルロース、力〃ボキシメチ〃セル
ロース・ナトリウム塩、メチルセルロース、エチルセル
ロース等）、ポリアクリルアミド類（例えば、ポリアク
リルアミド、ポリメタクリルアミド、及びその共重合体
）、ポリビニルピロリドン及びその共重合体、ポリビニ
μアルコール等が挙げられる。

色原体は分析素子内のいずれの層にも含有することが可
能であるが、好ましくは、ペルオキシダーゼと同一の層
に含有されるべきである。

本発明の用いられる色原体としては、過酸化水素の存在
下、ベルぞキシダーゼによシ検知可能な応答を示す化合
物であれば、ルーることが可能である。ここでいう検知
可能な応答とは、発色反応、消色反応、発蛍光反応、発
光反応等が挙げられる。好ましくは発色反応である。

例えば、トリンダー試薬として知られる４−アミノアン
チピリン誘導体と、１−ナフトール誘導体等との組合せ
、特開昭５７−９４６５３号、同５７−９４６５４号、
同５７−９４６５５号、及び同５７−９４６５４号各公
報に記載の化合物の組合せ、特開昭５３−２６１８８号
公報に記載の染料形成性前駆物質等が挙げられる。

更に、４−アルコキシ−１−ナフトール類、ＡＢＴ８（
２，２’−７ジノービス（３−エチルベンゾチアゾリン
−６−スルホン酸）〕、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジ
ン）等も用いられる。

前記水素供与体及びカプラーは、直接水に溶解して、又
は有機溶媒に溶解して、いわゆる直接分散の形で、ある
いはオイルプロテクト分散等の方法によって、容易に試
薬層に含有することができる。

試薬層中には、緩衝剤が含有される。緩衝剤としては、
上記範囲を緩衝できるものであれば良いが、例えば、リ
ン酸緩衝剤（［１諺ｐｏ４−Ｋｌ師４）、グツド（Ｇｏ
ｏａ）の緩衝剤として知られるものＣ例ＬＩｄＴｙｒ、
ｓ　（Ｎ−）リス（ヒドロキシメチＡ／）メチ１ｖ−２
−アミノエタンスルホン酸）−ＫＯＨ％　ＴＡＰＥ（ｌ
ｉ−）リス（ヒドロキシメチＡ／）メチｔＶ−Ｓ−アミ
ノプロバンスｐホン酸】−ＫＯ１’１等〕等の種々のも
のが挙げられる。

本発明に係る多孔性展開層は、公知の種々のものが用い
られる。例えば、特公昭５Ｍ−２１６７７号公報に開示
された非繊維質多孔性媒体層、いわゆるプラッシュポリ
マー層、特開昭５５−９０８５９号公報に開示された粒
子と接着剤微粒子から成る粒状構造輸送体、特開昭５５
−１６４５５６号公報に開示された親水化処理された織
物、特開昭５７−１９７４６６号公報に開示されたバラ
バラの繊維及び反応性高分子から成る繊維展開層、特開
昭５７−１０１７６０号、及び同５７−１０１７６１号
各公報に開示され九粒子が直接又は低分子化合物を介し
て結合された粒子結合体等が挙げられる。

４Ｉ＃ＩＣ特開昭５７−１９７４６６号公報に開示され
た繊維展開層は、製造も容易で、かつ十分な精度を与え
るものとして有用である。

本発明に係る多孔性展開層は、膜厚が約５０μｍから約
１■、好ましくは、約１００μｍから約５ｏｏｐ鋼であ
る。

更に多孔性展開層の中で前記特開昭５７−１９７４６６
号公報に開示された繊維展開層に用いられるバラバラの
繊維（Ｐ紙庫材料用繊維と称−ｆ　）　ｉｆ　ＪＩ日フ
ルイで、４０メツシユから５００メツｙ：Ｌまでの広範
囲にわたって使用することができる。

本発明の実施態様の１つに従えば、クレアチナーゼは、
多孔性展開層に含有することができる。酵素を安定に展
開層に組込むためには特開昭４１−１７７９９７号公報
の開示に従って、上記酵素を阻害しないタンパク質と共
に凍結乾燥し、この凍結乾燥粉末を微細粉末として含有
することで達成される。

更に色原体として、特開昭５７−９４６５５号、同５７
−９４６５４号、同５７−９４６５５号及び同５７−９
４６５４号各公報に開示の組合せを用いる場合、水素供
与体を含有することは有用である。

本発明の多層分析素子は、試薬層及び多孔性展開層を必
須の構成層とするが、必要に応じて他の機能層を組込む
ことが可能である。

他の機能層としては例えば、光反射層、濾過層、バリヤ
ー層、マイグレーション阻止層、レジストレーション層
、妨害物質除去層等、若しくは構造層（例えば接着層等
）が挙げられる。

本発明の多層分析素子の各層には種々の添加剤を添加す
ることができる。例えば、界面活性剤（アニオン性、カ
チオン性１両性、非イオン性界面活性剤）、硬膜剤、保
恒剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸等）が含有され
る。界面活性剤は各層の塗布工程の延展効果だけでなく
、分散のための助剤等の効果で用いられる。また、硬膜
剤は、試薬層の親水性バインダーを架橋し、分析素子に
液体試料を適用した後のインキュベーシミン過程での試
薬等の展開層へのマイグレーションを防止することがで
きる。更に保恒剤は、例えば酵素活性を阻害する物質を
トラップするエチレンジアミン四酢酸及びその塩等が効
果的である。

本発明の多層分析素子は、生物学的液体試料、すなわち
血液、血漿、血清、尿、髄液等を用いることができる。

用いられる量は５μｔから２０μ４好ましくは７μＬか
ら１５μｔ、一般的には１０μｔが好ましい。

測定波長は色原体から生成する色素によって決定される
が、可視領域すなわち４００　ｎｍから７００　ｎｍの
範囲で選択される。好ましくけ４５０　ｎｍ以上の波長
から選択されるべきである。また、測定方法としては内
因性のクレアチンの反応が終了した時点から一定時間多
点で測定し、その間の単位時間当りの濃度変化量を求め
るいわゆるレート法、また同様に内因性のクレアチンの
反応が終了した後測定し、更に一定時間後再度測定し、
この二点の濃度差を求める、いわゆる二点測定法が好ま
しいものとして挙げられる。

〔実施例］ 以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定され危い。

なお、各側において使用したクレアチナーゼ及びクレア
チニナーゼはフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａａｔ
ｅｒｉｕｍ　）　ｓｐ、ザルコシンオキシダーゼはコリ
ネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）８
ｐ。

そしてペルオキシダーゼは西洋わさび由来のものである
。

実施例−１ 透明な下塗り済み厚さ約１８０μｍのポリエチレンテレ
フタレート支持体上に、下記組成の層を積層した。

（第一の試薬層） 脱イオン化ゼラチン　　　　　　１０９７ｍ”ペルオキ
シダーゼ　　　　　　　７千ＸＵ／ｍ”ザルコシンオキ
シダーゼ　　１万５手工ｇ／−２クレアチニナーゼ　　
　　　　１０万Ｉ　ＴＴ　／　ｍ″フタル酸ジプナ”　
　　　　　　　６．７９　／？Ｆｌ　”１．８Ｍリン酸
カリウム緩衝剤（ｐＨ！７．５）　　　３ａｏ　９７ｍ
”アルカノールｘｏ（デュポン社より市販）（１１５９
７ｍ”ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテｌＶＱ、
３６ｔ／ｍ”（第二の試薬層） 脱イオン化ゼラチン　　　　　　　５９７ｍ”クレアチ
ナーゼ　　　　　　１２万５千Ｉ　Ｕ　／　ｍ”アスコ
ルビン酸オキシダーゼ　　　　　　１万工Ｕ　／　ｍ　
”１．８Ｍリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ＝７．５　）　
　　１９．０　ｔ　／　ｍ”アルカノールＸａ　　　　
　　　　α０７５９７ｍ”ビス（ビニルスルホニルメチ
ル）エーテル　　１１８９７ｍ”エチレンジアミン四酢
酸・２ナトリウムｊ４　　　Ａ３６ｔ／ｍ”（接着層） （多孔性展開層） １紙原材料用繊維（４０メツシュ以上）　　　　　１０
５９７ｍ”トリトン！−１００（ロームエンタース社）
　　　１α２９／ｍ”更に比較分析素子として、同様に
透明な下塗り済み厚さ１８０μｍのポリエチレンテレフ
タレート支持体上に下記組成の試薬層を積層した。

（試薬層） セ？　ｆ　ン１０ｆ７ｍ” ペルオキシダーゼ　　　　　　　７手工Ｕ／ｍ”ザルコ
シンオキシダーゼ　　　１万５千工ＩＴ／ｍ”クレアチ
ナーゼ　　　　　　１２万５千工Ｕ　７ｍ”クレアチニ
ナーゼ　　　　　　１０万工Ｕ／ｍ”フタ〃酸ジブチＡ
ｙ＆７ｆ／ｍ” １．８Ｍリン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ＝７．５）　　　
５１ＬＯｆ／ｍ”アスコルビン酸オキシダーゼ　　１万
工Ｕ／ｍ”エチレンジアミン四酢酸・２ナトリウム塩　
　　江５６ｆ／ｍ”７Ａ／力／−ＩＷ　Ｘ　Ｏ［１１５
９７ｍ”ビス（ヒニルスルホニルメチル→エーテル　　
　１１５６ｆ／ｍ”更に前記本発明の分析素子（１）に
示した接着層及び多孔性展開層を同一の組成で積層し、
比較分析素子（１）を作成した。クレアチニン及びクレ
アチンを種々の濃度で混合溶解した標準液を作成シ、こ
れをクレアチニンを酵素法［ｃｉＥ（Ｋ）ＫＡ工Ｎ０日
、■カイノスより市販］、クレアチンをピクリン酸塩法
で測定し、両者の濃度を決定した後、本発明の分析素子
（１）及び比較分析素子（１）＆Ｃ１０ｐＬ点着し、５
７℃でインキュベーシミンを行い、点着後３分及び７分
後の反射濃度を５４６　ｎｍのフィルターを用いて測定
し、７分から３分の反射濃度差（ΔＤＡ）及び７分後の
反射濃度を出した。結果を表−１に示す。

表　　−１ 表−１によれば、本発明分の分析素子（１）は、７分−
３分のΔＤＲを測定することでクレアチン量に依存せず
、クレアチニンの濃度と良好な相関があるのに反し、比
較分析素子（１）はΔＤＲをとつても、クレアチンの量
によって正誤差が出ていることが明らかである。

実施例−２ 実施例−１で用いた本発明の分析素子の組成のうち緩衝
剤ＯｐＨｔ−ｔｏ、　　７．０．　７．８．　　ａ５と
変化させて、実施例−１と同様のクレアチニ、ン標準液
を用いて、点着後３分及び７分後のＤＲの差（ΔＤＲ）
を求めた。結果を表−２に示す。

表　　−２ 表−２から明らかなように、特に本発明の分析素子（２
）及び（３）を用いた場合には、内因性のクレアチンの
影響の排除において、優れた効果が奏せられる。

実施例−３ 透明な膜厚１８０μｍの下塗り済みポリエチレンテレフ
タレート支持体１忙、下記組成の層を順次積層し、分析
素子とした。

（試薬層） 脱イオン化ゼラチン　　　　　　　１０　ｔ／ｍ”ペル
オキシダーゼ　　　　　　１万２千工Ｕ／ｍ”クレアチ
ニナーゼ　　　　　　　表−３に示すザルコシンオキシ
ダーゼ　　　１　万５　千Ｉ　Ｔｌ／ｍ”２−ヒドロキ
ｖ−１ｓ−ｙクロ）（４ムグＡｎｈ７ｆｌｌ　　　　　
　　ｔ　２　ｔ　／　ｍ”４−アミノアンチピリン・塩
酸塩　　　　１８　ｔ　／　ｍ”１．８Ｍリン酸カリウ
ム緩衝剤（ｐＨ＝７．５　）　　　５　ａ　Ｏｆ／ｍ”
エチレンジアミン四酢酸・２ナトリウム塩　α５６９／
ｍ”ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル　　　　
α５６９／ｍ”（接着層） （展開層） １紙原材料用繊維（４０メツシュ以上）　　　　　１０
５　ｔ／ｍ”ト　　リ　　ト　　ン　Ｘ　　　−１００
Ｉ　　Ｑ、２ｔ／ｍ”クレアチナーゼ　　　　　　　　
表−３に示すウシ血清アルブミン　　　　　　　五１３
９７ｍ”表　　−３ 上記本発明の分析素子（６）〜（９）に、実施例−１で
用いた検体１〜８を１０μを点着した後、３７℃でイン
キュベーションを行い、実施例−１と同様に点着後３分
及び７分で５４６　ｎｍのフィルターを用いて反射濃度
を測定した。結果を表−４に示す。

表　　−４ 以上の表−４から明らかなように、クレアチニナーゼ忙
対するクレアチナーゼの比率が１よシ大きい場合には、
内因性のクレアチンの影響の排除において、優れた効果
が奏せられる。

［発明の効果］ 以上説明したように、本発明の分析素子を用いれば、１
回の操作でクレアチンの影響を排除して精度よくクレア
チニンを定量することができるという顕著な効果が奏せ
られる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、支持体上に試薬層、その上方に多孔性展開層を有し
   、少なくともクレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ザル
   コシンオキシダーゼ及び過酸化水素検出用組成物を含有
   する、液体試料中のクレアチニンを分析するための多層
   分析素子において、該クレアチナーゼが、クレアチニナ
   ーゼ含有層よりも該展開層により近い層及び／又は展開
   層に含有され、かつ素子内にクレアチニナーゼに比べて
   クレアチナーゼの活性が高くなるのに十分な緩衝剤が含
   有されていることを特徴とするクレアチニン分析用多層
   分析素子。 ２、該クレアチナーゼの含有量が、該クレアチニナーゼ
   の含有量よりも多い請求項１記載のクレアチニン分析用
   多層分析素子。 ３、該クレアチニナーゼが試薬層に、該クレアチナーゼ
   が展開層に含有されている請求項１又は２記載のクレア
   チニン分析用多層分析素子。 ４、該過酸化水素検出用組成物が、ペルオキシダーゼ作
   用を有する物質、水素供与体、及びカプラーからなるも
   のである請求項１〜３のいずれか１項に記載のクレアチ
   ニン分析用多層分析素子。