JPH01277755A - 血中成分の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血中成分、特に血液および血球中に含有され
る成分を、高速液体クロマトグラフィーを用いて精度良
く容易に測定する方法、特に自動化可能な測定方法に関
する。

（従来の技術） 血液中に含まれる各種成分の測定が病理学的研究１診断
、治療などのために行われている。例えば、血液中の薬
物濃度をモニタリングすることにより、薬物投与量の決
定がなされている。このような薬物の例としては、シク
ロスポリンへ　（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎＡＨｃｙＡ）
が挙げられる。ＣＶＡは、環状ペプチドであり強力な免
疫抑制作用を示す。このＣＶＡの消化吸収は個人差が大
きく、投与期間などによっても吸収効率が変動するため
血中濃度をモニタリングすることが必要である。このＣ
ＶＡは。

通常９次の方法（「医学のあゆみ」第１２９巻、第９号
、６２３〜６２７　（１９７４））により測定される。

まず、血液をあらかじめ適度に親水処理された除りンパ
ク力ラムに通し、　ＣＹＡを吸着させるとともにタンパ
クを吸着させることなく通過させて除去する。このカラ
ムにメタノールを流してＣｙＡを溶出させ、溶出液から
溶媒を揮発させた後、アセトニトリル−水（７０：３０
）を溶離液として高速液体クロマトグラフィー（ＩＩＰ
Ｌｃ）によりｃｙへの測定を行う。

上記ＣｙＡの測定法のように１通常、血液中の成分を測
定する場合には、全血から血球成分を除いた血漿、また
は血清が用いられる。なぜなら、ヘモグロビンを有する
赤血球が検体中に含まれると。

紫外および可視領域の全域にわたって大きな吸収が現れ
９分光学的手法による測定が不能となるためである。し
かし、目的とする被測定成分が血球中にも含有される場
合があるため、ｈ記血漿または血清を使用する方法では
不正確であることが指摘されている。例えば、上記Ｃｙ
Ａは血球中にも取り込まれ、かつ血液を採取した時点か
ら、血球内と血漿内との薬物濃度の比率が徐々に変化す
る。

血漿および血球の両方に含まれる被測定成分を測定する
ときに、上記高速液体クロマトグラフィーを用いた測定
法においては、除タンパクカラムが血球により目詰まり
を起こすため採用することができない。血漿および血球
内の被測定成分を測定するには溶血させて血球成分を破
壊する必要がある。たとえば、ジャーナル　オブ　クロ
マトグラフィー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒａｐｈｙ）、３４０１９８５）。

４１１〜４１９頁、にはアセトニトリルを用い溶血させ
た後にＣＶＡを測定する方法が記載されている。

それによればまず、採取した全血にアセトニトリルを添
加して溶血させ、タンパク成分を沈澱させた後、遠心分
離して上清を集める。この上清部分をシリカゲルを用い
た逆相クロマトグラフィーにかけてＣＹＡおよびｃｙｔ
以外の疎水成分を吸着させてその他の成分を除去するこ
とにより前処理した後、　　ＯＯＳシリカゲルカラムに
かけて分離し、測定を行う。

このように、全血中の被測定成分を測定し得る方法が開
発されているが、遠心分離など処理工程が複雑化するた
め自動測定に応用することはできない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の欠点を解決することであり。

その目的とするところは、血漿および直球中に含有され
る被測定物質を精度良く、容易に測定し得る方法を提供
することにある。本発明の他の目的は血中の被測定成分
を１例えば全血を試料として自動的に短時間のうちに測
定し得る方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段および作用）本発明の血中
成分の測定法は、血液または血球成分を含有する試料中
の被測定物質を高速液体クロマトグラフィーで測定する
方法であって、　ＩＩＬＢ値が１０〜１７の非イオン界
面活性剤を含む溶液と該試料とを混合して、該試料中の
血球成分を破壊する工程、該混合後の試料溶液を前処理
カラムに導き該被測定物質を吸着させ、かつ該試料溶液
中のタンパク成分を吸着させることなく通過させる工程
、および該前処理カラムに溶離液を流して被測定物質を
脱着させて分離用カラムに導き、これを測定する工程、
を包含し、そのことにより上記目的が達成される。

本発明方法に用いられる界面活性剤は、血球を破壊する
溶血剤として用いられる。非イオン系界面活性剤が用い
られ、そのＨＬＢ値は１０〜１７の範囲である。ＨＬＢ
値とは、界面活性剤の分子が有する親水性基と親油性基
との相対的割合を示すパラメーターである。ＨＬＢ値が
大きいと親水性基の占める割合が大きく、従って親水性
の度合が高くなり。

ＨＬＢ値が小さいと疎水性基の占める割合が大きく。

従って親油性の度合が高（なる。非イオン系界面活性剤
が有する親水性基としては、ポリオキシエチレン基、水
酸基などが、そして疎水性基としては２脂肪族または芳
香族の炭化水素基がある。本発明に用いられる界面活性
剤としては、　ＩＩＬＢ値が上記範囲のポリオキシエチ
レンアルキルエーテル。

ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル。

ポリオキシエチレンアラルキルフェニルエーテル（例え
ば、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル
）などが挙げられる。ＨＬＢ値が１０を下まわると親水
性が低くなり、水溶液中ではミセルを形成して不透明に
なるため測定が正確になされず、かつ、これらをカラム
に供給すると、カラムもしくはフィルターの目詰まりを
起こすという問題が生じる。逆に１比Ｂ値が１７を越え
ると血球の細胞膜の破壊が完全に行われない。

上記界面活性剤は２通常水溶液として用いられるが、界
面活性剤の溶解性を高めるために、水と混合し得る有機
溶媒が加えられてもよい。このような有機溶媒としては
、メチルアルコール、エチルアルコール、アセトン、ア
セトニトリルなどがある。これらの有機溶媒は、血液中
のタンパクが凝固して沈澱を生じない範囲内で、使用さ
れる。

その濃度は１通常、３０％以下である。上記界面活性剤
の使用量は、血液１ｒｄもしくは血液１ｍ中に含有され
る血球成分量あたり１０〜５００ｍｇである。

例えば、上記界面活性剤を　０．０１〜２重量％の割合
で含有する溶液を使用する場合には、血液１　ｍｌあた
り２〜１００ｄの割合で添加される。

血球成分を破壊する方法としては、有機溶媒を用いて血
球細胞膜の脂質を溶解する方法；および水を添加して浸
透圧差により上記の細胞膜を破壊する方法も知られてい
るが、いずれも破壊された膜成分および他のタンパク成
分が沈澱するため。

不適当である。

本発明に用いられる前処理カラムに充填される充填剤と
しては、逆相クロマトグラフィー用充填剤が用いられる
。なかでも解離基を持たない合成高分子系充填剤が好適
である。一般に疎水性の強い合成高分子系充填剤は、タ
ンパクを強く吸着するが、これに親水性を付与していく
とタンパクを吸着しなくなる。さらに親水性の度合を高
くすると、　ＣＶＡなとの被測定物質をも吸着しなくな
る。

本発明の充填剤としては、所定の割合で水酸基などの親
水基とアルキル基などの疎水基とを合わせ持つ合成高分
子系充填剤が用いられる。このような充填剤は、特定の
条件で１例えば水や特定ｐＨの緩衝液中では、非タンパ
ク物質である被測定物質を吸着するが、タンパクは吸着
せず、そして、他の条件下、たとえば上記と異なるｐｔ
＋の緩衝液中では、これに吸着した上記被測定物質を溶
離する性質を有する。このような充填剤としては１例え
ば。

アクリル系モノマーを（共）重合成分とする（共）重合
体である粒子が用いられる。そのような七ツマ−として
は、ポリエチレングリコールモノ　（またはジ）−（メ
タ）アクリレートポリプロピレングリコールモノ（また
はジ）−アクリレート。

テトラメチロールメタンモノ　（またはジ、トリ）アク
リレートなどがある。これらのモノマーの懸濁重合によ
って得られ、その粒径が５〜３０μｍ程度の微粒子が特
に好適である。一般に、逆相クロマトグラフィー用充填
剤のうちでもＯＤＳシリカゲル（オクタデシルシリル基
が結合したシリカゲル）充填剤およびＣＮシリカゲルに
トリル基が結合したシリカゲル）充填剤などはシラノー
ル基が存在し、タンパクが吸着されるため９本発明方法
には適当ではない。イオン交換クロマトグラフィー用の
充填剤もある限られた条件下においては使用可能である
が、はとんどの場合１本発明方法に使用するのは不適当
である。

分析カラムに充填される充填剤としては上記前処理カラ
ムに充填される充填剤よりも被測定物質の吸着性の高い
充填剤が、被測定物質および前処理カラムの充填剤の種
類に応じて適宜選択される。

例えば、　ＯＯＳシリカゲル充填剤などが用いられる。

本発明方法は１例えば第１図に示す装置により具体化さ
れる。この装置は、接続端Ａ−Ｆを有する六方バルブ４
．該六方バルブの接続端Ｂ−Ｅを介して接続された前処
理カラム５および該六方バルブの接続端Ｃに接続された
分析カラム８を有する。

前処理カラム５には上記逆相クロマトグラフィー用充填
剤が充填され１分析カラムには、被測定物質の種類に応
じて適当な充填剤（例えば、　ｃｙＡを測定する場合に
はＯＤＳシリカゲル）が充填されている。

例えば、全血中の被測定物質の測定を行なう場合には、
採取した血液に上記界面活性剤溶液を添加し、振盪して
血球成分を破壊（溶血）させ、これを試料とする。まず
、第１図の装置において。

水槽１中のイオン交換水もしくは緩衝液をポンプ２によ
って試料インジェクター３および接続端へ・Ｂを経て前
処理カラム５に送り、そこから接続端Ｅ−Ｆを通り系外
に排出する。次に、上記溶血により調製した試料を試料
インジェクターから系内へ注入する。注入された試料は
、ポンプ２によりイオン交換水もしくは緩衝液と共に移
送されて前処理カラム５に達する。ここで試料中の被測
定物質（非タンパク性物質である）は該カラムの充填剤
に吸着される。他方、該試料中のタンパク成分は吸着さ
れないでカラム５を通過し、六方バルブ４の接続端Ｅ−
Ｆを経て系外に排出される。

溶離液槽６には、上記前処理カラム５に吸着した被測定
物質を溶離させ得る溶離液が収容されている。この溶離
液はポンプ７により、接続端りおよびＣを経由して分析
カラム８へ送られる。次いで第２図に示すように、六方
バルブ４を切り換えて接続端りを已に接続すると、ポン
プ７により溶離液槽６中の溶離液が接続端りおよびＥを
経て前処理カラム５に供給される。溶離液がカラム５を
通過することにより、吸着された被測定物質が溶離され
、溶離液と共に接続端ＢおよびＣを経て分析カラム８に
達する。被測定物質は分析カラム８で分離され９分析カ
ラム８以降に設けられた図外の適宜な検出器により検出
される。分析カラム８には前処理カラムに用いられる充
填剤よりも吸着性の商い充填剤が充填されているため、
前処理カラムに吸着されていた被測定物質は溶離液によ
って完全に溶離し、精度良く分離し測定される。

以上に述べた例では前処理カラム５におけるポンプ２に
よるイオン交換水の進行方向と、ポンプ７による溶離液
の進行方向とはそれぞれ反対方向になっているが、これ
に限られる必要はない。進行方向が同じ方向となるよう
な接続方式が採用されてもよい。第２図に示すような接
続に切換えた後、被測定物質が六方バルブ４の接続端Ｃ
を通過して分析カラム８に達したころを見計らって、六
方バルブ４を第１図に示される接続にさらに切換えるこ
ともできる。このように切換えることにより１分析カラ
ム８で分析を行ないながら９次の試料を前処理カラム５
に通し次の分析のための前処理を行なうことができる。

上記本発明の方法においては、所定のＩＩＬＢ値を有す
る非イオン界面活性剤が溶血剤として使用される。その
ため、効果的に血球成分を破壊して。

血球中に含有される被測定成分を放出させることが可能
である。破壊された膜成分やその他のタンパク、および
脂質成分は均一に試料中に分散し。

これらが沈澱することがない。そのため、従来のように
遠心分離により膜成分やタンパク成分を沈澱させて除去
するという工程を必要とせず、そのまま、　ＨＰＬＣに
かけて分析することが可能となる。

血球成分によりカラムが目詰まりを起こすこともない。

上記界面活性剤で処理された試料は２合成高分子充填剤
を用いた前処理カラムで効果的にタンパク成分が除去さ
れるため、被測定成分は９分析カラムで分析後、精度良
く測定され得る。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

ＬＬＬ 高圧六方バルブ４に、前処理カラム５および液体クロマ
トグラフィー（島津製作所製、モデルＩ、Ｃ６Ａ）に組
み込まれた分析カラム８などを第１図に示すように接続
した。前処理カラム５としては、内径４閣、長さ１　、
５　ｃｍのステンレス製カラムを用いた。充填剤として
は粒子径５〜２０μｍのアクリル系高分子多孔性粒子を
用いた。このアクリル系高分子多孔性粒子は、４重量％
ポリビニルアルコール水溶液４００ｄ中にテトラエチレ
ングリコールジメタクリレート４０ｇ、　テトラメチロ
ールメタントリアクリレート１０ｇ、ｌ−ルエン４０ｇ
およびベンゾイルパーオキサイド０．５ｇを加え、これ
を４００ｒｐａ＋で撹拌しなから８０°Ｃで１０時間反
応させ２反応後熱水およびアセトンで洗浄して得られた
。

正常男子全血にシクロスポリンＡ（サンド社製）を８０
０ｎｇ／ａｆｆｉの割合で添加し、その０　、５　ｍｌ
に、溶血試薬２ＩＲ１を加えて振盪した。溶血試薬とし
ては。

ポリエチレングリコールラウリルエーテルを主成分とす
る界面活性剤（Ａｔｌａｓ社製、　Ａｔ１ａｓ　Ｇ−２
１３３；１１ＬＢ値１３．１）の２騨／ν％水溶液に内
部標準物質としてシクロスポリンＤ（サンド社製）を２
００ｎｇ／−の割合で添加したものを用いた。上記得ら
れた溶血液５００μｌを試料とした。ポンプ２により水
槽１中のイオン交換水を１　、０　ｍｌ　／分の流速で
六方バルブ４の接続端Ａ−Ｂを経て前処理カラム５に流
しながら、試料インジェクター３から上記試料を注入し
た。１０分後に六方バルブ４を切り換え第２図に示すよ
うに接続した。ポンプ７により、溶離液槽６中からアセ
トニトリル対水が７０　：　３０の溶離液を１．５ｍｆ
ｆ１／分の流速で六方バルブ接続端Ｄ・Ｅ、前処理カラ
ム５そして六方バルブ接続端Ｂ・Ｃを経て液体クロマト
グラフィーの分析カラム８へ通した。上記溶離液の流通
により溶離したＧｙ＾の測定を行なった。使用した分析
カラムはシリカ系ＯＤＳカラム（漬水化学工業■製、メ
ディポーラ一〇ＤＳ　、カラムサイズ内径４．６ｍｍ；
長さ２５ｃｍ）であり、検出は波長２１０ｎｍの吸光度
によって行った。得られたクロマトグラムを第３図（八
）に示す。

第３図（八）において、ａはＣＶＡのピークを、ｂはＣ
ｙＤのピークを示す。

別にシクロスポリンＡを添加せずに同様の方法により測
定を行なったところ第３図（Ｂ）に示すクロマトグラム
が得られた。第３図（Ａ）および（Ｂ）を比較すると３
本発明方法により、シクロスポリンＡおよびＤが、単独
ピークとして分離・測定されることがわかる。別に作成
した検量線から、　ＣＹＡの血中濃度は７６０ｎｇ／ｍ
ｌであると算出され２回収率は９５％と良好であること
がわかった。

夫詣炎Ｉ ポリエチレングリコールソルビクンモノパルミテートを
主成分とする界面活性剤であるＴｗｅｅｎ−２０（Ａｔ
ｌａｓ社製、　ＨＬＢ値１５．６）を２−／ｖ％の割合
で水−エタノール混合液（９０：　１０ｖ／ｖ）に混合
して溶血試薬を得た。これを用いたこと以外は、実施例
１と同様に操作したところ、　ＣＹＡおよびＤのピーク
が実施例１と同様に確認された。回収率はいずれも９３
％であった。

尖施拠主二土 界面活性剤としてＡｌｔａｓ　Ｇ−３７０５（Ａｔｌａ
ｓ社製、ＨＬＢ値１０．８）を用い、その２ｇをｌＯ％
エタノール水溶液１００ｍｊ！に添加し２室温にてスタ
ーラーで５分間撹拌し、その熔解性を目視観察した。次
にこの溶液を実施例１の装置のインジェクターから注入
し。

カラムの圧力および目詰まりが起こるが否かを観察した
。別に、この界面活性剤２　ｍｌに抗凝固処理した全血
０．５ｍを加えて振盪し、目視および顕微鏡観察を行な
い溶血が完全に行われたか否かを観察した。その結果を
下表に示す。実施例３−２〜３−３および比較例１−１
〜１−２の結果もあわせて下表に示す。

実施■ユニ又 界面活性剤としてＡｌｔａｓ　Ｇ−２１３３（Ａｔｌａ
ｓ社製、　１１　Ｌ　Ｂ値１３．１）を用いたこと以外
は実施例２−１と同様である。

実力」しシ二ｌ 界面活性剤としてＢｒ１ｊ　３５　（Ａｔｌａｓ社製ｉ
　ＨＬＢ値１６．９）を用いたこと以外は実施例２−１
と同様である。

此惠ＬｆＬＬ二上 Ｂｒ１ｊ　３０　（Ａｔｌａｓ社製；ＩＩＬＢ値９．５
）を用いたこと以外は実施例３−１と同様である。

ル較桝土二Ｉ Ａｌｔａｓ　Ｇ−２１５９（へＨａｓ社製、ＩＩＬＢ値
１８．８）を用いたこと以外は実施例２−１と同様であ
る。

（以下余白） ズ尉ｌ糺生 健常人全血を採血後、該血液１滅に対し、直ちに抗凝固
剤（日本商事株式会社製；アングロット）１滴を加えた
。これにシクロスポリンＡを８００Ｂ／　ｍｌの割合と
なるように添加し、　　ＣＶＡ含存全血を調製した。こ
れを、３７°Ｃにて３時間加温し、直ちに遠心分離によ
り血球（沈降物）および血漿（上澄み）とに分離した。

血球と血漿との容量比は５５対４５であった。

得られた血漿を、医学のあゆみ第１２９巻、第９号、６
２３頁に記載の方法で測定したところ、血漿中のシクロ
スポリンＡの濃度は６４０ｎｇ／ｍｌであった。次に、
上記血球０．２５ｍＮに対し、実施例１で用いたのと同
様の溶血試薬２．２５ｄを加え、実施例１と同様の方法
および装置によりシクロスポリンＡを測定したところ、
その濃度は８４０ｎｇ／／１７ｉ！であった。これらの
結果により、シクロスポリンＡは３７°Ｃ２３時間のイ
ンキュベーションにて、最初血漿中に溶解していたもの
が除々に血球中に溶解してゆくことが確認された。

（発明の効果） 本発明方法によれば、このように、血漿中および血球中
に含有される成分が精度よ（容易に測定される。本発明
方法は特に自動化高速液体クロマトグラフィーによる血
中成分の測定に好適であり８例えば、投与量から容易に
血中濃度を予測することの難しいＣＶＡの血中濃度のモ
ニタリングなど１広範囲にわたる利用が可能である− ４、′　の　−な量口 第１図および第２図は本発明方法の実施に用いられる測
定装置の一例を示す接続図、第３図（八）および（Ｂ）
は本発明方法により血中のシクロスポリンＡおよびＤを
測定したときに得られたクロマトグラムである。

１・・・水槽、２．７・・・ポンプ、３・・・試料イン
ジェクター、４・・・六方バルブ、５・・・前処理カラ
ム、６・・・溶離液槽、８・・・分析カラム。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血液または血球成分を含有する試料中の被測定物質
   を高速液体クロマトグラフィーで測定する方法であって
   、 ＨＬＢ値が１０〜１７の非イオン界面活性剤を含む溶液
   と該試料とを混合して、該試料中の血球成分を破壊する
   工程、 該混合後の試料溶液を前処理カラムに導き該被測定物質
   を吸着させ、かつ該試料溶液中のタンパク成分を吸着さ
   せることなく通過させる工程、および 該前処理カラムに溶離液を流して被測定物質を脱着させ
   て分離用カラムに導き、これを測定する工程、 を包含する血中成分の測定法。 ２、前記被測定物質がシクロスポリン誘導体である特許
   請求の範囲第１項に記載の測定法。