JPH01291796A - ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 - Google Patents
ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法Info
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- JPH01291796A JPH01291796A JP12264488A JP12264488A JPH01291796A JP H01291796 A JPH01291796 A JP H01291796A JP 12264488 A JP12264488 A JP 12264488A JP 12264488 A JP12264488 A JP 12264488A JP H01291796 A JPH01291796 A JP H01291796A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒト正常細胞の産する組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子（以後、ｔＰＡと略す）の製法に関する。
ン活性化因子（以後、ｔＰＡと略す）の製法に関する。
ｔＰＡは、血管内皮細胞および種々の組繊細胞から生産
分泌され、血栓の本体であるフィブリンを溶解し、血栓
症の治療薬として有効なものである。
分泌され、血栓の本体であるフィブリンを溶解し、血栓
症の治療薬として有効なものである。
ｔＰＡは１本鎖のものと２本鎖のものがあることが知ら
れている。これらの血栓溶解活性は、２本鎖のものが１
本鎖にくらべて太き（、従来、いわゆるＬＰＡと言われ
るものは、２本鎖単独のものまたは２本鎖に１本鎖が混
合した状態のものが開発されてきた。
れている。これらの血栓溶解活性は、２本鎖のものが１
本鎖にくらべて太き（、従来、いわゆるＬＰＡと言われ
るものは、２本鎖単独のものまたは２本鎖に１本鎖が混
合した状態のものが開発されてきた。
２本積ｔＰＡは、血栓の溶解活性が大きく、フィブリン
溶解効果を必要とする血栓部分ではなく、血流中でプラ
スミノーゲンを活性化させる可能性が非常に高く、臨床
的には出血傾向が高い（特開昭５９−１１８７１７ ）
。
溶解効果を必要とする血栓部分ではなく、血流中でプラ
スミノーゲンを活性化させる可能性が非常に高く、臨床
的には出血傾向が高い（特開昭５９−１１８７１７ ）
。
しかしながら、２本積ｔＰＡの前駆体と考えられる１＊
ｔｌｔＰＡは、フィブリンにはより高い親和性を有し、
フィブリンに吸着されると直に早い速度で２本ｔＡｔ
ＰＡに転換される。
ｔｌｔＰＡは、フィブリンにはより高い親和性を有し、
フィブリンに吸着されると直に早い速度で２本ｔＡｔ
ＰＡに転換される。
したがって、ｌ＊鎮ｔＰＡは凝血部分でプラスミノーゲ
ン活性を最大に発揮することができる。
ン活性を最大に発揮することができる。
このように血栓溶解活性が比較的不活性とされていた１
末鎖ｔＰＡは、血流中で作用することがないとされ、臨
床的には多く望まれるようになっている状況であり、１
末鎖ｔＰＡのみを効率良く生産させる方法が強く望まれ
ている。
末鎖ｔＰＡは、血流中で作用することがないとされ、臨
床的には多く望まれるようになっている状況であり、１
末鎖ｔＰＡのみを効率良く生産させる方法が強く望まれ
ている。
しかしながら、１末鎖ｔＰＡを細胞を用いて生産させる
場合には、培地中に含まれるプロテアーゼまたは細胞そ
のものが生産するプロテアーゼ（これらのプロテアーゼ
は主にプラスミンやトリプシンと考えられる）により生
産中に１本鎖から２本鎖へ転換して効率よく１本鎖を得
ることは離しいという問題がある。
場合には、培地中に含まれるプロテアーゼまたは細胞そ
のものが生産するプロテアーゼ（これらのプロテアーゼ
は主にプラスミンやトリプシンと考えられる）により生
産中に１本鎖から２本鎖へ転換して効率よく１本鎖を得
ることは離しいという問題がある。
したがって、このような問題を解決する方法として、次
のような方法が知られている。
のような方法が知られている。
すなわち、アプロチニンの存在下に培養または後処理を
行う方法（ヨーロッパ特許公開公報第４１７６６号）、
生産細胞培養液中に大豆より誘導されるトリプシン阻害
剤またはアプロチニンを使用する方法（特開昭５９−１
１８７１７） 、アプロチニンまたはベンズアミジンを
添加した培地で培養もしくは誘導生産させる方法（特開
昭６ｌ−１９４８６） 、精製時にアプロチニン、６−
アミノカプロン酸を添加して１本鎖のみを生産させる方
法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ−ｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ
１９８２．７１９（２）、 ３１８〜３２８）等が知
られている。
行う方法（ヨーロッパ特許公開公報第４１７６６号）、
生産細胞培養液中に大豆より誘導されるトリプシン阻害
剤またはアプロチニンを使用する方法（特開昭５９−１
１８７１７） 、アプロチニンまたはベンズアミジンを
添加した培地で培養もしくは誘導生産させる方法（特開
昭６ｌ−１９４８６） 、精製時にアプロチニン、６−
アミノカプロン酸を添加して１本鎖のみを生産させる方
法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ−ｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ
１９８２．７１９（２）、 ３１８〜３２８）等が知
られている。
また、とくに付着性細胞を使用する場合、培養中に細胞
が器壁またはビーズから剥離することが大きな問題とな
るが、これを防ぐ方法として、血清からプラスミンを除
去する、またはアプロチニンを加えることが報告されて
いる（カウフマンモルキエラー・アンド・セルラー・バ
イオロジ ５巻、 １７５０頁）。
が器壁またはビーズから剥離することが大きな問題とな
るが、これを防ぐ方法として、血清からプラスミンを除
去する、またはアプロチニンを加えることが報告されて
いる（カウフマンモルキエラー・アンド・セルラー・バ
イオロジ ５巻、 １７５０頁）。
これらの公知方法において使用されるアプロチニンは掻
めて高価であり、また血清からプラスミンを除去する方
法は煩雑な操作を必要とする等、産業上実施するには問
題が多い。
めて高価であり、また血清からプラスミンを除去する方
法は煩雑な操作を必要とする等、産業上実施するには問
題が多い。
〔課題を解決するための手段）
本発明者は、上述の公知技術の問題点を解消するｔＰＡ
生産方法について鋭意検討し、細胞、特に付着性細胞の
ｔＰＡ生産において、ｐ−アミノメチル安息香酸類を培
地に添加することが、１本鎖の生産性の向上及び細胞の
器壁やビーズからのＷ’ｌ 諦防止に極めて有効である
ことを見出し、本発明を完成した。
生産方法について鋭意検討し、細胞、特に付着性細胞の
ｔＰＡ生産において、ｐ−アミノメチル安息香酸類を培
地に添加することが、１本鎖の生産性の向上及び細胞の
器壁やビーズからのＷ’ｌ 諦防止に極めて有効である
ことを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は細胞を使ってヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子を製造する方法において、培養培地中
にｐ−アミノメチル安息香酸類を添加することを特徴と
するヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法、お
よび細胞を使ってヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
子を製造する方法において、培養後、ヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子誘導物質を含む生産培地にＰ−ア
ミノメチル安息香酸類を添加することを特徴とするヒト
組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法である。
ーゲン活性化因子を製造する方法において、培養培地中
にｐ−アミノメチル安息香酸類を添加することを特徴と
するヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法、お
よび細胞を使ってヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
子を製造する方法において、培養後、ヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子誘導物質を含む生産培地にＰ−ア
ミノメチル安息香酸類を添加することを特徴とするヒト
組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法である。
本発明において使用するｐ−アミノメチル安息香酸類と
しては、例えばｐ−アミノメチル安息香酸、３−メトキ
シ−４−アミノメチル安息香酸、３−エトキシ−４−ア
ミノメチル安息香酸、３−ヒドロキシ−４−アミノメチ
ル安息香酸、３−フルオロ−４−アミノメチル安息香酸
、３−クロロ−・１−アミノメチル安息香酸、３−メチ
ル−４−アミノメチル安息香酸、２−アミノ−４−アミ
ノメチル安息香酸なとである。
しては、例えばｐ−アミノメチル安息香酸、３−メトキ
シ−４−アミノメチル安息香酸、３−エトキシ−４−ア
ミノメチル安息香酸、３−ヒドロキシ−４−アミノメチ
ル安息香酸、３−フルオロ−４−アミノメチル安息香酸
、３−クロロ−・１−アミノメチル安息香酸、３−メチ
ル−４−アミノメチル安息香酸、２−アミノ−４−アミ
ノメチル安息香酸なとである。
また、本発明のおけるｐ−アミノメチル安息香酸類とし
てはそのエステル化合物、塩酸塩の形で使用できること
は言うまでもない。
てはそのエステル化合物、塩酸塩の形で使用できること
は言うまでもない。
本発明におけるρ−アミノメチル安息香酸類の培地への
添加量は、１０−４〜１０−’Ｍ、更に好ましくは１０
４〜１０４Ｍである。
添加量は、１０−４〜１０−’Ｍ、更に好ましくは１０
４〜１０４Ｍである。
本発明において使用されるｔＰＡ生産細胞としては、例
えば、ヒト正常細胞由来ヒト組織型プラスミノーゲン活
性化因子をコードするＤ Ｎ Ａ配列をヒト由来メタロ
チオネインのプロモーターに接続し、ＢＰＶ由来プラス
ミドの一部及びｐＢＲ３２２プラスミドの一部及び転写
停止に必要なりＮＡ配列などを組み込んで構築したプラ
スミドをマウスＣ−１２７細胞に形質転換して得られた
ｔＰＡ生産株、ｈＴ−３８２株などが使用できる（特開
昭６２４２６９７８ ）。
えば、ヒト正常細胞由来ヒト組織型プラスミノーゲン活
性化因子をコードするＤ Ｎ Ａ配列をヒト由来メタロ
チオネインのプロモーターに接続し、ＢＰＶ由来プラス
ミドの一部及びｐＢＲ３２２プラスミドの一部及び転写
停止に必要なりＮＡ配列などを組み込んで構築したプラ
スミドをマウスＣ−１２７細胞に形質転換して得られた
ｔＰＡ生産株、ｈＴ−３８２株などが使用できる（特開
昭６２４２６９７８ ）。
また、例えば、ヒト正常細胞由来ヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子をコードするＤＮＡ配列を５Ｖ−４０
の初期プロモーターを接続したＤＮＡ配列とジヒドロ葉
酸還元酵素をコードするＤＮＡ配列から成るプラスミド
で、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を形質
転換し、更にメソトロキサートを含む培地で遺伝子の増
幅した細胞を選択して得られたｔＰＡ生産株、ＳＶ−２
１−Ｍ２．５に７株などが使用できる（特開昭６２−１
２６９７８）。
ーゲン活性化因子をコードするＤＮＡ配列を５Ｖ−４０
の初期プロモーターを接続したＤＮＡ配列とジヒドロ葉
酸還元酵素をコードするＤＮＡ配列から成るプラスミド
で、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を形質
転換し、更にメソトロキサートを含む培地で遺伝子の増
幅した細胞を選択して得られたｔＰＡ生産株、ＳＶ−２
１−Ｍ２．５に７株などが使用できる（特開昭６２−１
２６９７８）。
もちろん、突然変異、馴化など手段を併用したもの、あ
るいはウィルス他により形質転換された細胞などいずれ
もｔＰＡ産生株であれば使用できる。
るいはウィルス他により形質転換された細胞などいずれ
もｔＰＡ産生株であれば使用できる。
使用する培地は、ダルベツコ変法イーグルＭＥＭ培地（
日永製薬製）、１９９培地（日永製薬製）、イーグルの
最小必須培地（日永製薬製）などに予め不活性化させた
ウシ胎児血清（ＦＣＳギブコ社製）を０〜１０％添加し
たものが使用されるが、成分濃度などは必要に応じて変
更できる。
日永製薬製）、１９９培地（日永製薬製）、イーグルの
最小必須培地（日永製薬製）などに予め不活性化させた
ウシ胎児血清（ＦＣＳギブコ社製）を０〜１０％添加し
たものが使用されるが、成分濃度などは必要に応じて変
更できる。
また、必要に応じて界面活性剤など第３成分を添加して
もよい。
もよい。
ＬＰＡの生産を誘導する物質として亜鉛、カドミウムも
しくはその塩を添加する。添加量は１〜１００μＭであ
る。
しくはその塩を添加する。添加量は１〜１００μＭであ
る。
１８養方法は、とくに限定されるものではなく、例えば
、次のような方法で行われる。
、次のような方法で行われる。
すなわち、ルーフラスコに培地及び必要ならばｔＰＡ誘
導物質を装入し、細胞の適切量を植え付け、適温、適切
な時間炭酸ガスインキュベーター中で増殖と同時にｔＰ
Ａの生産を行う。
導物質を装入し、細胞の適切量を植え付け、適温、適切
な時間炭酸ガスインキュベーター中で増殖と同時にｔＰ
Ａの生産を行う。
または、ルーフラスコに培地を装入し、細胞の適切量を
植え付け、適温、適切な時間、炭酸ガスインキュベータ
ー中で増殖させ、コンフレンドに達した後、生産培地と
切り換え、同じく炭酸ガスインキュベーターで適温、適
時ｔＰＡの生産を行う。
植え付け、適温、適切な時間、炭酸ガスインキュベータ
ー中で増殖させ、コンフレンドに達した後、生産培地と
切り換え、同じく炭酸ガスインキュベーターで適温、適
時ｔＰＡの生産を行う。
例えば、７５ｃＪのルーフラスコを使用した場合、細胞
を０．５〜２．０Ｘ１０’ケ／ｍｌを植え付け、３７°
Ｃ２３〜４日間増殖と同時にｔＰＡの生産を行う。
を０．５〜２．０Ｘ１０’ケ／ｍｌを植え付け、３７°
Ｃ２３〜４日間増殖と同時にｔＰＡの生産を行う。
または、例えば、７５ｃｆｆｌのルーフラスコを使用し
た場合、細胞を１〜２Ｘ１０５ケ／ｍｅを植え付け、３
７°Ｃ１３〜４日間増殖させ、生産培地と切り換えた後
は３７’Ｃ，１〜３日間ｔＰＡの生産を行う。
た場合、細胞を１〜２Ｘ１０５ケ／ｍｅを植え付け、３
７°Ｃ１３〜４日間増殖させ、生産培地と切り換えた後
は３７’Ｃ，１〜３日間ｔＰＡの生産を行う。
このような方法で、ｔＰＡの生産量は分析の結果、１本
鎮ｔＰＡが５〜１０ｍｇ／４２．２末鎖ｔＰＡが０〜２
ｍｇ／ｌであり、全体に占める１本鎖の比率は９５％以
上であった。
鎮ｔＰＡが５〜１０ｍｇ／４２．２末鎖ｔＰＡが０〜２
ｍｇ／ｌであり、全体に占める１本鎖の比率は９５％以
上であった。
本発明では、培養培地または生産培地中に従来高価なア
プロチニンなどを添加していたものを、安価なｐ−メチ
ル安息香酸類を添加することにより、１末鎖ｔＰＡの生
産性の向上及び細胞の器壁やビーズからの２す離を防止
することができる。
プロチニンなどを添加していたものを、安価なｐ−メチ
ル安息香酸類を添加することにより、１末鎖ｔＰＡの生
産性の向上及び細胞の器壁やビーズからの２す離を防止
することができる。
以下、本発明を実施例により説明する。
実施例１
ｔＰＡの生産に用いた細胞は、ヒトメタロチオネインを
プロモーターとしてＢＰＶ由来プラスミドの一部及びｐ
ＢＲ３２２プラスミドの一部及び転写停止に必要なりＮ
Ａ配列などを組み込んで構築したプラスミドをマウスＣ
−１２７細胞に形質転換して得られたｈＴ−３８２株を
使用した。
プロモーターとしてＢＰＶ由来プラスミドの一部及びｐ
ＢＲ３２２プラスミドの一部及び転写停止に必要なりＮ
Ａ配列などを組み込んで構築したプラスミドをマウスＣ
−１２７細胞に形質転換して得られたｈＴ−３８２株を
使用した。
７５ｃｍのルーフラスコにダルベツコ変法イーグルＭ
Ｅ Ｍ培地に予め不活性化させたウシ胎児血清を１０％
添加したものを２Ｏｎ＋１仕込み、塩化亜鉛をＩＯμＭ
になるように、及び表１に掲げる各物質を各濃度で添加
したｌａ地を作成し、それぞれに上記細胞を１．０Ｘ１
０’ケ／…１となるように植菌した。
Ｅ Ｍ培地に予め不活性化させたウシ胎児血清を１０％
添加したものを２Ｏｎ＋１仕込み、塩化亜鉛をＩＯμＭ
になるように、及び表１に掲げる各物質を各濃度で添加
したｌａ地を作成し、それぞれに上記細胞を１．０Ｘ１
０’ケ／…１となるように植菌した。
炭酸ガスインキュベーター中で３７°Ｃ２４日間培養し
、コンフレンド（細胞数１０ ＸＩＯ’ケ／ ｍ ｌ
）に達した時点で培養液中の１本鎖及び２末鎖ＬＰＡ
’ｇ５度を以下の分析法で定堅し、表１のような結果を
得た。
、コンフレンド（細胞数１０ ＸＩＯ’ケ／ ｍ ｌ
）に達した時点で培養液中の１本鎖及び２末鎖ＬＰＡ
’ｇ５度を以下の分析法で定堅し、表１のような結果を
得た。
培地中の１本鎖及び２末鎖ｔＰＡの分析方法を以下に示
す。
す。
１、ＥＬＩＳ八法
■ＥＬＩＳＡ専用プレート（コーニング社９６ｗｅｌｌ
）を１末鎖ＬＰへに対するモノクローナル抗体（ＰＡＭ
−１アメリカンダイアゴノティカ社）、１末鎖＋２本鎖
ｔＰＡに対するモノクローナル抗体（ＰＡＭ−２アメリ
カンダイアゴノティ力社）をコート溶液で希釈して１０
μｇ／ｍｌとし、各プレートの−ｅｌｆに５０μｉずつ
加え、室温で２時間放置後、ｗｅｌｌ内の液を捨てる。
）を１末鎖ＬＰへに対するモノクローナル抗体（ＰＡＭ
−１アメリカンダイアゴノティカ社）、１末鎖＋２本鎖
ｔＰＡに対するモノクローナル抗体（ＰＡＭ−２アメリ
カンダイアゴノティ力社）をコート溶液で希釈して１０
μｇ／ｍｌとし、各プレートの−ｅｌｆに５０μｉずつ
加え、室温で２時間放置後、ｗｅｌｌ内の液を捨てる。
■洗浄液で洗浄後、各−ｅｌｌをブロッキング溶液で満
たし、室温で３０分以上放置する。
たし、室温で３０分以上放置する。
１０００〜２０００倍に希釈したサンプル及びスタンダ
ード（０，１，２，４，８ｎｇ／ｍｌ）を各５０μＰず
つ各−ｅｌｌに加えて２時間放置する。
ード（０，１，２，４，８ｎｇ／ｍｌ）を各５０μＰず
つ各−ｅｌｌに加えて２時間放置する。
■洗浄液で洗浄後、抗ｔＰＡウサギ抗体を添加する。
■洗浄液で洗浄後、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ Ｒａｂｂｉｔ
ＩｇＧ。
ＩｇＧ。
八Ｉｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅ（シグマ社）を５００倍に希釈して各−ｅｌ
ｆに５０μＰずつ添加し、１時間放置する。
ｕｇａｔｅ（シグマ社）を５００倍に希釈して各−ｅｌ
ｆに５０μＰずつ添加し、１時間放置する。
■洗浄液で洗浄後、基質溶液（Ｐ−ＮｉＬｒｏｐｈｅｎ
ｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅシグマ社０．６ｍｇ／ Ｒ）を
各−ｅｌｆに５０μＥずつ加えて３０分間放置する。
ｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅシグマ社０．６ｍｇ／ Ｒ）を
各−ｅｌｆに５０μＥずつ加えて３０分間放置する。
■各ｗｅｌｌに５０μ２ずつの３ＮＮａ０１１を加えて
酵素反応を停止する。
酵素反応を停止する。
■４０５ｎｍにおける吸収を市販のＥＬＴＳＡ ＲＥＡ
ＤＥＲで読み取る。
ＤＥＲで読み取る。
■スタンダードより検量線を作成し、サンプル中のＬｒ
’Ａ濃度を測定する。
’Ａ濃度を測定する。
■計算法
１本鎖 ｔ Ｐ Ａ 量＝ＰＡＭ−１測定値（ｍｇ／
１ ）２本鎖 ｔＰＡ量＝ＰＡＭ−２−ＰＡＭ−１測定
値（ｍｇ／ ｅ ） ■、イムノプロットによる定性的分析 ■培養液をβ−メルカプトエタノールを含むあるいは含
まない電気泳動用試料処理で処理することによって蛋白
質を還元した後、あるいは還元しない状態で、Ｌａｅｍ
ｎ＋ｕｌｉ（１９７０）の方法で電気泳動する。
１ ）２本鎖 ｔＰＡ量＝ＰＡＭ−２−ＰＡＭ−１測定
値（ｍｇ／ ｅ ） ■、イムノプロットによる定性的分析 ■培養液をβ−メルカプトエタノールを含むあるいは含
まない電気泳動用試料処理で処理することによって蛋白
質を還元した後、あるいは還元しない状態で、Ｌａｅｍ
ｎ＋ｕｌｉ（１９７０）の方法で電気泳動する。
■泳動された蛋白をＴｏｗｂｉｎ ら（１９７９）の方
法で電気的にニトロセルロース上に転移する。
法で電気的にニトロセルロース上に転移する。
■非特異的蛋白吸着部位をウシ血清アルブミンで飽和す
る。
る。
■ニトロセルロースを第一抗体である抗ｔＰＡ抗体（例
えばヤギやウサギ由来のポリクローナル抗体、またはマ
ウス由来のモノクローナル抗体）で処理し、ニトロセル
ロース上のｔＰＡと反応させる。
えばヤギやウサギ由来のポリクローナル抗体、またはマ
ウス由来のモノクローナル抗体）で処理し、ニトロセル
ロース上のｔＰＡと反応させる。
■二次抗体を抗ｔＰΔ抗体と反応させた後、アルカリフ
ォスファターゼと結合した、二次抗体に対する抗体と反
応さセる。
ォスファターゼと結合した、二次抗体に対する抗体と反
応さセる。
■アルカリフォスファターゼの基質として、ニトロブル
ーテトラゾリウムを含む溶液に溶解したブロモクロロイ
ンドリルリン酸を用い発色させ、ニトロセルロース」−
のｔＰＡあるいはその分解物、凝集物等の位置を検知す
る。
ーテトラゾリウムを含む溶液に溶解したブロモクロロイ
ンドリルリン酸を用い発色させ、ニトロセルロース」−
のｔＰＡあるいはその分解物、凝集物等の位置を検知す
る。
１零ｔｉｔｐＡでは、還元、非還元の前処理にかかわら
ず、約７０ＫＤの主要なバンドが得られる。
ず、約７０ＫＤの主要なバンドが得られる。
２本積ＬＰＡでは、非還元の場合、１本鎖同様約７０Ｋ
Ｄの主要なバンドが得られるが、還元した場合は、約７
０ＫＤのバンドは消失し、かわって約３０ＫＤと約４０
ＫＤのバンドが得られる。これら還元、非還元の試料の
イムノプロントに於ける約７０ＫＤ、約３０および約４
０ＫＤのバンドを比較することにより、定性的に試料中
の１本鎖、２本鎖の呈比を推定することができる。
Ｄの主要なバンドが得られるが、還元した場合は、約７
０ＫＤのバンドは消失し、かわって約３０ＫＤと約４０
ＫＤのバンドが得られる。これら還元、非還元の試料の
イムノプロントに於ける約７０ＫＤ、約３０および約４
０ＫＤのバンドを比較することにより、定性的に試料中
の１本鎖、２本鎖の呈比を推定することができる。
１ｍｍｕｎｏ Ｂｌｏｔによる分析は定性的であるが、
常々ＥＬＩＳＡにより得られた定量的Ｄａ ｔａと矛盾
がないことを確認するために用いた。
常々ＥＬＩＳＡにより得られた定量的Ｄａ ｔａと矛盾
がないことを確認するために用いた。
実施例２
実施例１と同じ細胞を使用し、７５ｃＪのルーフラスコ
にダルヘソコ変法イーグルＭＥＭ培地に予め不活性化さ
せたウシ胎児血清を１０％添加したものを２０ｍ１仕込
み、１．ＯＸＩＯ’ケ／ｍｌとなるように植菌した。
にダルヘソコ変法イーグルＭＥＭ培地に予め不活性化さ
せたウシ胎児血清を１０％添加したものを２０ｍ１仕込
み、１．ＯＸＩＯ’ケ／ｍｌとなるように植菌した。
炭酸ガスインキュヘーター中で３７°Ｃ１４日間培養し
、コンフレンド（細胞数１０ ＸＩＯ’ケ／ｌｌ１Ｎ）
に達した時点で培地を捨て、同一の組成で塩化亜鉛を１
０８ｍとなるように、及び表２に掲げる各物質を各濃度
で添加した培地を２０ｎ＋ １ずつ加えて炭酸ガスイン
キュベーター中で３７°Ｃ，２日間ｔＰＡを生産させ、
その時点での生産培地中でのｔＰＡ濃度を実施例と同様
に分析し、表２のような結果を得た。
、コンフレンド（細胞数１０ ＸＩＯ’ケ／ｌｌ１Ｎ）
に達した時点で培地を捨て、同一の組成で塩化亜鉛を１
０８ｍとなるように、及び表２に掲げる各物質を各濃度
で添加した培地を２０ｎ＋ １ずつ加えて炭酸ガスイン
キュベーター中で３７°Ｃ，２日間ｔＰＡを生産させ、
その時点での生産培地中でのｔＰＡ濃度を実施例と同様
に分析し、表２のような結果を得た。
実施例３
ｔＰＡの生産に用いた細胞は、ｔＰＡをコードするＤＮ
Ａ配列を５Ｖ−４０の初期プロモーターを接続したＤＮ
Ａ配列と、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードするＤＮＡ配
列から成るプラスミドで］１０（チャイニーズハムスタ
ー卵巣）細胞を形質転換し、更にメソトロキサートを含
む培地で遺伝子の増幅した細胞を選択して得られたＳＶ
−２１−Ｍ２．５に７株を使用した。
Ａ配列を５Ｖ−４０の初期プロモーターを接続したＤＮ
Ａ配列と、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードするＤＮＡ配
列から成るプラスミドで］１０（チャイニーズハムスタ
ー卵巣）細胞を形質転換し、更にメソトロキサートを含
む培地で遺伝子の増幅した細胞を選択して得られたＳＶ
−２１−Ｍ２．５に７株を使用した。
実施例１と同様な培地（ただし塩化亜鉛は添加せず）で
同様な方法で行い、表３のような結果を得た。
同様な方法で行い、表３のような結果を得た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、細胞を使ってヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
子を製造する方法において、培養培地中にｐ−アミノメ
チル安息香酸類を添加することを特徴とするヒト組織型
プラスミノーゲン活性化因子の製法。 ２、細胞を使ってヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
子を製造する方法において、培養後、ヒト組織型プラス
ミノーゲン活性化因子誘導物質を含む生産培地にｐ−ア
ミノメチル安息香酸類を添加することを特徴とするヒト
組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法。
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12264488A JP2648611B2 (ja) | 1988-05-19 | 1988-05-19 | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 |
| US07/347,649 US5151359A (en) | 1988-05-19 | 1989-05-05 | Method for producing of human tissue type plasminogen activator |
| CA000599119A CA1334288C (en) | 1988-05-19 | 1989-05-09 | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
| DE68916857T DE68916857T2 (de) | 1988-05-19 | 1989-05-16 | Verfahren zur Herstellung von menschlichem Gewebeplasminogenaktivator. |
| AT89304944T ATE108825T1 (de) | 1988-05-19 | 1989-05-16 | Verfahren zur herstellung von menschlichem gewebeplasminogenaktivator. |
| EP89304944A EP0342931B1 (en) | 1988-05-19 | 1989-05-16 | Method for the production of human tissue type plasminogen activator |
| AU34892/89A AU612837B2 (en) | 1988-05-19 | 1989-05-17 | Method for production of human tissue type plasminogen activator |
| FI892358A FI98123C (fi) | 1988-05-19 | 1989-05-17 | Menetelmä ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorin valmistamiseksi |
| NZ229187A NZ229187A (en) | 1988-05-19 | 1989-05-18 | Method of production of t-pa from cell culture |
| NO891995A NO175541C (no) | 1988-05-19 | 1989-05-18 | Fremgangsmåte for fremstilling av human vevtype plasminogenaktivator |
| DK243589A DK243589A (da) | 1988-05-19 | 1989-05-19 | Fremgangsmaade til fremstilling af human-vaevstypeplasminogenaktivator |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12264488A JP2648611B2 (ja) | 1988-05-19 | 1988-05-19 | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01291796A true JPH01291796A (ja) | 1989-11-24 |
| JP2648611B2 JP2648611B2 (ja) | 1997-09-03 |
Family
ID=14841072
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12264488A Expired - Lifetime JP2648611B2 (ja) | 1988-05-19 | 1988-05-19 | ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2648611B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5824552A (en) * | 1994-02-18 | 1998-10-20 | Teijin Limited | Medium for culturing animal cells |
-
1988
- 1988-05-19 JP JP12264488A patent/JP2648611B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5824552A (en) * | 1994-02-18 | 1998-10-20 | Teijin Limited | Medium for culturing animal cells |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2648611B2 (ja) | 1997-09-03 |
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