JPH01272968A - レーザ磁気免疫測定方法を実施するための検体調整方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野〕 本発明は極めて微量の検体から特定の抗体または抗原を
定ｈＸ的に検出可能なレーｌ′ｆ磁気免疫測定方法に用
い−Ｃ好適な検体調整力法に関するものである。 〔従来の技術〕 後天性免疫不全症候群、成人Ｔ細胞白血病等のような新
型ウィルス竹疾病、あるい

【３１各秤ガンの早期検査法
として、抗原抗体反応を利用した免疫測定法の開発が、
睨在、世界的規模で推進されている。 従来から知られる一次反応を利用した微量免疫測定方法
としては、ラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩ△法と記
′ＴＩ）、耐累イムノアッヒイ（ＥＩＡ）、蛍光イノ１
ノアツレイ法等が既に実用化され（いる。これらの方法
は、それぞれアイソ１〜−ブ、酵素、蛍光物質を標識と
して付加した抗原また【よ抗体を用い、これと特異的に
反応覆る抗体または抗原の有無を検出づる方法である。 ＲＩ　Ａ　ｖ：は、標識化されたアイソトープの放的線
紹を測定することにより抗原抗体反応に寄りした検体量
を定δ１づるｂので・あり、ビー」グラム程度の超微足
測定が可能４ｆ現右暗−の方ｄ１である。しかしながら
、この方法は放ＤＪ竹物質を利用覆るので、特殊設備を
必要とし、また、半減期客にＪ、る標識効果の減衰等を
考１煮しな（Ｊればなら４ｆいので、実施には人込゛な
制約がある。更に、散開性廃棄物処理が和会問題とな−
）でいる現状を書庫りると、その実施は自ずと制限され
る。 一方、酵素、蛍光体を標識どして用いる方法は、抗原抗
体反応に寄与した検体量を、発色や発光を観測りること
にＪ、り検出り゛る方ｒ人であり、ＲＩＡ法の如き実施
上の制約はない。しかしながら、発色あるいは発光を精
密に定がすること０９１困難であり、検出限界はプノグ
ラム程度である。 また、レーリ゛光を利用して抗原抗体反応の右フ１（（
を検出りる方法として、例えば、主に肝臓病の検出を目
的どじで開発された△ＦＰ（アルファ・ノー■１〜プ１
１−フィン）を利用した方法がある。 この方法は、Ａ　Ｆ　Ｐに対Ｊる抗体をプラスダック微
粒子にイτｊ加し、抗原抗体反応によってプ゛ラスデッ
ク粒子が凝集してノＩしる質耐変化から調べる方法で゛
あり、１Ｏ−１０ｙの検出感度を達成している。これは
、従来のレーリ゛−光を用いた方法の白イ８以−Ｌの感
度であるが、ＲＩＡ法に比較Ｊるど自分の−・以下に過
ぎない。史に、この方法が水溶液中にａ３　Ｌ−Ｊる抗
Ｉ京抗体複合物のブラウン運動の変化を利用しくいるた
めに、抗体を含む水溶液の舘１ａ、揺乱の影響あるいは
水溶液に混在ザる不純物粒子の影響を極めて受【Ｊ易く
、これ以上に検出感度を４′２めることは■；１即的に
望外のものＣ゛ある。Ｊ、た、このＪ、うな木質的欠点
があるため、多量の検体を必要どじてぃた。 ！述のｊ、うに、従来の免疫測定手段においては、高い
検出感度を右Ｊる「り［Ａ法は、放０４刊物７゛１を使
用づるために、イの実流（ンついて（Ｊ多くの制約があ
り、一方、実施の容易な酵素イムノアラレイ法、蛍光イ
ムノアッレイｄ、等は感度が低く、精密な定ｉ７１的測
定がＣさなか・）だ。 てこで、本発明者らは、従来の方法とは原理を異に覆る
免疫測定方法のω］究を行ない、先に、ｒ」願昭６１−
２２４５６７　；′Ｊ、特願昭６１−２５２４２７８、
特願昭６１−２５４１６４号、特願昭６２−２２０６２
号、特願昭６２−２２０６３号、特願昭６２−１５２７
９１月、特願昭６２−１５２７９２＠、特願昭６２−１
ε１９０２号、特願昭６２−２６４３１９号、特ｗ１昭
６２−２６７／１３３１ｇどしてレーザ磁気免疫測定方
法及び測定装置についての発明を特許出願している。こ
れらの新しい免疫測定方法は標ｉａ月利としてＩａ刊微
オイｌ子を用いる点に特徴があり、アイソ１〜−プを用
いないでビニ１グラムの超微量検出が可能である。検出
ｙＪ法は検体に照射したレーリ゛光の散乱光、透過光、
反ＱＪ光、］渉光重回折光の何れを検出しでもＪ、い、
。 本発明者らは１述の秘ｈ′［に２；↓づさ、磁ｆＬ微粉
了を抗原あるい【Ｊ抗体に標識し、初めてウィルスの検
出等を行なった。この新しいレーザ磁気免疫測定方法は
、従来形も検出感度が高いとされている「くＩＡ法Ｊ、
リーし検出悪疫が高いことが確認されつつある。、　ｐ
Ａえぼ、発明発布らが日本ウィルス学会第３Ｌ）回総会
（昭和６２く［１１月　講演番＋：　４０１１［新しく
開発した免疫測定装置を用いたウィルスの検出実験−ｊ
）て発表したように、不活刺止したインフルＪンリ“ウ
ィルスΔ、Ｂ型をウィルスのモデルとして用いて、ウィ
ルス検出実験を行なったところ、１ｄ中に１個程度のウ
ィルスが存在覆る場合でも検出できた。１ 〔発明が解決しようとする課題〕 どこ／）で・、一般に、［でＩ△、１日Ｉ△、Ｆ■Δ並
びに本発明でのレーリ“ｖＡ気免疫測定方法のように標
識物質を用いる方法は検体調整の際に、検体と反応しな
かった未反応の標識体を分−１・除去Ｊる必要がある。 例えば、「［Ａ法の一秤である「１−Ｉｓ八へでは既知
の抗原が同相化されたマイク［−１プレートに、検体溶
液を反応させた後に洗浄を行なって、未反応の検体溶液
を除去し、次に酵素標識抗体を加えて酵素標識を行な・
）だ後、さらに未反応の酵素標識抗体を洗浄覆る方法が
とられている。この洗浄−１程は通！ｊｊ　５・へ・６
回行う必要があった。洗浄−工程を簡略化覆ればマイク
［Ｉブレー１へ十−Ｇ　＝ に標識酵累が残留し、１ｌｌｌｌ定に妨害をりえるため
である。 また、マイク１」ブレー１・に抗原を固相比重る従来の
方法は抗原抗体反応がンイクロブレー１−の表面に限ら
れることから極微量の検体の検出には、抗原ＩＩＬ体反
応口、１間を長ｕ４間にりる必要があった。。 本発明は未反応の磁性体標識抗体の分離を１回の操作Ｃ
確実に行うと共に、抗原抗体反応の表面積を増やすこと
ににって、検体ど磁性体標識抗体の遭遇の機会を増やし
、極微量の検体をも確実（ご磁性体標識抗体で捕捉・標
識づることによって、検出感度の向Ｌ１１１．びに測定
時間の短縮を図ることを課題としている。 〔課題を解決りるための手段〕 本発明は、前記課題を解決ηるためになされたもので、
本発明によれば、 磁性体標識抗体よりも充分に人きな質量を右りるＪ１１
磁性粒子に検体を固定さ−ける第１の１程と、前記検体
と前記磁性体標識抗体とを抗原抗体反応さ（！る第２の
工程と、前記第２の工程で１ｆＩられた磁性体標識検体
複合体と前記第２の−Ｌ稈（・残存りる未反応の前記磁
性体標識抗体とを遠心により分離リ−ることを特徴とす
るレーリ゛磁気免疫測定方法を実施するための検イホ調
整方法が提供される。 本発明の実施態様としＣ１非磁個体粒−ｒに検体を固定
さける前記第２のＴ稈には、非磁性体粒子の表面を活性
化して検体を非特異的に吸着さＩＪる方法あるいは昇磁
↑〕を体粒子の表面上に予め既知の抗体あるいは抗原を
固定し−ＣＪ３ざ検体を抗原抗体反応によって特異的に
結合させる方法が目的に応じて選択できる。 〔作用〕 本発明に係るレーク“磁気免疫測定方法を実施りるため
の検体調整１ノ法は、標識物質として磁性体微粒子を利
用し、この磁性体微粒子に抗体を結合して１１ノられる
磁性体標識抗体Ｊ、リム充分に人さな質量を右する昇磁
ｆ［体粒子の表面上で検体を捕捉した後、前記磁性体標
識抗体ど検体とを抗原抗体反応さける。検体を捕捉り−
るための前記非磁性体粒子は磁性体であ・）−Ｕ　Ｃ：
Ｌならイｒい。何故イ、−らぽ、検体を捕捉１１２磁性
体標識抗体１″′標識づる意味が７７（（り４’Ｌるか
らである。前記非磁性体微粒子としては、平均粒？！０
．１へ・１０７１７１１程度の微粒子が好Ｊ、しい。０
．１μｍ以下ではウィルスや磁性体標識抗体の人ささと
同程度になり、次の］稈の遠心分１１１１１に不都合に
なるからである。また、１０μｍ以上Ｃは表面積が小さ
くなるためウィルスの検出窓ｆσ並びにレーク“磁気免
疫測定の際の測定６１瓜が低下１Ｊるため（゛ある。 ｊ）０記非磁性体粒子は、例えばアクリルボリン−樹脂
−）ｂボリスヂレン樹脂等のプラスチック微小球、ある
いはシリカやアルミナ等の無機］ロイド粒子などが好ま
しい３、さらに好ましく【９１、これらの−１１磁性体
粒子は前記磁性体標識体よりも密度が大きいこと゛（・
ある。何故ならば、非磁性体粒子は沈澱さけ、未反応の
磁性体標識抗体をＪ＝　？ｉ′ｒどし−Ｃ分離りる遠心
分離操作に右利になるからである。密度の人さｈ非磁性
体粒子を得る方法どして、鉛等のＪｆ　ｔｉｎ　＋４金
属を核に持つ（１機あるいは烈機の複合月利から作製り
る方法が好Ｊ、しい。 −〇　− 非磁性体粒子の表面に検体を捕捉覆る方法の一′つどし
て、Ｊ１１磁性粒子の表面を１１５慴（ヒして検体を非
特異的に吸着Ｊる方法をどることができる。 この方法は、スクリーニング検査１″）、患貨のうがい
液からインフル１−ンリーウイルスを検出づるＪ、うな
場合に有効である。うがい液にはウィルスは多くても数
百側程度しか存在しないし、Ｊ、た、Δ型、１Ｂ型舌の
複数の変早（株があるｈ日ら、まずウィルスを特定せず
に確実に前記非磁性体粒子に捕捉Ｊる目的に適している
。１ らう一つの方法として、非ｆ！ｌ竹体粒子の表面上に予
め既知の抗体あるいは坑口；ミを固定しておき検体を抗
原抗体反応にＪ：って特異的に結合させる方法がある３
、この方法１．□１、非特異反応をできる限りＣ１除し
て特定のウィルスのみを確実に検出づる精密検査に適し
ている３゜ さて、前記の検体捕捉工程の後、捕捉された検体と磁性
体標識抗体とを抗原抗体反応さける。この肋、磁性体標
識抗体は、検体と確実に抗原抗体反応ざ已るために、検
体Ｊ、リム過剰に加えることが望ましい３１例えば−例
として、ビ］グラム台の検体を検出りるためには磁性体
標識抗体１０’？／程度加えればＪ、い。 次に、前記の抗原抗体反応工程で磁性標識された抗原抗
体複合体（磁性体標識検体複合体）と前記■稈で夕＆存
づる未反応の前記Ｉ６磁性標識抗体とを分離させる。こ
の分離方法として、本発明の効果を最大に発揮させる遠
心による分離が最す望、Ｊ、しい。例えば、１μｍのア
クリルポリマー樹脂を非磁性体粒子どじて用いた場合、
非磁性体粒子に捕捉された抗原抗体複合体は１５００　
ｐ　ｐ　ｍ、１５分間の低速遠心で沈澱づる。一方、未
反応の磁性体標識抗体は沈澱ｉ！ザ、上清として留まる
。沈澱物を採取して、例えば、ｔ」［Ｐ　ＬＥ　Ｓ　（
１）、Ｊ、う泡・緩シ＋ｉｊ液中に抗原抗体複合体を分
散さける。 この、Ｊ、うにして、本発明のレーザ磁気免疫測定方法
を実施りるための検体調整がイＣされる。 本発明の検体調整方法を適用した後、本発明にらが先に
出願したレーＩＪ’　Ｉａ気免疫測定方方法び測定′￥
、２′７に技術開示している方法ぐ極微量のウィル−’
＋１− スあるいは工程の検出を行うことができる。 以下に図面を参照して本発明をより具体的に詳述するが
、以下に示すもの＋、Ｉ、本発明の一実施例に過ぎず、
本発明の技術的範囲を何等制限Ｊるものではイヱい。 〔実施例１〕 第１図は本発明の検体調整方法の一実施例を説明するＩ
−稈図であ・つて、図中（ａ　）　Ｔ、ＬＪｌ磁性体を
液中分散づる工程、（ｂ）は検体を捕捉Ｊる工程、（ｃ
）ＬＪｖ１１気標識−［稈、（ｄ　）　４．を遠心分１
ｉｌＩｔ丁稈、（ｅ）は測定に稈である。 本実施例においでは実験」二安金性の畠い不活＋１化し
たインフル゛［ンリ゛ウィルスを用いＣ本発明の検体調
整法の検出限界を調べる目的で実施した。 平均粒径１μｍのアクリルポリマーから４する非磁性体
粒子１の表面には、ウリギを免疫して冑られたインフル
エンザウィルスに対づ−る高度免疫抗面消が抗体２とし
て固相化され−Ｃいる。凍結乾燥保存されでいる前記非
磁性体粒子１は］７稈（ａ）において反応容器に入れら
れｌ）Ｂ　Ｓ緩衝液中に分散される３゜ 前記工程（ｂ）は−し′）刀し検体として既知の′ａ度
のインフル］−シｔＦウィルス（Δ／石川（＋−１３Ｎ
　２　））を前記までの工程Ｔ：′得られたＸＩ＋磁＋
＋　（ホ粒子分散液に加えて、前記インフルエンザウィ
ルスを捕捉づる工程である。本実施例ではウィルスの検
出限界を調べるために濃Ｉα１・〜１千万個／威の範囲
で１０倍階段稀釈した各淵曵のウィルス溶液を用いＩご
　、。 前記工程（Ｃ）は、磁１７１体標識抗体４を添加して、
検体との間で抗原抗体反応さけ、磁気標識・ノるＩ稈て
・あって、磁性体標識抗体４はｒキス１〜ランで被覆し
た平均粒子４　Ｑ　ｎ　ｍのマグネタイ１へからなる磁
性微粒子４　ａにノ】レツ１〜を免疫し−Ｃｙ１られる
抗血Ｆ？’＋からＭｉ　ＭｌしたＩ　ＣＪ　Ｇ抗体４ｂ
を共有結合したものである１、前記磁気標識は３５℃、
２゜５時間のイン：１コベー１−の条ｆ１て・行った。 。 前記−「稈（ｄ）は、前記までのＴ稈で得られた抗原抗
体複合体く磁性体標識検体複合体）５と未反応の磁ｆ［
体標識抗体４どを分１ｉＩＩＩりる工程であつ−１３＝ て、１５００　ｐ　ｐ　ｍ、５分間（１）　ｉ、４心ニ
に　−）　Ｔ、前記抗原抗体複合体５〕は沈澱し、未反
応の磁性体標識抗体４は下漬どして４ＥＪらねた。 前記工程（ｅ　）は前記までの工程で得られた沈澱物を
採取してレーザ磁気免疫測定方法で測定する工程であ・
）で、］−口Ｐ　［Ｓ緩衝液１ｍｌに前記沈澱物を加え
、本発明化らが先に発明した干渉法（特曳１昭６２−１
８４９０２号）で′ウィルスの検出を行ｔ１つだ。その
結果、ウィルス１個程度を検出ケることが出来た。 第２図は比較対照例であって、現在、エイズ抗体検査等
に広く用いられている［ＬＩＳＡ法の検体調整］稈図で
ある。Ｆｌ−ＩＳＡ法の場合、（ａ）固相化工程、（ｂ
）検体捕捉−工程、（Ｃ）洗浄工程、（ｄ）酊累標識二
り稈、（Ｃ）洗浄］工程、（ｆ）気質反応−［稈、（０
）反応停止Ｔ稈、（ｈ）測定工程、等の数多くのＴ稈を
経て検体調整される。 １Ｊなわち、既知の抗原１０をマイク【］プレート１１
に同相化しくａ）、この同相化され１＝マイクロプレー
ト１１に検体３の溶液を反応さＢ　（ｂ　）、＝　１４
− その後に洗浄を行ｔｒって未反応の検体３の溶液を除去
しくＣ）、次に酵素標識抗体１２を加えて酊糸標識を行
ない（ｄ）、その後、さらに未反応の酵素標識抗体１２
を洗浄、除去しくｅ）、前記；１、での工程Ｃ得られた
標識検体段合体１３に気Ｖ−ｉ　１４を反応さｔ！（ｆ
）、この反応を停止液で停止（す）さけ／、：後に、紫
外線を照（ｌ（ｌ、て測定（１１）していた１、これら
の■程のうち、洗浄丁卯（９Ｌ通１；ｉ、５・〜・６回
反覆洗浄されている。洗？１ｒが不完全／、ｉ：隻（合
、測定■稈においてバックグランドが土４ηるので、検
出感度の低手あるいは誤判断の原因になる１３本発明の
方ｖ１とＥｌ、ＩＳＡ法とを比較Ｊるど、本発明の方が
３３二Ｆ程短縮できる利点がある。 本発明の場合、表面積の大きな非！Ｈ！１体粒子の表面
（・３次元的に検体を捕］）？シ、磁性体標識抗体と抗
原抗体反応Ｊるから、従来の２次元的に反応さける方法
Ｊ、りも反応時間を短縮りることができる。また、この
特徴のため、極微量の検体の捕捉にも右利である。、捕
捉・反応過程Ｃ撹拌処Ｊ！Ｉｌを０［ＨＥ　ＦＪれぽ更
に捕ｊ；Ｃ・反応処理］１゜１間の短縮ができる。 −１！’ｊ− また、本発明の場合、遠心力によって分１ｌｌＩづるか
ら、洗浄Ｊ、りも確実２．ｚ分離が行なわれる３、遠心
条件は使用覆る非磁性体粒子とｖＡ竹鉢体標識抗体の比
重〉ｆに応じて最適り条（’ｌが決められる３□〔実施
例２〕 本実施例は患者のうがい液からインフルエンザウィルス
を検出づる実験例（−ある。 患者のうがい液を３０−採取し、まず、前処理どじで３
０００　ｒ′Ｌ）　ｍ、１０分間の遠心にか【プて貸物
等を沈澱さけて除去した後、十清を２０００Ｑｒｐｍ、
３０分間超超遠心上か【づインフルエンザウィルスを沈
澱させ、沈澱物１ｄを採取して検イ木どじムコ。 次に、ウィルスが非ｑ：！ｉ　ｑ的にイ」着するように
活性化したアクリルボリン−からなる非磁性体粒子を用
いて３５℃、１０ｔ１５間インー１−ユベートの条件で
検体を捕捉した。検体を捕捉処理後、前記非磁性体粒子
のウィルスがイ」盾しくいない表面をＢＳ八で被覆し、
＋’＋Ｆｒ記非磁性体粒子を不活性化した。 この後の検体調整：「稈は実施例１の（０）以降と同じ
方法で行イｆつだ。検体調整を終えた検体を前記レー１
ｆ磁気免疫測定方法で測定したところ、Ａ型のインフル
丁ンリ゛ウィルスが検出された。 従来、インフルエン量アウイルスを検出するためには、
うがい液中の機作な・ウィルスを鶏卵でＪｇ差し、１；
「万個以」−にまでウィルスを増イ１した後、血液凝固
仏で検出りる７’Ｊ沃が採られでいｌＪ０従来法で・は
検査結果が出るまて゛１カ月程度かかつていた。本発明
の方法は、ウィルスを培養ｕずに、直接検出でさる感度
を右しているから、本実施例のインノルエン１ｆウイル
スに限りヂ、あらゆるウィルスにム適用て゛さる。１例
えば、ウィルスの培養が困難である未知のウィルスの検
出にも適用でさる１゜（発明の効果〕 以上詳述のように、本発明に係るレーリ゛磁気免疫測定
方法を実／Ｉｉ！！ηるｌζめの検体調整力法ｔ３１、
検体を捕捉するだめの非磁性体粒子と標識物質として！
ｌｌ機微粒子用いて、遠心分Ｈ１にＪ、って検体を調整
づることか１４徴である。ＲＩΔ法以十の検出感度を右
しているから、従来不可能であった感染直後の抗原検査
が実施でさる。更に、Ｊ１磁何体粒子、標識体として用
いる磁性超微粒子は、放射線あるいはＡ刊の点では問題
なく、検体に対して安定なものを容易に入手できる。 本発明は、実施例に十げＩζウィルスの検出に１によら
ず、癌の早期診断、アレルギー、細菌等の検合ヤ〕従来
ＲＩＡ法が適用されＣいたベブブード小ルーしン笠の種
々のホルモンあるいは種々の酵素、ビタミン、薬剤など
の測定にも応用することが可能である。従って、従来は
限定された／１ｔ！ＢＪでＲ１へ法にＪ、らイヱ【づれ
ぼ実施て・さなか−）だ精密な測定を、−殻内な環境で
広〈実施Ｊることが可能となる。 集団検診雪−のようイア船釣的な状況Ｃ１各種のウィル
ス、癌等のスクリーニング検査等の精密な測定が広〈実
施でされば、癌あろい（１１ウイルス＋１疾患等の早期
診断が可能となり、有効な早期治療を的確に実施するこ
とが可能どなる。このＪ、うに、本発明が医学・医療の
分野で宋たり効果は計り知れない１゜

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の検体調整方法の一実施例を説明づるＴ
程図であって、（Ｅ））は：１１−磁ｆ」体粒子を液中
分散覆る一１程図、（ｂ）は検体を捕捉１Ｊるｌ稈図、
（Ｃ）（よ磁気標識］二程図、（ｄ）は遠心分１ｌＩＩ
Ｉ］−稈図、（Ｃ）　Ｔｉｔ測定−「稈図であろ１゜イ
）２図は比較λ１照例で゛あって、現在、］イズ抗体検
査等に広く用いられている、ＦｉｌＳＡ法の検体調整］
程図である。ＦＬｆＳＡ７／、の場合、（ａ）は固相化
Ｔ程図、（ｂ　）は検体捕捉］程図、（Ｃ）　ｉ；↓洗
浄−１−稈図、（ｄ）は酵素４Ｓ：識］稈図、（ｅ）は
洗浄■「稈図、（ｆ　）　Ｂ、１．　ｊ；！質反応］程
図、（す）は反応ＰＦＩドＩ−稈図、（ｈ　）　１．Ｌ
測定［稈図である。 １・・・Ｊ１磁ｆ１体粒子、２・・抗体、３・・・検体
、４・・・磁＋ｔ−（Ａ標識抗体、５・・・＋７１：　
Ｂａ抗体複合体（磁性体Ｆ識検体複合体）。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）磁性体標識抗体よりも充分に大きな質量を有する
   非磁性体粒子に検体を固定させる第１の工程と、前記検
   体と前記磁性体標識抗体とを抗原抗体反応させる第２の
   工程と、前記第２の工程で得られた磁性体標識検体複合
   体と前記第２の工程で残存する未反応の前記磁性体標識
   抗体とを遠心により分離することを特徴とするレーザ磁
   気免疫測定方法を実施するための検体調整方法。
2. （２）前記第１の工程が非磁性体粒子の表面上に固定さ
   れた既知の抗体と検体とを抗原抗体反応によって特異的
   に結合させることを特徴とする請求項１記載のレーザ磁
   気免疫測定方法を実施するための検体調整方法。