JPH0129423B2

JPH0129423B2 -

Info

Publication number: JPH0129423B2
Application number: JP58091487A
Authority: JP
Inventors: Kazusawa Oosawa; Yoryoshi Ehata; Mitsuyoshi Hirata
Original assignee: Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
Current assignee: Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
Priority date: 1983-05-26
Filing date: 1983-05-26
Publication date: 1989-06-09
Also published as: EP0127841B1; US4582808A; ATE36195T1; EP0127841A1; DE3473177D1; JPS59217164A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は銀染色方法に関し、さらに詳細には、
検出すべき物質を含有した支持担体を銀染色する
に際し、ポリエチレングリコール又はポリオキシ
エチレンアルキルフエノールを含有する中性また
はその付近のアルコール溶液で前処理し、次いで
特定の銀染色液で処理する銀染色方法に関する。現在、染色方法は種々行なわれているが、最近
では感度が比較的高いことから銀染色の方法が注
目されている。銀染色方法は、例えば蛋白質、核
酸、糖、脂質等の検出すべき物質の濃度の低い試
料、即ち尿、脳脊髄液等を濃縮操作なしに泳動分
析可能な為広く利用されて来ている。銀染色の染色方法は、種々報告されている（生
化学、52巻、411頁、1980年、蛋白質核酸、27巻、
1277頁、1982年、Electrophoresis2巻、141頁及
び135頁、1981年）がいずれの方法も、染色が完
了するまで長時間を要したり、使用するゲル、染
色される物質により操作法を異にする為、煩雑な
操作を必要とする等種々の欠点を有しており、し
かも本発明者等の経験によれば、いずれの染色方
法においても再現性よく染色することが困難であ
つた。例えば、ポーリンブ（Paehling）らの方法
Electrophoresis（２巻、141頁、1981年）では電
気泳動後の支持担体を50％メタノール、10％酢酸
溶液で30分間固定化することで、ゲルのバツクグ
ランドの着色をおさえ、そして６％グルタールア
ルデヒド溶液でさらに固定化することにより染色
感度を上昇させている。しかし、その結果これら
の試薬を除去する目的でメタノール及び水で数回
洗浄することが必要であり、従つて前記処理工程
に長時間を要するという不都合が生じていた。そこで、本発明者等は、公知方法の欠点を改良
すべく鋭意検討を行なつた結果、ポリエチレング
リコール若しくはポリオキシエチレンアルキルフ
エノールを含むアルコール溶液で支持担体である
ゲルを処理するとゲルが収縮し、その洗浄が促進
され、結果として洗浄時間が短縮されること並び
に銀染色溶液の主成分である硝酸銀、Ｒ−NH₂
（但し、Ｒ−NH₂はアンモニア又は第１級アミン
を示す）で表わされる化合物及び苛性アルカリの
割合を一定の比率にしておくと操作時間の短縮及
び染色の再現性の向上が図れることを見出し本発
明を完成した。すなわち本発明は、検出すべき物質を含有した
支持担体をポリエチレングリコール若しくはポリ
オキシエチレンアルキルフエノールを含有するア
ルコール溶液で前処理し、次いで、硝酸銀、Ｒ−
NH₂（但し、Ｒ−NH₂は前記と同じ意味を有す
る）で表わされる化合物及び苛性アルカリをそれ
らの分子量比として１：4.5〜9.5：1.0〜26.0の割
合で含有する溶液で処理することを特徴とする銀
染色方法を提供するものである。本発明方法を実施するには、まず、通常の方法
で電気泳動させた支持担体（以下単に「ゲル類」
という）をポリエチレングリコール若しくは、ポ
リオキシエチレンアルキルフエノールを含有する
アルコール溶液（以下「洗浄固定液」という）に
約10〜60分間、好ましくは約25分間浸漬し、ゲル
類を収縮させる。この収縮によりゲル類中の水分
及びこの中に含まれていた試薬が放出される。洗
浄固定液に用いられるアルコールとしては、低級
アルコール即ち炭素数１〜４の直鎖状又は分枝状
のアルコールが好ましく、例えばメタノール、エ
タノール、プロパノール、イソプロパノール、ブ
タノール、イソブタノール及びそれらの混合液が
使用可能である。これらのうち、特にイソプロパ
ノール又はメタノールとエタノール混合液が好ま
しい。これらアルコールは30〜70v／ｖ％濃度の
水溶液が好ましく、特に50v／ｖ％程度のものを
使用するのが有利である。また、ポリエチレング
リコールとしては、平均分子量600〜3500のもの
が好ましく、特に1500〜2500の範囲の分子量のも
のを使用するのが好ましい。一方、ポリオキシエチレンアルキルフエノール
は、一般式

【式】（但し、R′は炭素数６〜10ヶの直鎖状及び分枝状
のアルキルを示し、ｎは分布の中心が７〜10にあ
るものを示す）で表わされるものであり、特に
R′はオクチル、ｎは分布の中心が９にあるもの
が好ましい。これらポリエチレングリコール
（PEG）、ポリオキシエチレンアルキルフエノー
ルは、洗浄固定液の全量に対し、0.05〜５％含ま
れていれば良いが、２％程度が特に好ましい。こ
の洗浄固定液において、アルコール濃度が20％以
下の時はバツクグランドが着色し、バンドの確認
がしにくく好ましくない。一方、90％以上の時
は、バンドが明確に現われない。また、ポリエチ
レングリコールまたはポリオキシエチレンアルキ
ルフエノール濃度が0.01％以下の時はバンドが明
瞭に現れず、一方５％以上であつてもその効果は
変らなかつた。次に洗浄固定液によつて前処理されたゲル類
は、銀染色溶液に10〜30分間、好ましくは約15分
間浸漬し、銀染色溶液でゲル類を処理する。ここ
で用いる銀染色溶液は、硝酸銀、Ｒ−NH₂（Ｒ−
NH₂は前記と同様）で表わされる化合物及び苛
性アルカリをそれらの分子量比として１：4.5〜
9.5：1.0〜26.0の範囲で混合したものであり、こ
の範囲内の銀染色溶液で処理を行えば再現性良く
染色でき、且つ操作時間が短縮される。なお、Ｒ
−NH₂が４以下及び苛性アルカリが28以上の分
子量比であると酸化銀の著しい沈澱が生じ好まし
くない。一方アンモニアが10以上及び苛性アルカ
リが0.5以下の分子量比であると銀アンモニア錯
イオン化が強くて染色されにくい。本発明に使用
可能なＲ−NH₂で示されるものとしてはアンモ
ニア、エタノールアミン、プロパノールアミン、
イソプロパノールアミン、ブタノールアミン、イ
ソブタノールアミン、トリス（ヒドロオキシメチ
ル）アミンメタンおよびメチルアミン、エチルア
ミン、プロピルアミン、ブチルアミン、イソブチ
ルアミン等が挙げられ、また、苛性アルカリとし
ては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙
げられる。このように銀染色溶液で処理されたゲル類は現
像液に約10〜15分間浸される。必要であれば、現
像液で現像後さらに0.5〜２％の塩化金酸の溶液
に浸すことにより、より鮮明な染色像を得ること
ができる。叙上の本発明方法は、電気泳動に用いられる支
持担体のうち、特に網目構造を有する高分子担
体、例えばポリアクリルアミド、寒天、アガロー
ス等に有利に使用される。次に本発明方法と従来行なわれている方法を比
較して示せば次の通りである。

【表】叙上の如く本発明方法は、約60分で鮮明な染色
像を得ることが可能である。また、ゲル中に含ま
れる物質が蛋白質、核酸、糖、脂質等のいずれで
あつても全く同一の操作で行なうことが可能であ
る。更に、本方法には、固定化剤として不安定なグルタールアルデヒ
ド及び取り扱いに危険性を伴うトリクロール酢
酸、酢酸等酸を必要としない。固定化剤の除去操作を必要としない。前処理工程が簡便である。感度、再現性が良好である。等の特徴があり、銀染色方法として優れたもので
ある。次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明す
る。実施例１洗浄固定液中のアルコール濃度及びポリエチレ
ングリコール濃度を変化させてゲル類を洗浄し、
バンドの有無及びバツクグラウンド着色の有無を
判定した。この結果を第１表に示す。〔試料〕 λフアージDNAのHind切断片をポリアクリ
ルアミドゲルにて電気泳動したゲル。〔試薬〕 (1) 銀染色溶液硝酸銀、アンモニア及び水酸化ナトリウムの
分子量比が１：７：4.3になるように蒸留水で
溶解調製し全量を200mlとする。 (2) 現像液 0.05％クエン酸、37％ホルマリン及び蒸留水
を用いて0.005％（ｗ／ｖ）クエン酸の0.02％
（ｗ／ｖ）ホルマリン溶液200mlを調製した。〔操作〕試料を第１表に記載した各種のイソプロパノー
ル及びポリエチレングリコール2000混合液に25分
間浸した後、試料を銀染色溶液に15分間浸し銀染
色溶液をゲル内に浸透させる。次にこの試料を蒸
留水200mlを入れたバツトに１分間浸し水洗する。この操作を３回繰り返す。最後に現像液に試料
を15分間浸すと染色像がかつ色ないし黒く現われ
る。〔結果〕

【表】

【表】実施例２硝酸銀２ｇ／溶液を用い、該溶液に対する苛
性アルカリ（水酸化ナトリウム）及びアンモニア
の分子量比を変動させ、バンドの有無を調べて最
適組成比を求めた。この結果を第２表に示す。な
お、試料、現像液及び操作は後記実施例３と同一
である。結果

【表】実施例３〔試料〕牛血清アルブミン（BSA）をドデシル硫酸ナ
トリウム−ポリアクリルアミドゲル（SDS−
PAGと略す）にて電気泳動したゲル。〔試薬〕 (1) 洗浄固定液イソプロパノール及びポリエチレングリコー
ル2000（スイス、フルカ社発売）が各々50％
（ｖ／ｖ）及び１％（ｗ／ｖ）となるように蒸
留水で希釈し全量200mlとする。 (2) 銀染色溶液硝酸銀、アンモニアおよび水酸化ナトリウム
の分子量比が１：4.8：１になるように蒸留水
で溶解調製し全量を200mlとする。 (3) 0.05％クエン酸、37％ホルマリン及び蒸留水
を用いて0.005％（ｗ／ｖ）クエン酸の0.02％
（ｗ／ｖ）ホルマリン溶液200mlを調製した。〔操作〕試薬(1)、(2)、(3)をキヤビネ判用バツドに各々入
れておく、まず、試料を試薬(1)の入つたバツドに
25分間浸した後、試料を取り出し試薬の(2)の入つ
たバツドに15分間浸し銀染色溶液をゲル内に浸透
させる。次にこの試料を蒸留水200mlを入れたバ
ツドに１分間浸し水洗する。この操作を３回繰り
返す。最後に試薬(3)の入つたバツドに水洗した試
料を15分間浸すと染色像がかつ色ないし黒く現わ
れる。実施例４〔試料〕実施例３と同様〔試薬〕 (1) 洗浄固定液メタノール、エタノール及びポリエチレング
リコール2000が各々40％（ｖ／ｖ）10％（ｖ／
ｖ）及び２％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水で
希釈し全量200mlとする。 (2) 銀染色溶液硝酸銀、アンモニア及び水酸化ナトリウムの
分子量比が１：７：4.3となるように蒸留水で
溶解調製し全量を200mlとする。 (3) 現像液実施例３と同様。〔操作〕本実施例の試薬を用いて実施例３と同様の操作
を行ない実施例３と同様の染色像を得た。実施例５〔試料〕実施例３と同様。〔試料〕 (1) 洗浄固定液イソプロパノール及びポリオキシエチレンフ
エノール（米国、ロームハース社の商品名：ノ
ニゼツトＰ−40）が各々50％（ｖ／ｖ）及び３
％（ｗ／ｖ）となるよう蒸留水で希釈し全量を
200mlとする。 (2) 銀染色溶液硝酸銀、アンモニア及び水酸化ナトリウムの
分子量比が１：9.1：25.5となるように溶解調
製し全量を200mlとする。 (3) 現像液実施例３と同様〔操作〕本実施例の試薬を用いて実施例３と同様の操作
を行ない実施例３と同様の染色像を得た。実施例６〔試料〕実施例３と同様〔試薬〕 (1) 洗浄固定液実施例１と同様 (2) 銀染色溶液硝酸銀、トリス（ハイドロキシメチル）アミ
ノメタン及び水酸化ナトリウムの分子量比が
１：５：1.0となるように蒸留水で溶解調製し
全量を200mlとする。 (3) 現像液実施例３と同様〔操作〕本実施例の試薬を用いて実施例３と同様の操作
を行ない実施例３と同様の染色像を得た。

【図面の簡単な説明】

図面は実施例１の方法で得た電気泳動象であ
る。ａがBSAの染色象。なお、１が5nｇ、２が1n
ｇ、３が500pｇ、４が100pｇ、５が50pｇ、６が
10pｇのBSAを電気泳動させた時の染色象であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

１検出すべき物質を含有した支持担体をポリエ
チレングリコール若しくはポリオキシエチレンア
ルキルフエノールを含有するアルコール溶液で前
処理し、次いで硝酸銀、Ｒ−NH₂（但し、Ｒ−
NH₂はアンモニア又は第１級アミンを示す）で
表わされる化合物及び苛性アルカリをそれらの分
子量比として１：4.5〜9.5：1.0〜26.0の割合で含
有する溶液で処理することを特徴とする銀染色方
法。