JPH0129557B2 - - Google Patents
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- JPH0129557B2 JPH0129557B2 JP55033931A JP3393180A JPH0129557B2 JP H0129557 B2 JPH0129557 B2 JP H0129557B2 JP 55033931 A JP55033931 A JP 55033931A JP 3393180 A JP3393180 A JP 3393180A JP H0129557 B2 JPH0129557 B2 JP H0129557B2
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- dna
- mrna
- interferon
- plasmid
- coli
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明はヒト線維芽細胞インターフエロンメツ
センジヤーRNAの遺伝子を持つ新規な組換え体
プラスミドに関する。 インターフエロンはIsaacsとLindenmannによ
つて1957年に発見された抗ウイルス作用を持つ糖
蛋白（分子量約20000）である。又その後の研究
によつてインターフエロンは単に抗ウイルス作用
のみならず、抗腫瘍作用等をも示すことが明らか
となり、この物質の幅広い臨床応用が徐々にはじ
められている。例えば種々のウイルス疾患への投
与をはじめとして、骨肉腫や乳癌等の患者への効
果的投与も報告されている。 しかしインターフエロンはその高い種特異性の
為にヒトへの応用には必ずヒト由来のインターフ
エロンが使用されなくてはならない。そして現
在、投与に使用されているインターフエロンの純
度はおよそ１mgあたり106国際単位程度のもので
あり、それは約0.1〜0.01％の純度に相当すると
いえる。 また、インターフエロンの使用は、その量産が
困難な為に大きく阻まれており、現在までには臨
床検査の為の需要（一年当り約1013単位）に対し
てさえ、供給量は１％内外といつた状態であり、
このような理由から純度の高いヒトインターフエ
ロンを容易にしかも大量に生産する技術の開発が
望まれている。 本発明者等は、組換えDNA（デオキシリボ核
酸）技術を用いることによつてプラスミドDNA
（例えば大腸菌由来のプラスミドDNA）にヒトイ
ンターフエロン遺伝子を挿入することがインター
フエロンを容易に大量に生産する新らしい技術で
あると考え、この点に関し研究した結果、本発明
を完成するに至つた。 すなわち、本発明はヒト線維芽細胞インターフ
エロンメツセンジヤーRNA（リボ核酸）を鋳型と
して合成したDNAをベクタープラスミドに挿入
した、ヒト線維芽細胞インターフエロンメツセン
ジヤーRNAの少くとも全コード部分を有する遺
伝子を持つ新規な組換え体プラスミドであつて、
その目的は細菌例えば大腸菌内で増殖、増幅さ
せ、最終的にはヒト線維芽細胞インターフエロン
を細菌例えば大腸菌に生産させるのに利用するこ
とのできる新規な組換え体プラスミドを提供する
ことにある。ここに全コード部分とは、ヒト線維
芽細胞インターフエロンメツセンジヤーRNAの
配列のうち、ヒト線維芽細胞インターフエロン蛋
白質の全アミノ酸配列を指定する部分を云う。 従来、このようなヒト線維芽細胞インターフエ
ロンメツセンジヤーRNAの全コード部分を含む
遺伝子を持つ新規な組換え体プラスミド（もしく
は組換え体プラスミドDNA）は存在せず、本発
明者等により始めて得られたものである。そして
この新規な組換え体プラスミドは、細菌例えば大
腸菌内で増殖させ、ヒト線維芽細胞インターフエ
ロンを大量に低コストで生産させるのに用いられ
るものであつて非常に有用なものである。 本発明の新規な組換え体プラスミドは、Poly
(I)(C)（ポリイノシン酸とポリシチジル酸とにより
構成された二重鎖RNAで米国CALBIOCHEM社
などで販売されている）などにより誘導したヒト
線維芽細胞またはMG63細胞など、もしくはセン
ダイウイルスにより誘導したNAMALVA細胞な
どから細胞質RNAを抽出し、このRNAより
Poly Ａ（ポリアデニル酸）を含むヒト線維芽細
胞インターフエロンメツセンジヤーRNA（以下、
メツセンジヤーRNAをmRNAという）を分離
し、このmRNA中のヒトインターフエロン
mRNA活性の高いものを鋳型にし、逆転写酵素
などによつて二重鎖DNAを合成し、この合成
DNAを組換えDNA技術によつてベクターDNA
（例えば大腸菌プラスミドDNAのような）に挿入
することによつて得られた組換え体を放射性同位
元素で標識してこれを探針として、前述した合成
DNAの組換え体の中からヒト線維芽細胞インタ
ーフエロン蛋白質の全長をコードし得る長さの挿
入部分を持つ組換え体プラスミドを探すことによ
り得ることができる。 次にこの製法について具体的に説明する。 先ず、ヒト線維芽細胞は例えば胎児由来の包皮
から得ることができる。 このヒト線維芽細胞の培養液に小量のインター
フエロンを加えてヒト線維芽細胞のインターフエ
ロン産生をプライミングした後、これにさらに
Poly(I)(C)を加えて誘導する際、シクロヘキシミ
ドを同時に投与することによりインターフエロン
産生を更に高めること（起誘導すること）ができ
るが、これにつれてインターフエロンmRNAの
レベルも高められる。このようにヒト線維芽細胞
を超誘導してから適当時間（例えば４時間）後に
細胞を採集し、この細胞を破壊し、核を除去した
後、これから細胞質の全RNAを例えばフエノー
ルなどで抽出する。また細胞全体を破壊しDNA
とRNAを共に例えばフエノールなどで抽出し、
DNA分解酵素などによりDNAを分解、除去して
RNAを抽出することもできる。 また、ヒト線維芽細胞の代りに、MG63細胞
（骨肉腫の患者から得ることができる）などを用
い、上記したと同様に誘導しRNAを抽出するこ
ともできる。 そしてまた、MG63細胞（骨肉腫の患者から得
る事が出来る）、またはNAMALVA細胞（リン
パ腫の患者から得ることができる）を含有する液
などに例えばセンダイウイルス（大学の医学部な
どで手に入れることができる）などを加えたイン
キユベートして誘導したMG63細胞、または
NAMALVA細胞から上記したと同様にして
RNAを抽出することもできる。 この抽出したRNAを高塩濃度の塩溶液（例え
ばNaCl、KClなどの溶液）に溶かし、これを
oligo（dT）セルロース（米国Ｐ−Ｌ
Biochemicals社販売）のカラムにかけ、Poly Ａ
をもつたmRNAを吸着させた後、水または低塩
濃度溶液（例えば10ｍＭ Tris−HCl緩衝液）な
どで溶出してPoly ＡをもつたmRNAを分離す
る。 この分離したmRNAを、更に蔗糖密度勾配遠
心処理して主にこの分子量の差によつて分画す
る。 そして各々の分画におけるインターフエロン
mRNA活性を、その一部をアフリカツメガエル
（Xenopus laevis）の卵母細胞に微量注入し、合
成される蛋白中のインターフエロン活性（抗ウイ
ルス活性）を測定することにより調べる。 このようにして得た最も活性の高い分画の
mRNAを鋳型にして逆転写酵素〔トリのミエロ
ブラストシスウイルス（Avian myeloblastosis
virus）より得ることができる〕によつてmRNA
に相補的なDNAをin vitroで合成する。この合
成は次のようにして行われる。 mRNAをoligo（dT）（米国Ｐ−Ｌ
Biochemicals社などで販売）、MgCl2（例えば５
ｍＭ）、NaCl（例えば30ｍＭ）、メルカプトエタノ
ール（例えば５ｍＭ）、Tris−HCl緩衝液（例え
ばPH8.0、40ｍＭ）などに共に、デオキシアデノ
シン３リン酸（dATP）、デオキシチミジン３リ
ン酸（dTTP）、デオキシグアノシン３リン酸
（dGTP）、デオキシシチジン３リン酸（dCTP）
（例えば0.5ｍＭずつ）を基質として逆転写酵素と
一定時間（例えば60分）、一定温度（例えば37℃）
で反応させる。 このようにして出来た反応生成物（DNA）を
フエノールなどによつて除蛋白し、ついで鋳型
RNAをアルカリ処理により除去してから再び逆
転写酵素によつて二重鎖DNAを合成する。この
合成は、mRNAの代りにDNAを用い、oligo
（dT）を用いない以外は上記のmRNAより
mRNAに相補的なDNAの合成と同様にして行な
うことができる。 なお、逆転写酵素に代えて大腸菌DNAポリメ
ラーゼ（大腸菌MRE600などから得ることがで
きる）を用いても、同様の二重鎖DNAを合成す
ることができる。 上記のようにして合成した二重鎖DNAをヌク
レアーゼS1（アスペルギルス・オリゼーから得る
ことができる）で例えばZnCl2（例えば１ｍＭ）、
酢酸ナトリウム緩衝液（例えば0.1M、PH4.5）、
NaCl（例えば0.2M）などの存在下に処理した後、
仔ウシ胸線より純化したターミナルトランスフエ
ラーゼ（例えば米国Bethesda Research
Laboratories社販売）とカコヂル酸カリ緩衝液
（例えばPH7.6、0.14M）、Tris（塩基）（例えば
0.003M）、ジチオスレイトール（例えば0.1ｍ
Ｍ）、CoCl2（例えば１ｍＭ）、dATP（例えば１ｍ
Ｍ）などの存在下に一定時間（例えば20分）、一
定温度（例えば37℃）でインキユベートすること
により上記合成DNAの3′側両末端にデオキシア
デニン鎖を延長させる。 一方、ベクターDNAとなるプラスミドDNA例
えば大腸菌プラスミドpBR322DNA〔GeneVol.2、
P.95−113（1977）〕に制限酵素EcoRI（大腸菌
RY13などから得ることができる）を、例えば
Tris−HCl緩衝液（例えばPH7.5、10ｍＭ）、
MgCl2（例えば６ｍＭ）、NaCl（例えば0.1M）、メ
ルカプトエタノール（例えば６ｍＭ）などの存在
下に作用させてpBR322DNA中の１ケ所を切断し、
その切断部にフアージλ由来のエキソヌクレアー
ゼ〔例えば大腸菌W3102（λcI851X13）から得る
ことができる〕を例えばNa−グリシン緩衝液
（例えばPH9.5、0.1M）、MgCl2（例えば５ｍＭ）な
どの存在下に作用させた後に、dATPの代りに
dTTPを用いて上記合成二重鎖DNAと同様にこ
のDNAの3′側両末端にデオキシチミジン鎖を延
長させる。 上記のように3′側両末端に鎖延長させた合成二
重鎖DNAとプラスミドDNAを例えばTris−HCl
緩衝液（例えばPH7.5、50ｍＭ）、NaCl（例えば
0.1M）、EDTA（例えば５ｍＭ）などと共に一定
時間、一定温度にインキユベートしてアデニン−
チミンによる水素結合で会合（ハイブリダイゼー
シヨン）させた後、会合したDNAを例えばEnea
らの方法（J.Mol.Biol.Vol.96、p495−509、
1975）によつて形質転換可能な大腸菌例えば大腸
菌χ1776〔Molecular Cloning of Recombinant
DNA、Scott、W.A.＆ Werner、R.edited、
Academic Press p.99−114、（1977）〕を形質転
換させる。 このようにして得られた新規な組換えプラスミ
ドDNAには、ペクターDNA例えば大腸菌プラス
ミドpBR322の持つβ−ラクタマーゼ（アンピシ
リンを破壊する酵素）遺伝子が存在し、従つて形
質変換した大腸菌はアンピシリン耐性を示す。こ
のアンピシリン耐性株の中から、インターフエロ
ンmRNAに相補性を示す遺伝子を持つ新規な組
換え体をもつた菌株を探し出すには次の手法を用
いる。 先ず、上記したインターフエロンmRNA活性
をもつRNAを鋳型にして〔（32P）〕で標識した
DNAを合成し、このDNAをヒト線維芽細胞から
Poly(I)(C)による誘導なしに抽出したmRNA（従つ
てこのmRNAはインターフエロンmRNAを含ま
ない）にNaCl（例えば0.5M）などを含む反応液
中で高温（例えば65℃）でインキユベートするこ
とによつて会合させる。そしてこの会合した
DNA（ProbeA）とそうでないDNA（ProbeB）を
ハイドロオキシアパタイトカラムクロマトグラフ
イーにより分離し、Grunstein−Hognessの方法
〔Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.Vol.72、p3961−3965
（1975）〕に従つてフイルターに固定されたDNA
をProbeBとProbeAとを別個に会合させ、オー
トラジオグラフイーによりProbeAには全くもし
くは殆んど会合せず、ProbeBに会合するDNAを
もつた菌株を判別する。 次に、このようにして判別された菌株からプラ
スミドDNAを単離し、インターフエロンmRNA
活性をもつmRNAに例えば80％（Ｗ／Ｖ）ホル
ムアミド、0.4M NaCl等の存在下、高温（例え
ば53℃）でインキユベートすることにより会合さ
せる。上記菌株からのプラスミドDNAに会合し
たmRNAはニトロセルロースフイルターを通過
せず、捕獲されるので、このmRNAをフイルタ
ーから例えば90％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミドなどの
溶液中で高温（例えば60℃）で溶出し、上述した
ようにアフリカツメガエルの卵母細胞に注入しイ
ンターフエロンの活性を測定する。 このようにして、インターフエロン活性が測定
された場合、会合に用いたDNAはインターフエ
ロンmRNAに相補的な塩基配列を持つたDNAで
あると結論され、この手法によつてヒト線維芽細
胞インターフエロンmRNAに相補性を示す遺伝
子を持つ組換え体プラスミドDNAを判別するこ
とができる。 このようにして得られた組換え体プラスミド
DNA、又はその制限酵素による断片を、例えば
nick−translation法〔Rigbyら、J.Mol.Biol.
Vol.113、p.237−251（1977）〕によつて32Pなどの
放射性同位元素で標識し、これを探針として前述
した如く調製したアンピシリン耐性株の中から、
前述したと同じ手段を用いてインターフエロン
mRNAの配列を持つ組換え体プラスミドを含む
大腸菌株を確実に探し出す。そのようにして得ら
れた多数の株を培養し、それぞれからプラスミド
DNAを分離し、制限酵素などで切り出す事によ
つて挿入されたmRNA部分の長さを調べて、そ
の中からインターフエロン蛋白質の全長をコード
するような長さ、すなわち全コードを含むに足る
長さの挿入部分を持つたプラスミドを選ぶことに
より、ヒト線維芽細胞インターフエロンmRNA
の少くとも全コード部分に相補的な遺伝子すなわ
ち該mRNAの少くとも全コード部分を有する遺
伝子を持つ新規な組換え体プラスミドを得ること
ができる。そして、この組換え体プラスミドの一
次構造をMaxam−Gilbert法〔Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.vol.74、p.560−564（1977）〕などによ
つて、決定することにより、それが、ヒト線維芽
細胞インターフエロンmRNAの蛋白質をコード
する、すべての遺伝暗号を含んでいる事が証明さ
れた。 本発明の新規な組換え体プラスミドは、ヒト線
維芽細胞インターフエロンmRNAの少なくとも
全コード部分を有する遺伝子を持つているので、
これを利用して大腸菌もしくは大量増殖が可能な
有核細胞でのインターフエロンの大量生産を行う
ことに応用することができるので非常に有用であ
る。 次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明
するが、これにより本発明は制限されるものでは
ない。 実施例 ヒト線維芽細胞をインターフエロン（25単位／
ml）を含む市販のMEM培養液で一夜インキユベ
ートしてプライミングし、poly(I)(C)10μｇ／ml、
シクロヘキシミド5μｇ／mlを培養液中に投与し
て超誘導した。 ４時間後、この超誘導した109個のヒト線維芽
細胞をRSB緩衝液（10ｍＭ、Tris−HCl、PH
7.5：10ｍＭ、NaCl：1.5ｍＭ、MgCl2）中で0.3
％NP−40、50μｇ／mlヘパリンの存在下にテフ
ロンホモジエナイザーによつて破壊し、核を遠心
分離によつて除いた後、フエノールで３回抽出を
行うことによつて9.6mgの細胞質RNAを得た。 この細胞質RNAをエタノールで沈澱させ、10
mlの１ｍＭ EDTA溶液に溶かし、65℃で２分
間処理した後、溶液中に2.5mlの高塩溶液（0.5M
Tris−HCl、PH7.5：1M、MaCl：50ｍＭ、
EDTA）を加え、これをoligo（dT）セルロース
カラムにかけた。カラムに吸着したpolyAを含む
mRNAを低塩溶液（10ｍＭ、Tris−HCl、PH7.5）
と水で交互に溶出させることによつて250μｇの
polyAを含むmRNAを分離した。 このmRNAを更にエタノールで沈澱させ、0.5
mlの１ｍＭ EDTA溶液に溶かし、65℃で２時
間処理して５％〜25％蔗糖密度勾配遠心処理（米
国Beckmann社製SW40のローターを用い４℃に
おいて35000r.p.m.で16時間回転）することによ
り分画化して20分画を得た。この各分画につき
RNAの一部ずつを上述したようにしてインター
フエロンmRNA活性を測定した。その結果は第
１表の如くであつた。
センジヤーRNAの遺伝子を持つ新規な組換え体
プラスミドに関する。 インターフエロンはIsaacsとLindenmannによ
つて1957年に発見された抗ウイルス作用を持つ糖
蛋白（分子量約20000）である。又その後の研究
によつてインターフエロンは単に抗ウイルス作用
のみならず、抗腫瘍作用等をも示すことが明らか
となり、この物質の幅広い臨床応用が徐々にはじ
められている。例えば種々のウイルス疾患への投
与をはじめとして、骨肉腫や乳癌等の患者への効
果的投与も報告されている。 しかしインターフエロンはその高い種特異性の
為にヒトへの応用には必ずヒト由来のインターフ
エロンが使用されなくてはならない。そして現
在、投与に使用されているインターフエロンの純
度はおよそ１mgあたり106国際単位程度のもので
あり、それは約0.1〜0.01％の純度に相当すると
いえる。 また、インターフエロンの使用は、その量産が
困難な為に大きく阻まれており、現在までには臨
床検査の為の需要（一年当り約1013単位）に対し
てさえ、供給量は１％内外といつた状態であり、
このような理由から純度の高いヒトインターフエ
ロンを容易にしかも大量に生産する技術の開発が
望まれている。 本発明者等は、組換えDNA（デオキシリボ核
酸）技術を用いることによつてプラスミドDNA
（例えば大腸菌由来のプラスミドDNA）にヒトイ
ンターフエロン遺伝子を挿入することがインター
フエロンを容易に大量に生産する新らしい技術で
あると考え、この点に関し研究した結果、本発明
を完成するに至つた。 すなわち、本発明はヒト線維芽細胞インターフ
エロンメツセンジヤーRNA（リボ核酸）を鋳型と
して合成したDNAをベクタープラスミドに挿入
した、ヒト線維芽細胞インターフエロンメツセン
ジヤーRNAの少くとも全コード部分を有する遺
伝子を持つ新規な組換え体プラスミドであつて、
その目的は細菌例えば大腸菌内で増殖、増幅さ
せ、最終的にはヒト線維芽細胞インターフエロン
を細菌例えば大腸菌に生産させるのに利用するこ
とのできる新規な組換え体プラスミドを提供する
ことにある。ここに全コード部分とは、ヒト線維
芽細胞インターフエロンメツセンジヤーRNAの
配列のうち、ヒト線維芽細胞インターフエロン蛋
白質の全アミノ酸配列を指定する部分を云う。 従来、このようなヒト線維芽細胞インターフエ
ロンメツセンジヤーRNAの全コード部分を含む
遺伝子を持つ新規な組換え体プラスミド（もしく
は組換え体プラスミドDNA）は存在せず、本発
明者等により始めて得られたものである。そして
この新規な組換え体プラスミドは、細菌例えば大
腸菌内で増殖させ、ヒト線維芽細胞インターフエ
ロンを大量に低コストで生産させるのに用いられ
るものであつて非常に有用なものである。 本発明の新規な組換え体プラスミドは、Poly
(I)(C)（ポリイノシン酸とポリシチジル酸とにより
構成された二重鎖RNAで米国CALBIOCHEM社
などで販売されている）などにより誘導したヒト
線維芽細胞またはMG63細胞など、もしくはセン
ダイウイルスにより誘導したNAMALVA細胞な
どから細胞質RNAを抽出し、このRNAより
Poly Ａ（ポリアデニル酸）を含むヒト線維芽細
胞インターフエロンメツセンジヤーRNA（以下、
メツセンジヤーRNAをmRNAという）を分離
し、このmRNA中のヒトインターフエロン
mRNA活性の高いものを鋳型にし、逆転写酵素
などによつて二重鎖DNAを合成し、この合成
DNAを組換えDNA技術によつてベクターDNA
（例えば大腸菌プラスミドDNAのような）に挿入
することによつて得られた組換え体を放射性同位
元素で標識してこれを探針として、前述した合成
DNAの組換え体の中からヒト線維芽細胞インタ
ーフエロン蛋白質の全長をコードし得る長さの挿
入部分を持つ組換え体プラスミドを探すことによ
り得ることができる。 次にこの製法について具体的に説明する。 先ず、ヒト線維芽細胞は例えば胎児由来の包皮
から得ることができる。 このヒト線維芽細胞の培養液に小量のインター
フエロンを加えてヒト線維芽細胞のインターフエ
ロン産生をプライミングした後、これにさらに
Poly(I)(C)を加えて誘導する際、シクロヘキシミ
ドを同時に投与することによりインターフエロン
産生を更に高めること（起誘導すること）ができ
るが、これにつれてインターフエロンmRNAの
レベルも高められる。このようにヒト線維芽細胞
を超誘導してから適当時間（例えば４時間）後に
細胞を採集し、この細胞を破壊し、核を除去した
後、これから細胞質の全RNAを例えばフエノー
ルなどで抽出する。また細胞全体を破壊しDNA
とRNAを共に例えばフエノールなどで抽出し、
DNA分解酵素などによりDNAを分解、除去して
RNAを抽出することもできる。 また、ヒト線維芽細胞の代りに、MG63細胞
（骨肉腫の患者から得ることができる）などを用
い、上記したと同様に誘導しRNAを抽出するこ
ともできる。 そしてまた、MG63細胞（骨肉腫の患者から得
る事が出来る）、またはNAMALVA細胞（リン
パ腫の患者から得ることができる）を含有する液
などに例えばセンダイウイルス（大学の医学部な
どで手に入れることができる）などを加えたイン
キユベートして誘導したMG63細胞、または
NAMALVA細胞から上記したと同様にして
RNAを抽出することもできる。 この抽出したRNAを高塩濃度の塩溶液（例え
ばNaCl、KClなどの溶液）に溶かし、これを
oligo（dT）セルロース（米国Ｐ−Ｌ
Biochemicals社販売）のカラムにかけ、Poly Ａ
をもつたmRNAを吸着させた後、水または低塩
濃度溶液（例えば10ｍＭ Tris−HCl緩衝液）な
どで溶出してPoly ＡをもつたmRNAを分離す
る。 この分離したmRNAを、更に蔗糖密度勾配遠
心処理して主にこの分子量の差によつて分画す
る。 そして各々の分画におけるインターフエロン
mRNA活性を、その一部をアフリカツメガエル
（Xenopus laevis）の卵母細胞に微量注入し、合
成される蛋白中のインターフエロン活性（抗ウイ
ルス活性）を測定することにより調べる。 このようにして得た最も活性の高い分画の
mRNAを鋳型にして逆転写酵素〔トリのミエロ
ブラストシスウイルス（Avian myeloblastosis
virus）より得ることができる〕によつてmRNA
に相補的なDNAをin vitroで合成する。この合
成は次のようにして行われる。 mRNAをoligo（dT）（米国Ｐ−Ｌ
Biochemicals社などで販売）、MgCl2（例えば５
ｍＭ）、NaCl（例えば30ｍＭ）、メルカプトエタノ
ール（例えば５ｍＭ）、Tris−HCl緩衝液（例え
ばPH8.0、40ｍＭ）などに共に、デオキシアデノ
シン３リン酸（dATP）、デオキシチミジン３リ
ン酸（dTTP）、デオキシグアノシン３リン酸
（dGTP）、デオキシシチジン３リン酸（dCTP）
（例えば0.5ｍＭずつ）を基質として逆転写酵素と
一定時間（例えば60分）、一定温度（例えば37℃）
で反応させる。 このようにして出来た反応生成物（DNA）を
フエノールなどによつて除蛋白し、ついで鋳型
RNAをアルカリ処理により除去してから再び逆
転写酵素によつて二重鎖DNAを合成する。この
合成は、mRNAの代りにDNAを用い、oligo
（dT）を用いない以外は上記のmRNAより
mRNAに相補的なDNAの合成と同様にして行な
うことができる。 なお、逆転写酵素に代えて大腸菌DNAポリメ
ラーゼ（大腸菌MRE600などから得ることがで
きる）を用いても、同様の二重鎖DNAを合成す
ることができる。 上記のようにして合成した二重鎖DNAをヌク
レアーゼS1（アスペルギルス・オリゼーから得る
ことができる）で例えばZnCl2（例えば１ｍＭ）、
酢酸ナトリウム緩衝液（例えば0.1M、PH4.5）、
NaCl（例えば0.2M）などの存在下に処理した後、
仔ウシ胸線より純化したターミナルトランスフエ
ラーゼ（例えば米国Bethesda Research
Laboratories社販売）とカコヂル酸カリ緩衝液
（例えばPH7.6、0.14M）、Tris（塩基）（例えば
0.003M）、ジチオスレイトール（例えば0.1ｍ
Ｍ）、CoCl2（例えば１ｍＭ）、dATP（例えば１ｍ
Ｍ）などの存在下に一定時間（例えば20分）、一
定温度（例えば37℃）でインキユベートすること
により上記合成DNAの3′側両末端にデオキシア
デニン鎖を延長させる。 一方、ベクターDNAとなるプラスミドDNA例
えば大腸菌プラスミドpBR322DNA〔GeneVol.2、
P.95−113（1977）〕に制限酵素EcoRI（大腸菌
RY13などから得ることができる）を、例えば
Tris−HCl緩衝液（例えばPH7.5、10ｍＭ）、
MgCl2（例えば６ｍＭ）、NaCl（例えば0.1M）、メ
ルカプトエタノール（例えば６ｍＭ）などの存在
下に作用させてpBR322DNA中の１ケ所を切断し、
その切断部にフアージλ由来のエキソヌクレアー
ゼ〔例えば大腸菌W3102（λcI851X13）から得る
ことができる〕を例えばNa−グリシン緩衝液
（例えばPH9.5、0.1M）、MgCl2（例えば５ｍＭ）な
どの存在下に作用させた後に、dATPの代りに
dTTPを用いて上記合成二重鎖DNAと同様にこ
のDNAの3′側両末端にデオキシチミジン鎖を延
長させる。 上記のように3′側両末端に鎖延長させた合成二
重鎖DNAとプラスミドDNAを例えばTris−HCl
緩衝液（例えばPH7.5、50ｍＭ）、NaCl（例えば
0.1M）、EDTA（例えば５ｍＭ）などと共に一定
時間、一定温度にインキユベートしてアデニン−
チミンによる水素結合で会合（ハイブリダイゼー
シヨン）させた後、会合したDNAを例えばEnea
らの方法（J.Mol.Biol.Vol.96、p495−509、
1975）によつて形質転換可能な大腸菌例えば大腸
菌χ1776〔Molecular Cloning of Recombinant
DNA、Scott、W.A.＆ Werner、R.edited、
Academic Press p.99−114、（1977）〕を形質転
換させる。 このようにして得られた新規な組換えプラスミ
ドDNAには、ペクターDNA例えば大腸菌プラス
ミドpBR322の持つβ−ラクタマーゼ（アンピシ
リンを破壊する酵素）遺伝子が存在し、従つて形
質変換した大腸菌はアンピシリン耐性を示す。こ
のアンピシリン耐性株の中から、インターフエロ
ンmRNAに相補性を示す遺伝子を持つ新規な組
換え体をもつた菌株を探し出すには次の手法を用
いる。 先ず、上記したインターフエロンmRNA活性
をもつRNAを鋳型にして〔（32P）〕で標識した
DNAを合成し、このDNAをヒト線維芽細胞から
Poly(I)(C)による誘導なしに抽出したmRNA（従つ
てこのmRNAはインターフエロンmRNAを含ま
ない）にNaCl（例えば0.5M）などを含む反応液
中で高温（例えば65℃）でインキユベートするこ
とによつて会合させる。そしてこの会合した
DNA（ProbeA）とそうでないDNA（ProbeB）を
ハイドロオキシアパタイトカラムクロマトグラフ
イーにより分離し、Grunstein−Hognessの方法
〔Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.Vol.72、p3961−3965
（1975）〕に従つてフイルターに固定されたDNA
をProbeBとProbeAとを別個に会合させ、オー
トラジオグラフイーによりProbeAには全くもし
くは殆んど会合せず、ProbeBに会合するDNAを
もつた菌株を判別する。 次に、このようにして判別された菌株からプラ
スミドDNAを単離し、インターフエロンmRNA
活性をもつmRNAに例えば80％（Ｗ／Ｖ）ホル
ムアミド、0.4M NaCl等の存在下、高温（例え
ば53℃）でインキユベートすることにより会合さ
せる。上記菌株からのプラスミドDNAに会合し
たmRNAはニトロセルロースフイルターを通過
せず、捕獲されるので、このmRNAをフイルタ
ーから例えば90％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミドなどの
溶液中で高温（例えば60℃）で溶出し、上述した
ようにアフリカツメガエルの卵母細胞に注入しイ
ンターフエロンの活性を測定する。 このようにして、インターフエロン活性が測定
された場合、会合に用いたDNAはインターフエ
ロンmRNAに相補的な塩基配列を持つたDNAで
あると結論され、この手法によつてヒト線維芽細
胞インターフエロンmRNAに相補性を示す遺伝
子を持つ組換え体プラスミドDNAを判別するこ
とができる。 このようにして得られた組換え体プラスミド
DNA、又はその制限酵素による断片を、例えば
nick−translation法〔Rigbyら、J.Mol.Biol.
Vol.113、p.237−251（1977）〕によつて32Pなどの
放射性同位元素で標識し、これを探針として前述
した如く調製したアンピシリン耐性株の中から、
前述したと同じ手段を用いてインターフエロン
mRNAの配列を持つ組換え体プラスミドを含む
大腸菌株を確実に探し出す。そのようにして得ら
れた多数の株を培養し、それぞれからプラスミド
DNAを分離し、制限酵素などで切り出す事によ
つて挿入されたmRNA部分の長さを調べて、そ
の中からインターフエロン蛋白質の全長をコード
するような長さ、すなわち全コードを含むに足る
長さの挿入部分を持つたプラスミドを選ぶことに
より、ヒト線維芽細胞インターフエロンmRNA
の少くとも全コード部分に相補的な遺伝子すなわ
ち該mRNAの少くとも全コード部分を有する遺
伝子を持つ新規な組換え体プラスミドを得ること
ができる。そして、この組換え体プラスミドの一
次構造をMaxam−Gilbert法〔Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.vol.74、p.560−564（1977）〕などによ
つて、決定することにより、それが、ヒト線維芽
細胞インターフエロンmRNAの蛋白質をコード
する、すべての遺伝暗号を含んでいる事が証明さ
れた。 本発明の新規な組換え体プラスミドは、ヒト線
維芽細胞インターフエロンmRNAの少なくとも
全コード部分を有する遺伝子を持つているので、
これを利用して大腸菌もしくは大量増殖が可能な
有核細胞でのインターフエロンの大量生産を行う
ことに応用することができるので非常に有用であ
る。 次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明
するが、これにより本発明は制限されるものでは
ない。 実施例 ヒト線維芽細胞をインターフエロン（25単位／
ml）を含む市販のMEM培養液で一夜インキユベ
ートしてプライミングし、poly(I)(C)10μｇ／ml、
シクロヘキシミド5μｇ／mlを培養液中に投与し
て超誘導した。 ４時間後、この超誘導した109個のヒト線維芽
細胞をRSB緩衝液（10ｍＭ、Tris−HCl、PH
7.5：10ｍＭ、NaCl：1.5ｍＭ、MgCl2）中で0.3
％NP−40、50μｇ／mlヘパリンの存在下にテフ
ロンホモジエナイザーによつて破壊し、核を遠心
分離によつて除いた後、フエノールで３回抽出を
行うことによつて9.6mgの細胞質RNAを得た。 この細胞質RNAをエタノールで沈澱させ、10
mlの１ｍＭ EDTA溶液に溶かし、65℃で２分
間処理した後、溶液中に2.5mlの高塩溶液（0.5M
Tris−HCl、PH7.5：1M、MaCl：50ｍＭ、
EDTA）を加え、これをoligo（dT）セルロース
カラムにかけた。カラムに吸着したpolyAを含む
mRNAを低塩溶液（10ｍＭ、Tris−HCl、PH7.5）
と水で交互に溶出させることによつて250μｇの
polyAを含むmRNAを分離した。 このmRNAを更にエタノールで沈澱させ、0.5
mlの１ｍＭ EDTA溶液に溶かし、65℃で２時
間処理して５％〜25％蔗糖密度勾配遠心処理（米
国Beckmann社製SW40のローターを用い４℃に
おいて35000r.p.m.で16時間回転）することによ
り分画化して20分画を得た。この各分画につき
RNAの一部ずつを上述したようにしてインター
フエロンmRNA活性を測定した。その結果は第
１表の如くであつた。
【表】
分画No.11中のmRNAは約5μｇであつた。
このmRNAおよび逆転写酵素を用い、20μの
反応液〔5μｇのmRNA：0.5ｍMdATP；0.5ｍ
MdTTP；0.5ｍMdGTP；0.5ｍMdCTP1μｇの
oligo（dT）：８ユニツトの逆転写酵素；MgCl2、
５ｍＭ：NaCl、30ｍＭ：メルカプトエタノール、
５ｍＭ：Tris−HCl、PH8.0、40ｍＭ〕中で37℃
で１時間インキユベートした後に、フエノールに
よつて除蛋白し、0.3NのNaOHで37℃で15時間
処理してRNAを除いた後、合成された単鎖DNA
を20μの反応液〔mRNAとoligo（dT）を含ま
ない以外は上記と同じ反応液〕中で反応（37℃、
１時間インキユベーシヨン）させることによつて
1.5μｇの二重鎖DNAを合成した。 この二重鎖合成DNAにヌクレアーゼS1を50μ
の反応液（1.5μｇ二重鎖DNA：ZnCl2、１ｍ
Ｍ：酢酸ナトリウム、PH4.5、0.1M：NaCl、
0.2M、0.05ユニツトのS1）中で30分間37℃で作
用させ、フエノールで除蛋白し、エタノールで
DNAを沈澱させた後、これにターミナルトラン
スフエラーゼを20μの反応液〔DNA、1.5μｇ：
カコジル酸カリ、PH7.6、0.14M：Tris（塩基）、
0.03M：ジチオスレイトール、0.1ｍＭ：CoCl2、
１ｍＭ：dATP、１ｍＭ：１ユニツト、ターミナ
ルトランスフエラーゼ〕中で20分間、37℃で作用
させ二重鎖DNAの3′両端に約100個のデオキシア
デニン鎖を延長させた。 一方、10μｇの大腸菌プラスミドpBR322DNAに
制限酵素EcoRIを100μの反応液（Tris−HCl、
PH7.5、10ｍＭ：MgCl2、６ｍＭ：NaCl、0.1M：
メルカプトエタノール、６ｍＭ：10ユニツトの
EcoRI）中で２時間、37℃で作用させてpBR
322DNA中に１ケ所存在する切断部位を切断し、
これにフアージλ由来のエキソヌクレアーゼを
200μの反応液（DNA、10μｇ：Na−グリシ
ン、PH9.5、0.1M：MgCl2、５ｍＭ：アルブミン、
50μｇ／ml：λエキソヌクレアーゼ、17.5ユニツ
ト）中で90分間０℃で反応させ、フエノールで除
蛋白した後、ターミナルトランスフエラーゼを
50μの反応液〔DNA、10μｇ：カコジル酸カ
リ、PH7.6、0.14M：Tris（塩基）、0.03M：ジチオ
スレイトール0.1ｍＭ：CoCl2.1ｍＭ、dTTP、１
ｍＭ：２ユニツトのターミナルトランスフエラー
ゼ〕中で20分間37℃で作用させ上記プラスミド
pBR322DNAの3′両端に約100個のデオキシチミジ
ン鎖を延長させた。 このようにして得られた合成二重鎖DNA0.02μ
ｇと上記プラスミドpBR322DNA0.1μｇを0.1M
NaCl、50ｍＭ Tris−HCl PH7.5、５ｍＭ
EDTAよりなる溶液中で、65℃で２分、45℃で
１時間、37℃で１時間、室温で１時間インキユベ
ートして会合させ、Eneaらの方法に従つて大腸
菌χ1776を形質転換させた。 このようにして約4000のアンピシリン耐性株が
単離された。このなかから、3600の耐性株を選び
各々のDNAを２枚のニトロセルロースフイルタ
ーの上に固定した（Grunstein−Hogness法）。 一方、上述のようにして抽出し、部分純化した
インターフエロンmRNA分画（約10μｇ）を鋳型
とし逆転写酵素により上述の単鎖DNA合成方法
と同じようにして（但し、dCTPは22Pで標識さ
れたものである。）〔22P〕で標識した単鎖DNAを
合成した（約0.44μｇ、Spec.radio act.約６×10
c.p.m.／μｇ）。このDNAをpnly(I)(C)で誘導しな
いヒト線維芽細胞から、poly(I)(C)で誘導した
mRNAを抽出するのと同じ方法で抽出した
mRNA25μｇと50μの反応液（25μｇ
mRNA：0.45μｇ22Pで標識した単鎖DNA：
NaCl、0.5M：Pipes緩衝液、PH6.5、25ｍＭ）中
で65℃で40時間反応させることにより会合させ
た。このものをハイドロキシアパタイトカラムに
かけて、まず0.14Mのリン酸緩衝液（PH6.5）で
単鎖DNAを溶出、つぎに0.4Mの同緩衝液で
RNAに会合したDNAを溶出することによつて、
上記mRNAとハイブリツドを形成したDNA（全
体の約90％）（ProbeA）とハイブリツドを形成
しなかつたDNA（全体の約10％）（ProbeB）に分
離した。 この各々のProbeを使つてGrunstein−
Hognessの方法に従つて上記のニトロセルロース
フイルター上に固定したDNAに会合させた。そ
してオートラジオグラフイーによつてProbeAに
は少ししか反応せず、ProbeBに反応する菌株を
４個単離した。第２表はこの４個の菌株のオート
ラジオグラムによるProbeと菌株内DNAとの反
応度の差異を示す。
反応液〔5μｇのmRNA：0.5ｍMdATP；0.5ｍ
MdTTP；0.5ｍMdGTP；0.5ｍMdCTP1μｇの
oligo（dT）：８ユニツトの逆転写酵素；MgCl2、
５ｍＭ：NaCl、30ｍＭ：メルカプトエタノール、
５ｍＭ：Tris−HCl、PH8.0、40ｍＭ〕中で37℃
で１時間インキユベートした後に、フエノールに
よつて除蛋白し、0.3NのNaOHで37℃で15時間
処理してRNAを除いた後、合成された単鎖DNA
を20μの反応液〔mRNAとoligo（dT）を含ま
ない以外は上記と同じ反応液〕中で反応（37℃、
１時間インキユベーシヨン）させることによつて
1.5μｇの二重鎖DNAを合成した。 この二重鎖合成DNAにヌクレアーゼS1を50μ
の反応液（1.5μｇ二重鎖DNA：ZnCl2、１ｍ
Ｍ：酢酸ナトリウム、PH4.5、0.1M：NaCl、
0.2M、0.05ユニツトのS1）中で30分間37℃で作
用させ、フエノールで除蛋白し、エタノールで
DNAを沈澱させた後、これにターミナルトラン
スフエラーゼを20μの反応液〔DNA、1.5μｇ：
カコジル酸カリ、PH7.6、0.14M：Tris（塩基）、
0.03M：ジチオスレイトール、0.1ｍＭ：CoCl2、
１ｍＭ：dATP、１ｍＭ：１ユニツト、ターミナ
ルトランスフエラーゼ〕中で20分間、37℃で作用
させ二重鎖DNAの3′両端に約100個のデオキシア
デニン鎖を延長させた。 一方、10μｇの大腸菌プラスミドpBR322DNAに
制限酵素EcoRIを100μの反応液（Tris−HCl、
PH7.5、10ｍＭ：MgCl2、６ｍＭ：NaCl、0.1M：
メルカプトエタノール、６ｍＭ：10ユニツトの
EcoRI）中で２時間、37℃で作用させてpBR
322DNA中に１ケ所存在する切断部位を切断し、
これにフアージλ由来のエキソヌクレアーゼを
200μの反応液（DNA、10μｇ：Na−グリシ
ン、PH9.5、0.1M：MgCl2、５ｍＭ：アルブミン、
50μｇ／ml：λエキソヌクレアーゼ、17.5ユニツ
ト）中で90分間０℃で反応させ、フエノールで除
蛋白した後、ターミナルトランスフエラーゼを
50μの反応液〔DNA、10μｇ：カコジル酸カ
リ、PH7.6、0.14M：Tris（塩基）、0.03M：ジチオ
スレイトール0.1ｍＭ：CoCl2.1ｍＭ、dTTP、１
ｍＭ：２ユニツトのターミナルトランスフエラー
ゼ〕中で20分間37℃で作用させ上記プラスミド
pBR322DNAの3′両端に約100個のデオキシチミジ
ン鎖を延長させた。 このようにして得られた合成二重鎖DNA0.02μ
ｇと上記プラスミドpBR322DNA0.1μｇを0.1M
NaCl、50ｍＭ Tris−HCl PH7.5、５ｍＭ
EDTAよりなる溶液中で、65℃で２分、45℃で
１時間、37℃で１時間、室温で１時間インキユベ
ートして会合させ、Eneaらの方法に従つて大腸
菌χ1776を形質転換させた。 このようにして約4000のアンピシリン耐性株が
単離された。このなかから、3600の耐性株を選び
各々のDNAを２枚のニトロセルロースフイルタ
ーの上に固定した（Grunstein−Hogness法）。 一方、上述のようにして抽出し、部分純化した
インターフエロンmRNA分画（約10μｇ）を鋳型
とし逆転写酵素により上述の単鎖DNA合成方法
と同じようにして（但し、dCTPは22Pで標識さ
れたものである。）〔22P〕で標識した単鎖DNAを
合成した（約0.44μｇ、Spec.radio act.約６×10
c.p.m.／μｇ）。このDNAをpnly(I)(C)で誘導しな
いヒト線維芽細胞から、poly(I)(C)で誘導した
mRNAを抽出するのと同じ方法で抽出した
mRNA25μｇと50μの反応液（25μｇ
mRNA：0.45μｇ22Pで標識した単鎖DNA：
NaCl、0.5M：Pipes緩衝液、PH6.5、25ｍＭ）中
で65℃で40時間反応させることにより会合させ
た。このものをハイドロキシアパタイトカラムに
かけて、まず0.14Mのリン酸緩衝液（PH6.5）で
単鎖DNAを溶出、つぎに0.4Mの同緩衝液で
RNAに会合したDNAを溶出することによつて、
上記mRNAとハイブリツドを形成したDNA（全
体の約90％）（ProbeA）とハイブリツドを形成
しなかつたDNA（全体の約10％）（ProbeB）に分
離した。 この各々のProbeを使つてGrunstein−
Hognessの方法に従つて上記のニトロセルロース
フイルター上に固定したDNAに会合させた。そ
してオートラジオグラフイーによつてProbeAに
は少ししか反応せず、ProbeBに反応する菌株を
４個単離した。第２表はこの４個の菌株のオート
ラジオグラムによるProbeと菌株内DNAとの反
応度の差異を示す。
【表】
上記４個の菌株の各々の菌体からプラスミド
DNAをCurrierとNesterの方法〔Analyt.
Biochem.Vol.76、p.431−441（1976）〕によつて
単離した。次にこれらのDNAをインターフエロ
ンmRNAと以下の様にして会合させた。 先ず、5μｇのプラスミドDNAを制限酵素Hind
〔フエモフイルス・インフルエンザRd
（Haemophilus influenzae Rd）から得ることが
できる〕と50μの反応液（Tris−HCl、PH7.5、
10ｍＭ：MgCl2、６ｍＭ：NaCl、50ｍＭ、メル
カプトエタノール、６ｍＭ：５ユニツトのHind
）中で２時間37℃でインキユベートすることに
より制限酵素Hindで切断し、フエノールで除
蛋白した後、エタノールで沈澱させ、これを20μ
の80％（Ｗ／Ｖ）ホルムアミドに溶かし、85℃
で10分間熱変性させた後、2.5μｇのmRNAと20μ
の80％（Ｗ／Ｖ）ホルムアミド、20ｍＭ
Pipes緩衝液PH6.5、0.4M NaCl、５ｍＭ
EDTAよりなる溶液中で53℃においてインキユ
ベートした。 ４時間後、これに0.4mlの３×SSC（１×SSCは
0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）と０
℃において混合し、ニトロセルロースフイルター
（直径１cm、0.45μｍポアーサイズ）で１分当り約
0.5mlの速度で過した。フイルターに更に約1.5
mlの２×SSCを加えて過した後、そのフイルタ
ーを0.6mlの90％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、20ｍ
Ｍ Pipes緩衝液、0.1％SDS（ソジウムドデシル
サルフエート）、５ｍＭ EDTAよりなる溶液中
に浸した。そのフイルターを60℃で２分間インキ
ユベートし、溶液を取除くといつた操作を３回く
り返し、溶液（1.8ml）中にニトロセルロースフ
イルターから溶出されたRNAをエタノールで沈
澱させた。このRNAを上記のようにしてoligo
（dT）セルロースカラムクロマトグラフイーする
ことによりpolyAを持つmRNAを分離し、3μ
の10ｍＭ Tris−HCl、PH7.5：88ｍＭ NaCl溶
液にとかし、アフリカツメガエルの卵母細胞に注
入し、合成される蛋白中のインターフエロン活性
（抗ウイルス活性）を測定した。 上記４個の菌株から取り出したDNAとハイブ
リツドを形成したmRNAにおけるインターフエ
ロンmRNA活性は第３表に示す通りである。
DNAをCurrierとNesterの方法〔Analyt.
Biochem.Vol.76、p.431−441（1976）〕によつて
単離した。次にこれらのDNAをインターフエロ
ンmRNAと以下の様にして会合させた。 先ず、5μｇのプラスミドDNAを制限酵素Hind
〔フエモフイルス・インフルエンザRd
（Haemophilus influenzae Rd）から得ることが
できる〕と50μの反応液（Tris−HCl、PH7.5、
10ｍＭ：MgCl2、６ｍＭ：NaCl、50ｍＭ、メル
カプトエタノール、６ｍＭ：５ユニツトのHind
）中で２時間37℃でインキユベートすることに
より制限酵素Hindで切断し、フエノールで除
蛋白した後、エタノールで沈澱させ、これを20μ
の80％（Ｗ／Ｖ）ホルムアミドに溶かし、85℃
で10分間熱変性させた後、2.5μｇのmRNAと20μ
の80％（Ｗ／Ｖ）ホルムアミド、20ｍＭ
Pipes緩衝液PH6.5、0.4M NaCl、５ｍＭ
EDTAよりなる溶液中で53℃においてインキユ
ベートした。 ４時間後、これに0.4mlの３×SSC（１×SSCは
0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）と０
℃において混合し、ニトロセルロースフイルター
（直径１cm、0.45μｍポアーサイズ）で１分当り約
0.5mlの速度で過した。フイルターに更に約1.5
mlの２×SSCを加えて過した後、そのフイルタ
ーを0.6mlの90％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、20ｍ
Ｍ Pipes緩衝液、0.1％SDS（ソジウムドデシル
サルフエート）、５ｍＭ EDTAよりなる溶液中
に浸した。そのフイルターを60℃で２分間インキ
ユベートし、溶液を取除くといつた操作を３回く
り返し、溶液（1.8ml）中にニトロセルロースフ
イルターから溶出されたRNAをエタノールで沈
澱させた。このRNAを上記のようにしてoligo
（dT）セルロースカラムクロマトグラフイーする
ことによりpolyAを持つmRNAを分離し、3μ
の10ｍＭ Tris−HCl、PH7.5：88ｍＭ NaCl溶
液にとかし、アフリカツメガエルの卵母細胞に注
入し、合成される蛋白中のインターフエロン活性
（抗ウイルス活性）を測定した。 上記４個の菌株から取り出したDNAとハイブ
リツドを形成したmRNAにおけるインターフエ
ロンmRNA活性は第３表に示す通りである。
【表】
更に菌株＃319のDNAを用いて次の実験を行な
つた。 菌株＃319からCurrierとNesterの方法により
得た5μｇのプラスミドDNAを制限酵素Hindで
上記と同様にして切断し、ウサギβグロビン遺伝
子をもつ組換えプラスミドβGpBR322DNA（ベク
ターはpBR322）（チユーリツヒ大学分子生物学
研究所から入手）を混合しもしくはこれらを別
個に、ウサギグロビンmRNA（ウサギ赤血球から
得ることができる）（1μｇ）とヒト線維芽細胞か
ら得たインターフエロンmRNA（2.5μｇ）との混
合体に、上述と同様の条件で会合させ、ハイブリ
ツドと形成したmRNAをアフリカツメガエルの
卵母細胞に注入し、卵母細胞を3Hでラベルした
ヒスチジンを含む液（Barthの培養液に15時間イ
ンキユベートすることによつて合成され、3Hでラ
ベルされたβグロビンをアクリルアミドゲル電気
泳動で分離し、フルオログラフイーによつて定量
し、インターフエロンは上記のように抗ウイルス
活性により測定した。それによりウサギβグロビ
ン、ヒトインターフエロンの合成を調べた。その
結果は第４表に示す通りである。
つた。 菌株＃319からCurrierとNesterの方法により
得た5μｇのプラスミドDNAを制限酵素Hindで
上記と同様にして切断し、ウサギβグロビン遺伝
子をもつ組換えプラスミドβGpBR322DNA（ベク
ターはpBR322）（チユーリツヒ大学分子生物学
研究所から入手）を混合しもしくはこれらを別
個に、ウサギグロビンmRNA（ウサギ赤血球から
得ることができる）（1μｇ）とヒト線維芽細胞か
ら得たインターフエロンmRNA（2.5μｇ）との混
合体に、上述と同様の条件で会合させ、ハイブリ
ツドと形成したmRNAをアフリカツメガエルの
卵母細胞に注入し、卵母細胞を3Hでラベルした
ヒスチジンを含む液（Barthの培養液に15時間イ
ンキユベートすることによつて合成され、3Hでラ
ベルされたβグロビンをアクリルアミドゲル電気
泳動で分離し、フルオログラフイーによつて定量
し、インターフエロンは上記のように抗ウイルス
活性により測定した。それによりウサギβグロビ
ン、ヒトインターフエロンの合成を調べた。その
結果は第４表に示す通りである。
【表】
この実験結果から、＃319のDNAはインターフ
エロンmRNAと特異的にハイブリツドを形成す
るDNA（インターフエロン遺伝子）をもつことが
証明された。菌株＃319はEscherichia col
x1776／TpIF319 ATCC39066として米国アメリ
カン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンに寄託
してある。 次に＃319のDNAを数種の制限酵素で切断して
アガロース電気泳動法などにより制限酵素地図を
作成した〔第１図ａ〕。なお、第１図は本実施例
における新規な組換え体プラスミド（＃319−13）
を得るのに使用する組換え体（＃319）のヒト線
維芽細胞インターフエロンmRNAに相補的な部
分、及び新規な組換え体プラスミド（＃319−13）
のヒト線維芽細胞インターフエロンmRNAに相
補的な部分の制限酵素地図である。制限酵素Pst
、BglおよびHind（これらは、例えば米国
Bethesda Research Laboratories社で販売）
は、＃319DNAを第図ａに示す箇所で切断す
る。次いでこの＃319のDNAを制限酵素Pstと
Bglで切断した断片を、例えばTabakと
Flavellの方法〔Nucleic Acids Research、
vol.5、P.2321−2332（1978）〕によつてゲル電気
泳動で分離精製し、これを例えばRigbyらの方法
〔J.Mol.Biol.vol.113、P.237−251、（1977）〕によ
つて32Pで標識し、これを探針として、先に述べ
たGrunstein Hogness法〔Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A vnl.72、P.3961−3965、（1975）〕（一名コ
ロニ−ハイブリダイゼーシヨン法と云う）によつ
て、先に述べた方法により分離したアンピシリン
耐性株の中より、この探針と相補性をもつプラス
ミドを含んだ株を多数分離した。これらの分離し
た株のそれぞれにより先に述べたCurrier−
Nesterの方法によりプラスミドDNAを抽出し
て、挿入部をHindなどの制限酵素により切り
出し、その挿入部の長さを分離した株間において
比較することにより最も長い断片を含むものをえ
らび、このプラスミドを＃319−13と名づけた。 このプラスミドの制限酵素地図を第図ｂに示
す。この地図は、この新しいプラスミドが、
＃319と同じ配列に加えて、より長いmRNA配列
を持つている事を暗示している。そこで次にこの
＃319−13プラスミドに挿入されたmRNA配列の
一次構造（塩基配列）をMaxam−Gilbertの方法
〔Proc.Natl.Acad.Sci−U.S.A.vol.74、P.560−
564（1977）〕によつて決定した。その一次構造は
下記のとおりである。
エロンmRNAと特異的にハイブリツドを形成す
るDNA（インターフエロン遺伝子）をもつことが
証明された。菌株＃319はEscherichia col
x1776／TpIF319 ATCC39066として米国アメリ
カン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンに寄託
してある。 次に＃319のDNAを数種の制限酵素で切断して
アガロース電気泳動法などにより制限酵素地図を
作成した〔第１図ａ〕。なお、第１図は本実施例
における新規な組換え体プラスミド（＃319−13）
を得るのに使用する組換え体（＃319）のヒト線
維芽細胞インターフエロンmRNAに相補的な部
分、及び新規な組換え体プラスミド（＃319−13）
のヒト線維芽細胞インターフエロンmRNAに相
補的な部分の制限酵素地図である。制限酵素Pst
、BglおよびHind（これらは、例えば米国
Bethesda Research Laboratories社で販売）
は、＃319DNAを第図ａに示す箇所で切断す
る。次いでこの＃319のDNAを制限酵素Pstと
Bglで切断した断片を、例えばTabakと
Flavellの方法〔Nucleic Acids Research、
vol.5、P.2321−2332（1978）〕によつてゲル電気
泳動で分離精製し、これを例えばRigbyらの方法
〔J.Mol.Biol.vol.113、P.237−251、（1977）〕によ
つて32Pで標識し、これを探針として、先に述べ
たGrunstein Hogness法〔Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A vnl.72、P.3961−3965、（1975）〕（一名コ
ロニ−ハイブリダイゼーシヨン法と云う）によつ
て、先に述べた方法により分離したアンピシリン
耐性株の中より、この探針と相補性をもつプラス
ミドを含んだ株を多数分離した。これらの分離し
た株のそれぞれにより先に述べたCurrier−
Nesterの方法によりプラスミドDNAを抽出し
て、挿入部をHindなどの制限酵素により切り
出し、その挿入部の長さを分離した株間において
比較することにより最も長い断片を含むものをえ
らび、このプラスミドを＃319−13と名づけた。 このプラスミドの制限酵素地図を第図ｂに示
す。この地図は、この新しいプラスミドが、
＃319と同じ配列に加えて、より長いmRNA配列
を持つている事を暗示している。そこで次にこの
＃319−13プラスミドに挿入されたmRNA配列の
一次構造（塩基配列）をMaxam−Gilbertの方法
〔Proc.Natl.Acad.Sci−U.S.A.vol.74、P.560−
564（1977）〕によつて決定した。その一次構造は
下記のとおりである。
【表】
重要なことは、この中にKnightら〔Science
vol.207、P.525−526、（1980）〕によつて既に発
表されたヒト線維芽細胞インターフエロンのアミ
ノ末端から13個迄のアミノ酸配列に相当する塩基
配列（遺伝暗号三連子による）が一つの誤りもな
く存在する事であり、これによつて＃319−13プ
ラスミドが間違いなく、ヒト線維芽細胞インター
フエロンのmRNA配列を持つている事が証明さ
れる。又、この一次配列のデータから、このプラ
スミドは上記mRNAの蛋白質をコードする部分
を全部持つており、恐らくシグナルペプチドと考
えられる部分をコードする配列も含んでいること
が明らかとなつた。 この事は、このプラスミド又はそれに挿入され
たmRNA配列が、それを他の表現プラスミド
（expression plasmid）に移すことによつて、大
腸菌などの宿主にインターフエロンを生産させる
事が可能である事を示すものである。＃319−13
プラスミドを含む大腸菌菌株はEscherichia coli
x1776／TpIF319−13 ATCC31712として米国ア
メリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンに
寄託してある。
vol.207、P.525−526、（1980）〕によつて既に発
表されたヒト線維芽細胞インターフエロンのアミ
ノ末端から13個迄のアミノ酸配列に相当する塩基
配列（遺伝暗号三連子による）が一つの誤りもな
く存在する事であり、これによつて＃319−13プ
ラスミドが間違いなく、ヒト線維芽細胞インター
フエロンのmRNA配列を持つている事が証明さ
れる。又、この一次配列のデータから、このプラ
スミドは上記mRNAの蛋白質をコードする部分
を全部持つており、恐らくシグナルペプチドと考
えられる部分をコードする配列も含んでいること
が明らかとなつた。 この事は、このプラスミド又はそれに挿入され
たmRNA配列が、それを他の表現プラスミド
（expression plasmid）に移すことによつて、大
腸菌などの宿主にインターフエロンを生産させる
事が可能である事を示すものである。＃319−13
プラスミドを含む大腸菌菌株はEscherichia coli
x1776／TpIF319−13 ATCC31712として米国ア
メリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨンに
寄託してある。
第１図は実施例における新規な組換え体プラス
ミド（＃319−13）を得るのに使用する組み換え
体（＃319）のヒト線維芽細胞インターフエロン
mRNAに相補的な部分、及び新規な組換え体プ
ラスミド（＃319−13）のヒト線維芽細胞インタ
ーフエロンmRNAに相補的な部分の制限酵素地
図である。
ミド（＃319−13）を得るのに使用する組み換え
体（＃319）のヒト線維芽細胞インターフエロン
mRNAに相補的な部分、及び新規な組換え体プ
ラスミド（＃319−13）のヒト線維芽細胞インタ
ーフエロンmRNAに相補的な部分の制限酵素地
図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒト線維芽細胞インターフエロンメツセンジ
ヤーRNAを鋳型として合成した下記配列に含ま
れるDNAをベクタープラスミドDNAに挿入し
た、ヒト線維芽細胞インターフエロンメツセンジ
ヤーRNAの少くとも全コード部分を有する遺伝
子を持つ新規な組換え体プラスミド。 【表】 ２ 組換え体プラスミドが組換え大腸菌プラスミ
ドDNAである特許請求の範囲第１項に記載の新
規な組換え体プラスミド。
Priority Applications (14)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3393180A JPS56131598A (en) | 1980-03-19 | 1980-03-19 | Novel recombinant plasmid having gene of human fibroblastic interferon messenger rna |
| AU63762/80A AU538665B2 (en) | 1979-10-30 | 1980-10-28 | Human interferon dna |
| DK458480A DK458480A (da) | 1979-10-30 | 1980-10-29 | Dna, recombinant plasmid og mikroorganisme indeholdende dette samt fremgangsmaader til fremstilling deraf |
| IL61366A IL61366A (en) | 1979-10-30 | 1980-10-29 | Dna with interferon activity,recombinant plasmids containing it,microorganisms prepared therewith and methods for the preparation thereof |
| NO803230A NO158950C (no) | 1979-10-30 | 1980-10-29 | Dna-sekvens som koder for et polypeptid med human fibroblast-interferonaktivitet, fremgangsmaate for dens fremstilling, samt fremgangsmaate for fremstilling av et plasmid. |
| AT80106685T ATE18072T1 (de) | 1979-10-30 | 1980-10-30 | Doppelstraengige dns, welche fuer ein polypeptid mit der aktivitaet von menschlichem fibroblasten- interferon codiert, clonierte dns, rekombinantes plasmid, welches die dns enthaelt, und mikroorganismus, welcher das rekombinante plasmid enthaelt. |
| DE8080106685T DE3071435D1 (en) | 1979-10-30 | 1980-10-30 | Double-stranded dna which codes for a polypeptide with human fibroblast interferon activity, cloned dna, recombinant plasmid containing the dna and microorganism containing the recombinant plasmid |
| EP80106685A EP0028033B1 (en) | 1979-10-30 | 1980-10-30 | Double-stranded dna which codes for a polypeptide with human fibroblast interferon activity, cloned dna, recombinant plasmid containing the dna and microorganism containing the recombinant plasmid |
| CA000363628A CA1341563C (en) | 1979-10-30 | 1980-10-30 | Dna coding for human fibroblast interferon polypeptide and recombinant plasmid |
| ES496426A ES8203102A1 (es) | 1979-10-30 | 1980-10-30 | Un procedimiento para la preparacion de un adn que codifica un polipeptido con actividad de interferon. |
| ES507596A ES8303530A1 (es) | 1979-10-30 | 1981-11-30 | Un procedimiento para la preparacion de un microorganismo que contiene un plasmido recombinante de un adn |
| ES507595A ES8303529A1 (es) | 1979-10-30 | 1981-11-30 | Un procedimiento para la produccion de un plasmido recombi- nante. |
| US08/400,179 US5514567A (en) | 1979-01-30 | 1995-03-06 | DNA and recombinant plasmid |
| US08/463,757 US9376478B1 (en) | 1979-10-30 | 1995-06-05 | DNA and recombinant plasmid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3393180A JPS56131598A (en) | 1980-03-19 | 1980-03-19 | Novel recombinant plasmid having gene of human fibroblastic interferon messenger rna |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56131598A JPS56131598A (en) | 1981-10-15 |
| JPH0129557B2 true JPH0129557B2 (ja) | 1989-06-12 |
Family
ID=12400254
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3393180A Granted JPS56131598A (en) | 1979-01-30 | 1980-03-19 | Novel recombinant plasmid having gene of human fibroblastic interferon messenger rna |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS56131598A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0041313B1 (en) | 1980-04-03 | 1990-09-12 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human fibroblast interferon |
| IE54592B1 (en) * | 1982-03-08 | 1989-12-06 | Genentech Inc | Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL58765A (en) * | 1979-11-21 | 1986-09-30 | Yeda Res & Dev | Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta |
-
1980
- 1980-03-19 JP JP3393180A patent/JPS56131598A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS56131598A (en) | 1981-10-15 |
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