JPH01294701A - リン脂質集合体用修飾剤、リン脂質小胞体用凝集防止剤、リン脂質小胞体用融合防止剤およびリン脂質膜用表面固定化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規に合成した構造明確なオリゴサツカライ
ド脂肪酸エステルと、このエステルのリン脂質への利用
法に関するものである。

リン脂質は、自己集合して単分子膜、二分子膜、多重層
膜あるいはこれらからなる小胞体を形成する。これらは
、超薄膜、固体表面の改質、ハイドロゲル、キャリアー
等への利用に供されるが、本発明のオリゴサツカライド
脂肪酸エステルを導入することにより、各種の機能付与
が可能となる。例えば、配向固定されたリン脂質単分子
膜にこのオリゴサツカライド脂肪酸エステルを導入すれ
ば、表面の水和状態や親水ゲル領域の制御のみならず、
生体分子、細胞等との相互作用も制御が期待でき、バイ
オセンサー、細胞培養床修飾剤等への応用が可能である
。

〔従来の技術と発明が解決しようとする課題〕塘構造を
固相表面に固定するためには多くの方法があるが、少量
で有効に作動させるためには、共有結合で固相表面上に
固定する方法が知られている。しかし、この方法には、
処理の煩雑さ、表面化学構造の制限などの問題がある。

一方、遺伝子工学、細胞工学に関係し、大腸菌をはじめ
とした多くの菌体、細胞の培養が重要になっている。従
来、グラスライニング、ポリマーライニングさらにはセ
ラミックライニングなど新機軸を打ち出す各種培養床の
設計が展開されてきた。しかし、培養効果は所望の結果
をもたらしてはいない、この理由は、主として培養床あ
るいは培養槽表面と細胞表面との間の親水性を欠いてい
る所にその一因がある。

また、リン脂質集合体の一例である小胞体（リポソーム
）は、細胞モデル、あるいはカプセル材料として注目さ
れているが、実際は不安定であるため、リン脂質の単独
使用ではマイクロカプセルとしての利用に適さない。そ
こで、コレステロールや蛋白質などを包埋し、膜の強度
向上を狙う試みがある。これらの包埋例では、膜強度は
向上するものの、コレステロールでは約２０％以上導入
する必要がある。しかし、コレステロールを２０％以上
導入すれば、本来リン脂質小胞体がもつ特徴（例えば、
ゲル−液晶相転移、特定刺激に対する物質透過性の変化
等）が消失し、さらに調製方法の制限（例えば、小径リ
ン脂質小胞体の調製不可、有機溶媒使用不可等）が増え
るため、この方法は限定利用に供されていたに過ぎない
。また、これらリン脂質小胞体は調整後、融合、凝集等
の形態変化を起こし易く、製品化した場合の経時安定性
、静脈注射による投与時の血中分散安定性に問題がある
。これらの問題の解決方法としてホスファチジン酸等の
荷電物質を小胞体に添加する方法があるが、未だ充分な
ものではない。一方、添加安定剤として水溶性高分子も
用いられているが、リン脂質小胞体を生体内投与に用い
る場合、これらの物質の多（は自由度高く溶存するため
、安定化に対する添加効率が悪い、溶解性を調整した高
分子においても生体適合性や代謝に問題があった。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、前記した従来技術にみられる問題を解決せん
とするものである。即ち、本発明は、下記する■乃至■
の発明を提供するものである。

■　糖重合度が２〜３０の整数で示され、且つ、アシル
基の置換度が１〜５の範囲にあるオリゴサツカライド脂
肪酸エステル。

■　飽和脂肪族鎖または１〜４個の不飽和結合を含む不
飽和脂肪族鎖からなる、炭素数が１２〜２２個であるア
シル基を備えた請求項１記載のオリゴサツカライド脂肪
酸エステル。

■　請求項１または２記載のオリゴサツカライド脂肪酸
エステルからなるリン脂質集合体用修飾剤。

■　請求項１または２記載のオリゴサツカライド脂肪酸
エステルからなるリン脂質小胞体用凝集防止剤。

■　請求項１または２記載のオリゴサツカライド脂肪酸
エステルからなるリン脂質小胞体用融合防止剤。

■　請求項１または２記載のオリゴサツカライド脂肪酸
エステルからなるリン脂質膜用表面固定化剤。

以下に、さらに詳細に説明をする。

本発明のオリゴサツカライド脂肪酸エステルの製法は次
のごときものである。

糖重合度が２〜３０の整数で示されるオリゴサツカライ
ドの重合変則、種類別分取は、カラムを保温したゲル濾
過を用い、且つ、検出器には示差屈折計を使用すること
により、純度高（行うことができる。

分取したオリゴサツカライドの定性および純度の確認は
、シリカゲル薄層板を用いて混合溶媒（１−ブタノール
・ピリジン・水）で多重展開し、硫酸発色させるか、あ
るいは、ヤミノカラムを固定相にし混合溶媒（アセトニ
トリル・水）を移動相にして用いた液体クロマトグラフ
ィーに供することにより行うことができる。

なお、本発明に使用するオリゴサツカライドには、構造
が明確であれば市販の純品を用いてもよい。

オリゴサツカライド脂肪酸エステルを得るための手段に
は、（１）、前記のごとくにして得たオリゴサツカライ
ドに、ピリジン等の有機塩基触媒およびビニルピリジン
・スチレン共重合体等の塩基性高分子触媒の存在下で、
脂肪酸塩化物または脂肪酸無水物を加える方法、（２）
、オリゴサツカライドをＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
、ジメチルスルホキシド等に溶解し、脂肪酸メチル等で
エステル交換を行う方法、また、（３）。

リパーゼを用いる合成方法があるが、何れの方法を採っ
てもよい。

そして、（１１、（２）あるいは（３）の反応が終了し
たのち、減圧下で溶媒を留去し、ジエチルエーテル、ヘ
キサン等の無極性溶媒に不純物を溶解、濾過し、残渣を
乾燥して粗精製物とする。

本発明のオリゴサツカライド脂肪酸エステルは、主とし
てその脂肪酸の種類と置換度の違いおよび糖重合度の違
いにより、該オリゴサツカライド脂肪酸エステルの極性
、種々の溶媒に対する溶解性および種々のカラム担体に
対する親和性を異にするので、単一の性格をもつように
分離、分取する必要がある。

即ち、前記したオリゴサツカライド脂肪酸エステルの粗
精製物を、逆相系のカラムを固定相に、水、アルコール
、テトラハイドロフラン等の極性溶媒を移動相にした液
体クロマトグラフィーに供する。この方法により、前記
粗精製物は置換度の小さい順に溶出するので、各ピーク
のフラクションを分取することができる。フラクション
の確認は、フーリエ変換核磁気共鳴測定（以下、ＦＴ−
ＮＭＲと略称する。）によって行うことができる。

なお、極性溶媒と逆相系のカラムの種類の組合わせは、
分離、分取したいオリゴサツカライド脂肪酸エステルの
種類により異なるものである。

斯くして、逆相系の分取用クロマトグラフを用いること
により、大量に構造明確な純度の高いオリゴサツカライ
ド脂肪酸エステルを得ることができる。

本発明のオリゴサツカライド脂肪酸エステルの分離、分
取には、上記方法に限らず、例えば、シリカゲルを固定
相とした、順相系液体クロマトグラフィー、超臨界クロ
マトグラフィー、あるいは、溶媒抽出によるなどの方法
を選ぶこともできる。

前記した如くにして得られたオリゴサツカライド脂肪酸
エステルの定性および純度確認は、逆相系の分析用アフ
ィニティークロマトグラフィーに供するか、液体クロマ
トグラフィーと同条件の薄層クロマトグラフィーに供す
ることにより、行うことができる。

本発明におけるリン脂質小胞体、リン脂質単分子膜の作
成法は、通常行われる一船法によるものであって、何等
特殊なものではない。

本発明に使用するオリゴサツカライドは、グルカン、フ
ルクタン、キシラン、ガラクタン、マンナン、キチン、
キトサンの系列の糖のほか結合様式が異なった糖のうち
、その糖重合度が２〜３０の整数で示される多糖であっ
て、糖アルコールをも含んでいる。

また、本発明に使用する脂肪酸を例示すれば、直鎖飽和
脂肪酸として、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン
酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マーガリン酸、ス
テアリン酸、ノナデカン酸、アラキン酸、ベヘン酸が挙
げられ、その他、オレイン酸、リノール酸、リルン酸等
で知られる直鎖不飽和脂肪酸や分岐飽和脂肪酸あるいは
分岐不飽和脂肪酸がある０本発明のオリゴサツカライド
脂肪酸エステルには、その炭素数が１２〜２２個であれ
ば、如何なる脂肪酸であっても使用可能である。

本発明で試料として製造した代表的なオリゴサツカライ
ド脂肪酸エステルの構造を、そのす表　１．　試料番号
とマルトオリゴサッカライド脂肪酸エステルの構造との
相関 マルトオリゴサツカライドの構造はα−１，４−グルカ
ンである。

試料番号２８〜３０はマルトペンタオース２．４−オク
タデカジエネートである。

ソホロオリゴサッカライドの構造はβ−１，２−グルカ
ンである。

ラミナリオリゴサッカライドの構造はβ−１，３−グル
カンである。

表　４．　試料番号とセロオリゴサツカライド脂肪酸エ
ステルの構造との相関 セロオリゴサッカライドの構造はβ−１，４−グルカン
である。

表　５．　試料番号とイソマルトオリゴサツカライド脂
肪酸エステルの構造との相関 イソマルトオリゴサツカライドの構造はα−１，６−グ
ルカンである。

表　６．　試料番号とイヌロオリゴサッカライド脂肪酸
エステルの構造との相関 イヌロオリゴサッカライドの構造はβ−２，１−フルク
タンである。

ジエネートである。

ツカライド構造に従い表１〜８にまとめた。

〔作　用〕

本発明のオリゴサツカライド脂肪酸エステルは、リン脂
質と親和性が非常によいため、リン脂質修飾剤として好
適である。さらに、リン脂質に固定されたオリゴサツカ
ライド脂肪酸エステルは、糖構造を水相に露出した状態
に保持し、且つ、膜上に均一に分散することができる。

本発明の、リン脂質集合体の修飾剤としてのオリゴサツ
カライド脂肪酸エステルは、親疎水バランスを調整した
化合物であるため、利用目的（例えば、親細胞化、リン
脂質小胞体凝集防止、膜融合防止、特定抗体による認識
用ラベル化等）に応じての使い分けが可能である。いず
れも少量の添加で充分に有効であり、リン脂質集合体の
基本的な物性は変化させない。

また、本発明のオリゴサツカライド脂肪酸エステルは、
これを重合性リン脂質と併用し、例えば、培養容器表面
にこれらを塗布し重合せしめて、容器表面を親水性、親
細胞性表面に変換するために使用するには最適のもので
あって、これは、従来にみられない飛躍的な培養効果を
観測できる表面を与えるものである。

〔実施例〕

以下、具体的な実施例について述べる。

”オリゴサツカライド脂肪酸エステルの製造”重合度５
のマルトペンタオース１モルに対し、７．５倍モルの特
級とリジンおよび１００倍モルの特級Ｎ、Ｎ−ジメチル
ホルムアミドを加え、溶解させた。これに、２．５倍モ
ルの特級バルミチン酸クロリド（アシル鎖長１６）を滴
下し、反応を開始した。この反応は無水系で行い、攪拌
下で５０℃で２４時間反応させた。この反応液を５０℃
、減圧下でピリジンおよびＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミ
ドを留去した。ついで１、バルミチン酸等の不純物を溶
出除去させるためヘキサンにて洗浄を繰り返したのち濾
葉した。得られた残渣を５０℃で減圧乾燥させ、粗精製
物を得た。

この粗精製物をカラム（メルク社製、ハイバーカラムリ
クロソルブＲＰ−２）により分画した。移動相にはメタ
ノール：水−９：１混合溶媒を用いた。検出には示差屈
折計を使用した。

前記カラムにより分離された各ピークを分取し、各々Ｆ
Ｔ−ＮＭＲにより構造を確認した。

その結果、図１の、マルトペンタオースパルミテートの
置換度４以上を示すクロマトグラムにあるごとく、マル
トペンタオース（置換度０（１））　、マルトペンタオ
ースモノパルミテート（置換度１（２））、マルトペン
タオースジパルミテート（置換度２（３））、マルトペ
ンタオーストリパルミテート（置換度３（４））次いで
置換度４以上（５）のマルトペンタオースパルミテート
の順に溶出し、分取も可能であることが明らかとなった
。この知見を利用すれば、前記反応混合物からマルトペ
ンタオースモノパルミテート、マルトペンタオースジパ
ルミテート、マルトペンタオーストリパルミテートを精
度高（分離できる。なお、分離、分画条件は上記記載の
ものに限らず、ウォーターズ社のマイクロボンダスフェ
アＣ８や資生堂のカプセルバックＣ１Ｂをカラムとし、
移動相としてテトラハイドロフラン、１−プロパツール
、２−プロパノール、メタノール、水の単一あるいは２
種以上の混合溶媒を用いても分離可能であるなお、図１
において、置換度２（３）および置換度３　（４）の部
分に複数のピークが見られるが、これらは何れも、主と
して置換位置の違いによる、異性体である。

他のオリゴサツカライド脂肪酸エステルの合成について
も、オリゴサツカライド１モルに対して１〜３倍モルの
特級脂肪酸塩化物、２〜１５倍モルの特級ピリジンを加
え、７０℃以下で、１２時間以上反応させ、上記”と同
様の方法により粗精製物を得た。これらを同様に分画し
、各々目的の置換度を有する構造であることをＦＴ−Ｎ
ＭＲから確認した。

ただし、不飽和脂肪酸エステルの合成については、窒素
気流下でこの操作を行った。また、反応温度は、４０℃
を越えないように注意しながら、攪拌下で２４時間以上
反応させ、充分にエステル化が行われるようにした。こ
のようにして得られたオリゴサソカライド不飽和脂肪酸
エステルの不飽和の劣化は、ＦＴ−ＮＭＲによりいずれ
も３％以下であることが確認された。

オリゴサツカライド脂肪酸エステルによるリン脂質の修
飾” 実施例　１゜ 重合度５のマルトペンタオース（純品）にパルミチン酸
を１分子導入したマルトペンタオースモノパルミテート
（試料番号１）３■とリン脂質としてジパルミトイルホ
オスファチジルコリン（以下、ＤＰＰＣと略称する。）
１００■をメタノールに溶解し、混合したのち、エバポ
レーターにて試験管の内壁に薄膜を形成させた。５ｍｌ
の純水と数個のガラスピーズとを添加し、ポルテックス
にて５０℃で攪拌して白濁液を得た。この白濁液をエク
ストルーダにて処理した。エクストルーダのフィルター
の孔径ヲＯ。

４　μ閘　、　０．２　μ鋼　、　０　、１　μ■　、
　０．０５　　μ−と順次変化させながら、各５回通過
させることにより白色透明なりＰＰＣ小胞体分散液を得
た。この状態での小胞体の平均粒径はネガティブ染色し
た透過型電子顕微鏡（以下、ＴＥＭと略称する。）写真
より計算した結果、直径５５ｎ−あった。

小胞体分散液を０．５重量“％に希釈したのち、ゲル濾
過（ファルマシア社製、セファロースＣＬ−４Ｂ、２０
鶴φ、３００ｇｍＨ）Ｌ、、自由に溶存する糖脂肪酸エ
ステルを系外に除いたのち、小胞体を含むフラクション
部をフェノール硫酸法による糖の呈色を行い、試料番号
１の小胞体への導入率を決定した。その結果、試料番号
１は、添加料の約５０％が小胞体に取り込まれているこ
とが明らかとなった。

０．０５μ園のフィルターを通過させた小胞体の分散液
の形態安定性は、室温放置で５００ｎｍの吸光度（濁度
）の変化を測定することで評価した。オリゴサツカライ
ド脂肪酸エステル無添加の小胞体（コントロール）では
濁度が急激に増大し、また粒径分布測定から小胞体の粒
径の経時的な増加が認められることから、小胞体の凝集
、融合を確認した。試料番号ｌを脂質に対し２モル％添
加した系では、分散状態が安定に保たれ、経時変化もな
いことが明らかになった。ＴＥＭ写真で、これらの小胞
体の直径を測定したところ、コントロールでは７４ｎ−
に増大したが、試料番号１を導入した系では粒径変化が
認められなかった。

試料番号１／ＤＰＰＣ（１モルフ５０モル）の組成のリ
ン脂質小胞体分散液７０μｌをアルミ製示差走査熱量計
用容器に封入し、示差走査熱量計測定を行った。ゲル−
液晶質転移温度を観測すると、ＤＰＰＣ小胞体と同様の
４１℃に吸熱ピークが認められ、ピークの幅広化は見ら
れなかった。このことからオリゴサツカライド脂肪酸エ
ステルが、２モル％程度導入されても膜の転移には何ら
影響をおよぼさないことが確認された。また、オリゴサ
ツカライド脂肪酸エステルのＤＰＰＣ小胞体への導入確
認は、０゜０４重量％のタチナタマメレクチン（以下、
Ｃｏｎ　　Ａと略称する。）を添加することによる小胞
体の凝集からも確認した。

実施例　２゜ 表１〜８所載の試料番号２〜６３について、実施例１と
同様の方法を用いてＤＰＰＣ小胞体に包埋させ、凝集や
融合の防止能力について検討した。上記試料を脂質に対
し、それぞれ５モル％導入し、測定して得られた結果を
、実施例１の結果とともに、表９に整理した。

試料番号２，３．１０〜１４．１９〜２８゜３１．３４
，３５．３７〜４１，４３．４６゜４９．５２．５４．
５６〜６３は、粉末のまま小胞体分散液に添加し、５０
℃にて数時間程放置するだけで包埋できた。

試料番号２．３，２８．３１，４０，４３゜４６．４９
，５２．５４．５６は、１モル％以下の導入では、小胞
体の凝集防止効果はなくなるが、試料番号１０〜１５．
２４〜２７．６０表　９．　　ＤＰＰＣ小胞体導入オリ
ゴサツカライド脂肪酸エステルの試料番号と導入効果 符号の説明： ■は、極めて効果がある；　Ｏは、効果がある；　△は
、やや効果がある；　×は、効果がないことを示す。

は０．２モル％でも防止効果を示した。融合防止に関し
てはこれよりも少ない導入量でも充分である。

なお、重合度が小さいオリゴサツカライド、例えば重合
度２〜３のオリゴサツカライドについては、置換度が３
以上になると、小胞体への導入率が低下した。従って、
重合度が小さいものについては、置換度を１あるいは２
に抑えたオリゴサツカライド脂肪酸エステルが小胞体の
融合、凝集防止に適している。

また、オリゴサツカライド脂肪酸エステルのＤＰＰＣ小
胞体への導入確認は、試料番号２〜１５．２８〜３０．
４６〜４８については０゜０４重量％のＣｏｎ　　Ａを
添加、試料番号５６．５７については０．０４重量％の
小麦胚レクチン（以下、ＷＧＡと略称する。）を添加す
ることによる小胞体の凝集からも確認した。

実施例　３゜ リン脂質として卵黄レシチン（以下、ＥＹＬと略称する
。）を用いて実施例２の方法と同様に、試料番号１〜５
７を小胞体に包埋させ、その効果を評価した。効果はほ
ぼ同一であったが以下の点で相違が認められた。

実施例２においては、融合および凝集測定は室温で行っ
たが、ＥＹＬ小胞体は室温では凝集し難いので４℃で測
定を行った。ＥＹＬがエタノール溶液の製品である場合
は、小胞体の調整の際、エタノールの除去が不完全であ
るとフェノール硫酸法で呈色する。そのため、充分に注
意して調整した系について導入率を算出した結果、表１
とほぼ同様の結果が得られた。このことは、オリゴサツ
カライド脂肪酸エステルの導入率ならびに性能は、リン
脂質構造に関係なく、糖脂肪酸エステルの構造に依存し
ていることを表している。オリゴサツカライド脂肪酸エ
ステルの小胞体への導入は、試料番号１〜１５゜２８〜
３０．４６〜４８の場合、０．０４重量％のＣｏｎ　　
Ａを添加、また、試料番号５６゜５７の場合、０．０４
重量％のＷＧＡを添加することによる小胞体の凝集から
も確認した。

実施例　４゜ 試料番号２８，２９．３０を重合性リン脂質である１、
２−ビス（２，４−オクタデカジェノイル）グリセロホ
スホコリンからなる小胞体に導入し、アゾビスイソブチ
ロニトリル等のラジカル開始剤を添加したのち、加熱し
て重合した。ここに得られた高分子化小胞体は、オリゴ
サツカライド脂肪酸エステルとの共重合体であり、槽構
造を安定に担持した。これらは、商品名「トライトンＸ
−１００Ｊやコール酸ナトリウム等の界面活性剤、また
、メタノール等の有機溶媒洗浄に対しても極めて安定に
形態を保持していた。この小胞体は、Ｃｏｎ　　Ａによ
り凝集することから、ｗｉ鎖の安定被覆を確認した。

実施例　５゜ 試料番号５６．５７を実施例４に従って、１．２−ビス
（２，４−オクタデカジェノイル）グリセロホスホコリ
ンからなる小胞体に導入し、アゾビスイソブチロニトリ
ル等のラジカル開始剤を添加したのち、加熱して重合し
た。ここに得られた高分子化小胞体は、オリゴサツカラ
イド脂肪酸エステルを安定に担持しており、商品名「ト
ライトンＸ−１００Ｊやコール酸ナトリウム等の界面活
性剤、また、メタノール等の有機溶媒洗浄に対しても極
めて安定に形態を保持していた。この小胞体は、ＷＧＡ
により凝集することから、糖鎖の安定被覆を確認した。

実施例　６゜ 試料番号２８．２９．３０を１．２−ビス（２，４−オ
クタデカジェノイル）グリセロホスホコリンからなるリ
ン脂質単分子膜に導入した、さらに、アゾビスイソブチ
ロニトリル等のラジカル開始剤を加えたのち、加熱して
重合すると高分子化リン脂質薄膜が得られた。これらの
膜は、オリゴサッカライド脂肪酸エステルが共有結合で
固定されているため、糖鎖が表面に安定に修飾された膜
として調製されたものである、かかる系では、糖は水中
に全く溶出しなかった。また、この膜表面はレクチンに
より容易に認識されることが、螢光プローブでラベルし
たＣｏｎ　　Ａを用いた螢光顕微鏡観察より明らかにさ
れた。

実施例　７゜ 試料番号５６．５７を１．２−ビス（２，４−オクタデ
カジェノイル）グリセロホスホコリンからなるリン脂質
単分子膜に導入した。さらに、アゾビスイソブチロニト
リル等のラジカル開始剤を加えたのち、加熱して重合す
ると高分子化リン脂ｆｆｆｌｌｌｌが得られた。これら
の膜は、オリゴサツカライド脂肪酸エステルが共有結合
で固定されているため、糖鎖が表面に安定に修飾された
膜として調製されたものである。かかる系では、糖は水
中に全く溶出しない、また、この膜表面はレクチンによ
り容易に認識されることが、螢光プローブでラベルした
ＷＧＡを用いた螢光顕微鏡観察より明らかにされた。

実施例　８゜ 試料番号２８，２９．３０を１−バルミトイル２−　（
２，４−オクタデカジェノイル）グリセロホスホコリン
からなる小胞体に導入し、紫外線照射あるいはラジカル
開始剤にて共重合させ、糖鎖を導入したリン脂質・オリ
ゴサツカライド脂肪酸エステル共重合体を調製した。こ
のものを、凍結乾燥後、クロロホルム等の有機溶媒に溶
解させガラス板上に塗布したうえ、窒素気流中で乾燥す
ることにより薄膜が容易に得られ、また水中で再分散さ
せれば糖鎖を水相に露出した小胞体が得られた。この小
胞体構造はＴＥＭより確認できた。レクチンの作用によ
る凝集反応も同様に確認した。

実施例　９゜ 本発明にかかるオリゴサツカライド脂肪酸エステルの例
として、試料番号１，４．１８．２８．２９をそれぞれ
重合性リン脂質である１゜２−ビス（２，４−オクタデ
カジェノイル）グリセロホスホコリンと混合し、糖部分
が全体の２モル％程度となるよう調製した。これを用い
て、細胞壇養に使用する通常の容器内表面を単分子膜で
被覆した。試料番号２８および２９の例については、さ
らにラジカル開始剤を添加し表　１０．　　大腸菌培養
におけるオリゴサツカライド脂肪酸エステル含有リン脂
質分子膜被覆の効果 て重合した系の安定性を高めた０次いで、これらのオリ
ゴサツカライド脂肪酸エステルを含むリン脂質単分子膜
で被覆した培養容器に培地を充たし、大腸菌を３７℃に
て４８時間培養した、培養後の菌を集菌して、比濁法に
より面数を比較したところ、表１０に示す結果を得た。

培養効率は無被覆の例に比較し、高い効果が認められた
。なお、培養効率は無被覆培養器で培養した大腸菌数を
１として、これに対する各培養器で培養して得た大腸菌
数の１０の乗数をもって示した。

実施例　１０゜ 試料番号１，４，１０．１３．１９．２２゜６１．６２
．６３について、実施例１の方法のうち、純水の代わり
に２５℃のヒト血漿を用いた方法で、小胞体の融合、凝
集防止効果を評価した。その結果、無添加系と比べて何
れの試料についても融合、凝集防止効果が認められた。

純水中では効果のなかった二Ｉ！誘導体であるマルトー
スモノパルミチン酸エステル（試料番号６２）が血漿中
ではリン脂質小胞体の融合、凝集防止効果があることが
わかった。

〔試験例〕

実施例に示したオリゴサツカライド脂肪酸エステル導入
リン脂質小胞体の膜安定性を、カルボキシフルオレセイ
ン（以下、ＣＦと略称する、）の放出を以て試験した。

即ち、リン脂質としてＤＰＰＣを用いた小胞体に内包し
たＣＦの放出測定から、オリゴサツカライド脂肪酸エス
テル導入リン脂質小胞体の膜安定性を評価し、オリゴサ
ツカライド脂肪酸エステル無添加のリン脂質小胞体の性
能と比較した。

１＋ｗｌの０．５重量％リン脂質小胞体分散液に４ｍｌ
の１００ｍＭのＣＦ　（ｐＩ−Ｉ８．６）を添加し、リ
ン脂質小胞体にＣＦを内包させた。内包は、既報（Ｍａ
ｋｒｏｍｏｌ　Ｃｈｅｍ、Ｒａｐｉｄ　Ｃｏ５ｕ＋ｕｎ
；８＋２１５（１９８７））に示す方法に従った０次い
で、未内包のＣＦをゲル濾過で除去したのち、螢光測定
を行った。即ち、３１１１のトリスバフファー（５０ｍ
Ｍ、ｐＨ８，６）中に試料３００μｌを添加したのち、
ＣＦの放出に伴う螢光強度の増大を測定した（励起波長
−３３０ｎｍ、螢光波長−５２０ｎ＋＋＋）、その際、
界面活性剤である商品名「トライトンＸ−１００Ｊを添
加してリン脂質小胞体を破壊し、完全にＣＦを放出した
時の螢光強度を１００％ＣＦ放出時とした。

例として、試料番号１０．１３を、ＤＰＰＣ５０モルに
対し、それぞれ１モルの比で添加したリン脂質小胞体（
７）、（８）の系でのＣＦ放出挙動を、オリゴサツカラ
イド脂肪酸エステル無添加リン脂質小胞体（６）と比較
した結果を図２に示した。

本図に示した如くに、オリゴサツカライド脂肪酸エステ
ルの添加により、ＣＦの放出は抑制され、脂質の充填構
造の乱れは観測されず、より安定なリン脂質小胞体が得
られることが明らかとなった。この結果は、他の試料を
添加した系でも認められた。

オリゴサツカライド脂肪酸エステルの添加量の増大に伴
い、ＣＦ放出速度は減少したのち再び増大した。従って
、ＣＦ放出抑制に最も効果の高いオリゴサツカライド脂
肪酸エステルの添加比が存在していることを認めた。一
般にこの値は、本試験に使用した如くに、モル比で５０
：１前後であった。

〔発明の効果〕

シ、ＩＩ長鎖脂肪酸エステルや両親媒性高分子であるポ
リサッカライド長鎖脂肪酸エステルは、生体毒性が低い
ため、化粧品、食品添加物、さらには蛋白質の可溶化剤
に至るまで、幅広く利用されている。これらは、機能性
分子というよりは、むしろ、特徴ある化学環境を設定で
きる材料として考えられ、量を用いて特性を導（もので
ある、このようなポリサッカライド長鎖脂肪酸エステル
の生化学的な利用も、勿論進められている０例えば、長
崎大学の抄本教授らは、分子量の大きなポリサッカライ
ドに長鎖脂肪酸をエステル結合で導入し、人工細胞壁と
してリン脂質小胞体の安定化剤に利用する試みを報告し
ている。（Ｐｏ１７ｍｅｒｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
”、　Ｐｌｅｓｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８３）　ｐ１
５７　）が、このようなポリサンカライド被覆小胞体系
と比較して、本発明のオリゴサツカライド脂肪酸エステ
ルは、リン脂質小胞体に少量添加するのみで充分に効果
があがるため、もとの小胞体の基本的な物性を保ってい
る点に特徴がある。

一方、重合度の大きいポリサンカライド脂肪酸エステル
は、そのＩ！鎖長、脂肪酸エステル置換度に応じた精密
な分離精製が困難なため、その構造は不明瞭であり、糖
重合度、脂肪酸エステル置換度は全て平均値である。こ
れに対し、本発明のオリゴサツカライド脂肪酸エステル
は純品としても得ることができ、塘重合度、脂肪酸エス
テルチ置換度等が厳密に規定できるため、糖鎖長、脂肪
酸の種類、置換度を変えることにより、オリゴサツカラ
イド脂肪酸エステルの権性、溶解性等の諸物性を調整で
き、目的に応じても使い分けることができる。

さらに、本発明のオリゴサツカライド脂肪酸エステルは
、分離、精製が容易であるため不純物の混入がなく、リ
ン脂質の膜特性に悪影響をおよぼす因子がない、これら
の多くは水に対する溶解性が比較的低いため、脂質集合
膜に安定に固定される。オリゴサツカライドには、多糖
より高い生理活性を有するものがあるため、リン脂質小
胞体表面にこれを固定すれば、表面で認識を行う小胞体
としても利用できる。

本発明の、アシル鎖に不飽和結合を有するオリゴサッカ
ライド脂肪酸エステルは、重合性リン脂質集合体に導入
し、紫外線照射、開始剤添加等により共重合できる。そ
の結果、オリゴサツカライド脂肪酸エステルを高分子リ
ン脂質集合体に共有結合で固定できる。このようなＩ！
鎖部分を表面に共有結合で固定した高分子リン脂質集合
体は、熱、有ｍ溶媒、界面活性剤等の物理的、化学的刺
激に対して安定であるため、糖の活性を有効に利用する
ことができる０例えば、オリゴサツカライド脂肪酸エス
テルを共有結合させた高分子リン脂質単分子膜や二分子
膜は凝集素であるレクチンに対して極めて敏感に結合す
るため、これらのセンサーとなる。

従って、このように多くの特徴を持ったオリゴサツカラ
イド脂肪酸エステルは、従来にない、付加価値の高い機
能材料である。

【図面の簡単な説明】

図１は、マルトペンタオースパルミテートの置換度４以
上を示すクロマトグラムの図であり、図２は、リン脂質
小胞体のＣＦ放出挙動示す図である。 図中の符号は次の意味を有する。 １．１ｆ換度０．２．置換度１．３．置換度２．　４．
置換度３．５．置換度４以上。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）糖重合度が２〜３０の整数で示され、且つ、アシ
   ル基の置換度が１〜５の範囲にあるオリゴサッカライド
   脂肪酸エステル。
2. （２）飽和脂肪族鎖または１〜４個の不飽和結合を含む
   不飽和脂肪族鎖からなる、炭素数が１２〜２２個である
   アシル基を備えた請求項１記載のオリゴサッカライド脂
   肪酸エステル。
3. （３）請求項１または２記載のオリゴサッカライド脂肪
   酸エステルからなるリン脂質集合体用修飾剤。
4. （４）請求項１または２記載のオリゴサッカライド脂肪
   酸エステルからなるリン脂質小胞体用凝集防止剤。
5. （５）請求項１または２記載のオリゴサッカライド脂肪
   酸エステルからなるリン脂質小胞体用融合防止剤。
6. （６）請求項１または２記載のオリゴサッカライド脂肪
   酸エステルからなるリン脂質膜用表面固定化剤。