JPH0321151B2 - - Google Patents

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JPH0321151B2
JPH0321151B2 JP61182054A JP18205486A JPH0321151B2 JP H0321151 B2 JPH0321151 B2 JP H0321151B2 JP 61182054 A JP61182054 A JP 61182054A JP 18205486 A JP18205486 A JP 18205486A JP H0321151 B2 JPH0321151 B2 JP H0321151B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の要約〕 組替えDNA分子、それらにより形質転換され
かつひとインターフエロンの生物学的もしくは免
疫学的活性を示すポリペプチドを生産する宿主お
よびこれらポリペプチドをコードするDNA配列
につき開示する。DNA配列は、ひとインターフ
エロンの生物学的もしくは免疫学的活性を示すポ
リペプチドをコードすることを特徴とする。適当
な宿主において、これらのDNA配列および組替
えDNA分子は、ひとインターフエロンの生物学
的もしくは免疫学的活性を示す遺伝子およびポリ
ペプチドの生産および同定を可能にすると共に、
抗ウイルスおよび抗腫瘍もしくは抗癌剤における
その使用を可能にする。 本発明は、DNA配列、組替えDNA分子ならび
にインターフエロンおよびインターフエロン様ポ
リペプチドを産生するよう形質転換された宿主に
関するものである。本明細書中に開示する組替え
DNA分子は、ひと白血球インターフエロンの免
疫学的もしくは生物学的活性を有するポリペプチ
ドをコードするDNA配列を特徴とする。以下の
記載から明らかになるように、本発明のDNA配
列、組替えDNA分子およびその製造方法は、抗
ウイルス剤および抗腫瘍もしくは抗癌剤ならびに
その製造方法に有用なポリペプチドを製造するの
に使用することができる。 本出願においては、ネイチヤー誌第286巻、第
2421頁（1980年７月10日）に発表されたインター
フエロンという名称を使用する。この名称によ
り、本出願の優先権となる原出願において使用さ
れた名称を置き換える。たとえば、IFはここで
はIFNで表わされ、白血球インターフエロンはこ
こではIFN−αで表わされる。 インターフエロン（“IFN”）は２種類存在する
ことが知られている。種類Ｉのインターフエロン
は小さい酸安定性の（グリコ）−蛋白質であつて、
細胞をウイルス感染耐性にするものである〔エ
ー・イサークスおよびジエー・リンデンマン「ウ
イルス干渉Ｉ。インターフエロン」、プロシーデ
イング・ロイヤル・ソサイエテイ・シリーズＢ、
第147巻、第258〜267頁（1957）およびダブリユ
ー・イー・スチユアート・、「ザ・インターフ
エロン・システム」、スプリンガー出版（1979）
（以下、「ザ・インターフエロン・システム」と云
う）〕。IFNは、或る程度細胞特異性である（ザ・
インターフエロン・システム第135〜145頁）が、
ウイルス特異性でない。寧ろ、IFNは広範囲のウ
イルスに対して細胞を保護する。 ひとインターフエロン（“HuIFN”）は３つの
群α，βおよびγに分類されている。HuIFN−
αすなわち白血球インターフエロンはひと白血球
中において、リンパ芽球細胞中の少量のHuIFN
−β（繊維芽細胞インターフエロン）と共に生産
される。HuIFN−αは均質になるまで精製され
かつ特性化されている〔たとえば、エム・ルーベ
ンスタイン等、「ひと白血球インターフエロン：
生産、均質までの精製および初期特性化」、プロ
シーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サイエ
ンスUSA、第76巻、第640〜644頁（1979）〕。こ
れは、恐らく炭水化物成分のため、寸法に関して
は不均質である。２種の成分が記載されており、
その一方は21000〜22000の分子量を有し、他方は
15000〜18000の分子量を有する。低分子量の方の
成分は非グリコシル化型を示すことが報告されて
いる。また、より小さいHuIFN−αの型が
HuIFN−α活性の大部分または全てを保持する
ことも報告されている〔ダブリユー・イー・スチ
ユアート・等、「ひと白血球インターフエロン
の生産および性質に対するグリコシル化抑制剤の
効果」、ビロロジー、第97巻、第473〜476頁
（1979）〕。リンパ芽球細胞からのHuIFN−αのア
ミノ酸配列の一部およびそのアミノ酸組成も報告
されている〔ケー・シー・ズーン等、「ひとリン
パ芽球細胞インターフエロンの主成分のアミノ末
端配列」、サイエンス、第207巻、第527〜528頁
（1980）ならびにエム・ハンカピラーおよびエ
ル・フード、私的通信（1980）〕。 さらに、HuIFN−αは幾つかの異なる型とし
て存在することも報告されている（たとえば、英
国特許出願第2037296A号）。これらの型は、構造
的におよび生理学的に互いに異なつていると思わ
れる。HuIFN−αのこれら型に関し、まだ認め
られた名称は採用されていない。したがつて、本
出願においては、各型を、一般的なHuIFN−α
の名称の後に数字を付して、すなわちHuIFN−
α1またはHuIFN−α3のように記載する。 HuIFN−αは、多くのひと蛋白質と同様に、
多形質である。したがつて、特定個人の細胞はよ
り一般的なHuIFN−α群内におけるHuIFN−α
種を生成することができ、或いはその群内におい
て生理学的には同じであるがその群とはもしくは
その一部である形態とは構造上僅かに異なる形態
を生成することができる。したがつて、HuIFN
−αの蛋白質構造は一般的には良く規定されてい
るが、特定個人はそれと僅かに異なるHuIFN−
αを生成することができ、この対立形質的変化は
恐らくHuIFN−αの種々の形態間における相違
ほど大きいものでない。 HuIFNは、通常、正常もしくは健全な細胞に
は検出されない（ザ・インターフエロン・システ
ム、第55〜57頁）。寧ろ、細胞をIFN誘発体に曝
す結果、蛋白質が生成される。IFN誘発体は一般
にウイルスであるが、性質上非ウイルス性のも
の、たとえば伝然もしくは合成の二重鎖RNA、
細胞内微生物、微生物生成物および各種の化学薬
剤とすることもできる。ひと細胞をウイルス感染
耐性にすべく、これら非ウイルス性誘発体を利用
する多くの試みがなされている〔エス・バロンお
よびエフ・ジアンザニ編、テキサス・レポート・
オン・バイオロジー・アンド・メデイスン、第35
号（「テキサスレポート」）、第528〜540頁
（1977）〕。これらの試みは大して成功を収めてい
ない。寧ろ、現在では外来性HuIFNの使用が好
まれている。 ウイルスおよび腫瘍もしくは癌に対するインタ
ーフエロン治療が、種々異なる投与量にてかつ幾
つかの投与様式にて行なわれている〔ザ・インタ
ーフエロン・システム、第305〜321頁〕。たとえ
ば、インターフエロンは、経口的に或いは接種
（静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内および皮下）に
より、或いは点眼薬、軟膏および噴霧剤の形態で
効果的に投与されている。通常104〜107単位の投
与量で毎日１〜３回投与される。治療程度は、患
者および処置すべき状態に依存する。たとえば、
ウイルス感染は通常数日間乃至２週間にわたり毎
日もしくは１口２回投与することにより処置さ
れ、腫瘍および癌は通常数ケ月乃至数年間にわた
り毎日または１日多数回投与することにより処置
される。勿論、或る患者に対し最も有効な治療
は、投与様式および投与量を選択するにあたり、
たとえば病気、従前の治療およびインターフエロ
ンに対する患者の反応など周知の因子を考慮する
担当医師により決定されねばならない。 抗ウイルス剤として、HuIFNは次の病気を処
置するために使用されている：呼吸器感染症（テ
キサスレポート、第486〜496頁）、単純疱疹性角
膜炎（テキサスレポート、第497〜500頁）、急性
出血性結膜炎（テキサスレポート、第501〜510
頁）、水痘性帯状疱疹（テキサスレポート、第511
〜515頁）、巨大ウイルス感染症（テキサスレポー
ト、第523〜527頁）、およびＢ型肝炎（テキサス
レポート、第516〜522頁）。ザ・インターフエロ
ン・システム、第307〜319頁も参照できる。しか
しながら、抗ウイルス剤としてのIFNの大規模な
使用は、従来入手し得るよりも多量のIFNを必要
とする。 HuIFNは、その抗ウイルス作用に加えて、他
の効果をも有する。たとえば、これはコロニー刺
戟因子の効果に拮抗し、造血性コロニー形成細胞
の成長を抑制し、かつまた顆粒球および大食球先
駆体の正常分化を阻害する（テキサスレポート、
第343〜349頁）。さらに、これはDMSO処理され
たフレンド白血病細胞における赤血球分化を抑制
する（テキサスレポート、第420〜428頁）。また、
HuIFNは、免疫反応の調整に役割を演ずる。抗
原に対する施用の量と時間とに応じて、HuIFN
−αは生体内および試験管内において免疫促進的
にも或いは免疫抑制的にもなりうる（テキサスレ
ポート、第357〜369頁）。さらに、特異的に感応
されたリンパ芽細胞は、抗原に接触すると、
HuIFN−αを生成することが観察された。した
がつて、この種の抗原誘発されたHuIFN−αは
免疫反応の調節体となり、循環抗原レベルと細胞
免疫性の発現との両者に作用することができる
（テキサスレポート、第370〜374頁）。さらに、
HuIFNはキラーリンパ球の活性および抗体依存
性の細胞媒介される細胞毒性を高めることも知ら
れている〔アール・アール・ハーバーマン等、
「ひと天然および抗体依存性細胞媒介細胞毒性の
インターフエロンによる促進」、ネイチヤー誌、
第277巻、第221〜223頁（1979）；ピー・ビバリー
およびデイー・ナイト、「死亡は自然に起こる」、
ネイチヤー誌、第278巻、第119〜120頁（1979）；
テキサスレポート、第375〜380頁〕。これらの両
種類は恐らく、腫瘍細胞に対する免疫学的攻撃に
含まれる。 したがつて、ひと抗ウイルス剤としての使用に
加え、HuIFNは抗腫瘍および抗癌治療において
有力な用途を有する（ザ・インターフエロン・シ
ステム、第319〜321頁）。現在、IFNは多くの動
物における多くの種類の腫瘍の成長に影響を与え
ることが知られている（ザ・インターフエロン・
システム、第292〜304頁）。それらは、他の抗腫
瘍剤と同様、小腫瘍に対して使用された場合、特
に効果的であると思われる。動物IFNの抗腫瘍効
果は投与量と時間とに左右されるが、これは毒性
レベル以下の濃度で示されたものである。したが
つて、IFNの抗腫瘍および抗癌性につき多くの研
究および臨床試験が過去に行なわれ、、現在も行
なわれ続けている。これらには、たとえば骨肉
腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫およびホジ
キンス病のような幾つかの悪性疾患の処置が包含
される（テキサスレポート、第429〜435頁）。さ
らに、HuIFNは、黒腫症および胸部癌に侵され
た患者における皮下腫癌結節に注射すると、局部
腫瘍退化をしたらすことが最近示された〔テイ
ー・ネモト等、「黒腫症および胸部癌のひとイン
ターフエロンおよび内部治療」、アメリカン・ア
ソシエーシヨン・フオー・カンサー・リサーチ、
アブストラクト、第994号第246頁（1979）〕。これ
ら臨床試験の結果は好ましいものであつたが、
IFNの抗腫瘍および抗癌用途は、精製IFNの充分
な供給が得られないため、著しく妨げられてい
る。 今日、HuIFN−αは、組織培養で増殖させた
ひと細胞を介して、或いは供血者から集めたひと
白血球を介して生産される。2.6×109IUの粗製
HuIFN−αが800の培養ナマルバ（Namalva）
細胞から得られることが報告されている（ピー・
ジエー・ブリツジエン等、上記）。極めて大きな
血液センター、たとえばフインランド国ヘルシン
キ在のフインランド赤十字センターでは、その生
産能力は年間約1011IUの粗製HuIFN−αである。
投与量は典型的には１患者当り毎日３×106IUで
あるから、これら供給源はHuIFN−αの必要市
販量をまかなうには不充分である。したがつて、
他の方法によるHuIFN−αの生産が望まれる。
IFN−αの比活性は高く、4.0×108〜109IU／mg
の程度であるため、一般用途に必要とされる
HuIFN−αの量は少なくなる。たとえば、100g
の純HuIFN−αは３〜30×100万回の投与量をま
かなうであろう。 分子生物学における最近の進歩により、特異性
の非細菌性成熟核蛋白質をコード化するDNAを
細菌細胞中に導入することが可能となつた。一般
に、化学合成により製造されたもの以外のDNA
によれば、この種の組替えDNA分子の製造は、
所望蛋白質に対する精製メツセンジヤーRNA
（mRNA）離型の単一鎖DNAコピー（cDNA）
を生成させ、このcDNAを二重鎖DNAに変え、
このDNAを適当なクローン化ベヒクルにおける
適当な部位に結合させて組替えDNA分子を形成
させかつこの組替えDNA分子により適当な宿主
を形質転換させるという過程からなつている。こ
のような形質転換は、宿主が所望蛋白質を生産す
るのを可能にする。 数種の非細菌性蛋白質および遺伝子が、大腸菌
（イー・コリ）において組替えDNA技術を用いて
得られている。これらには、ラツテプロインシユ
リン抗原決定因子を示す蛋白質〔エル・ピラーカ
マロフ等、「プロインシユリンを合成する細菌ク
ローン」、プロシーデイング・ナシヨナル・アカ
デミー・サイエンス・USA、第75巻、第3727〜
3731頁（1978）〕、ラツテ成長ホルモン〔ピー・エ
ツチ・シーブルグ等、「細菌による成長ホルモン
の合成」、ネイチヤー誌、第276巻、第795〜798頁
（1978）〕、ねずみジヒドロ葉酸レダクターゼ〔エ
ー・シー・ワイ・チヤング等、「ねずみジヒドロ
葉酸レダクターゼを暗号化するDNA配列の、大
腸菌（イー・コリ）における発現型」、ネイチヤ
ー誌、第275巻、第617〜624頁（1978）〕、ひとソ
マトスタチン〔ケー・イタクラ等、「ソマトスタ
チンホルモンに対する化学合成遺伝子の大腸菌に
おける発現」、サイエンス誌、第198巻、第1056〜
1063頁（1977）、およびヨーロツパ特許出願第
0001929号、第0001930号および第0001931号なら
びに他国における対応出願〕、ひとインシユリン
のＡおよびＢポリペプチド鎖〔デイー・ヴイー・
ゲデル等、「ひとインシユリンに対する化学合成
遺伝子の大腸菌における発現」、プロシーデイン
グ・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス・
USA、第76巻、第106〜110頁（1979）、ならびに
ヨーロツパおよび関連特許出願明細書（上記）〕、
ひとＢ型肝炎ウイルスの抗原〔シー・ジエー・バ
レル等、「プラスミドpBR322においてクローン
化されたＢ型肝炎ウイルスDNA配列：大腸菌に
おける発現」、ネイチヤー誌、第279巻、第43〜47
頁（1979）ならびにエム・パセク等、「Ｂ型肝炎
ウイルス遺伝子および大腸菌におけるその発現」、
ネイチヤー誌、第282巻、第575〜579頁（1979）〕、
ひと成長ホルモン（デイー・ヴイー・ゲデル等、
「ひと成長ホルモンをコードするDNA配列の大腸
菌における直接的発現」、ネイチヤー誌、第281
巻、第544〜551頁（1979）〕、SV40t抗原（テイ
ー・エム・ロバーツ等、「大腸菌における猿ウイ
ルス40t抗原の合成」、プロシーデイング・ナシヨ
ナル・アカデミー・サイエンス・USA、第76巻、
第5596〜5600頁（1979）〕、ならびにひと繊維芽細
胞インターフエロン（HuIFN−β）〔テイー・タ
ニグチ等、｛ひと繊維芽細胞インターフエロン遺
伝子配列を含有する細菌プラスミドの製造および
同定」、プロシーデイング・ジヤパン・アカデミ
ー、第55巻Ｂ号、第464〜469頁（1979）および私
的通信（1980）〕が包含される。 しかしながら、
これら組替えDNA法のいずれも、本発明におけ
るように、HuIFN−αの合成に向けられていな
い。これが、本発明の目標とする課題である。こ
の解決は、合成遺伝子（たとえばソマトスタチ
ン）を調製するのに必要とされる配列情報を入手
することによる、或いは特定DNA配列の豊富な
細胞型もしくはウイルス（たとえば肝炎ウイルス
抗原）または所望ヒブリドDNAを含有する細菌
クローンの調製および同定を可能にするmRNA
種（たとえばラツテインシユリン）を入手するこ
とによる、或いは所望蛋白質（たとえばねずみジ
ヒドロ葉酸レダクターゼ）を発現する大腸菌宿主
の選択を可能にする系を入手することによる上記
の組替えDNA系におけるようには簡単でない。
さらに、卵母細胞においてHuIFN−β活性（た
とえば、繊維芽細胞インターフエロン）をもたら
すmRNAにポリ（Ａ）RNAからヒブリド化する
ようなDNA配列を含有すると云われるプラスミ
ドの報告は、、何ら役に立たない。また、本発明
の解決法は、純粋もしくはほぼ純粋なHuIFN−
αmRNAをHuIFN−α遺伝子のクローン化前に
調製するための研究報告第18309号、第361〜362
頁（1979）における示唆とは異なる目的を有す
る。 最後に、DNA配列の選択または卵母細胞にお
いてHuIFN活性をもたらすようなmRNAにポリ
（Ａ）RNAからヒブリド化する組替えDNA分子
の調製は、DNA配列または組替えDNA分子のヒ
ブリド挿入物がHuIFNに相当することを示すに
は充分でないことを認めるべきである。寧ろ、
HuIFNの免疫学的もしくは生物学的活性を示す
ポリペプチドの生成によつてのみ、選択DNA配
列もしくは構成組替えDNA分子がHuIFNに相当
することが実際に示される。さらに重要なこと
は、HuIFN作用の後にのみDNA配列、組替え
DNA分子またはそれに関連する配列を用いて本
発明のHuIFNに対応する他の配列を選択しうる
ことが示される点である。 したがつて、組替えDNA技術を使用して
HuIFN−αを生産する問題は上記した方法のい
ずれとも極めて異なることが、上記から判るであ
ろう。ここでは、未知構造の特定DNA配列（適
当な宿主においてHuIFN−αの発現をコードす
る）を、極めて複雑なDNA配列の混合物におい
て見出しかつそこから分離してこれをHuIFN−
αの生産に使用する。さらに、この位置決定およ
び分離の問題は、複合混合物において所望DNA
配列の著しい低濃度が予想されること、および所
望配列を選択しかつ分離するため混合物の多くの
DNA配列を迅速分析する有効手段がないことに
より悪化される。 本発明は、適当な宿主においてHuIFN−αの
発現をコードするDNA配列を決定しかつ分離し
それによりDNA配列と、組替えDNA分子と、宿
主を形質転換させてひと白血球インターフエロン
の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプ
チドを生産する方法とを提供することにより、上
記の問題を解決する。 本発明により、抗ウイルス剤、抗腫瘍または抗
癌剤および方法に使用するための、HuIFN−α
の免疫学的もしくは生物学的活性を示すポリペプ
チドを得ることができる。本発明は、従来不可能
であつた量および方法でこれらポリペプチドの生
産を可能にする。 以下の開示から判るように、本発明のDNA配
列および組替えDNA分子は、HuIFN−αの免疫
学的もしくは生物学的活性を示すポリペプチド
の、適当な宿主における生産を方向付けることが
できる。適当な宿主におけるこれらDNA配列と
組替えDNA分子との複製は、これらポリペプチ
ドをコードする遺伝子を多量に生産することを可
能にする。これらポリペプチドおよび遺伝子の分
子構造および性質は、容易に決定することができ
る。ポリペプチドおよび遺伝子は、宿主で生産さ
れたまま或いは適当な誘導化もしくは改変の後、
組成物中におよびこれら生成物自身の生産を検知
かつ改善する方法に使用することができ、かつ抗
ウイルス剤および抗腫瘍もしくは抗癌剤および方
法に使用することができる。 したがつて、この方法は、上記の従来方法とは
異なり、DNA配列とHuIFN−αの免疫学的もし
くは生物学的活性を示す少なくとも一種のポリペ
プチドをコードする適当なDNA配列を含んだ組
替えDNA分子との調製および選択を含む点にお
いて、上記従来方法と区別できる。 上記から判るように、本発明の基本的局面は、
HuIFNの免疫学的もしくは生物学的活性を示す
ポリペプチドをコードすることを特徴としかつＺ
−pBR322（Pst）／HcIF−4c、Ｚ−pBR322
（Pst）／HcIF−2h、Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF
−SN35、Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−SN42、
Ｚ−KT287（Pst）／HcIF−2h−AH6のDNA挿
入物と、これらDNA挿入物のいずれかにヒブリ
ド化するDNA配列と、これらDNA配列もしくは
挿入物のいずれかに対し単一もしくは多重のベー
ス置換、欠失、挿入および転位を含め突然変異に
関連して得られる天然、合成もしくは半合成の供
給源を包含するあらゆる供給源からのDNA配列
と、前記DNA配列および挿入物のいずれかのコ
ドンの発現においてコードされるポリペプチドに
類似した免疫学的もしくは生物学的活性を発現に
おいてコードするコドンの配列からなるDNA配
列とよりなる群から選択されるDNA配列を提供
することであり、これらの配列は宿主においてイ
ンターフエロンおよびインターフエロン様ポリペ
プチドの生産を可能にする。 ここに記載した本発明をより充分に理解するた
め、以下詳細に説明する。 本明細書中において、次の用語を使用する。 ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐酸塩
と含窒素複素環塩基とからなるDNAもしくは
RNAの単量体単位。塩基は、グルコシド炭素
（ペントースの1′炭素）を介して糖成分に結合さ
れる。塩基と糖との結合体はヌクレオシドと呼ば
れる。各ヌクレオチドはその塩基を特徴とする。
４種のDNA塩基はアデニン（“Ａ”）、グアニン
（“Ｇ”）、シトシン（“Ｃ”）およびチミン（“Ｔ”
）
である。４種のRNA塩基はＡ，Ｇ，Ｃおよびウ
ラシル（“Ｕ”）である。 DNA配列：隣接ペントースの3′炭素と5′炭素
との間のホスホジエステル結合により互いに結合
されたヌクレオチドの線状列。 コドン：mRNAを介してアミノ酸と翻訳開始
信号と翻訳終了信号とをコードする３種のヌクレ
オチド（トリプレツト）のDNA配列。たとえば
ヌクレオチドトリプレツトTTA、TTG、CTT、
CTC、CTAおよびCTGはアミノ酸ロイシン
（“Leu”）をコードし、TAG、TAAおよびTGA
は翻訳停止信号であり、ATGは翻訳開始信号で
ある。 解読枠：アミノ酸配列までmRNAを翻訳する
際のコドンのグループ化。翻訳の際、適切な解読
枠を維持せねばならない。たとえば、配列
GCTGGTTGTAAGは３つの解読枠（すなわち
相）において翻訳することができ、その各々は異
なるアミノ酸配列 GCT GGT TGT AAG−−Ala−Gly−Cys−
Lys Ｇ CTG GTT GTA AG−−Leu−Val−
Val GC TGG TTG TAA Ｇ−−Trp−Leu−（停
止） を与える。 ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−アミノ
基とカルボキシル基との間のペプチド結合により
互いに結合されたアミノ酸の線状列。 ゲノム：細胞もしくはウイルスの全DNA。こ
れは、特に物質のポリペプチドをコードする構造
遺伝子、ならびにオペレータ、プロモータおよび
リボソーム結合ならびにたとえばシヤイン−ダル
ガーノ配列のような配列を含めて相互作用配列を
包含する。 構造遺伝子：雛型もしくはメツセンジヤー
RNA（“mRNA”）を介して、特定ポリペプチド
に特徴的なアミノ酸配列をコードするDNA配列。 転写：構造遺伝子からmRNAを生成する過程。 翻訳：mRNAからポリペプチドを生成する過
程。 発現：ポリペプチドを生成するため構造遺伝子
により受ける過程。これは、転写と翻訳との組合
せである。 プラスミド：完全「レプリコン」からなる非ク
ロモソーム二重鎖DNA配列であり、これにより
プラスミドは宿主細胞内で複製される。プラスミ
ドを単細胞微生物に入れると、その生物の特性が
プラスミドのDNA挿入の結果として変化または
形質転換する。たとえば、テトラサイクリン耐性
（TetR）についての遺伝子を担持するプラスミド
は従前テトラサイクリンに感受性であつた細胞を
これに対し抵抗性の細胞に形質転換させる。プラ
スミドにより形質転換された細胞を「（形質転換
体）」と呼ぶ。 フアージまたはバクテリオフアージ：細菌性ウ
イルスであり、その多くは蛋白質エンベロプもし
くは被覆（「カプシド」）中にカプセル化された
DNA配列からなつている。 クローン化ベヒクル（cloning vehicle）：宿主
細胞中で複製しうるプラスミド、フアージDNA
またはその他のDNA配列であり、これは１個ま
たは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特徴と
し、この部位においてこのDNA配列はDNAの本
質的な生物学的機能（たとえば再現性）、被覆蛋
白質の生成の喪失またはプロモータもしくは結合
部位の喪失を伴わずに決定可能に切断され、また
この部位は形質転換細胞の同定（たとえばテトラ
サイクリン耐性またはアンピシリン耐性）に使用
するのに適する標識を有する。クローン化ベヒク
ルはしばしばベクター（Vector）と呼ばれる。 クローン化：微生物またはDNA配列の増殖を
得る過程であつて、無性増殖によりこの種の一種
の微生物または配列から得られる。 組替えDNA分子すなわちヒブリドDNA：生体
細胞の外部で末端−末端結合されかつ宿主細胞に
感染してそこに維持される能力を有する、異なる
ゲノムからのDNA断片よりなる分子。 発現制御配列：構造遺伝子と作用結合した場合
これら遺伝子の発現を制御および調整するヌクレ
オチドの配列。それらには、lac系、trp系、フア
ージλの主要オペレータおよびプロモータ領域、
fdコート蛋白質の制御領域ならびに原核もしくは
真核細胞およびウイルスの遺伝子の発現を制御す
ることが知られたその他の配列が包含される。 第１図について述べれば、これは組替えDNA
分子の混合物の製造方法における一実施態様の概
略図であり、ここで組替えDNA分子の幾つかは
ひと白血球インターフエロンの免疫学的もしくは
生物学的活性を有するポリペプチドをコードする
挿入DNA配列を特徴とする。 ひとインターフエロンmRNA（IFN−
αmRNA）を含有するポリ（Ａ）RNAの製造 センダイ（Sendai）ウイルスを用いてひと白
血球を37℃で５時間誘発させ、次いで抽出してひ
と白血球インターフエロンmRNA（“HuIFN−
αmRNA”）含有するポリ（Ａ）RNA混合物を得
た。誘発はカンテル法によつて行なつた〔ザ・イ
ンターフエロン・システム、第130〜131頁および
そこに挙げられた引用文献〕。ポリ（Ａ）RNA混
合物を、その実際の割合とは無関係に第１図に示
す。誘発白血球を収穫し、1011個の細胞を水１
中NaCl8gとKC1 0.2gとNa2HPO4・2H2O1.15g
とKH2PO40.2gとを溶解含有する溶液（“PBP”）
１に再懸濁させ、これを激しく攬拌しながら50
分液濾斗中の20mMトリス−HC1（pH7.5）と
1mM EDTA（“TE緩衝液”）と２％ドデシル硫酸
ナトリウム（“SDS”）の17に加えた。自己消化
したプロナーゼ（カルビオケム社）を200μg／ml
まで加え、そしてこの溶液を室温で１時間攬拌し
た。106カウント／分（“cpm”）のI125−グロビン
mRNAを、ポリ（Ａ）RNAを回収しかつ次工程
におけるmRNA分解を管理するための標識とし
て加えた。全容量の1/20に等しい量（“1/20容
量”）の2Mトリス−HCl（pH9）を加え、そして
混合物を15の再蒸留フエノールにより激しく攬
拌しながら10分間抽出した。３のクロロホルム
を加えて混合物を５分間攬拌した。30分間相分離
させた後、水相を除去して再びフエノールとクロ
ロホルムとで抽出した。得られた水相は全部で
19.1であり、これを60gのSDSと合した。この
水相から、1/10容量の3M酢酸ナトリウム
（pH5.5）と２容量のエタノールとによつて核酸
を沈澱させた。 −20℃で一晩保存した後、プラスチツク製篩を
通しての濾過により繊維状の核酸沈澱を取出し
た。次いでこの物質を、0.5％SDSを含有する
00mlのTNE〔50mMトリス−HCl（pH7.5）、
100mM NaCl、5mM EDTA〕と共に攬拌した。
次いでこれを、さらにこの溶液350mlの添加によ
り溶解させた。非繊維状沈澱を、ソルバールRC
−３型遠心分離器において１ソルバール瓶中に
5000rpmにて15分間遠心分離することにより集
め、0.5％SDSを含有するTNE350ml中に溶解さ
せた。２つのTNE溶液を合し、そして１容量の
フエノールで３回、1/2容量のエーテルで３回お
よび１容量のエーテルで３回それぞれ抽出した。
水相からのRNA回収は、260nmでの吸光度によ
り測定して全部で775mgであつた。 ポリ(A)RNA混合物の単離は、オリゴ（dT）セ
ルロース（タイプ７、Ｐ−Ｌビオケミカル社）に
対する反復バツチ吸着により行なつた。2.7gのオ
リゴ（dT）セルロースを、500mlすなわち上記
のRNA含有溶液の約半量に加えた。室温で１時
間攬拌してポリ(A)RNAをオリゴ（dT）セルロー
スに吸着させた後、セルロースとこれに結合され
たmRNAの混合物とを遠心分離によつて集め、
50mlのTNEで１回、次いで15mlのTNEで１回
洗浄した。次いで、結合したポリ(A)RNAを、
H2O2mlでの５回連続洗浄によつて溶出させた。
収量は、光学密度で測定してポリ(A)RNA860μg
であつた（調製物Ａ）。第一吸着から得た上澄
RNA溶液を、正確に上記と同様にしてさらに２
回の吸着サイクルにかけた。第二および第三吸着
は、それぞれ600μgおよび170μgのRNAを与え、
これらを合した（調製物Ｂ）。 RNAをクセノプス・レビス（Xenopus
laevis）の卵母細胞に注入してHuIFN−
αmRNAにつき分析した（ザ・インターフエロ
ン・システム、第93〜95頁）。RNAを15mMトリ
ス−HCl（pH7.5）、88mM NaCl（“TNK緩衝液”）
に溶解させて約１mg／mlの濃度を得た。この溶
液50nlを各50個の卵母細胞中に注入した。これら
卵母細胞をバース（Barth）培地において室温で
一晩培養した〔ゴードン、ジヤーナル・エムブリ
オール・アンド・エキスペリメンタル・モーホロ
ジー、第20巻、第401〜414頁（1968）および同第
７巻、第210〜222頁（1959）〕。次いで、培養卵母
細胞を洗浄し、パツスールピペツトを用い1.5ml
エツペンドルフ遠心分離管中で0.5mlの52mMト
リスグリシン緩衝液（pH8.9）中においてホモジ
ナイズした。混合物をエツペンドルフ遠心分離器
にて２分間遠心分離し、上澄液を抜き取りそして
−20℃で凍結させて分析した。IFN−α活性はプ
ラーク減少分析によつて測定した〔エツチ・スト
ランダーおよびケー・カンテル、「試験管中にお
けるひと白血球によるインターフエロンの生産」、
Ann.Med.exp.Fenn.、第44巻、第265〜273頁
（1966）〕。１単位のIFN−αはウイルスプラーク
を50％減少させる。IFN−α調製物の活性は、ひ
と基準HuIFN−α69／19に関して表わす〔インタ
ーフエロンおよびインターフエロン誘発剤の基準
化に関する国際シンポジユウム、1969〕。代案と
して、分析は主として次の文献に記載された細胞
病理学的効果の減少に基づいて行ない〔ダブリユ
ー・イー・スチユアート・およびエス・イ−・
スルキン、「ラビースウイルスを実験的に感染さ
せたハムスターにおけるインターフエロン生産」、
プロシーデイング・ソサイエテイ・エキスペリメ
ンタル・バイオロジカル・メデイスン、第123巻、
第650〜653頁（1966）〕、ただしこの場合ひと
CCL−23細胞を使用しかつメンゴウイルスを用
いて実験した。卵母細胞抽出物は、注入RNAの
1μg当り300IUのIFN−α活性を有した。後者の
分析においては、注入卵母細胞の培養を48時間行
ない、大部分のインターフエロンが卵母細胞によ
り分泌されるため、培養培地のみを分析した〔エ
ー・コールマンおよびジエー・モルサー、「キセ
ノプス・レビスの卵母細胞からの蛋白質の分泌」、
セル誌、第17巻、第517〜526頁（1979）〕。ポリ(A)
RNAをさらに精製するため、充分量の0.5Mエチ
レンジアミンテトラ酢酸（“EDTA”）をポリ(A)
RNA調製物Ａに加えて濃度を5mM EDTAにし
た。得られた溶液を等容量のTNE−飽和フエノ
ールで２回および等容量のエーテルで５回抽出し
た。次いで、これを0.1mlのチエレツクス−100ビ
オ−ラドカラム（Chelex−100Bio−Rad
column）に通し、100℃にて90秒間加熱し、そし
て50mMトリス−HCl（pH7.5）と1mM EDTAと
0.2M NaClとを含有する13mlの５〜23％蔗糖濃
度勾配に曝した。制限酵素HindとPstとによ
りpBR322を同時切断して生成させた5′−末端P32
ラベルしたDNA断片（ニユーイングランドビオ
ラブス社）の10000opmをサイズ標識として加え
た。SW40型ロータで10℃かつ35000rpmにて16時
間遠心分離した。フラクシヨン（0.6mlづつ）を
ISCOグラジエントコレクターにより1ml／min、
の速度で集めた。これらのクラクシヨンを上記し
たように、HuIFN−αmRNAにつき分析し、P32
−DNA標識に対するそれらの位置を、後の参考
のため記録した。後の遠心分離において、
HuIFN−αmRNA含有フラクシヨンを標識と比
較して同定した。HuIFN−αmRNA活性を有す
るフラクシヨンは80μgのポリ(A)RNAを含有し
た。これらを、0.5％SDSおよび0.02％ポリビニ
ルサルフエート（後の調製においてはポリビニル
サルフエートを省略した）を含有する２容量の
TNEと混合し、50μlのオリゴ（dT）セルロース
カラムに加えた。上記したようにカラムを洗浄し
た後、RNA混合物40μgを0.6mlの無菌蒸留水で
４回洗浄して溶出させた。エタノール沈澱させた
後、RNAを0.5mMのEDTA中に1mg／mlとなる
よう溶解させた。 HuIFN−αmRNA活性の分析を、上記したよ
うに、ポリ(A)RNA沈澱の一部について行なつた。
これは、注入RNA1μg当り3600IUのインターフ
エロンの比活性を有した。したがつて、蔗糖濃度
勾配は、ポリ(A)RNAをHuIFN−αmRNAに関し
約10倍濃化させた。次の同様な調製において、約
40倍の濃化が得られた。調製物Ｂを同様に精製
し、そしてこれは調製物Ａと同様な比活性を有し
たので、両者をプールした。 この時点において、蔗糖濃度勾配処理から得ら
れたポリ(A)RNA生成物でさえ極めて多数の異な
るmRNAを含有することを認めるべきである。
IFN−αに対して特異的なmRNAを除き、他の
mRNAは望ましくない汚染物である（第１図）。
不都合なことに、これら汚染RNAは、本発明の
残余のクローン化過程全体においてHuIFN−
αmRNAと同様に挙動する。したがつて、ポリ(A)
RNA中にそれらが存在すると、IFN−α以外の
ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する多数
の望ましくない細菌クローンの最終的調製物が生
ずる。この汚染は、所望のIFN−αヒブリドクロ
ーンの単離において複雑な選別問題を提起する。
IFN−αの場合、この選別問題は、所望クローン
を同定するための選別比較試料として作用する
HuIFN−αmRNAまたはDNAもしくはその一部
の精製試料が充分存在しないためさらに悪化す
る。したがつて、IFN−αクローンの選別過程は
極めて時間がかかりかつ困難となる。さらに、極
めて少割合のIFN−αクローンしか生物学的活性
型または免疫学的活性型においてIFN−αを発現
することが期待されないので、活性クローンの単
離はわら山から針を探すような選別過程になる。 有利なことに、本発明は組替えDNA技術を用
いて、HuIFN−αmRNAまたはcDNAもしくは
その一部の精製試料を得ることができる。この精
製mRNAまたはcDNAを使用して極めて多数の
細菌クローンを迅速に選別しかつそれにより活性
型でIFN−αを発現するクローンを単離する確率
が著しく増大する。 HuIFN−αcDNAを含有するcDNA混合物の合成 IFN−αmRNAが濃化されたポリ(A)RNA調製
物（Ａ＋Ｂ）を雛型として使用して、単一鎖の相
補DNA（cDNA）を調製した（第１図）（エー・
エフストラチアジス等、「グロビンおよびコリオ
ンmRNAの全体的および個々の部分的な逆転
写」、セル誌、第４巻、第367〜378頁（1975）お
よびそこに引用されている文献〕。800μlの反応混
合物は40mMのトリス−HCl（pH7.5）と、30mM
のNaClと、5mMのMgCl2と、0.5mMのDTT（カ
ルビオケム社）と、20μg／mlのオリゴ（dT）12
〜18（Ｐ＆Ｌビオケミカル社）と、5mMのdGTP
（シユワルツ社）、dCCTP（レボサン社）および
dTTP（シグマ社）と、5mMのP32−dATP
（NEN、比活性100000cpm／ｎモル）と、60μg／
mlのポリ(A)RNAと、280単位の鳥類骨髄芽球症
ウイルス（AMV）逆転写酵素〔フロリダ州セン
トピータースブルグ在ライフサイエンス社から寄
贈〕とを含有した。37℃で１時間培養した後、
0.5MのEDTAと20％のSDS（再結晶したもの）を
10mMのEDTAおよび0.1％のSDSまで加えた。
この混合物を１容量のフエノール（蒸留物）で抽
出した。フエノール相を200μlの200mMトリス−
HCl（pH7.5）と1mM EDTAと0.1％SDSとで洗
浄し、水相を合した。これらを等容量のエーテル
（フルカ社、プロアナル）で抽出し、TNE中5ml
のセフアデツクスＧ−100カラムにてクロマトグ
ラフにかけた。0.1mlづつのフラクシヨンを
0.3ml／min、の速度で集めた。放射能（セレン
コフ放射線により測定）を示すフラクシヨンを合
し、3Mの酢酸ナトリウムを0.3Mまで加えた。こ
の核酸を2.5容量のエタノールで沈澱させた。−20
℃で一晩保存した後、試料を遠心分離しそして上
澄液を捨てた。この沈澱を180μlの蒸留水中に溶
解させ、シリコーンライニングしたエツペンドル
フ管に移した。20μlの5M NaOHを加え、混合物
を室温で40分間保つた。20μlの5M酢酸ナトリウ
ムと100μlの蒸留水と500μlのエタノールとを加え
た。−20℃にて一晩冷却した後、生じた沈澱を重
力の10000倍（10000xg）に相当する力で０℃に
て20分間遠心分離することにより、回収した。単
一鎖cDNAの収量は10μgであつた。 ここでも、上記のように調製した単一鎖cDNA
生成物は実際的に、ポリ(A)RNA混合物中に存在
する対応のmRNAから転写された多数の異なる
cDNAの複合混合物であることを理解すべきであ
る（第１図）。これらcDNAのうち極めて少量の
みがIFN−α関連性、すなわちHuIFN−αcDNA
である。他の要因も作用してcDNA混合物を複雑
化させ、ポリ(A)RNA混合物の各mRNA種は通常
完全には転写されない。寧ろ、各mRNA種に関
し、転写過程はmRNAの末端に達する前に停止
することがある。したがつて、各mRNA種から
多種類のcDNAが生成されうる（第１図に示さ
ず）。各種類は後のクローン化過程において多か
れ少なかれ同様に挙動し、したがつて特定蛋白質
に関する遺伝子の断片のみを有する組替えDNA
分子を含有した細菌クローンが生産されるであろ
う。これら断片含有クローンの存在は、さらに最
終的なクローン選別過程を複雑化させる。 各種の単一鎖cDNAの寸法は、少量をアルカリ
性２％アガロースゲル上に、電解質として30mM
のNaOHと2mMのEDTAとを使用して電気泳動
させることにより測定した〔エム・ダブリユー・
マクドネル等、「T7DNAの制限断片の分析なら
びに中性およびアルカリ性ゲルにおける電気泳動
により分子量の測定」、ジヤーナル・モレキユラ
ー・バイオロジー、第110巻、第119〜146頁
（1977）〕。P32−cDNAは、サイズ標識として使用
した単一鎖グロビンcDNAおよびP32−標識した
DNA断片に比べ、600〜1000ヌクレオチドの長さ
を有した。 二重鎖cDNAの調製 単一鎖cDNAは、DNAポリメラーゼＩで処理
して二重鎖にすることができる〔テイー・マニア
チス等、「試験管中で合成したβ−グロビン遺伝
子の拡大および特性化」、セル誌、第８巻、第163
〜182頁（1976）〕。上記からの沈澱した単一鎖
cDNAを200μlのH2O中に溶解させ、100℃にて２
分間加熱し、そして500μlの0.1M熱変性燐酸カリ
ウム緩衝液（pH6.9）と10mMのMgCl2と10mM
のDTT（カルビオケム社）と各1mMのdATP（メ
ルク社）、dGTP（シユワルツ社）およびdCTP
（レボサン社）と1mMのH3−dTTP（NEN、比活
性100000cpm／ｎモル）と150単位／mlのイー・
コリDNAポリメラーゼ（ベーリンガー・マン
ハイム社）とにおいて培養した。15℃にて6.5時
間の後、0.5MのEDTAと20％のSDSを10mMの
EDTAおよび0.1％のSDSまで加えた。次いで混
合物を500μlのフエノールで抽出し、フエノール
相を250μlの20mMトリス−HCl（pH7.5）と5mM
EDTA（“TE緩衝液”）とで再抽出した。２つの
水相を合し、前記したと同じ条件下で5mlのセフ
アデツクスＧ−100カラム上でクロマトグラフに
かけた。酢酸ナトリウム（3M）を0.3Mまで加
え、2.5容量のエタノールを混合してDNAを沈澱
させた。全部で13μgのDNAが回収された。 DNAをヌクレアーゼS1で処理した〔このヌク
レアーゼS1は、アール・シー・ビーガンド等、
「アスペルギルス・オリゼーからのS1ヌクレアー
ゼの特異性」、ジヤーナル・バイオロジカル・ケ
ミストリー、第250巻、第8848〜8855頁（1975）
の方法により調製した〕。沈澱したDNAを250μl
のS1緩衝液（0.2MのNaCl、50mMの酢酸ナトリ
ウム（pH4.5）、10mMの硫酸亜鉛）に溶解させ、
37℃にて30分間加温した。1.5μlのS1酵素（11単
位／μl）を加え、混合物を37℃で30分間培養し
た。SDSとEDTAとを0.1％SDSおよび5mM
EDTAまで加え、そして混合物を250μlのフエノ
ールで抽出した。フエノール相を100μlのTE緩衝
液で洗浄した。水相を合し、TNEにおいてセフ
アデツクスＧ−100（フアーマシア社）カラム上で
クロマトグラフにかけ、0.1mlづつのフラクシヨ
ンを0.3ml／min.の速度で集めそして各フラクシ
ヨンのセレンコフ放射線を測定した。 上記したようにエタノールと酢酸ナトリウムと
で沈澱させた後、8μgの二重鎖cDNAを回収し
た。 ここでも、上記で生産した二重鎖cDNAは多数
のcDNAとその断片との混合物であり、その極く
少数のみがHuIFN−αcDNAもしくはその断片で
あることを認めねばならない（第１図）。 二重鎖DNAのクローン化 多種類の宿主／クローン化ベヒクルの組合せ物
を使用して、上記のように調製された二重鎖
cDNAをクローン化させた。たとえば、有用なク
ローン化ベヒクルは染色体、非染色体および合成
DNA配列の断片、たとえば各種公知の細菌プラ
スミド、たとえばcolEl、pCR1、pBR322および
それらの誘導体を含む大腸菌（イー・コリ）から
のプラスミド、広範囲の宿主のプラスミド、たと
えばRP4、フアージDNA、たとえばフアージλ
の多数の誘導体、たとえばNM989、ならびにプ
ラスミドとフアージDNAとの組合せから生じた
ベクター、たとえばフアージDNAもしくは他の
発現制御配列を用いて改変させたプラスミドまた
は酵母プラスミド、たとえば2μプラスミドもし
くはその誘導体から構成することができる。有用
な宿主は細菌宿主、たとえば大腸菌の菌株、たと
えばイー・コリHB101、イー・コリX1776、イ
ー・コリX2282、イー・コリMRCIおよびシユー
ドモナス（Pseudomonas）、枯草菌（Bacillus
subtilis）、高熱菌
（Bacillusstearothermophilus）およびその他バ
チルスの菌株、酵母およびその他の真菌類、動物
もしくは植物宿主、たとえば動物（人間を含む）
もしくは培養した植物細胞またはその他の宿主を
包含する。勿論、必らずしも全ての宿主／ベクタ
ー組合せ物が同等に有効ではない。宿主／クロー
ン化ベヒクル組合せの特定の選択は、示した原理
を適当に考慮して当業者により、本発明の範囲を
逸脱することなく行なうことができる。 さらに、各特定クローン化ベヒクル内におい
て、種々の部位を選択して二重鎖DNAを挿入す
ることもできる。これらの部位は通常、これらを
切断する制限エンドヌクレアーゼにより命名する
ことができる。たとえば、pBR322においてPstI
部位は、β−ラクタマーゼ用の遺伝子において、
その蛋白質のアミノ酸181および182をコードする
ヌクレオチドトリプレツトの間に位置する。この
部位は、ラツテのプロインシユリン抗原決定因子
を示す蛋白質の合成において、ビラーカマロフ等
（上記）によつて用いられた。２つのHindエン
ドヌクレアーゼ認識部位の一方はアミノ酸101お
よび102をコードするトリプレツトの間に存在し、
また数個のTaq部位の一つはpBR322におけるβ
−ラクタマーゼのアミノ酸45をコードするトリプ
レツトに存在する。同様に、このプラスミドにお
けるEcoRI部位およびPvu部位は、コード化域
の外部に存在し、EcoR部位はそれぞれテトラ
サイクリンおよびアンピシリン耐性をコードする
遺伝子の間に位置する。この部位は、イタクラ等
およびゲデル等により、組替え合成法（上記）に
おいて使用された。これらの部位は当業者により
充分認識されている。勿論、本発明に有用なクロ
ーン化ベヒクルは、選択DNAを挿入するための
制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必要のない
ことを理解すべきである。寧ろ、ベヒクルは別の
手段により断片に結合させうるであろう。 ベクター、すなわちクローン化ベヒクル、特に
選択DNA断片を結合させて組替えDNA分子を生
成させるためそこに選択される部位は、種々の要
因たとえば特定制限酵素に対し感受性部位の数、
発現すべき蛋白質の大きさ、宿主細胞酵素により
蛋白質分解を受ける所望蛋白質の感受性、精製の
際除去困難な宿主細胞蛋白質により発現すべき蛋
白質の汚染、たとえばベクター配列に関する開始
および停止コドンの位置のような発現特性ならび
に当業者により認められるその他の要因のような
各種の要因により決定される。ベクターおよび特
定遺伝子用の挿入部位は、これら要因のバランス
により決定され、必らずしも全ての選択が一定の
場合に対し同等に有効であるとは限らない。 外来DNAをクローン化ベヒクルすなわちベク
ター中に挿入して組替えDNA分子を生成させる
には幾つかの方法が当分野で知られているが、本
発明による第一の構成に好ましい方法はビラーカ
マロフ等（上記）により記載され、第１図に示さ
れている。この方法は、プラスミド（特に
pBR322）を挿入用に選択された部位（特にPstI）
に特異的な制限酵素により切断し、そしてdGMP
末端を末端トランスフエラーゼにより末端付加さ
せることを特徴とする。dGMP末端は切断プラス
ミドの5′末端に付加されて、PstI部位を再生する
と共に、相補的末端を有するcDNA断片への結合
を可能にする。同様に、二重鎖cDNAは、dCMP
末端を処理プラスミドに対する結合を可能にする
3′末端に付加させて伸長される。次いで処理プラ
スミドとcDNAとをアニールして、プラスミドの
適当な部位にcDNAを挿入すると共にヒブリド
DNAを環化させ、末端の相補的性質はそれらの
凝集を可能にする（第１図）。かくして、生じた
組替えDNA分子は、選択制限部位に遺伝子を有
する（第１図）。 勿論、DNA配列をクローン化ベヒクル中に挿
入して組替えDNA分子を生成させるその他の公
知方法も、同等に本発明において有用である。こ
れらは、たとえば直接的結合、合成リンカー、エ
キソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ結合修復反
応に続く結合、或いはDNAポリメラーゼと適当
な単一鎖雛型とによるDNA鎖の伸長に続く結合
を包含する。 勿論、クローン化ベヒクルの選択位置に挿入さ
れたヌクレオチド配列またはcDNA断片は、所望
ポリペプチド用の実際の構造遺伝子の一部でない
ヌクレオチドも包含することができ、或いは所望
蛋白質用の完全構造遺伝子の断片のみも包含する
ことができることを了解すべきである。何らかの
DNA配列が挿入されて形質転換した宿主が
HuIFN−αの生物学的もしくは免疫学的活性を
有するポリペプチドを生産すること、或いは
HuIFN−αの免疫学的もしくは生物学的活性を
有するポリペプチドの生産に有用なDNA配列を
含んだクローンを選択するためDNA配列自身が
ヒブリド化試料として使用できることのみが必要
とされる。 外来遺伝子を含有するクローン化ベヒクルすな
わちベクターを使用して、ヒブリドDNAにより
コードされる蛋白質またはその一部を宿主が発現
しうるようこの宿主を形質転換させる。適当な宿
主の選択も、当分野で知られた多くの要因により
管理される。これら要因には、たとえば選択ベク
ターとの適合性、ヒブリドプラスミドによりコー
ドされる蛋白質の毒性、所望蛋白質の回収の容易
さ、発現特性、生物安全性および価格が包含され
る。これら要因をバランスさせるには、必らずし
も全ての宿主が特定の組替えDNA分子を発現す
るのに同等に有効でないと云う理解を考慮せねば
ならない。 この合成において、好適な初期クローン化ベヒ
クルは細菌性プラスミドpBR322であり、好適な
初期制限エンドヌクレアーゼ部位はPst部位で
ある（第１図）。このプラスミドは、抗生物質ア
ンピシリン（Amp）およびテトラサイクリン
（Tet）に対する耐性遺伝子を有する小型（分子
量約2.6メガダルトン）のプラスミドである。プ
ラスミドは完全に特性化されている〔エフ・ボリ
バール等、「新規クローン化ベヒクルの構成お
よび特性化。多目的クローン化システム」、ジー
ン誌、第95〜113頁（1977）；ジエー・ジー・サツ
トクリツフ、「DNA配列から生ずるpBR322制限
地図。4361ヌクレオチド対の長さまでの正確な
DNAサイズ標識」、ヌクレイツク・アシツド・リ
サーチ、第５巻、第2721〜2728頁（1978）〕。この
部位におけるDNA生産物の挿入は多数の細菌ク
ローンを与え、その各々は予め調製されたDNA
生産物に存在するDNA遺伝子もしくはその断片
の一つを含有する。ここでも、これらクローンの
極く少数のみがIFN−αもしくはその断片用の遺
伝子を含有する（第１図）。本発明における初期
クローン化用の好適宿主はイー・コリHB101で
ある。イー・コリX1776を用いて他の実験を行な
つたが、この宿主は英国特許第1516458号に記載
されており、アメリカ合衆国、メリーランド州ロ
ツクビル在のアメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨン（ATCC）に寄託され、ATCC番号
第31244号が付与されている。 1.Pst−開裂され、dGMP−伸長されたpBR322
の調製 プラスミドpBR322（20μg）を21単位のPstエ
ンドヌクレアーゼ（MREポートンダウンス社ま
たはニユーイングランド・ビオラブス社）によ
り、150μlの10mMトリス−HCl（pH7.5）と6mM
のMgCl2と50mMのNaClと6mMの２−メルカプ
トエタノールと200mg／μlの牛血清アルブミン
（“BSA”）（カルビオケム社）との中で切断した。
37℃にて２時間の後、混合物を１容量のフエノー
ル−クロロホルム（１：１）と１容量のエーテル
とで抽出しそしてエタノールにより沈澱させた。 末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラー
ゼ（TdT）〔エフ・ジエー・ボルム、「子牛胸腺
からのデオキシヌクレオチド重合酵素」、メソツ
ド・イン・エンチモロジー（エル・グロスマンお
よびケー・モルデープ編）、アカデミツク・プレ
ス社、ニユーヨーク、第128巻、第591〜611頁
（1968）により精製〕による単独重合dGMP末端
の付加（第１図）を、100mMのカコジル酸ナト
リウム（pH7.2）と10mMのNaH2PO4と5mMの
MgCl2と1mMのdGTPと50μg／μlのBSAと３〜
６単位のTdT（上記のように精製）とをDNA1μg
当りに含有する328μlの反応容量にて行なつた。
培養を37℃にて20分間行なつた。EDTAを10mM
まで加えそして混合物を上記のように抽出し、
TNE緩衝液に対し２日間透析した。 2.dCMP伸長させたDNAの調製 二重鎖DNAを標準法（たとえば、ビラーカマ
ロフ等、上記）によりdCMP残基で伸長させた。
上記の二重鎖cDNA150ngを、100mMのカコジル
酸ナトリウム（pH7.2）と2.5mMのCoCl2と
50μg／μlのBSAとDNA1μg当り３〜６単位の精
製TdTを含む0.1mMのdCTPとの8μl中で27℃に
て８分間培養し、次いで、−20℃にて凍結させた。
前記と同様、dCMP伸長させたDNAは種々異な
る種類の混合物であり、そのうち極く少数のみが
IFN関連性であつた（第１図）。 3.Ca++処理されたイー・コリX1776の調製 イー・コリX1776の単一コロニーを、100μg／
mlのジアミノピメリン酸（コツホライト・ラボ
ラトリース社）と10μg／mlのナリジキシン酸
（カルビオケム社）と10μg／mlのテトラサイクリ
ン（アクロマイシン、アメリカンシアナミド
社）とが加えられた100mlのトリプトン培地中に
接種した〔シー・ワイスマンおよびダブリユー・
ボル、「組替えプラスミドDNAの調製における起
こりうる害の減少」、ネイチヤー誌、第261巻、第
428〜429頁（1976）〕。培養物を、650nm（OD650）
にて0.6の見掛け光学密度（ベツクマンDB型分光
光度計にて測定）まで37℃にて生育させ、氷中で
30分間冷却させた。次いで、培養物をソルバール
H4型スウイングバケツトロータにて4000rpmで
沈降させ、細胞を50mlの10mM NaClで洗浄し、
遠心分離によつて分離除去しそして20mlの
100mM CaCl2中に再懸濁させた。懸濁物を氷中
で30分間冷却し、遠心分離により粒状化させて
4mlの100mM CaCl2中に再懸濁させ、そして氷
上で一晩放置した後使用した。形質転換用として
イー・コリHB101をエム・マンデルおよびエ
ー・ヒガの方法〔「カルシウム依存性バクテリオ
フアージDNA感染」、ジヤーナル・モレキユラ
ー・バイオロジー、第53巻、第159〜162頁
（1970）〕により調製した。一部（0.5ml）を−70
℃で凍結状態に保ち、少なくとも３ケ月間その活
性を保持した。 4.dGMP伸長されたpBR322およびdCMP伸長さ
れたDNAのアニール化末端Pst−開裂pBR322
と末端 cDNAとのアニール化を文献〔ジエー・フア
ン・デン・ベルグ等、「２つの同族対のイントロ
ンの強力な多様性を示すクローン化された兎とね
ずみとのβ−グロビン遺伝子の比較」、ネイチヤ
ー誌、第276巻、第37〜44頁（1978）〕に記載され
ているように行なつた。8ngのdCMP伸長された
DNA生成物を22ngのdGMP伸長されたPst−
開裂pBR322と、TNE緩衝液50μl中で混合した。
培養を65℃、46℃、37℃および20℃にて順次に４
段階で１時間づつ行なつた。100mMのトリス−
HCl（pH7.5）と100mMのCaCl2と100mMの
MgCl2と50μlのTNE緩衝液とを含有する20μlを
加えそして混合物を氷中で20分間冷却した。 勿論、生成物は種々異なる組替えDNA分子と、
挿入DNA配列のない若干のクローン化ベヒクル
との混合物である。しかしながら、各組替え
DNA分子はPst部位にcDNA断片を含有する。
この種のcDNAの各々は遺伝子またはその断片か
らなることができる。cDNA断片の極く少数のみ
がIFNまたはその部分をコードする（第１図）。
大多数は他の蛋白質またはその部分の一種をコー
ドし、それらのmRNAは本発明の方法に使用さ
れるポリ(A)RNAの一部であつた（第１図）。 5.アニールされたヒブリドプラスミドによるイ
ー・コリX1776の形質転換 組替えDNA分子の混合物によるイー・コリ
1776の形質転換はジエー・フアン・デン・ベルグ
等（上記）により記載されているように行なつ
た。P3封鎖手段を用いて形質転換過程と全ての
次工程とを行ない、そこにおいて得られた形質転
換細菌を処理した。アニールしたpBR322組替え
DNA分子を100μlの予め調製されたCa++処理し
たイー・コリX1776に加え、混合物を氷中で20分
間冷却し、20℃にて10分間加熱し、そして0.6ml
のトリプトン培地を加えた。混合物を、上記のよ
うに添加された２枚のトリプトン培地寒天板に接
種した。形質転換効率はアニールpBR322の1μg
当り3.3×104個のコロニーであり、原pBR322は
1μg当り３×106個のコロニーを与えた。 プラスミドpBR322はテトラサイクリン耐性に
関する遺伝子を含むので、その完全遺伝子を有す
るプラスミドで形質転換させたイー・コリ宿主
は、そのように形質転換させてない細菌を除き、
その抗生物質を含有する培養物において増殖する
であろう。したがつて、テトラサイクリン含有培
養物における増殖は、組替えDNA分子または再
使用ベクターにより形質転換させた宿主の選択を
可能にする。 37℃にて48時間の後、個々のコロニーを採取し
てこれらをミクロ測定板（ダイナテク社）の穴部
における100μlのトリプトン培地（上記のように
添加したもの）に懸濁させた。37℃にて一晩培養
した後、100μlの40％グリセリンを各穴中に混入
した。測定板を−20℃に保存し、そして形質転換
イー・コリX1776の100000個の個々のクローンを
調製した。 これら100000個のクローンは、IFN生成性白血
球からのポリ(A)RNA調製物においてmRNAの混
合物の完全もしくは部分的コピーを示す各種の組
替えDNA分子を含有する（第２図）。これらの大
多数は単一の組替えDNA分子のみを含有するで
あろう。これら組替えDNA分子の極く少数のみ
がIFNに関連する。したがつて、クローンを選別
してIFN関連クローンを他のものから分離せねば
ならない。 HuIFN−αcDNAを含有するクローンの選別 ひと白血球インターフエロンcDNA（“HuIFN
−αcDNA”）を含有する細菌クローンを選別す
るための幾つかの方法がある。これらには、たと
えばRNA選別ヒブリド化〔アルウイン等、（下
記）〕、差別ヒブリド化〔テイー・ピー・セントジ
ヨーンおよびアール・ダブリユー・デービス、
「差別プラークフイルターヒブリド化によりサツ
カロミセス・セレビシエからのガラクトース誘発
DNA配列の単離」、セル誌、第16巻、第443〜452
頁（1979）；ヘージメーカース等、下記〕、合成試
料によるヒブリド化〔ビー・ノイエス等、「オリ
ゴデオキシヌクレオチド試料を使用するガストリ
ンmRNAの検出および部分的配列分析」、プロシ
ーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サイエン
ス・USA、第76巻、第1770〜1774頁（1979）〕ま
たは免疫学分析（エル・ビラ−カマロフ等、上
記）もしくは生物学的分析（エー・シー・ワイ・
チヤング等、上記）による所望蛋白質を生成する
クローンの選別が包含される。本発明は、IFN−
αcDNAを含有するクローンの第一次選別のため
の最も便利かつ有望な方法としてRNA選択ヒブ
リド化を選択した。 A.RNA選択ヒブリド化分析 1.初期分析の概要 次に第２図について述べれば、組替えDNA
を、上記クローン貯蔵物（第２図に示した２クロ
ーンの２つの混合物）における512個のクローン
の混合物の培養物から単離した（工程Ａ）。この
バツチサイズを選別する理由を以下に説明する。
組替えDNA分子を開裂させ、変性させそして前
記したように調製したIFN−αmRNAを含有する
白血球ポリ(A)RNAまでヒブリド化させた（工程
Ｂ）。全ての組替えDNA分子−ポリ(A)RNAヒブ
リドを非ヒブリド化ポリ(A)RNAから分離した
（工程Ｃ）。ポリ(A)RNAをヒブリドから回収しか
つ精製した（工程Ｄ）。回収したRNAを上記のよ
うにIFN−αmRNA活性につき分析した（工程
Ｅ）。もしも組替えDNA分子の混合物が厳格なヒ
ブリド化条件の下でポリ(A)RNA中のIFN−
mRNAにヒブリド化しうる挿入ヌクレオチド配
列を持つた組替えDNA分子を含有するならば、
そのヒブリドから遊離されたmRNAは卵母細胞
中においてIFN−αの生成をもたらすであろう。
何故なら、その他の如何なる組替えDNA分子−
ポリ(A)RNAヒブリドから遊離されたmRNAも
IFN−α関連性でないからである。512個のクロ
ーンの群が正の反応を示せば、これらクローンを
64個づつの８ロツトに再組分けして、各ロツトに
つき上記のように分析した。この処理を、この分
析に応答する単一のクローンが同定されるまで続
けた。 形質転換されかつこのように同定された組替え
DNA分子および細菌クローンがIFN−αの完全
なIFN−αcDNA配列を含有したり、或いはDNA
配列が実際にIFN−αをコードする保証はない。
しかしながら、組替えDNA分子はIFN−
αmRNAコード配列に相補的な広汎なヌクレオチ
ド配列を確実に含有する。したがつて、組替え
DNA分子は、他の組替えDNA分子およびそれに
より形質転換されたクローンを迅速選別するため
の試料の供給源として使用することにより、標準
的および完全なIFN−αヌクレオチドコード配列
を含有しうる別の群のクローンを同定することが
できる。 2.理論的考察 ヒブリド化（工程Ｂ）の条件は臨界的であ
る。組替えDNA分子とポリ(A)RNAとの絶対濃度
および比は、反応速度と化学量論とを考慮して選
択せねばならない。適正な選択は、ポリ(A)RNA
におけるIFN−αmRNAの割合が未知であるた
め、困難である。制御されかつ充分な速度を確保
するため、組替えDNA分子からのDNA配列の濃
度が推定IFN−αmRNA濃度に比較して過剰とな
る条件の下で行なつた。512個の可能な種々異な
る組替えDNA分子の混合物においてIFN−α関
連DNA配列（“IFN−αRDNA”）は全く生じな
い（負の分析値を与える）か、或いは組替え
DNA分子の少なくとも約１／512を構成する。組
替えDNA分子混合物の濃度およびしたがつて
IFN−αRDNAの濃度をヒブリド化工程で調製し
て、充分なヒブリド化割合を確保することができ
る。さらに、反応混合物中のIFN−αRDNAの量
は、ポリ(A)RNAからの充分な量のIFN−
αmRNAを結合して、組替えDNA分子−ポリ(A)
RNAとブリドから回収されたmRNAを卵母細胞
に注入した後にIFN−αの検出を可能にするのに
足る量でなければならない。 用いうる分析によりIFN−αを検出するには、
その濃度は100IU／mlもしくはこれ以上にしなけ
ればならない。反復測定のためには0.5mlづつを
必要とするので、50IUを卵母細胞中に発生させ
るべきである。前記で使用した誘発白血球からの
ポリ(A)RNAは、その1μgを卵母細胞中に注入す
ると、約500IUのIFN−αを発生する。したがつ
て、必要とする50IUを発生させるには、少なく
とも0.1μgのポリ(A)RNAを注入せねばならない。
兎グロビンmRNAと兎β−グロビンcDNAクロ
ーンとを用いたモデル実験は、ヒブリド化ミツク
スに加えたI125−グロビンmRNAに対し卵母細胞
中のI125−グロビンmRNAの全回収率が約10％で
あり、かつmRNA活性の回収率が約５％である
ことを示した。したがつて、ヒブリド化分析用に
は少なくとも0.1／0.05＝2μgの白血球ポリ(A)
RNAを使用すべきである。充分安全な限界を確
保するには、１回の分析当り12μgのポリ(A)RNA
を使用した。 12μgのポリ(A)RNA中のIFN−αmRNAを結合
させるには、組替えDNA分子からのどの程度の
DNAが必要とされるかを計算するため、ポリ(A)
RNAのIFN−αmRNA含有量を推定した。1μgの
ポリ(A)RNAは500IUのIFを発生させる。IFN−
αの比活性は２×108〜109IU／mg蛋白質である。
したがつて、500IUのIFN−αは500／２×108＝
2.5×10-6mg（2.5ng）〜500／109＝５×10-7mg
（0.5ng）のインターフエロンに対応する。 卵母細胞中に注入したIFN−αmRNAの量と生
成されたIFN−αの量との間の関係は未知であ
る。β−グロビンmRNAの場合、mRNA1分子
当り約30分子の蛋白質が１時間当りに生成され、
この値はβ−グロビンに対し約６である〔ジエ
ー・ビーグルドシ等、「注入フロツグ卵母細胞に
おける伝達安定性：長寿命の哺乳動物およびβ−
グロビン伝達」、ジヤーナル・モレキユラー・バ
イオロジー、第80巻、第539〜551頁（1973）〕。
IFN−αに関し平均値が20であり、IFN−αに関
し分子量が18000でありかつIFN−αmRNAに関
し分子量が330000であると仮定すれば、26mg
（18000／330000×20×24）のIFN−αが注入IFN
−αmRNA1mg当りに24時間で生成される筈であ
る。もしIFN−αの比活性が２×108／mg（２×
102IU／ng）であるとすれば、1ngのIFN−
αmRNAは26×２×102＝5.2×103IUのIFN−α
を生成するであろう。比活性が109／mg（103IU／
ng）であるとすれば、生成するIFN−αの量は
2.6×104IUとなるであろう。1μgの白血球ポリ(A)
RNAは上記の仮定条件の下で500IUのIFN−α
を生成するので、1μgのポリ(A)RNA中のIFN−
αmRNAの濃度は0.1ng〜0.02ngに低下し、白血
球ポリ(A)RNAにおけるIFN−αmRNAの割合は
１：10000〜１：50000となるであろう。したがつ
て、12μgのポリ(A)RNAは約1.2ng〜0.2ngのIFN
−αmRNAを含有する。 卵母細胞中のIFN−αmRNAの翻訳比がグロビ
ンmRNAに対する平均値よりも大きさの次数
（order of magnitude）だけ低ければ、ポリ(A)
RNAのIFN−αmRNA含量は、上記計算値より
も10倍高くなるか、或いは約１：1000〜１：5000
となるであろう。その場合、12μgのポリ(A)RNA
は約12ng〜2ngのIFN−αmRNAを含有するであ
ろう。他方、卵母細胞中のIFN−αmRNAの翻訳
比がグロビンmRNAの平均値よりも大きさの次
数だけ高ければ、ポリ(A)RNAのIFN−αmRNA
含量は上記計算値よりも10倍低くなるか、或いは
約１：100000〜１：500000となるであろう。その
場合、12μgのポリ(A)RNAは0.1ng〜0.02ngのIFN
−αmRNAを含有するであろう。 プラスミドpBR322は4361b.p.を有する。IFN
−αmRNAの完全cDNAは、全部で約5200〜
5400b.p.となるようpBR322−IFN−αcDNAの生
成の際、pBR322に対し約800〜1000b.p.を付加す
るであろう。したがつて、その分子量はIFN−
αmRNA単独のそれの約12倍（２×5200／800）
となるであろう。したがつて、上記に計算した
IFN−αmRNAを結合して分析に必要な12μgの
ポリ(A)RNA中に存在させるには、IFN−
αmRNAの量の12倍に等しい組替えDNA分子の
量が必要となるであろう（化学量論量）。 組替えDNA分子を調製するのに使用されるポ
リ(A)RNAのIFN−αmRNA含量は粗ポリ(A)RNA
のそれよりも10〜40倍増大したので、512個のク
ローンの群は、上記から計算したよりも10〜40倍
多い所望IFN−αmRNA含有のクローンを有する
筈である。 IFN−αmRNAが1000の粗ポリ(A)RNAのうち
１部であれば、12μgのポリ(A)RNAは12ngのIFN
−αmRNAを含有しかつ化学量論量のIFN−
αcDNAプラスミドは144ngである。512個のクロ
ーンの群は少なくとも５個のIFN−αcDNA挿入
物を含有するので、必要とされる全ヒブリドプラ
スミドDNAは14.8μg（144×512／５×10-3）であ
る。IFN−αmRNAが10000のうち１部であれば、
12μgのポリ(A)RNAは1.2ngのIFN−αmRNAを含
有しかつ必要とされるIFN−αcDNAの量は
14.4ngである。512個のクローンの群は０もしく
は１個のIFN−αcDNA挿入物を含有し、したが
つて必要とされる全ヒブリドプラスミドDNAの
量は7.4μg（14.4×512×10-3）である。IFN−
αmRNAが100000のうち１部であれば、必要とさ
れる全ヒブリドプラスミドDNAの量は0.74μg
（1.44×512×10-3）である。ヒブリド化反応が
DNA過剰条件下（すなわち、ポリ(A)RNAに比較
して過剰の組替えDNA）で進行するよう確保す
るため、20μgの混合物（約1.4〜30倍過剰）を分
析用に選択した。 ヒブリド化は、(a)ポリ(A)RNAのヒブリド化さ
れた部分が完全かつ生物学的活性の型で回収され
ること、(b)非特異的なDNA−mRNA結合が防止
されることおよび(c)ヒブリド化反応が少なくとも
75％完結まで進行することを確保するような条件
下で行なわねばならない。これらの条件は、特に
80％ホルムアミド、0.4MNaCl中におけるヒブリ
ド化により満たされると思われる〔ジエー・カセ
イおよびエヌ・ダビドソン、「高濃度のホルムア
ミドにおけるRNA：DNAおよびDNA：DNA複
合体の生成速度および熱安定性」、ヌクレイツ
ク・アシツド・リサーチ、第４巻、第1539〜1552
頁（1977）〕。この溶液において、ヒブリド化は約
40℃で行なうことができる（ホルムアミドを省略
すると、60〜70℃が必要とされる）。ポリ(A)RNA
に対する損害を最小にするには、より低温度が好
適である。本発明は56℃のヒブリド化温度を選択
する。これはT1／2iより約３℃低く〔ジエー・
カセイおよびエヌ・ダビドソン、上記〕かつ
T1／2dより約10〜13℃低い〔ハマグチおよびガ
イヅシエク、ジヤーナル・アメリカン・ケミカ
ル・ソサイエテイ、第84巻、第1329頁〕。したが
つて、この温度は約87％以下のホモロジーをもつ
て、配列をヒブリド化させない筈である。何故な
ら、１％の差はT1／2dを１℃だけ低下させるか
らである〔テイー・エフ・ボナー等、「配列多様
化によるDNA再結合の速度低下」、ジヤーナル・
モレキユラー・バイオロジー、第81巻、第123〜
135頁（1973）〕。 このヒブリド化において、DNAの自己ヒブリ
ド化は主たる問題でない。何故なら、使用される
DNAの混合物は同じベクター（pBR322）およ
び各種のcDNA挿入物よりなるからである。した
がつて、大低のDNA配列はヘテロ複合体となり、
ここで挿入物はポリ(A)RNAにヒブリド化させる
のに使用することができる。異なる複合体の一部
を形成する相補的cDNA挿入物は、トポロジー的
拘束により殆んど相互作用することがない。いず
れにせよ、DNA：DNA再結合は、使用反応条件
下で最小化される（ジエー・カセイおよびエヌ・
ダビドソン、上記）。 少なくとも75％反応を確保するのに必要とされ
るヒブリド化時間を決定するため、２次速度式を
使用した： ｔ＝InCo−Ro＋Ro（１−Ｒ／Ro）／（１−Ｒ／Ro）Co／
KR（Co−Ro）＝3.9h 【式中、 Ｒ＝ヒブリド化RNAのヌクレオチドモル濃度、 Co＝ヒブリド化すべき初期DNAのヌクレオチド
モル濃度、 Ro＝ヒブリド化すべき初期RNAのヌクレオチド
モル濃度、 KR＝RNA−DNAヒブリド化に関する速度恒数、 ｔ＝時間（秒）、 Ｒ／Ro＝0.75（75％反応完結）、 KR＝472〔KR＝１／12Kd（ジエー・カセイおよび
エヌ・ダビドソ ン、上記）であり、こ
こで Kd＝ヒブリド化の選択条件下におけるDNAの２
次速度恒数、かつ Kd＝1.7×105×L1／２×N-1〔ジエー・アール・
ハツトンおよびジ エー・ジー・ウエトム
ア、「バクテリオフアージX174DNA−RNAヒブ
リドの変性：RNA長さ効果および核化速
度恒数」、ジヤーナル・モレキユラ ー・バ
イオロジー、第77巻、第495〜500頁（1973）〕、 Ｌ＝900〔b.p.における鎖長；約900は完全IFN−
αcDNA挿入物中に存 在する〕 Ｎ＝900〔ヒブリド鎖のb.p.における複合度；ここ
で複合度が900である理 由は、IFN−
αmRNAの900個のヌクレオチドがIFN−αcDNA
挿入 物の900個の相補的ヌクレオチドと結合
するからである〕 Co＝2.5×10-7〔分析に使用すべき予め測定された
20μgの組替え DNA分子を含有する40μlの
溶液に基づいており、ここでもIFN−αc
DNA挿入物は組替えDNA分子の１／12でありか
つ512個のクローンの 少なくとも１個に生
ずると仮定し、一つのDNA塩基対の平均分子量
として６ 62を与える〕 Ro＝8.7×10-8〔分析に使用すべき予め測定された
12μgのポリ(A) RNAを含有する40μlの溶液
に基づいており、ここでもポリ(A)RNAは１
：10000部のIFN−αmRNAを含有すると仮定
し（大過剰のDNAを 与えれば異なる比率
はヒブリド化の割合に対し殆んど影響を与えな
い）かつＲ NAの１個のリボヌクレオチド
の平均分子量として343を与える〕 である】。 3.初期分析の実施 工程Ａ：組替えDNA分子混合物の調製および
開裂 所望数の細菌クローンを、上記のように添加さ
れたトリプトン培地寒天板の上に接種し、これは
機械用具を使用して各ミクロ測定穴から一部を寒
天板上に移して行なつた。37℃で培養した後、各
クローンは直径数mmのコロニーを形成した。全て
のコロニーを寒天板から洗い取つて保存し、これ
を接種物として使用して上記のように添加された
トリプトン培地１に三角フラスコ２中にて接
種した。この培養物を37℃にて約0.8の見掛け
OD650（肉眼推定）まで振とうした。１容量の添
加トリプトン培地と170μg／mlまでのクロラムフ
エニコールを培養物に加え、これをさらに37℃に
て16時間振とうした。20mlのクロロホルムを加
え、培養物を37℃にてさらに10分間振とうするこ
とにより細菌を殺した（シー・ワイスマンおよび
ダブリユー・ボル、上記）。培養物をクロロホル
ムからデカントしそして細胞を6000rpmかつ４℃
にて15分間遠心分離（ソルバールGS3型ロータ）
して集めた。各１の調製物につき約１〜2gの
細胞が得られた。細胞を30mlの20mMトリス−
HCl（pH7.5）中に懸濁させ、5000rpmかつ４℃に
て20分間遠心分離し（ソルバールSW型ロータ）、
そして30mlの50mMトリス−HCl（pH7.5）中に
再懸濁させた。0.25容量のリゾチーム溶液
〔50mMトリス−HCl（pH7.5）中10mg／ml〕を加
え、０℃にて10分間冷却した後0.33容量（初期
50mMトリス−HCl培養物懸濁液の容量に対し）
の0.5M EDTA（pH8.0）を振とうなしに静かに
混入させた。０℃でさらに10分間の後、１／16容
量（初期容量に対し）の２％トリトンＸ−100を
加えた。60分後、試料をソルバールSW型ロータ
にて10000rpmかつ０℃で60分間遠心分離した。
上澄液を磁気攬拌機を備えたビーカー中に移し、
3MのNaOHを攬拌下に加えてpH12.5に到らしめ
た〔ガラス電極と、オリオンリサーチ601型pH計
とを使用し、ベツクマンpH10炭酸塩緩衝液（No.
3505）にて較正し、20℃にて測定した〕。20℃に
て10分間攬拌した後、pHを8.5に調整した。さら
に３分間攬拌した後、１／９容量の5M NaClと
１容量のフエノール（蒸留しかつ9.5M NaClで
平衡化させたもの）とを加えて激しく攬拌を５分
間続けた。10000rpmかつ０℃にて10分間遠心分
離（ソルバールGSA型ロータ）して相分離させ
た。型ＩのDAN（環状二重鎖DAN）を含有する
上澄液を中間相（単一鎖DANを含有する）から
注意して取り出し、クロロホルムで３回抽出した
（フエノールは大部分がこの工程で除去された）。
型ＩのDANフラクシヨンは、分析用に選択され
た512個のクローンの一部を構成するような宿主
細胞を形質転換させるのに最初に使用した組替え
DNA分子（pBR322−cDAN挿入物）を含有する
であろう。 パンクレアチンRNAアーゼＡ（５mg／ml85℃
にて10分間予備加熱）を型ＩのDANに20μg／ml
の濃度まで加え、混合物を37℃にて60分間培養し
た。１／５容量の5M NaClを加え、この混合物
を30％ポリエチレングリコール6000（ユニオンカ
ーバイド社、120℃にて20分間オートクレープに
かけたもの）により最終濃度7.5％PEGまで調整
した。−10℃にて２〜16時間の後、沈澱を
8000rpmかつ０℃にて20分間ソルバールSW型ロ
ータで遠心分離して集め、0.075MのNaClと
0.0075Mのクエン酸ナトリウムとの中に吸光度20
（260nmにて）まで溶解させ、そして0.5％SDSに
調整した。この溶液をプロナーゼ0.5mg／ml（20
mg／mlにて37℃で２時間自己消化させたもの）
と共に37℃にて30分間培養し、１容量の蒸留フエ
ノールで３回および１容量％のクロロホルムで２
回抽出した。試料（１mg／mlDAN溶液の2mlま
で）を50mMトリス−HCl（pH7.5）、1mM
EDTA中の５〜23％蔗糖濃度勾配にて、ベツク
マンSW27型ロータにより21000rpmかつ15℃で15
時間遠心分離した。フラクシヨンを集めてOD260
を測定した。DAN含有フラクシヨンを集め、
DANを酢酸ナトリウムとエタノールとにより沈
澱させた。遠心分離により20〜100μgの型Ｉの
DAN混合物が回収された。 20μgの精製された型ＩのDANを、150μlの
10mMトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2
50mM NaCl、6mM2−メルカプトエタノール、
200μg／mlBSAもしくはゼラチン、および20単
位のHind（ニユーイングランド・ビオラプ社）
の中で切断した。このHind制限酵素はpBR322
成分内の部位において型ＩのDANを開裂させる
（cDAN成分も開裂されるとは思われず、もしそ
うならば分析は実質的に影響を受けない筈であ
る）。37℃で２時間の後、一部（１％）を50mM
トリス−酢酸（pH7.8）、2mM EDTA中の１％
アガロースゲルにより50mAで１時間電気泳動し
て分析し、切断が完結したかどうか確認した。切
断が未完結であれば、さらにHindを加えて培
養を２時間続けた。型ＩのDANが完全に線状分
子まで変換されたら、プロナーゼ（カルビオケム
社）とEDTAとSDSとをそれぞれ0.5mg／ml、
10mMおよび0.5％となるまで加えた。37℃で30
分間の後、溶液を30μlフエノール−クロロホルム
（１：１）にて抽出した。有機相を50μlの20mM
トリス−HCl（pH7.5）、1mM EDTAで洗浄し、
そして合した水相をエーテルで３回抽出し、
0.1mlチエレツクスカラムを通して濾過し、
EDTA−煮沸したパイレツクスチユーブに集め
て、１／10容量の3M酢酸ナトリウムと2.5容量の
エタノールとにより再沈澱させた。−20℃にて一
晩静置した後、DANを遠心分離により集めた。 工程Ｂ：ポリ(A)RNAによるDANのヒブリド化 ２種のヒブリド化混合物を調製した。混合物Ｉ
は、4μlの10倍濃度のヒブリド化緩衝液（4M
NaCl、0.1パイプス（pH6.4、１，４ピペラジン
−ジエタンスルホン酸、シグマ社）と、50mM
EDTAと、0.5μlの約5ngのI125−グロビン
mRNA（5000cpm）、6μlの誘発白血球ポリ(A)
RNA（2μg／μl）とを、卵母細胞中に注入した場
合、6000IUのIFNを発生するに足る量で含有し
た。混合物は、10μlの上記からのHindで切
断された型ＩのDANと、0.1μgのPst−切断さ
れたＺ−pBR322（H3）／RcβG−4.13（Hind部
位にβ−グロビン配列を含有するpBR322誘導
体）〔マンテイ等、「クローン化した兎β−グロビ
ン染色体DANにより形質転換させたねずみＬ細
胞における兎β−グロビンmRNAの生産」、ネイ
チヤー誌、第281巻、第40〜46頁（1979）〕とを含
有した。混合物におけるI125−グロビンmRNA
および混合物におけるβ−グロビンDANは、
ヒブリド化分析に対する内部陽性比較として作用
する。両混合物を窒素ガス流中にて乾燥した。
40μlの80％ホルムアミドを混合物の残部に加
え、溶液を100℃にて10分間変性させて、氷中に
て迅速に冷却した。変性溶液を使用して混合物
の残部を溶解させ、得られた溶液を56℃にて４時
間培養した。 工程Ｃ：非ヒブリド化ポリ(A)RNAからのヒブ
リド化ポリ(A)RNA−クローンの分 離 1mlを冷0.9M NaClと0.09Mクエン酸ナトリウ
ムとホルムアミド（100％）とで４％（容量で）
まで希釈した後、溶液をミリポアフイルター
（0.45μm孔径）にて0.5ml／min.の速度で濾過し、
フイルターを先ずRNA−DNAヒブリドを保持す
る能力について試験した。何故なら、製造業者か
ら得られたフイルターは必ずしも全てが同等に効
果的でないからである。 工程Ｄ：ヒブリド化ポリ(A)RNAの精製 ポリ(A)RNAヒブリドを付着した上記のフイル
ターを1mlの0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナト
リウム、0.5％SDSに37℃にて10分間浸漬し、
50mMトリス−HCl（pH7.5）、10mM MgCl2、
2mM CaCl2で洗浄しそして0.6mlの新たな緩衝液
中に入れた。5μlのヨード酢酸処理したDNAアー
ゼ（５mg／ml）を添加した後〔エス・ビー・チ
ンメルマンおよびジー・サンデイーン・アナリテ
イカル・バイオケミストリー、第14巻、第269頁
（1966）、ピー・エー・プライス等、「牛膵臓デオ
キシリボヌクレアーゼの活性部位におけるヒスチ
ジン残基のアルキル化」、ジヤーナル・バイオロ
ジカル・ケミストリー、第244巻、第924〜932頁
（1969）〕、フイルターを37℃にて10分間培養した。 フイルターを除去し、溶液を１容量のフエノー
ルと１容量のエーテルとで抽出しそして0.1mlチ
エレツクスカラムに通した。5μgのキヤリヤ
RNA（精製酵母RNA）を溶液に加え、RNAを酢
酸ナトリウムとエタノールとで沈澱させた。
10000xgでの遠心分離により沈澱を集め、100μl
の1mM EDTA中に溶解させ、100℃にて90秒間
加熱し、TNEとSDSとを2xTNEおよび0.5％
SDSになるまで加えた。RNAを100μlのオリゴ
（dT）セルロースカラムに吸着させ、0.3mlの蒸
留水で４回洗浄して溶出させ、酢酸ナトリウムと
エタノールとで沈澱させた。−20℃で16時間の後、
沈澱したRNAを遠心分離により分離し、2μlの
TNK緩衝液中に溶解させた。 工程Ｅ：IFN−αmRNA活性の測定 上記からのポリ(A)RNA溶液を40個の卵母細胞
中に注入した（卵母細胞１個当り約50nl）。卵母
細胞を23℃にて24〜48時間培養し、ホモジナイズ
しそして遠心分離し（または培養培地を回収し）、
前記したようにIFN−αにつき分析した。4.後分
析：フイルター結合したDNAに対するヒブリド
化 単一クローンからの組替えDNA分子の後分析
は大部分、DBMもしくはDPT紙結合したDNA
について行なつた。何故なら、分析条件はもはや
臨界的でなくかつ分析がより便利となるからであ
る。DPT紙はより低い誤差を与え、したがつて
優先的に使用した。DBM紙は文献〔ジエー・シ
ー・アルウイン等、「ジアゾベンジルオキシメチ
ル紙への移行によるアガロースゲルにおける特定
RNAの検出およびDNA試料によるヒブリド化の
方法」、プロシーデイング・ナシヨナル・アカデ
ミー・サイエンス・USA、第14巻、第5350〜
5354頁（1977）に記載されているように調製し
た。APT紙はビー・シード（ペルス・コミユー
ニケーシヨン）の方法により調製した：ワツトマ
ン540の紙片（20g）を70mlの0.5M NaOH、２
mg／ml NaBH4および30mlの１，４−ブタンジ
オールジグリシジルエーテルの混合物と共に20℃
にて16時間攬拌した。次いて、この紙をアセトン
40ml中の２−アミノチオフエノール10mlの溶液
に移し、10時間攬拌した。紙をアセトン、0.1N
HCl、H2O、0.1N HCl、H2Oで徹底的に洗浄し
そして乾燥させた。APT紙を、ABM紙から
DBM紙への変換について記載されていると同様
に、DPT紙に対しジアゾ化させた〔アルウイン
等、上記〕。 DNA（15μgまで）を50mm2のジアゾ化ABM
（DBM）またはジアゾ化APT（DPT）紙に結合
させ〔ジエー・エツチ・ジエー、ヘイジメーカー
等、「トリパノソマ・ブルセイの表面グリコ蛋白
変種のためのメツセンジヤーRNAに相補的な
DNAを含有するプラスミドの単離」、ジーン誌、
印刷中（1980）〕、これを下記に示す。 ヒブリドプラスミドDNAをエンドヌクレアー
ゼPstIで切断し、1ml当り500μgのプロナーゼと
0.5％のSDSと10mMのEDTAとで37℃にて30分
間処理し、フエノールとエーテルとで抽出し、
0.1mlのチエレツクスカラムに通しそしてエタノ
ールで沈澱させた。熱変性したDNA（5μgまで、
少量のP32−DNAをトレーサーとして加えた）を
１cm2のDBMもしくはDPT紙と共に200μlの
25mM燐酸カリウム緩衝液（pH6.5）中で０℃に
て一晩培養した。濾紙を、50mM燐酸カリウム緩
衝液（pH6.5）、１％グリシンにて室温で５分間
３回および99％再結晶化ホルムアミドで３回洗浄
した。99％ホルムアミドと共に68℃にて２分間さ
らに培養した後、50mM燐酸カリウム緩衝液
（pH6.5）中で20℃にて３回および0.4M NaOH
中で37℃にて10分間２回洗浄した。約40〜60％の
放射能がフイルター上に保持された。フイルター
を、１％グリシンを添加した予備ヒブリド化培地
Ａ中で38℃にて３時間培養し、この場合フイルタ
ー１個当り330μlを使用した。培地Ａは、50％ホ
ルムアミドと、5xSSCと0.04％ポリビニルピロリ
ドンと0.04％フイコール（フアーマシア社）と
0.1％SDSと25μgポリ(A)（ビー・アンド・エル社）
と100μg酵母RNA（BDH、フエノールで６回抽出
し、エタノールで沈澱させたもの）とを含有す
る。フイルターを培地Ａ中で２回洗浄し、次いで
培地Ａ中にてパラフイン油の下で上記したように
ポリ(A)RNAにより（通常５〜8μg）38℃にて16
時間ヒブリド化させた。RNAは次のようにして
付加させた。一枚の濡れたDNAフイルターを吸
水させ、無菌ペトリ皿中に入れ、このフイルター
上に20〜40μlのRNA溶液をピペツトで載置し、
第二のDNAフイルター（再現または比較）をそ
の上に載せ、そしてこのサンドイツチを無菌パラ
フイン油で覆つた。ヒブリド化の後、フイルター
を順次に培地Ａ（２回）、1xSSCと0.2％SDSと
1mMEDTAとを含有する溶液（それぞれ20℃で
10分間３回）、培地Ａ（38℃で２時間）および50％
ホルムアミド、5XSSC、0.1％SDS（20℃で10分間
３回）で洗浄した。ヒブリド化したRNAを、
200μlの10mMトリス−HCl（pH7.4）、1mM
EDTAおよび0.1％SDS中で100℃にて１分間加熱
することにより溶出させた。溶出工程を２回反復
し、溶出液を合し、そしてRNAを2μgの酵母
RNA（上記のように精製したもの）の添加の後、
エタノールにて沈澱させた。洗浄したペレツトを
減圧乾燥し、3μlのH2O中に溶解させそして卵母
細胞中に注入した。IFN−α活性を上記のように
分析した。 5.RNA選択ヒブリド化分析の結果 512個のクローンの８群（すなわち、群Ｔ、Ｙ、
Ｊ、Ｋ、．、Ｏ、εおよびπ）の分析は陰性であつ
た。512個のクローンの４群（すなわち、Ｉ，Ｓ，
Ｎおよびλ）の分析は陽性であり、ただし同一で
なかつた。陽性分析は次のように記録される：ポ
リ(A)RNA−DNAヒブリドから遊離されたRNA
により生成されたIFN−αのIU／ml〔Ｚ−
pBR322（H3）／RcβG−4.13（上記）を使用する
比較ヒブリド化の分析〕；ここで実験結果が比較
よりも高い分析値には下線を施こした。群 IU／ml Ｉ＜60（＜60）；110（＜20）；＜110 （＜110）；＜110（＜110）；＜35（＜35） δ 20（＜20） Ｎ 35（＜20）；＜110（＜110）；200（＜110） λ ＜60（＜60）；60（＜20）；＜110（＜110）； ＜110（＜110） 群λを64個のクローンの８つのサブグループに
分割し、ヒブリド化させ、そして前記のように分
析した。サブグループは上記と同様に表わして、
次の結果を与えた：サブグループ
IU／ml λ−Ｉ ＜35（＜35）；＜35（＜35） λ− 130（＜30）；＜45（＜45） λ− 225（＜35）；35（＜30）；35（＜30）； 600（＜30）；＜20（＜20） λ− 85（＜35）；＜25（＜25） λ− ＜35（＜35） λ− ＜35（＜35） λ− ＜35（＜35） λ− ＜35（＜35） サブグループλ−を８個のクローンの８組に
分割し、ヒブリド化させそして分析した。 組 IU／ml λ−−１ ＜20（＜20）；＜20（60）；35（＜30） λ−−２ ＜35（＜35）；＜30（＜30）；150 （＜20）；600（＜35）；110（60） λ−−３ ＜25（＜25）；＜30（＜30） λ−−４ 30（＜30）；＜20（＜20）；＜20（60） λ−−５ 30（？）（＜35）；＜20（＜20）； ＜35（60） λ−−６ ＜30（＜30）；＜０（＜20） λ−−７ ＜30（＜20） λ−−８ ＜30（＜20） 第一の陽性結果は組λ−−４により達成され
たので、この組の個々のコロニー（Ａ〜Ｈと云
う）をヒブリド化させかつ分析した。 λ−−４−Ｂ ＜35＊（＜35）；＜20（60） λ−−４−Ｃ 35（60）；60＊（＜35）；111＊ （＜11）；11＊（＜11）；20（＜
20） ＊ DBM紙をこの分析に使用した。 したがつて、クローンλ−−４−Ｃは、IFN
−αmRNAをヒブリド化しうる組替えDNA分子
を含有する。 このクローンにおける組替えDNA分子は次の
通りである：Ｚ−pBR322（Pst）／HclF−4C
（“Hif−4C”）およびこれを含有する細菌菌株：
イー・コリX1776（Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−
4C）（“イー・コリHif−4C”）。この名称は、組替
えDNA分子がチユーリツヒ（Ｚ）に起源しかつ
Pst部位にHIFN−αcDNA（“HcIF”）を含有す
るプラスミドpBR322であることを示し、特定の
組替えDNA分子はクローンλ−−４−Ｃ
（“4C”）に由来する。 Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−4Cの再クローン
化および特性化 形質転換細胞の第一次クローンはしばしば２種
以上の組替えDNA分子を含有するので〔エフス
トラチアジス等、「クローン化DNAから決定され
た兎β−グロビンmRNAの第一次構造」、セル
誌、第10巻、第571〜585頁（1977）〕、Hif−4Cを
イー・コリX1776（Hif−4C）クローンから単離
して上記のように精製した。Hif−4Cおよび
pBR322の試料をPstで切断し、１％アガロー
スゲル上での電気泳動により分析した。Hif−4C
は２つのバンドを与え、１つはPst−開裂
pBR322の移動度を有し、他方は約320b.p.に相当
する移動度を有した。 イー・コリHB101を上記のように単離Hif−4C
により形質転換させた。テトラサイクリン耐性か
つ形質転換した細菌の６個のクローンを採取し、
小培養物を調製し、型ＩのDNAを精製しそして
Pst開裂およびアガロースゲル電気泳動により
前記と同様に分析した。全ての試料は、Hif−4C
と同一の開裂様式を示した。これらの再クローン
化した組替えDNA分子の１つはＺ−pBR322
（Pst）／HcIF−4c（“Hif−4c”）と呼ばれ、後の
実験用に使用した。小文字“ｃ”は再クローン化
したDNA分子を意味する。 IFN−αmRNAにヒブリド化するHif−4cおよ
びそのcDNA挿入物の能力を測定するため、Hif
−4c（115μg）を125単位のPstにより完結する
まで切断し、フエノールとクロロホルムとで抽出
しそして上記したようにエタノールで沈澱させ
た。１部（10μg）を5′末端標識した（後の工程に
おけるトレーサーとして役立つ）が、これは
100μlの50mMトリス−HCl（pH7.5）中に１部を
溶解させ、これを0.1mlのチエレツクス100型カラ
ムに通しそしてこれを0.6単位の細菌性アルカリ
ホスフアターゼにより65℃で１時間処理して行な
つた。10倍濃度のTNE（40μl）を加え、この溶液
を１容量のフエノールで３回および１容量のクロ
ロホルムで３回抽出した。DNAを２容量のエタ
ノールで−20℃にて一晩沈澱させ、遠心分離によ
つて回収した。さらに精製するため、0.5mlTNA
中の試料を0.25mlのDEAEセルロース（ワツトマ
ンDE52、2mlの150mM、NaCl、50mMトリス−
HCl（pH7.5）、2mM EDTAにて予備洗浄）
（“NET−緩衝液”）に吸着させ、2mlのNET緩衝
液で洗浄し、0.4mlの1.5M NaCl、20mMトリス
−HCl（pH7.5）、2mM EDTAにて溶出させそし
て上記のようにエタノールで沈澱させた。Ｄ
NAをγ−P32−ATP（比活性約5000Ci／ミリモ
ル）およびポリヌクレオチドキナーゼと共に培養
し〔エー・エム・マクサムおよびダブリユー・ギ
ルバート、「DNAの新規な配列決定方法」、プロ
シーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サイエ
ンス・USA、第74巻、第560〜564頁（1977）〕、
そしてTNE中3mlのセフアデツクス−G50カラム
でクロマトグラフにかけて精製した。溶出させた
フラクシヨンを集め、P32−DNAを上記のように
エタノールで沈澱させた。収量は約107dpmであ
つた。 未標識Pst−開裂Hif−4cDNA（90μg）を上
記からの６×105dpmのP32−標識Pst−開裂Hif
−4cDNAと混合し、50mMトリス−酢酸緩衝液
（pH7.8）中の10×20×0.7cmの２％水平アガロー
スゲルに2.5cmスロツトにより通して電気泳動さ
せた。Ｘ線フイルムをゲルに露出させ、320bp断
片の位置を決定した。放射能バンドを有するゲル
片（1.3×105dpm）を切り取り、プラスチツク製
2ml注射器で圧砕し、ゲル容積の10倍量のNET
緩衝液と共に攬拌することにより４℃で一晩抽出
した。DNAを0.1mlのヒドロキシアパタイトカラ
ム（1mlのNET緩衝液で予備洗浄）に吸着させ
た。カラムを1mlの0.1M燐酸カリウム緩衝液
（pH7.5）で洗浄し、DNAを0.2mlの1M燐酸カリ
ウム緩衝液（pH7.5）で溶出させた。溶出液を滅
菌蒸留水で10倍に希釈し、DNAをDEAEに吸着
させかつそこから溶出させそして上記したように
エタノールで沈澱させた。このDNAを“Hif−
4c断片”と呼ぶ。 Hif−4c断片（120ng）をDPT紙（0.5×0.5cm）
に上記のようにして結合させた。比較としては、
120ngのβ−グロビンcDNA断片をヒブリドプラ
スミドＺ−pBR322（H3）RcβG−4.13からHind
により切断し〔エフ・マイヤー等、「ベクトル
からベクトルへの、AT結合したクローン化
DNAの転位」、エキスペリメンチア、第35巻、第
972頁（1979）；エヌ・マンテイ等、上記〕、そし
て同様に処理した。ポリ(A)RNA（20μl）に対する
複製フイルターのヒブリド化と、フイルターの洗
浄と、フイルターからのRNAの回収とは上記と
同様にして行なつた。卵母細胞中に注入した後、
次のIFN−α活性が検出された。 【表】 かくして、Hif−4cはIFN−αmRNAにヒブリ
ド化しうる挿入物を含有する。 Hif−4c中の挿入物にクロスヒブリド化する組替
えDNA分子を含有する大腸菌のクローンの同定 組替えDNA分子Hif−4cにおけるcDNA挿入物
は僅か約320b.p.であつたか、またはIFN−
αmRNAの第三の推定寸法であつたので、上記の
精製Hif−4c断片を試料として使用し、関連ヒブ
リドDNA挿入物を有する組替えDNA分子を含有
する細菌クローンを選別した。 上記したサブグループλ−を構成する64個の
細菌クローンをミリポア膜（直径８cm）上にスタ
ンプし、寒天板（ジアミノピメリン酸、ナリジキ
シン酸およびテトラサイクリンを上記のように添
加）上に載置しそして37℃で24時間培養した。フ
イルターを0.75ml液滴の0.5M NaOH上に載せ、
２〜３分間後に紙タオル上に移して過剰の液体を
除去し、工程を反復した。1Mトリス−HCl
（pH7.5）を用いてフイルターを中和し、上記と
同様にして1.5M NaCl−0.5Mトリス−HCl
（pH7.4）で洗浄し、そして風乾させた。フイル
ターを0.3M NaCl中に浸漬し、風乾し、そして
80℃にて減圧下に２時間加熱した。 Hif−4c Pst断片（30ng）を、β−P32−
dATPとα−P32−dCTP（それぞれ、比活性
40Ci／ミリモル）とを用いてニツク翻訳〔エー・
ジエー・ジエフリーおよびアール・エー・フラベ
ル、「兎β−グロビン遺伝子はコード配列中に大
きな挿入物を含有する」、セル誌、第12巻、第
1097〜1108頁（1977）〕によりP32−標識した。λ
−コロニーを有するフイルターを４セツト〔セ
ツトは0.15M NaCl、30mMトリス−HCl
（pH8.0）、1mM EDTAである〕と0.1％（Ｗ／
Ｖ）フイコールと、0.1％ポリビニルピロリジン
と0.1％（Ｗ／Ｖ）BSAと、0.5％SDSと200μg／
ml変性断片化鮭精子DNAとにおいて68℃で７時
間予備ヒブリド化させ、次いで４セツトと0.02％
（Ｗ／Ｖ）フイコールと0.02％ポリビニルピリジ
ンと0.02％（Ｗ／Ｖ）BSAと0.5％SDSと200μg／
ml変性鮭精子DNAとにおいて２×105cpmのP32
−標識Hif−4c断片にて68℃で16時間ヒブリド化
させた。このフイルターをセツト−0.5％SDSに
より室温で洗浄し、２セツト−0.5％SDSにて68
℃で５時間洗浄し、溶液を１回交換し、3mMト
リズマベースより室温で４時間洗浄し、溶液を１
回交換した。フイルターを乾燥した後、Ｘ線フイ
ルムをスクリーンによりフイルターに80時間露出
させた。３つのコロニー、すなわちλ−−7D、
λ−−2Hおよびλ−−4Cは強力な陽性反応
を示し、そして２つのコロニー、すなわちλ−
−1Eおよびλ−−3Dは弱い反応を示した。 Hif−4c関連クローンから小培養物を調製し、
型ＩのDNAを精製し、Pstで開裂させそして上
記のようにアガロースゲル電気泳動により分析し
た。全ての型のDNAは大きな断片（プラスミ
ドpBR322成分）と小さい断片（ヒブリド挿入
物）とを生じた。λ−−2Hからの組替えDNA
分子は、最大の挿入物、すなわち約900b.p.を遊
離した。この組替えDNA分子をＺ−pBR322
（Pst）／HclF−2H（“Hif−2H”）と名付け、そ
の挿入物を“Hif−2H断片”と名付ける。 Hif−2Hを、そのIFN−αmRNAを結合する能
力につき試験し、これは全て上記したように
DPT紙（4μg／100mm2）に結合させてポリ(A)RNA
（0.3μg／μl）に16時間ヒブリド化させ、そして
IFN−αmRNA活性を測定することにより行なつ
た。 【表】 別の実験において、組替えDNA分子を含有す
るさらに一組の大腸菌クローンを調製し、標識
Hif−4c断片にヒブリド化するコロニーを同定し
た。長cDNA挿入物を有するプラスミドの高収量
を確保するため、白血球ポリ(A)RNAから酵素的
に調製した二重鎖P32−標識白血球cDNAの１部
を、ポリ(A)RNAの遠心分離について記載したと
同じ手順で蔗糖濃度勾配により遠心分離して寸法
的に分別した。600b.p.DNA断片もしくはそれ以
上に対応した沈降速度を有するcDNAを含有する
フラクシヨンを集め、エタノール沈澱の後に
cDNAを回収した。cDNAをdCMP残部により伸
長させ、dGMP伸長したPstI開裂pBR322にヒブ
リド化させそしてこのヒブリドDNAを使用して
前記のように大腸菌を形質転換させ、この場合大
腸菌としてイー・コリHB101を使用した。細菌
を直径８cmのミリポアフイルター上に分布させ、
トリプトン培地寒天板（10μg／mlのテトラサイ
クリンを含有する）の上に載置しそして小コロニ
ーが出現するまで生育させた。新たな濡れたミリ
ポアフイルターをコロニー保持フイルターの上に
押圧させ、剥離し、その面を上に向けて4.4％グ
リセリン含有の寒天板の上に載置しそして小コロ
ニーが出現するまで培養することにより、複製フ
イルターを調製した。このコロニー保持フイルタ
ーをさらにミリポアフイルターで覆い、−55℃に
て凍結させて貯蔵した〔デイー・ハナハンおよび
エム・メセルソン、「高密度プラスミド選別に関
する記録」、1978年９月私的通信〕。全部で約5000
個のコロニーを保持する15枚のフイルターを調製
した。各フイルターの一複製物を用いて、上記し
たと正確に同様に、P32−標識Pst−切断Hif−
4cDNA断片にヒブリド化させた。約185個の陽性
コロニーが放射能写真上で同定され、ミリポアフ
イルター上で再クローン化させそしてヒブリド化
により再度同定した。最強のヒブリド化反応を示
す95個のクローンをＺ−pBR322（Pst）／HclF−
SN1乃至SN95と名付け、後の研究に使用した。 勿論、HuIFNの免疫学的もしくは生物学的活
性（下記）を示すポリペプチドを生産する能力が
Hif−2hに与えられているので、このHif−2hお
よびその他のこれに関連するDNA配列、たとえ
ばHif−4cをこのクローン選別法に使用すること
ができ、さらに組替えDNA技術、合成、天然源
もしくはそれらの組合せから生ずるDNA配列を
含有する他のクローン、或いは単一もしくは多重
のベース置換、挿入、転位もしくは欠失を含む突
然変異により他のDNA配列を選別するよう上記
DNA配列のいずれかに関連するクローンおよび
HuIFNをコードするクローンについても全く同
様に使用できることが明らかである。したがつ
て、この種のDNA配列およびそれらの同定も本
発明の範囲内である（たとえば下記）。また、上
記DNA配列により選別されず、しかもそれらの
ヌクレオチド配列の結果、上記DNA配列の発現
によりコードされたポリペプチドを発現において
コードするようなDNA配列も本発明の範囲内で
ある。 Hif−2hDNA挿入物の他の特性化 上記したように組替えDNA分子Hif−2hは約
900b.p.の挿入物を含有し、ひと白血球インター
フエロンmRNAにヒブリド化する。 下記の付加的特性をさらに決定した。 1.ヒブリド抑制翻訳 mRNAをクローン化された相補的cDNAにヒ
ブリド化させれば、mRNAの翻訳は抑制される
が、ヒブリドの熱変性は翻訳可能なmRNAを遊
離する〔ビー・エム・パターソン等、「DNA−
mRNAヒブリド−抑制された無細胞翻訳による
構造遺伝子同定および地図化」、プロシーデイン
グ・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス・
USA、第74巻、第4370〜4374頁（1977）〕。2.2μg
のPst−切断Hif−2hおよび比較として2μgの
Hind−切断Ｚ−pBR322（H3）／RcβG−4.13
（“RcβG”）を、10μlの80％（ｖ／ｖ）脱イオン化
ホルムアミド−20mMパイプス緩衝液（pH6.4）
において80℃で10分間変性させた。溶液をエツペ
ンドルフ管に加え、ここには予め白血球ポリ(A)
RNA（5μg）とNaCl（4μモル）とEDTA（10nモ
ル）とを乾燥させておいた。混合物をパラフイン
油層の下で48℃にて７時間加熱し、冷却しそして
200μlのH2Oで希釈した。２つの試料を等部に分
割し、それぞれの一方を100℃にて30秒間加熱し
た。核酸をエタノールにより沈澱させ、3μlの
H2O中に溶解させそして上記のように卵母細胞
中でIFN−αmRNA活性につき分析した。 【表】 したがつてHif−2hは、ポリ(A)RNAにヒブリ
ド化させると、ポリ(A)RNAにおけるIFN−
αmRNAの翻訳を抑制し、そしてヒブリドを変性
させるとIFN−αmRNAは再び翻訳可能になつ
た。この実験により、Hif−2hがIFN−αmRNA
に相補的な配列を含有することが確認される。 2.制限酵素開裂による分析ならびにヌクレオチ
ド／アミノ酸配列および制限地図の決定 各種制限酵素（ニユーイングランド・ビオラブ
社）によるHif−2hの切断を行ない、生じた生成
物をアガロースゲル電気泳動により分析した。下
線を施こした断片はpBR322およびHif−2hに対
し共通でない。 【表】 さらに、5′末端P32−標識Pst切断Hif−2hを
数種の制限酵素で開裂させ、組替えDNA分子中
のcDNA挿入物から生じた放射性断片の寸法を測
定した。 制限酵素 P32−断片＊ EcoR 676、209 Hind 開裂せず Bsp 799、86 Hpa 開裂せず Hha 開裂せず BamH 開裂せず Hinf 210、62 Bgl 545、340 ＊内部的に一致しているが、これら断片の絶
対寸法は第８〜１０図を参照して最 も良く
示される。 これらのデータから、Hif−2hの制限地図を推
定した（第４図）。この地図は部位の絶対位置に
関し決定的でなく、挿入物内のMbo部位に関
し不完全であろう。挿入物に最も近い部位のみが
pBR322成分内に示されている。矢印はIFN−
αcDNAコードストランドの方向性を示してい
る。 本発明のクローンにおけるHif−2h断片もしく
はその他挿入物の実際的構造またはそれからコー
ドされるポリペプチドのアミノ酸配列もしくは構
造は本発明を実施する上で当業者に必要とされな
いが、上記データおよび制限地図を本願出願時に
おける断片構造に関し最も良く利用しうる情報と
して本出願中に含ませる。爾来、期待されるよう
に（上記）、Hif−2h断片に関するこれらデータ
および制限地図は、ヌクレオチド配列決定および
制限分析の周知技術を用いて精選されている〔た
とえば、エー・エム・マクサムおよびダブリユ
ー・ギルバート、「DNAの新規な配列決定方法」、
プロシーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サ
イエンス・USA、第74巻、第560〜564頁
（1977）〕。プラスミドDNAをウイルキーの論文第
861〜862頁に記載された方法Ｂにより調製し〔エ
ヌ・エム・ウイルキー等、「単純疱疹ウイルス
の活性チミジンキナーゼ遺伝子を含有するヒブリ
ドプラスミド」、ヌクレイツク・アシツド・リサ
ーチ、第７巻、第859〜877頁（1979）〕、業者によ
り推奨されるように各種制限酵素で制限化し、た
だし200μg／mlのゼラチンを牛血清アルブミンの
代りに酵素緩衝液中に使用した。〔EcoRはダブ
リユー・ボルから寄贈され、Bspはエー・キス
から寄贈され、その他の酵素はニユーイングラン
ド・ビオラブ社から得られた〕。 制限DNA（20μg）をフエノールで抽出し、エ
タノールで沈澱させ、0.05Mトリス−HCl（pH8）
中に溶解させそしてチエレツクス100の小カラム
に通した。フラツシユ（flush）もしくは5′−結
合末端を有する断片を、200μlの0.05Mトリス−
HCl（pH8）中においてDNA5′末端ｐモル当り0.2
単位の子牛腸アルカリホスフアターゼ（ベーリン
ガー社）により37℃で60分間処理して脱燐酸化さ
せた。酵素を65℃で60分間加熱することにより失
活させた。3′結合末端を有するDNA断片につい
ては、細菌性アルカリホスフアターゼ（ワーシン
グトン社）を文献〔エー・エム・マキサムおよび
ダブリユー・ギルバート、上記〕に記載されてい
るように使用し、ただし培養は65℃にて30分間行
なつた。脱燐酸化DNAはDEAE−セルロースに
吸着および溶出させて精製し〔ダブリユー・ミユ
ーラー等、「DNAにおける部位指向性変異：アミ
ノ酸121〜123に対応する位置におけるクローン化
β−グロビン相補DNAのポイント変異の発生」、
ジヤーナル・モレキユラー・バイオロジー、第
124巻、第343〜358頁（1978）〕、或いはこれを必
要に応じポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
た（下記参照）。ポリアクリルアミド（もしくは
アガロース）ゲルから0.15M NaCl、0.05Mトリ
ス−HCl（pH8）中に回収した断片を0.1mlのヒド
ロキシアパタイト（ビオラドHTP社）カラムに
吸着させ、0.1M燐酸カリウム緩衝液（pH7）1ml
で４回洗浄しそして0.3mlの1M燐酸カリウム緩衝
液（pH7）で溶出させた。この溶液を10倍希釈
し、DNAをDEAE−セルロースに吸着させ、上
記のように回収した〔ダブリユー・ミユーラー
等、上記〕。 エタノール沈澱の後、DNAを〔γ−P32〕
ATP（DNA5′末端ｐモル当り12〜34μCi）および
ポリヌクレオチドキナーゼ（ニユーイングラン
ド・ビオラブ社またはＰ−Ｌビオケミカルス社）
にて、実質的にエー・エム・マキサムおよびダブ
リユー・ギルバート（上記）により記載されてい
るように5′末端標識したが、ただしキナーゼ反応
の前にDNAを変性させなかつた。DNA5′末端ｐ
モル当り１〜1.5μCi〔P32〕ホスフエートの比活性
が得られた。 配列決定のため、標識断片を第二の制限酵素で
開裂させ、そして生成物をトリス−硼酸−
EDTA緩衝液における５％ポリアクリルアミド
ゲルでの電気泳動により分離した。所望の断片を
このゲルから抽出して精製した〔ミユーラー等、
上記〕。配列決定用の各種断片を次のようにして
調製した〔数は、ベース対における名目断片鎖長
を示し、標識部位は星印により示される〕。 (1) BspによるHif−2hの開裂ならびに、レー
ニング緩衝液における５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によるBsp−Bsp−232およ
びBsp−Bsp−949の単離〔ユー・イー・
レーニング、「ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による高分子量リボ核酸の分別」、ジヤーナ
ル・バイオケミストリー、第102頁（1967）〕、 (2) BspによるHif−2hの開裂、標識化、Pst
による開裂ならびにBsp＊−Pst−83およ
びBsp＊−Pst−827の単離、 (3) BglによるHif−2hの開裂、標識化、Pst
による開裂ならびにBgl＊−Pst−336およ
びBgl＊−Pst−570の単離、 (4) MboによるHif−2hの開裂、標識化、Pst
およびHindによる切断（阻害性350bp
pBR322断片を開裂させる）、ならびにMbo
＊−Pst−519およびMbo＊−Pst−351
の単離、 (5) EcoRによるHif−2hの開裂、標識化、Pst
による開裂、ならびにEcoR＊−Pst−
708およびEcoR＊−Pst−198の単離、 (6) PstによるHif−2hの開裂、標識化、Bgl
による開裂ならびにPst＊−BgL−570およ
びPst＊−Bgl−336の単離、 (7) AvaによるHif−2hの開裂、標識化、Pst
およびBglによる開裂ならびにAva＊−
Pst−186およびAva＊−Bgl−147の単
離、 (8) PvuによるHif−2hの開裂、標識化、Pst
およびBglによる開裂ならびにPvu＊−Pst
−486の単離。 断片を、エー・エム・マキサムおよびダブリユ
ー・ギルバート（上記）の方法により減成させた
が、この場合同著者により1978年９月に示された
報告の変法を用いた。生成物を、50mMトリス−
硼酸、1mM EDTA（pH8.3）中で0.1×25×36cm
の12％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミ
ド／ビスアクリルアミド＝18／１）により分別化
させ、その際700ボルトで６時間の予備処理の後、
900ボルトで２，８，18および26時間処理した。
最良の結果は、ゲルを使用前２〜３日間にわたり
室温に維持した場合に得られた。 各長さのcDNA挿入物を両ストランドから配列
決定し、標識末端として役立つ各制限部位を緊張
させた断片により配列決定した。かく得られたヌ
クレオチド配列を第８〜１０図に示す。予期され
るように、この挿入物における各制限部位の位置
は、制限酵素開裂のみにより測定される位置より
も完全に位置決定され、これを第４図に示す。 第８〜１０図について見ると、挿入物のヘテロ
重合部分は5′末端における23G残基および7A残基
（恐らくmRNAのポリ(A)末端を反映する）によ
り、ならびに3′末端における15C残基により示さ
れる。参考のため、挿入物は、dG末端に続く第
一ヌクレオチドからポリ(A)残基の前の最終ヌクレ
オチドまで番号が付けられる。位置57〜59におけ
るATG開始トリプレツトおよび位置624〜626に
おけるTAA停止トリプレツトは、ナンセンスコ
ドンにより中断されない解読枠を規定する。挿入
物におけるこの領域内の２つの他の解読枠はそれ
ぞれ18個および12個のナンセンスコドンを有す
る。さらに異なる解読枠におけるATGもしくは
GTGおよび停止信号により示されて25個以上の
アミノ酸のポリペプチドをコードする他の配列
は、それぞれヌクレオチド226と304との間、640
と778との間および683と743との間に存在する。
したがつて、ヌクレオチド57と626との間の領域
は、恐らく本発明におけるIFN−αの生物学的も
しくは免疫学的活性を示すポリペプチドをコード
するようなHif−2h断片のヌクレオチド配列を含
むと思われる。 勿論、通常の方法〔エー・エフストラチアジス
等、上記〕によるポリ(A)RNAからのクローン化
cDNAは5′末端ヌクレオチドを欠失しかつ人工的
配列さえ含みうることを了解すべきである〔アー
ル・アイ・リチヤード等、「成鶏β−グロビン
cDNAの分子クローン化および配列分析」、ヌク
レイツク・アシツド・リサーチ、第７巻、第1137
〜1146頁（1979）〕。したがつて、ヌクレオチド57
〜59に位置するATGが標準mRNAの最初の
ATGであるとは限らない。しかしながら、以下
の説明の目的で、ヌクレオチド57〜59における
ATGが標準mRNAの最初のATGであると仮定
する。 挿入物のこの領域によりコードされるポリペプ
チドを標準ひとリンパ芽球細胞インターフエロン
の35個末端アミノ酸、すなわち、−−
SerAspLeuProGlnThrHisSerLeuGlyAsnArgAr
ｇＡｌａＬｅｕＩｌｅＬｅｕＬｅｕＡｌａＧｌｎＭｅｔ
ＧｌｙＡｒｇＩｌｅＳｅｒＬｅｕ
ＰｈｅＳｅｒＣｙｓＬｅｕＬｙｓＡｓｐＡｒｇＨｉｓＡ
ｓｐ−−〔ケー・シ
ー・ズーン等（上記）およびエム・フンカピラー
およびエル・フード（上記）により決定〕と比較
すれば、選択解読枠は適正であり、ヌクレオチド
57〜124は「成熟」ポリプチドをコードするヌク
レオチド配列に先立つ信号配列をコードしうるも
のと思われる。何故なら、公表された配列と決定
された配列とを並べて見ると（第24番目以降のア
ミノ酸）、顕著な一致性を示すからである（すな
わち26〜35アミノ酸）。 成熟核mRNAにおいて、5′末端からの第一
AUGトリプレツトは通常、蛋白合成に対する開
始部位である〔エム・コザツク、「成熟核リボソ
ームはどのようにしてメツセンジヤーRNAにお
ける開始域を選択するか」、セル誌、第15巻、第
1109〜1125頁（1978）〕。リンパ芽球細胞インター
フエロンの第一アミノ酸に対応するHif−2h断片
中のコドンは第一AUGからの22個のコドン（お
よび第二AUGからの14個のコドン）であり、こ
れはインターフエロンをコードする配列に先立つ
て、23個（もしくはそれ以下の恐らく15個）のア
ミノ酸の信号ペプチドを決定する配列があること
を示している。長い方の推定信号配列は11個の疎
水性アミノ酸の非中断系列を含有し、短い方のも
のは６個の疎水性アミノ酸のものを含有する。疎
水性残基のこの蓄積が信号配列の特徴である〔ビ
ー・デイー・デビスおよびピー・シー・タイ、
「膜を透過する蛋白質分泌のメカニズム」、ネイチ
ヤー誌、第283巻、第433〜438頁（1980）〕。 「成熟」IFN−αポリペプチドに明らかに対応
するヌクレオチド配列は498個のヌクレオチドか
らなり、166個のアミノ酸をコードする。カルボ
キシ末端処理がないと仮定すれば、インターフエ
ロンポリペプチドの分子量は19388である。コー
ド配列の基本組成は50％GCである。インターフ
エロンコード配列内のコドン使用は、一般に哺乳
類mRNAに対して示されたものとよく一致する
〔アール・グランタム等、「コドンカタログ使用お
よびゲノム仮説」、ヌクレイツク・アシツド・リ
サーチ、第８巻、第49〜62頁（1980）〕。観察され
る全ての変化は、関与する少数に起因する。 勿論、Hif−2h断片につき第８〜１０図に示さ
れたポリペプチドの構造は、生体内酵素との相互
作用、たとえばグリコソレーシヨン
（glycosolation）によりもたらされたポリペプチ
ドに対する変更を何も考慮に入れていない。した
がつて、この構造は生体内で生産されるIFN−α
とは同一でないが、たとえ同一でないにしろ極め
て類似した生物学的および免疫学的性質を有する
と理解せねばならない。さらに、この構造は、た
とぜば単一もしくは多重のベース置換、欠失、挿
入もしくは転位を含む突然変異またはこの構造の
化学的誘導化のような他の変化がIFN−α活性を
も示す化合物を生成させうることを示唆する。 3.挿入IFN−αcDNAのプラスストランドの決定 mRNAと同じ配列を有するDNA鎖をプラスト
ランドと名付け、その相補体をマイナスストラン
ドと名付ける。IFN−αcDNA挿入物のプラスス
トランドは第５図に示すように同定された。Hif
−2hDNAを制限酵素Bglによつて開裂させ、
末端をP32−燐酸によつて標識し（Pst−開裂末
端について記載したように）そしてDNAをPst
により切断して、より長い（545b.p.（上記した精
度のより大きい分析法により測定して570b.p.））
放射性断片と、より短い（340b.p.（上記した精度
のより大きい分析により測定して336b.p.））もの
と生成させた。これら断片を変性させそして誘発
白血球からのポリ(A)RNAに対し80％ホルムアミ
ド、0.4M NaCl中において、すなわちDNA−
DNA再結合が生じないような条件（上記）の下
でヒブリド化させた。核酸をヌクレアーゼS1で
切断し、これは全ての単一鎖核酸、特に非ヒブリ
ド化P32−DNAを減成し、そして生成物をポリア
クリルアミドゲルで分離した〔アール・エフ・ウ
イーバーおよびシー・ワイスマン、「バークーシ
ヤープ法の変法によるRNAの地図化」、ヌクレイ
ツク・アシツド・リサーチ、第７巻、第1175〜
1193頁（1979）〕。放射能写真は、短い方のヌクレ
オチド断片のみがヒブリド化されかつポリ(A)
RNAにより保護されていることを示し、この
5′−標識短ヌクレオチド鎖をマイナスストランド
と同定した。プラスストランドの方向性は、した
がつて、第４図および第５図（右手側）に示され
る通りである。 4.非誘発ひと白血球からのポリ(A)RNAはHif−
2hDNAにヒブリド化しない例 前節に記載したと同じ実験を行なつたが、ポリ
(A)RNAは、センダイウイルス誘発白血球の場合
と同じ手順により調製した非誘発ひと白血球から
のものとした。検出しうる量の標識DNAは保護
されなかつた。前節の結果と比較して、非誘発細
胞からのポリ(A)RNAは、誘発細胞からのポリ(A)
RNAにおけるよりも約１／20以下の量の、Hif
−2hにヒブリド化しうるmRNAを含有する。 Ｚ−pBR322（Pst）／HclF−4cに関連した組替
えDNA分子を含有する大腸菌による、インター
フエロン活性を有するポリペプチドの合成 pBR322のPst部位は、β−ラクタマーゼ
（ペニシリナーゼ）遺伝子内に存在する。したが
つて、コードDNA断片（たとえば、遺伝子の全
部または一部からなるcDNA）を適正方向および
適正解読枠における位置に結合すれば、融合蛋白
質が得られる。この蛋白質は、β−ラクタマーゼ
のアミノ末端部分からなり、それに続いて挿入
DNA配列がコードするアミノ酸配列が存在する
（エル・ビラーカマロフ等、上記）。挿入DNA断
片がそれ自身の開始信号を含むDNA配列からな
りかつβ−ラクタマーゼ配列と一致する停止信号
を備えた配列を有すれば、停止および再開始が第
二開始信号において起こり、非融合活性蛋白質が
生ずるであろう（エー・シー・ワイ・チヤング
等、上記）。Hif−4cに関連したDNA挿入物が適
正解読枠中に挿入されてβ−ラクタマーゼ遺伝子
内で発現するのを確保するため、一組のpBR322
の誘導体、すなわちpKT279、pKT280および
pKT287〔ケー・タルマツジ等、「信号配列コード
化領域における独特なPstクローン化部位を有
するプラスミドベクターの作成」、ジーン誌、第
12巻、第235〜241頁（1980）に記載された手法に
より作成）を使用した。これら誘導体の各々は
Pst部位を有し、その位置はその部位に結合さ
れたDNA挿入物が他の誘導体のPst部位におけ
る挿入物からの異なる解読枠中に存在するような
位置である。すなわち、第６図から判るように、
pKT279はプラスミドのプレペニシリナーゼ遺伝
子のヌクレオチド74に位置するPst部位を有し、
pKT280はヌクレオチド75に、またpKT287はヌ
クレオチド82にそれぞれPst部位を有する。各
プラスミドの残余の配列はpBR322における周知
配列である。したがつて、この組みは、全ての３
つの解読枠におけるβ−ラクタマーゼ遺伝子中へ
のDNAの挿入を可能にする。Hif−2hからのPst
切断挿入物を、Hif−4c断片について記載した
ように調製した。Hif−2hPst断片（10ng）を、
20μlの10mMトリス−HCl（pH7.5）、6mM
MgCl2、100mM NaCl、6mM β−メルカプト
エタノール、200μg／mlゼラチンおよび0.1mM
ATPの中でPst開裂pBR322、pKT279、
pKT280またはpKT287（それぞれ10ng）と混合
し、0.1単位のT4DNAリガーゼ（ニユーイングラ
ンド・ビオラブ社）と共に10℃にて16時間培養し
た。得られた組替えDNA分子をＺ−pBR322
（Pst）／HcIF−2h、Ｚ−pKT279（Pst）／HclF
−2h、Ｚ−pKT280（Pst）／HclF−2hおよびＺ
−pKT287（Pst）／HclF−2hと名付ける。イ
ー・コリHB101をこれら組替えDNA分子のそれ
ぞれにより形質転換させ、そして形質転換したコ
ロニーを前記したようにテトラサイクリン含有寒
天板の上で選択した。形質転換細菌のテトラサイ
クリン耐性クローンは循環ベクターを含有するの
で、各組の細菌コロニーをミリポアフイルター上
で生育させ、そしてP32−標識Hif−4c断片にヒ
ブリド化するコロニーを上記のように同定しかつ
選択した。これらの菌株は次のように名付けられ
た： イー・コリHB101（Ｚ−pBR322 （Pst）／HclF−2h−AH1）乃至 （−AH3）； イー・コリHB101（Ｚ−pKT279 （Pst）／HclF−2h−AH1）乃至 （−AH8）； イー・コリHB101（Ｚ−pKT280 （Pst）／HclF−2h−AH1）乃至 （−AH8）； イー・コリHB101（Ｚ−pKT287 （Pst）／HclF−2h−AH1）乃至 （−AH8） 上記菌株に幾種かならびに菌株Ｚ−pBR322
（Pst）／HclF−SN1〜95の幾種かの抽出物を、
IFN−α活性につき試験した。細菌をトリプトン
培地において固定相で増殖させ、回収し、１／20
容量（培養物の容量に対し）の50mMトリス−
HCl（pH8）、30mM NaClで洗浄しそして凍結さ
せた。解凍後、細胞を下記容量の前記緩衝液に再
懸濁させそしてリゾチームを１mg／mlまで加え
た。０℃にて60分間の後、懸濁物を凍結させ（エ
タノール−ドライアイス浴）、５回解凍させ（37
℃にて）、ソルバールGSA型ロータで12000rpm
にて10分間遠心分離した。或る場合には上澄液
（S30）の一部をさらにスピンコ65型ロータで
100000xgにて遠心分離し、上澄液（S100）を回
収した。このような上澄液を、細胞病理学的効果
減少分析によりIFN−α活性について選別した
（実験１）。実験１において陽性反応を示すコロニ
ーならびに上記の組Ｚ−pBR322／HclF−SN1〜
SN95からのクローンを、より低希釈にて再分析
した（実験２）。 抽出物源： 【表】 抽出物源： 【表】 上記からの、より活性の大きいものの幾つかを
さらに詳細に検査した。培養物を対数相の後期ま
で増殖させ（見掛けOD650は約0.9）＊、 細胞を１／50の培養物容量にて上記のように溶菌
させた。若干活性を有するが陰性比較（S30；
S100：０；０）としてＺ−pBR322（Pst）／
HclF−SN32を用いれば、次の結果が得られる： 抽出物源： 【表】 これら菌株により生産された実際の蛋白質は、
IFNに無関係にアミノ酸に融合してまたはIFNの
信号配列の全部もしくは一部を含んで生産された
かどうか決定するよう構造的に分析しなかつたこ
とを了解すべきである。しかしながら、少なくと
も蛋白質が生成されれば、これはIFNの免疫学的
もしくは生物学的活性を示す。したがつて、この
発現した蛋白質は有用である。この蛋白質をコー
ドするDNA配列がHulFN−αに関連するDNA
配列であることを蛋白質の活性が示すことは特に
重要である。かくして、例示したようなDNA配
列を使用して他の同様なHuIFN−α関連DNA配
列を選択すること、および成熟インターフエロン
もしくはその変種を発現し或いは特定の発現蛋白
質の収量を向上させるような他の構成に対し基礎
を与えることは当業者の範囲内にある。 蛋白質の生産レベルは２つの要因により支配さ
れる：すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数とそ
れら遺伝子コピーが転写されかつ翻訳される効率
とである。転写および翻訳（これらは共同して発
現となる）の効率は次いでヌクレオチド配列に依
存し、これは通常所望のコード配列の前方に位置
する。これらのヌクレオチド配列すなわち発現制
御配列は、特にRNAポリメラーゼが相互作用し
て転写を開始させる（プロモータ配列）と共にリ
ボソームがmRNA（転写の生成物）と結合し、か
つ相互作用して翻訳を開始させる位置を規定す
る。必ずしもこの種の全ての発現制御配列が同等
の効率をもつて作用するとは限らない。したがつ
て、所望蛋白質に対する特異的コード配列をその
隣接するヌクレオチド配列から分離し、これらを
寧ろ他の公知の発現制御配列に融合させてより高
レベルの発現に好適とするのが有利である。これ
も達成されるが、新たに処理されたDNA断片を
多重コピープラスミドまたはバクテリオフアージ
誘導体に挿入して細胞内の遺伝子コピーの数を増
加させ、それによりさらに発現蛋白質の収量を向
上させることもできる。 幾つかの発現制御配列を上記のように使用する
ことができる。これらには、イー・コリのラクト
ースオペロンのオペレータ、プロモータおよびリ
ボソーム結合かつ相互作用配列（たとえばシヤイ
ン−ダルガルノ配列のような配列を含む）（“lac
系”）、イー・コリのトリプトフアン合成酵素系の
対応配列（“trp系”）、フアージλの主要なオペレ
ータおよびプロモータ域（OLPLおよびORPR 1）、
フアージfdコート蛋白の制御域、或いは原子核
（原核）もしくは成熟核（真核）細胞およびその
ウイルスの遺伝子の発現を制御するその他の配列
が包含される。したがつて、適当な宿主において
特定ポリペプチドの生産を向上させるには、その
ポリペプチドをコードする遺伝子を前記のように
調製し、これを含有する組替えDNA分子から取
出して、前記発現制御配列に一層近接して或いは
上記発現制御配列の一つを管理しながら組替え
DNA分子中に再挿入する。この種の方法は当分
野で公知である。 所望生成物の細胞収量の増加は、細胞中で使用
しうる遺伝子数の増加に依存する。これは、たと
えば組替えDNA分子を前記したように中庸のバ
クテリオフアージλ（NM989）中に挿入すること
により、特に簡単には制限酵素でプラスミドを切
断することにより達成され、それにより線状分子
を生成させて、これを次いで制限フアージλクロ
ーン化ベヒクル〔たとえばエヌ・イー・ムレイ
等、「試験管内組替え遺伝子の回収を簡単にする
λフアージ」、モレキユラー・ジーン・ゲネチツ
クス、第150巻、第53〜61頁（1977）およびエ
ヌ・イー・ムレイ等、「バクテリオフアージT4か
らのDNAリガーゼ遺伝子の分子クローン化」、ジ
ヤーナル・モレキユラー・バイオロジー、第132
巻、第493〜505頁（1979）に記載されている種
類〕と混合し、そしてDNAリガーゼと共に培養
して組替えDNA分子を生成させる。次いで、所
望の組替えフアージを前記のよう選択しかつ使用
して宿主菌株の大腸菌を溶菌させる。 特に有用なλクローン化ベヒクルは、抑圧遺伝
子cIにおける感温性突然変異と遺伝子ｓにおける
抑圧性突然変異とを含み、その生成物は宿主細胞
の溶菌に必要でありかつ遺伝子Ｅ、すなわちその
生成物はウイルスの主要なカプシド蛋白質であ
る。この系を用いて、溶菌細胞を32℃で生育さ
せ、次いで45℃まで加熱してプロフアージの切断
を誘導させる。37℃における長期生育は高レベル
の蛋白質生産をもたらし、これらは細胞内に保持
される。何故なら、これらは通常の方法でフアー
ジ遺伝子生成物によつて溶菌されずかつフアージ
遺伝子挿入物はカプセル化されていないで転写用
に利用され続けるからである。次いで、細胞の人
工的溶菌は所望生成物を高収量で遊離する。 上記した過程によりＺ−pBR322（Pst）／HclF
−SN35で形質転換させた宿主から生産されてひ
と白血球インターフエロンの生物学的もしくは免
疫学的活性を示すようなポリペプチドの収量を増
加させる初期の試みにおいて、ヒブリド中の
DNA挿入物の制限地図を決定した。この地図は、
Hif−2hと比較して、Hif−SN35が配列の3′末端
を示すPst1部位を欠失しており、信号配列の一部
が欠失しており（コドン７まで）かつ信号配列に
おけるAva部位がBsp部位により交換されて
いることを示した。したがつて、Hif−SN35は
Hif−2hの多形的もしくは対立的変種であると思
われる。 プラスミドHif−SN35をPstにより開裂さ
せ、得られたDNA鎖を標準法により両端部で復
帰（chew back）させ、そしてそこにLAC−Alu
断片（下記）を挿入してプラスミドを再び閉環さ
せた。Ｚ−pBR322（PST）／HclF−SN35−
AHL6と同定された変型プラスミドの実際の構造
および大腸菌中に生産された蛋白質のアミノ末端
におけるアミノ酸配列を決定した。この構造のヌ
クレオチド配列は、LAC−Alu断片がIFN−α1
（SN35）の第一アミノ酸から離れた１個のアミノ
酸を結合したことを示している。大腸菌で発現さ
れた蛋白質のアミノ末端部のアミノ酸配列は、
IFN−α1（SN35）配列に融合した６個のアミノ
酸を有する融合蛋白質が生産されたことを示して
いる。しかしながら、変型プラスミドにより形質
転換された宿主は、未改変Ｚ−pBR322（Pst）／
HclF−SN35により形質転換された宿主と比較し
て、ひと白血球インターフエロンの生物学的もし
くは免疫学的活性を示す約100倍多いポリペプチ
ドを生産する。 第２５図を参照すれば、Ｚ−pBR322（Pst）／
HclF−SN35（第２５図におけるSN35）で形質転
換させた宿主により生産されて、ひと白血球イン
ターフエロンの免疫学的もしくは生物学的活性を
示すようなポリペプチドの収量を向上させる他の
試みが図示されている。Bsp（キツス博士より
寄贈）により標準法を用いてヒブリドプラスミド
を開裂させた。なお、このBspは当業界で既知
の容易に入手しうる制限酵素であつて、たとえば
A.キツス等「バチルス・スフアエリクスからの
新配列−特異性エンドヌクレアーゼ（Bsp）」ジ
ーン誌、第１巻、第323〜329頁（1977）の論文に
詳述されている。このBspは、第８図に示すよ
うに、DNAを配列GGCCにて切断する。制限酵
素を熱失活（65℃、30分）させた後、混合物を
50mMトリス−HCl（pH8）に調製して加熱した
（37℃、30分）。フエノールとエタノールとで抽出
した後、最大のα1cDNA断片を低温ゲル化アガ
ロース（0.8％）上で単離しそしてHindリンカ
ーを結合させた。次いで、この変型断片をHind
−開裂プラスミドHS−pBR322（Eco）／
lacUV5−150（“Lac−150”）＊（エツチ・シヤー
ラーにより寄贈）に結合させたが、これは断片含
有ゲル片（それぞれ約20μl）を65℃にて溶融さ
せ、37℃まで冷却しかつ1μl当り20UのT4DNAリ
ガーゼを加えて行なつた【＊このプラスミドは
lacプロモータHae−202b.p.断片を含有し〔ダ
ブリユー・ギルバート等、「Lac抑圧剤のラクト
ースオペレータ配列および作用」、蛋白質リガン
ド相互作用、エツチ・スンドおよびジー・プラウ
アー編（ベルリン、ワルター・デ・グルイター）、
第193〜206頁およびケー・バツクマン等、「試験
管内において組替え処理を使用するプラスミドに
対する遺伝子発現の最大化」、セル誌、第13巻、
第65〜71頁（1978）〕、その3′末端にてEcoRリ
ンカにより示される】。15℃にて16時間の後、固
化ゲルにおいて結合が生じた〔エツチ・レーラツ
ハ、私的通信、1980〕。 １／10容量の100mMトリス−HCl（pH7.5）、
100mM CaCl2 100mM MgCl2を試料に加え、こ
れを65℃にて５分間加熱し、37℃まで冷却した。
次いで、この試料を使用してCa++処理イー・コ
リHB101を形質転換させ、０℃にて20分間培養
し、42℃にて１分間および20℃にて10分間加熱し
た。１モルのトリプトン培地を加えた後、試料を
37℃にて60分間培養しそしてアンピシリンを含有
する寒天板上に接種した。プラスミドDNAをこ
れら培養物から前記のように分離しそしてLAC
断片に隣接する5′末端を持つたIFN−α1挿入物を
含有するヒブリドプラスミドを制限分析により同
定した。次いで、プラスミドを常法によりEcoR
で開裂させかつエンドヌクレアーゼBAL−31
で切断させ（0.06U／ml、30℃で２〜４分間）、
LAC断片の結合EcoR末端を除去しかつβ−ガ
ラクトシダーゼコード部分を短縮させた。 処理プラスミドが完全なIFN−α1コード配列
を含有するのを確実にするため、次いでプラスミ
ドを常法によりBg1で開裂させ、上記のように
後処理しそして最大断片をアガロースゲル（0.8
％）上で分離した。次いで、この断片をＺ−
pBR322（Pst）／HclF−SN35からのBsp−Bgl
断片と合し、得られたヒブリドプラスミドを使
用して上記のようにイー・コリHB101を形質転
換させた。この形質転換したコロニーをIFN活性
につき選別し、高レルのIFN活性を有する１つの
クローンを選択した。このクローンをイー・コリ
HB101（C8−IFN−α1）およびそのヒブリドプラ
スミドC8−IFN−α1と名付けた。 C8−IFN−α1のDNA配列分析は、開始トリプ
レツトの後のコード配列がβ−ガラクトシダーゼ
の最初の７個のアミノ酸と、融合により生成した
Pro残基と、IFN−α1信号配列およびIFN−α1
（SN35）配列のアミノ酸16〜23とを決定したこと
を示している。ヒブリドプラスミドC8−IFN−
α1で形質転換させたイー・コリミニセル菌株
（DS410）は、未改変Ｚ−pBR322（Pst）／Hif−
SN35で形質転換させたミニセルと比較し、
HuIFNの免疫学的もしくは生物学的活性を示す
ポリペプチドを１当り約5000万単位すなわち約
2500倍多く生産する。プラスミドC8−IFN−α1
により生産されたポリペプチドのアミノ酸配列
は、生産物がβ−ガラクトシダーゼからの７個の
アミノ酸と融合により生じた１個のアミノ酸と
IFN−α1に融合されたIFN−α1信号配列のアミ
ノ酸16〜23とを有する融合蛋白質であることを確
認させた。 さらに、本発明により蛋白質収量を向上させる
種々の構成の例を、他の型のIFN−αに関連して
検討した（下記）。 ヒブリドプラスミドで形質転換させた大腸菌に
より生産されるインターフエロン活性の性質 1.トリプシンに対するIFN−α活性の感受性 標準HuIFN−α（比活性、1.2×106U／mg、
50U）ならびにイー・コリHB101（Ｚ−pKT287
（Pst）／HcIF−2h−AH6）のS100抽出物（“Hif
−287−６抽出物”）（200U／ml、10U）およびイ
ー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）／HclF−
SN35）のS100抽出物（“Hif−35抽出物”）
（1000U／ml、50U）の試料50μlを、下記のよう
に種々な量のトリプシンと共に、37℃にて30分間
培養した。S100抽出物は高蛋白質含量を有する
一方、HuIFN−αはそうでないので、HuIFN−
αと比較S100抽出物Hif−32との混合物を並行的
に試験した。 【表】 【表】 したがつて抽出物のIFN−αは、トリプシンお
よびしたがつて蛋白質に対し感受性である。 Hif−35 S100抽出 ０ 30 物（50単位） 0.1 20 １ 20 10 ２ 50 ０ 2.セフアデツクスＧ−100上のクロマトグラフイ
ーにおける挙動 抽出物Hif−35（1ml）およびイー・コリHB101
（Ｚ−pBR322（Pst）／HclF−SN′32）のS100抽
出物（“Hif−32抽出物”）を32mlのセフアデツク
スＧ−100カラム上で、50mM燐酸カリウム緩衝
液（pH7.4）にて４℃でクロマトグラフにかけ
た。チトクロームｃ（0.2mg）を内部標識として加
えた。流速を2ml／hrとし、1.0mlづつのフラク
シヨンを集めた。280nmおよび405nm（チトクロ
ームｃ）における吸光度とIFN−α活性とを測定
した。第７図に示すように、Hif−35抽出物の
IFN−α活性は、チトクロームｃの前に、約0.45
のKD値をもつて溶出された。したがつて、この
物質の見掛け分子量は約20000〜30000〔ヌクレオ
チド配列決定により、カルボキシ末端処理なしと
仮定して測定した分子量は19388〕であり、比較
抽出物Hif−32のフラクシヨンには活性が検出さ
れなかつた。 3.ひと白血球インターフエロンに対する抗体によ
るHif−35およびHif−287−６のインターフエロ
ン活性の阻害 HuIFN−α（比活性1.2×106IU／mg）とHif−
35／Hif−287−６のS100抽出物とを、10％子牛
血清を含む100μlの改変イーグル培地（MEM）
中において、HuIFN−α〔ケー・カンテル、1976
年２月24日に調製、比活性450000単位／ml〕に
対する羊抗血清の種々な希釈により37℃で30分間
培養し、45μlを細胞病理学的効果減少分析により
IFN−α活性につき分析した〔抗体自身は細胞病
理学的効果を起こさなかつた〕。 【表】 抗体の作用が、たとえば蛋白質分解のような非
特異的作用に基づくものでないことを示すため、
ねずみインターフエロン系を用いて同様な実験を
行なつた。 【表】 かくして、特にHuIFN−αに向けられた抗体
は、HclF−2hDNA配列を含有する或る種の組替
えDNA分子により形質転換させた大腸菌で生産
されるポリペプチドのIFN−α活性を阻害する。
大腸菌で生産されたIFN−αに対する抗体の明ら
から低親和性は、これと天然HuIFN−αとの間
の構造上の相違を反映し、たとえば炭水化物成分
の不存在、信号配列の存在またはβ−ラクタマー
ゼ配列の一部に対する融合を反映する。 4.ねずみ細胞に対するHif−35およびHif287−６
抽出物の活性低下 ひとCCL23細胞またはねずみL929細胞をイ
ー・コリ抽出物、HuIFN−α〔ケー・カンテルの
方法により調製、比活性1.2×106単位／mg〕また
はねずみIF（N.I.H.標準）で処理し、これにウイ
ルスを接種し（ひと細胞の場合はメンゴウイルス
を用い、ねずみ細胞の場合はVSVを用いた）、そ
してIFN−α活性を細胞病理学的効果減少分析に
よつて測定した。 【表】 これらの結果はHif−35およびHif−287−６抽
出物がひと細胞に対し保護作用を有しかつねずみ
細胞に対し極く僅かの効果（〜10％）しか持たな
いことを示しており、これはひとインターフエロ
ンに対し典型的なことである。 5.幾つかの細胞機能に対する効果 イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）／Hif−
SN35−AHL6）からの抽出物を、幾つかの細胞
機能に対する効果につき、標準IFNと比較した。
イー・コリ製のIFN−αは、天然IFN−αの次の
性質を示した：(1)ひとリンパ球の自然致死活性を
高め、(2)抗体依存性の細胞媒介される細胞毒性を
高め、(3)抗原−およびミトゲン−誘発される白血
球移動阻害を抑制し、かつ(4)IFN−感受性バーキ
ツト（Burkitt）リンパ腫細胞の成長を抑制する。
これら性質は、ひと腫瘍および癌に対する大腸菌
合成されたIFN−α1活性を示唆する。 6.アミノ末端配列のないIFN−αの活性 アミノ末端配列のないIFN−αもまた大腸菌で
作られ、IFN活性と一致する活性を有することが
示された。 適当な組替えDNA分子を作成するため、プラ
スミドHif−2h（上記）をEcoRおよびBamH
により部分的に切断し、そしてIFN−α1コード
配列を含有する断片をアガロースゲルで分離し、
Hif−2h（上記）と比較してヒブリド挿入物の3′末
端に隣接したPst部位を欠失するプラスミド
Hif−SN35のEcoR／BamH制限から得られ
た非−IFN−α1コード配列と混合した。次いで、
得られたプラスミドをPst／Bglにより処理
してIFN−α1コード配列のアミノ末端部分を除
去した。その個所に、Pvuによるプラスミド
Hif−2hの切断と、Balエンドヌクレアーゼによ
る処理と、Pstリンカーの結合と、Bglによ
り制限とにより調製された一連のIFN−α1断片
を挿入した。このようにして得られたプラスミド
は、そのアミノ末端配列の種々な部分を欠失した
一連のIFN−α1コード配列を含有していた。こ
れらの１種（プラスミド2H−M8）をPstで切
断して、そのヌクレオチド配列を決定した。この
配列は、プラスミド2H−M8がPst部位とIFN−
α1の第一コドン（CYS）との間に数個のヌクレ
オチドを有することを示した。したがつて、Pst
切断されたプラスミド2H−M8をT4ポリヌク
レアーゼ／dATP、S1エキソヌクレアーゼで処理
しそしてSalにより切断させた。この過程は一
連の断片を形成し、そのIFN−α1コード配列は
アミノ末端部分を欠失していた。次いで、これら
の断片を、EcoRによる切断とエキソヌクレア
ーゼS1により処理とSalによる切断とでプラス
ミドLac3V8から調製したGUA−LAC断片に作
用結合させることにより、LAC制御下に置いた。
かく得られた一連のプラスミドは、LACプロモ
ータを含有する断片にAUGを介して反時計方向
に結合したアミノ末端の種々な部分を欠失する
IFN−α1コード配列を有した。 これらプラスミドの幾つかを配列決定した。一
つはIFN−α1の第５番目のアミノ酸から開始し、
一つはIFN−α1の第10番目のアミノ酸から開始
した。イー・コリ・ミニセル（DS410）におい
て、これらプラスミドの両者はIFN活性を示すポ
リペプチドを生産した。したがつて、必ずしも全
てのIFN−α1蛋白質がIFN活性のため必要とされ
るとは限らない。 配列は次のように作成した： (1) Ｚ−pBR322（Pst）／HclF−2h（プラスミド
Hif−2h）をEcoRおよびBamHで部分制
限した。これによりpBR322のBamH部位か
らDNA断片を作成し（第１図）、これはIFN−
α信号を介して延びかつプラスミドHif−2hの
配列をコードすると共にプラスミドHif−2hの
IFN−α挿入物における3′非コード化領域に位
置するEcoR部位で終端する（第４図および
第１０図のヌクレオチド685−690を参照）。 (2) 次いで、この断片をプラスミドHif−SN35
のEcoR／BamH断片と結合させた。この
EORI／BamHI断片は最初の断片の逆であつ
て、IFN−αの3′非コード領域におけるEcoR
部位から初期のpBR322を介してpBR322の
BamH部位まで延在する。プラスミドHif−
2hからの断片と結合させれば、得られるプラ
スミド（Hif−SN35）はIFN−α配列の3′末端
におけるPst部位を欠失し、Hif−2hのIFN
−α信号配列に対する完全なコード配列を有す
る。 (3) 次いで、得られたプラスミドをPstおよび
Bglで制限してIFN−αコード領域における
Bgl部位（第４図および第９図のヌクレオチ
ド313−318を参照）からpBR322由来の配列を
介してPst部位まで延びる断片を作成した。
かくしてこの配列は、IFN−αの5′非コード領
域とIFN−αの信号配列をコードする領域と
IFN−αの5′コード領域の１部とを欠失する。 (4) IFN−αのアミノ末端をコードする配列の１
部を欠失したDNA配列を作成するには、上記
(3)で作成した配列をアミノ末端コード領域の１
部を欠失するよう作成した一連の配列と組合せ
る必要がある。 これを行うため本発明はPvuでHif−2hを
開裂させ、このエンドヌクレアーゼはプラスミ
ドをIFN−αの信号配列をコードする領域の中
間で開裂する（第８図のヌクレオチド97−103
を参照）。次いで、この配列をBalエキソヌク
レアーゼによつて処理した。この処理により一
連のDNA配列が生ずると思われ、その幾つか
はIFN−αコード配列のアミノ末端領域におけ
る種々の部位から開始する。これはPvu部位
とIFN−αコード領域の開始部位との間に位置
する信号配列の25個以上のヌクレオチドを切断
する必要がある（第８図を参照）。 このBal切断の結果につき分析するため、切
断配列の両末端に対しPstリンカを最初に付
着させ、次いでBglで制限した。この結果、
このBal切断の際に除去されなかつたIFN−α
配列の第１ヌクレオチドにPstリンカが接続
した小型のDNA配列が生じ、この配列はIFN
−αコード領域からBgl部位まで存在する。
要するに、これらの断片を上記(3)の配列に結合
させると、IFN−α配列がBgl部位で再構成
され、Pstリンカは前記小型断片の他端部を
上記(3)のDNA配列のPst制限断片に結合させ
る。その結果、Hif−2hと比較して、Pvu部
位からIFN−αのコード領域まで存在するヌク
レオチドの幾つかを欠失する（Bal切断のた
め）プラスミドが作成される。 (5) このように作成されたプラスミドの１種
（2H−M8）を分析用に選択した。しかしなが
ら、このプラスミドにおいてはBal切断が充分
に行われておらず、信号配列の幾つかのヌクレ
オチドがまだ残存していた。従つて、これを
Pstで開裂させかつ再び切断して信号配列に
残存する全てのヌクレオチドとIFN−αのアミ
ノ末端部分をコードする少なくとも幾つかのヌ
クレオチドとを除去した。この切断には、S1
エキソヌクレアーゼを使用した。次いで、得ら
れた切断断片をLac3V8からの発現制御配列の
制御下において発現させた。 Hif−4c中の挿入物に弱くクロスヒブリド化しか
つHif−2h断片とは異なる制限地図も有する
DNA挿入物を含む組替えDNA分子を含有する大
腸菌のクローンの同定 標準リンパ芽球細胞インターフエロン〔ズーン
等（上記）ならびにエム・フンカピラーおよびエ
ル・フード（上記）〕とHif−2h断片から推定さ
れた配列との最初の35個のアミノ酸を比較すると
９個の相違が示される。全ての場合、相違するア
ミノ酸に対するコドンは、ワンベース（one−
base）変化により関連させうるであろう。一方
の標準リンパ芽球細胞インターフエロンについて
直接に決定されたアミノ酸組成と、他方のHif−
2h断片の配列から推定されるものとでは、それ
らのGly、Pro、CysおよびMetの含有量に関して
顕著な相違を示す。これらの相違は多形現象では
説明し得ない程大きい。寧ろ、それらは、少なく
とも２つの非対立遺伝子の存在を反映していると
思われる。何故なら、これら２種の蛋白質の相違
程度（26％差）は、たとえばひとと羊との間のβ
−グロビンのそれ（23％差）に近似する。したが
つて、前記に同定された（上記）断片Hif−4cに
対する弱いヒブリド化を示したクローンを検査
し、クローン・イー・コリHB101（Ｚ−pBR322
（Pst）／HcIF−−206）を同定した。 このクローンのヒブリドプラスミドＺ−
pBR322（Pst）／HcIF−−206（“HcIF−−
206”）およびそのDNA挿入物（“Hif−−206
断片”）は、Hif−4cおよびHif−2h断片に弱くヒ
ブリド化している。プラスミドHif−−206で
形質転換させた大腸菌（イー・コリ）はHuIFN
−αの生物学的もしくは免疫学的活性を示すポリ
ペプチドを生産する。Hif−−206断片は、Hif
−2h断片について決定されたものとは異なる制
限地図を有する。これら２種の制限地図の比較を
第１１図に示す。ここでも、Hif−−206断片
における制限部位の絶対的位置は、制限地図化だ
けでは決定されない。しかしながら、上記した標
準法を用いる、この挿入物のヌクレオチド配列に
関する配列決定は、これら位置の一層絶対的な決
定を可能にする。しかしながら、Hif−2h断片と
比較してHif−−206断片の制限地図には差が
あるので、これら２種の挿入物のインターフエロ
ン遺伝子は異なるヌクレオチド配列を有すること
が明らかである。 第１２〜１６図を参照すれば、培養物HcIF−
Ｇの挿入DNA配列（Hif−−206断片）と培養
物HcIF−Ｅ（下記）の挿入DNA配列（Hif−2h
断片）との上記で決定されたヌクレオチド配列な
らびにこれらヌクレオチド配列によりコードされ
た蛋白質の対応アミノ酸配列が示されている。
Hif−−206断片、すなわち文献〔エヌ・エ
ム・ウイルキー等、ヌクレイツク・アシツド・リ
サーチ、第７巻、第859〜877頁（1979）〕に記載
された方法Ｂの手順を使用して培養物HcIF−Ｇ
から単離したプラスミドDNAのPst断片
（790bp）のヌクレオチド配列を、エー・エム・
マキサムおよびダブリユー・ギルバートの標準法
（上記）を用いて決定した。用いた配列決定法を
第１７図に示す。 制限DNA（通常約10μg）を、文献〔エヌ・マ
ンテイ等、ジーン誌、第10巻、第１〜10頁
（1980）〕により記載されているように5′末端標識
した。標識断片を第二の制限酵素で開裂させ、生
成物をトリス−硼酸−EDTA緩衝液における５
％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動にかけ
て分離し〔エー・シー・ピーコツクおよびシー・
ダブリユー・ジングマン、バイオケミストリー、
第６巻、第1818〜1827頁（1967）〕、ゲルから抽出
しそして文献〔ダブリユー・ミユーラー等、ジヤ
ーナル・モレキユラー・バイオロジー、第124巻、
第343〜358頁（1978）〕に記載されているように
精製した。 第１７図を参照して、配列決定用の各種断片を
次のように調製した： 25および26−PstによるHif−−206の開
裂、標識化、Bglによる開裂、ならびにPst
＊−Bgl断片（257bp）（“25”）とPst＊−Bgl
断片（279bp）（“26”）との単離； 21、22および23−−PvuによるHif−−206
の開裂、標識化、Bglによる開裂、ならびに
Pvu＊−Bgl断片（88bp）（“21”）とPvu＊
−Bgl断片（176bp）（“22”）とPvu＊−Bgl
断片（214bp）（“23”）との単離； 11、12、13および14−−BglによるHif−
−206の開裂、標識化、Pstによる開裂ならびに
Bgl＊−Pst断片（279bp）（“14”）およびBgl
＊−Pst断片とBgl＊−Bgl＊断片との共
移動性混合物の単離。Pvuによるこの混合物の
開裂ならびにBgl＊−Pst断片（257bp）
（“13”）とBgl＊−Pvu断片（176bp）（“12”）
とBgl＊−Pvu断片（88bp）（“11”）との単
離； 27L、27U、41、43、44および45−−Hinfに
よるHif−−206の開裂、標識化ならびに先駆
体断片：Hinf＊−Hinf＊（113bp）
（“27P”）、Hinf＊−Hinf＊（146bp）
（“28P”）、Hinf＊−Hinf＊（159bp）
（“30P”）、Hinf＊−Hinf＊（397bp）
（“31P”）、およびHinf＊−Hinf＊（1522bp）
（“32P”）の単離。Mboによる28Pの開裂ならび
に断片Hinf＊−Mbo（112bp）（“41”）の単
離。Mboによる30Pの開裂ならびに断片Hinf
＊−Mbo（126bp）（“43”）の単離。Pstによ
る31Pの開裂ならびに断片Hinf＊−Pst
（151bp）（“44”）の単離。Pstによる32Pの開裂
ならびに断片Hinf＊−Pst（139bp）（“45”）
の単離。２種のストランド（“27U”および
“27L”）を得るための27Pのストランド分離。 27Uおよび27L以外の全ての断片を、両ストラ
ンドに関し配列決定し、しかも位置185における
Bgl部位以外につき配列決定用の起源として役
立つ制限部位にわたつて決定した。 ２種の挿入物によりコードされたアミノ酸配列
を比較すれば明らかなように、Hif−−206断
片はHif−2h断片におけるよりもアミノ酸の１個
少ないインターフエロン状蛋白質をコードする
〔Hif−2hに存在するアミノ酸44（Asp）がHif−
−206には欠如している〕。さらに、２種の断片
におけるヌクレオチド位置の10％と誘導アミノ酸
残基の17％とが異なる。 さらに、リンパ芽球細胞インターフエロンのア
ミノ末端につき決定された35個のアミノ酸〔ケ
ー・シー・ズーン等、サイエンス、第207巻、第
527〜528頁（1980）〕と比較して、挿入物Hif−
−206はズーン等（上記）により決定された35
個のアミノ酸残基とは５個の残基において異なる
蛋白質をコードする。したがつて、白血球型（α
型）の少なくとも３種の異なるIFN遺伝子、すな
わちHif−2h断片とHif−−206断片とズーン等
のIFNに対する遺伝子被覆とが存在する筈であ
る。インターフエロンの新たに提案された命名法
によれば、以下、これら遺伝子によりコードされ
る蛋白質を次のように同定する： IFN遺伝子源 蛋白質 Hif−2h IFN−α1 Hif−−206 IFN−α2 リンパ芽球細胞からの IFN−α3 IFN（ズーン等、上記） IFN−α1とIFN−α2との間の差は、ひと
CCL23と牛胎生腎（BEK）細胞とに対するそれ
らの異なる活性にも反映される。 【表】 【表】 したがつて、IFN−α1はIFN−α2よりも、ひ
と細胞に対して約30倍低い活性を有する。しかし
ながら、これら両者は共に、牛細胞に対しほぼ同
等の活性を有する。したがつて、IFNは、ひとに
おける抗ウイルス剤および抗腫瘍もしくは抗癌剤
としての使用に加え、牛におけるこれらの病状を
処置するにも有用である。たとえば、HuIFN−
αの調製物は、牛におけるFMDVおよびその他
周知のウイルス感染を処置する際、標準法（上
記）で使用することができるであろう。このこと
は特にIFN−α1について云えることである。何
故なら、牛細胞に対するその活性がひと細胞に対
する活性よりも約20倍高いからである。 次に、第２８図を参照して、プラスミドC8−
IFN−α2を高収率で作成する手順を示す。 構成C8（上記）を有するIFN−α1の場合改善さ
れた収量が得られたので、IFN−α2についても
同様な構成を作成した。Ｚ−pBR322（Pst）／
Hif−−206をBspにより完全にかつPvuに
より部分的に（P1にて）開裂させ（第２８図）、
867bpの断片を６％ポリアクリルアミドゲルで単
離した。次いで、この断片を、Pvu切断プラス
ミドC8−IFN−α1から単離された2590bpの断片
に結合させた。得られたヒブリドプラスミド
（C8−IFN−α2）を使用してイー・コリHB101を
形質転換させ、クローンをIFN活性につき選別し
た。高活性を示す１つのクローンを選択し、イ
ー・コリHB101（C8−IFN−α2）と名付けた。 ヒブリドプラスミドC8−IFN−α2のDNA配列
決定は、このプラスミドがC8−IFN−α1と同様
に開始コドンに続いてβ−ガラクトシダーゼの最
初の７個のアミノ酸と２個のDNA断片の融合に
より生じたPro残基とIFN−α2信号配列のアミノ
酸16〜23をコードするDNA配列とに関するDNA
配列を有することを示した。したがつて、ここで
もIFN−α2を含有する融合蛋白質が発現される
と思われる。この事実は、このプラスミドで形質
転換された宿主により発現されるIFN−αが融合
蛋白であることを示唆する。 このプラスミドにより形質転換されたミニセル
はIFNの１当り100〜200×100万単位を与え、
或いは未改変Ｚ−pBR322（Pst）／Hif−−206
により形質転換されたミニセルよりも20000〜
40000倍高いIFN−α2の収量を与える。 C8−IFN−α1（50×106単位／）とC8−IFN
−α2（100〜200×100万単位／）との相対的収
量を比較すると、先ず驚くことに、IFN−α2は
ひと細胞（上記）に対しIFN−α1よりも約30倍
高い活性を示した。しかしながら、これら２種の
C8プラスミドで形質転換させたミニセルにより
生産される２種の蛋白質の量の定量分析は、C8
−IFN−α1においてはC8−IFN−α2におけるよ
りも約５〜６倍多い蛋白質が生産されていること
を示した。したがつて、IFN活性を基準として測
定した収量は、C8−IFN−α1の場合生産された
蛋白質がずつと多い量だけずれていた。 次に第２６図を参照して、IFN−α2の収量を
向上させる試みの他の構成を記載する。先ず、公
知1acプロモータをAluで制限しかつ第２７図
に示したような断片（１つの末端につき）を
EcoRIリンカー（共同研究により調製）で伸長さ
せることにより、LAC Alu断片を含有する発現
プラスミドを調製した。次いで伸長した断片を
pBR322のEcoR部位に挿入し、そしてEcoRI−
EcoR断片を構造から削除した。第２６図に404
として示された得られたプラスミドをHindお
よびDvuで開裂させてIFN−α2含有断片を挿入
した。このIFN−α2断片は、Ｚ−pBR322
（Pst）／HcIF−−206（第２６図における
“206”）の部分的Sau3A制限と、Hindリンカー
によるSau3A断片の伸長（第２７図）と、Bsp
での開裂とにより調製した。この断片をHind
−Pvu開裂されたプラスミド404に挿入した後、
得られたプラスミドをHindとEcoRとで制限
し、S1ヌクレアーゼで処理してLACプロモータ
をIFN−α2遺伝子に近接させかつ再結合させた。
この構造は、LACプロモータの制御下において
IFN−α2DNA配列を有する。さらに、IFN−α2
配列は、そのプロモータの開始AUGコドンの直
後となる（第２７図参照）。したがつて、これら
プラスミドにより生産されたIFNの少なくとも一
部は成熟IFN、たとえば信号配列からの如何なる
アミノ酸をも含まないIFNである。ミニセルにお
いて、これらプラスミドの１種であるLAC−
AUG（α2）により得られたIFN−α2の収量は１
当り５〜10×100万単位であつた。 同様な結合原理に基づいて他のIFN−α2構造
をも作成した。ここでは、pBR322のペニシリナ
ーゼ発現制御配列は、AUG開始コドンを介して
Hif−−206＊からのIFN−α2遺伝子に結合さ
れている。 ＊ この構造は、MboによるpBR322の部分的
切断とS1での処理と上記したようなEcoRリ
ンカーの結合とpBR322のEcoR部位に対す
る断片の再挿入と１つのEcoR部位の削除と
により最も効果的に作成できる。次いで、得ら
れたプラスミド（“β−lac−AUGプラスミ
ド”）を、前記したような206のS1処理（緩和
に）されたHindリンカー−Bsp断片と組
合せることができる。EcoRで開裂させかつ
S1とホスフアターゼとで処理した後、発現プ
ラスミドβ−1ac−AUG（α2）を単離する。他
の遺伝子による構成は、単に構成β−lac−
AUGプラスミドを使用して他の遺伝子もしく
は構造を挿入させることにより、或いはより好
ましくはプラスミドβ−lac−AUG（α2）自身
にSau3A部位を使用することにより、同様に
行なうことができる。 このプラスミドは、β−lac−AUG（α2）と名
付けられ、宿主細胞を形質転換させるため使用す
ると、他の蛋白質配列に融合することなくIFN−
α2の生産をもたらす。ミニセルにおいて、１
当り50〜100×100万単位の収量が観察された。こ
のプラスミドは、本発明により使用するのに最も
好適なプラスミドである。これはまた、本明細書
中に記載した他のIFN−α遺伝子と共に使用する
にも好適である。本発明において好適な宿主は、
イー・コリDS410（ara azide TonA lac ｙ
Tsx min ａ min ｂ gal λ xyl stepR）で
ある。この菌株は、好適プラスミドβ−lac−
AUG（α2）の例と共にHclF−Ｋとして寄託され
ている。各種のプロモータ配列と、リボソーム結
合部位と、シヤイン−ダルガルノ配列と、プロモ
ータとAUG開始コドンと間のDNA配列とを使用
しかつ本明細書中に記載した各種のIFN−α遺伝
子とを使用する他の構成をも、同様の方法と原理
とにより作成できる。勿論、これらの構成も本発
明により実現され、本発明の範囲内である。 IFN−α1およびIFN−α2のヒブリド分子 IFN−α1およびIFN−α2の多数のヒブリド分
子を作成した。驚くことに、これらヒブリド構造
体は、それらの親であるIFN−α1またはIFN−
α2のいずれかと比較して、定量的に異なる性質
と活性とを有する。 第２８図を参照すれば、４種のこれらヒブリド
分子の構造の略図が示されている。便宜上、これ
らヒブリド分子をプラスミド，，および
と名付ける。これらの構造体において、制限酵素
（Bspはキツス博士から寄贈され、その他のも
のはビオラブ社から得られた）による切断を、供
給者により推奨されているように行なつた。部分
的DNA開裂は酵素量を減少させて行なつた。制
限酵素を熱失活（65℃、30分間）させた後、試料
を50mMトリス−HCl（pH8）にて調製し、必要
に応じ子牛腸アルカリホスフアターゼ（ベーリン
ゲン社）（DNA1μg当り１容量）を加えた。37℃
で30分間の後、試料をフエノールとエタノールと
で抽出した。大抵の場合、DNA断片を低温度ゲ
ル化アガロース（0.8％）にて分離させた。結合
のため断片含有のゲル片（それぞれ約20μl）を65
℃で溶融させ、37℃に冷却しそして1μl当り20U
のT4DNAリガーゼを加えた。混合物を15℃にて
16時間保ち、固化ゲルにおいて結合を生ぜしめた
〔エツチ・レーラツハ、私的通信（1980）〕。1/10
容量の100mMトリス−HCl（pH7.5）区100mMの
CaCl2と100mMのMgCl2とを加え、試料を65℃に
て５分間加熱しそして37℃まで冷却した。次いで
試料をCa++処理されたミニセルに加え、０℃に
て20分間培養し、42℃にて１分間および20℃にて
10分間加熱し、そして1mlのトリプトン培地を加
えた。37℃にて60分間培養した後、適当な抗生物
質を含有する寒天板の上に培養物を載置した。全
てのプラスミドをIFN配列における接合部にわた
りヌクレオチド配列を分析して特性化した。 ヒブリド分子、すなわちα−１（Pvu）α
−２ヒブリドをPvuによるC8−IFN−α1（上
記）（第２８図におけるC8−α1）の部分的開裂に
より作成し、脱燐酸化させ、Pstにより開裂さ
せそしてPst−Pvu（P2）1346bpの断片を単
離した。この断片を、PvuでのC8−IFN−α2
（上記）（第２８図におけるC8−α2）の完全開裂
とPstでの部分開裂とにより調製された2135bp
のPst（ａ）−Pvu（P2）断片に結合させた。 ヒブリド分子、すなわちα−１（Bgl）α
−２ヒブリドは、ヒブリド分子をBglにより
開裂させて作成した。脱燐酸化の後、大きなBgl
断片を単離してこれをC8−IFN−α2の小さな
Bgl断片に結合させた。クローン化の後、正し
い方向性にて小さなBgl断片を有するヒブリド
プラスミドを制限分析により同定した。 ヒブリド分子、すなわちα−２（Pvu）α
−１ヒブリドは、C8−IFN−α1をPvuで部分
開裂させ、脱燐酸化し、Avaで開裂させ、次い
で1686bpのPvu（P2）−Ava断片と3233bpの
Pvu（P1）−Ava断片とを単離することによ
り作成した。次いでこれら断片をHcIF−−206
（上記）（第２８図におけるSN206）の300bpの
Pvu（P1）−Pvu（P2）断片に結合させ、そ
して小さなPvu断片を含有するプラスミドを形
質転換大腸菌菌株のIFN−α活性を分析して同定
した。 ヒブリド分子、すなわちα−２（Bgl）α
−１ヒブリドは、BglおよびAvaでのC8−
IFN−α1の開裂によつて作成し、そして1776bp
の断片を単離した。次いで、この断片をヒブリド
分子の3543bpのBgl−Ava断片に結合させ
た。 互いに異なるインターフエロン種類の生物学的
活性をも測定した。各種のプラスミドで形質転換
させたミニセル（DS410）の培養物を増殖させ、
細菌を遠心分離により収穫し、PBSで洗浄し、
PBS中に懸濁させ（初期容量の約1/20）、１mg／
mlのリゾチームおよび10mMのEDTAと共に０
℃で60分間培養し、４回凍結・解凍を反復し、注
射器中に５回通して剪断しそして遠心分離により
開裂させた。 ひと、ねずみ、モルモツトおよび牛の細胞に対
する活性は次の通りであつた： 【表】 陰性比較 −− −− −− −−
驚くことに、全てのインターフエロンは牛細胞
に対しほぼ同じ活性を示したが、IFN−α1とIFN
−α1のアミノ末端成分を有する２つのヒブリド
IFN（および）とは、IFN−α2およびIFN−
α2のアミノ末端成分を有する２つのヒブリド
IFN（および）よりも、ひと細胞に対し約10
〜1000倍低い活性を示す。さらに驚くことに、
IFN−α1のアミノ末端部を有する２つのヒブリ
ドIFN（および）は、IFN−α1自身よりも10
倍以上低い活性をひと細胞に対して示す。しかし
ながら、IFN−α2のアミノ末端部を有する１つ
のヒブリド（）は、ひと細胞に対しIFN−α2
とほぼ同じ活性を示す。 IFN−αに対する染色体遺伝子の同定 HaeおよびAluでの部分開裂により生成さ
せかつEcoRリンカーによりλチヤロン4Aアー
ムに結合させひと胎児染色体DNAの断片から得
られたヒブリドフアージの集団をアール・エム・
ローン等、セル誌、第15巻、第1157〜1174頁
（1978）に従つて調製した。この遺伝子集団を、
pBR322（Pst）／Hif−2hから切断されたP32−標
識IFN−α1cDNA挿入物を試料として使用する
「現場」での方法により選別した〔ダブリユー・
デイー・ベントンおよびアール・タブリユー・デ
ビス、サイエンス、第196巻、第180〜182頁、
（1977）；テイー・マニアチス、セル誌、第15巻、
第687〜701頁（1978）〕。反復プラーク精製により
240000個のプラークから16個のヒブリド化陽性フ
アージクローンを単離した〔テイー・マニアチス
等、上記〕。10種のヒブリドフアージDNA調製物
をそれぞれHind、Tac，Hha、BamH、
EcoRおよびBglによつて開裂させ、そして
アガロースゲル上での電気泳動により断片を分離
してこれをミリポア膜に移し〔イー・エム・サウ
ザーン、ジヤーナル・モレキユラー・バイオロジ
ー、第98巻、第503〜517頁（1975）〕、そしてP32
−標識Hif−2hcDNA挿入物でヒブリド化させ
た。第１８図は、部分制限地図および種々の表と
して結果を要約している。そこに示されているよ
うに、各ヒブリドフアージDNA調製物について
は、少なくとも二三の特徴的制限部位が確立さ
れ、さらにIFN−α1遺伝子試料にヒブリド化す
る領域が描写されている（黒矢印）＊。 ＊ 第１８および２４図におけるchr16上の陰影
区域は、Hif−2hcDNAに弱くヒブリド化する
がＲ−ループ化を示さなかつた配列を示す。 次に第１８図および第２４図を参照すれば、ク
ローンchr−３およびchr−26は、幾つかのEcoR
およびHindの断片を共有するので、それら
の長さの多くにわたつて重復するDNA断片を示
しうることが判るであろう。さらに、chr−１の
ヒブリド化部分とchr−10のヒブリド化部分の１
つは、Hif−2h試料にヒブリド化するHind−
HindおよびEcoRI−EcoRの断片が同じ長さ
（それぞれ3.2kbおよび0.95kb）を有するので同じ
になるであろう。また、chr−16の「右手側」の
ヒブリド化部分（第１８図において“ｒ”と標識
する）はchr−35のヒブリド化部分と同一である
と思われるが、これら２つのクローンの各々は
Hif−2hcDNA試料にヒブリド化する1.4kbのBgl
−Bgl断片と2kbのEcoR−EcoR断片と
をもたらすので反対方向に配向する。したがつ
て、恐らくchr−16とchr−35との挿入物は重なる
であろう。 したがつて、11個のヒブリド染色体DNAの13
個のヒブリド化部分は10種類以上、すなわちchr
−１、chr−３、chr−12、chr−13、chr−16（左
手側、第１８図において“１”と標識する）、chr
−26、chr−30、chr−35、chr−19およびchr−27
になると思われる。 次に第２４図を参照すれば、chr−１とchr−３
とchr−10とchr−26との重復およびchr−16とchr
−35との重復が示されている。 上記のデータが示唆するところでは、個々のひ
とのゲノムはHif−2hにクロスヒブリド化する10
種以上の異なるDNA配列を含有する。この結論
は、クローン集団中に検出された断片Hif−2h関
連の配列の割合が約16000中１であるという事実
により裏付けられる。半数体ひとゲノムに対し３
×109bpの値を仮定すれば、16kb（検査されたク
ローンの平均値）という平均DNA断片寸法を有
する単一遺伝子コピーに対する予測値は約１：
190000である。したがつてHif−2h関連断片の頻
度は単一遺伝子に対する予測値よりも12倍高いも
のである。 これらデータと比較して、ローン等（上記）が
β−グロビンcDNA試料につき同ぞ遺伝子集団か
ら300000個のプラークを選別した際、僅か２つの
陽性クローンのみが同定され、この場合予測値は
1.6：300000であつた。したがつて、ひとゲノム
には、Hif−2h断片もしくはIFN−α1cDNAにク
ロスヒブリド化する10〜15個の明確な染色体
DNA断片が存在するであろう。 Hif−chr35の別の特性化 説明の目的として、chr−35のヒブリド化配列
（“Hif−chr35”）をさらに特性化した。前記した
染色体ヒブリドフアージのヒブリド化部分は同様
に特性化されかつ本発明の範囲を逸脱することな
く取扱いうることを了解すべきである。 chr−35のヒブリド化部分（“Hif−chr35”）
（Hif−chr16の右手断片と恐らく同一である、上
記）は、Bgl部位を有する唯一のヒブリド化染
色体DNA部分である。IFN−α1およびIFN−α2
のcDNAはそれらのコード配列内にそれぞれ１個
および２個のBgl部位を有するので、恐らく
Hif−chr35は２つの予めクローン化したインタ
ーフエロン遺伝子の１つの相手方になると思われ
る。3′末端Hif−2h cDNA断片（3′非コード域の
みを含有する）へのHif−chr35の強力なヒブリ
ド化は、この試料に対する他の染色体DNAの弱
いヒブリド化と比較して、Hif−chr35とHif−2h
との対応性を裏付けている〔エフ・カフアトス
等、プロシーデイング・ナシヨナル・アカデミ
ー・サイエンス×USA、第74巻、第5618〜5622
頁（1977）〕。 Hif−chr35断片をさらに分析するため、Hind
−BamHI断片をchr35から切除した。この断片
（3.4kb）は、chr−35のヒブリド化部分（“Hif−
chr35”）を含有する。この断片を、周知のdC−
dG末端化方法（エル・ビラーカマロフ等、上記）
を用いてpBR322のPst部位にクローン化させ、
そしてイー・コリHB101を得られた組替えDNA
分子により周知方法〔たとえばエス・ナガタ等、
ネイチヤー誌、第284巻、第316〜320頁（1980）〕
を用いて形質転換させた。 これら形質転換体のクローンをその場でのコロ
ニーヒブリド化（デイー・ハナハンおよびエム・
メセルソン、ジーン誌、第10巻、第63〜67頁
（1980）〕によりP32−標識Hif−2h断片（上記）
で選別し、プラスミドDNA、すなわちＺ−
pBR322（Pst）／HchrIF−35HB（“HchrIF−
35HB”）を陽性クローンから分離した〔エヌ・
エム・ウイルキー等、ヌクレイツク・アシツド・
リサーチ、第７巻、第859〜877頁（1979）方法
Ｂ〕。pBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子に関し
プラスミド中のヒブリド挿入物“HchrIF−
35HB断片”の方向性を、EcoRI開裂および得ら
れた断片の寸法決定により決定した。β−ラクタ
マーゼのそれと一致するよう配向した挿入物をα
と呼び反対の配向をβと呼ぶ。 これら陽性クローンの培養物を見掛けOD650＝
0.8になるまで増殖させ、そして細菌を収穫しか
つエス・ナガタ等（上記）に記載されたリゾチー
ム−凍結−解凍方法により溶菌させた。検査した
10種のクローンのうち７種が75〜500単位／細胞
ｇのIFN−α活性を示した（細胞病理学的効果減
少分析）。 これら７種のIFN生産性クローンのうちの１つ
のDNA挿入物、すなわちイー・コリHB101〔Ｚ
−pBR322（Pst）／HchrIF−35HBα〕を、制限
分析およびヌクレオチド配列決定によりさらに特
性化した。プラスミドDNA（HcrIF−35HBα）
を前記したようにクローンから調製し、制限部位
をスミス−ビルンスチールの地図化により決定し
た〔エツチ・オー・スミスおよびエム・エル・ビ
ルンスチール、ヌクレイツク・アシツド・リサー
チ、第３巻、第2387〜2398頁（1976）〕。HchrIF
−35HBαをEcoRで切断し、5′末端を標識しそ
してBglで切断した〔かつPstにより約1kbの
望ましくない断片を開裂させた〕。1.04kbのEcoR
−Bgl（3′近位）断片と0.96kbのEcoR−
Bgl（5′近位）断片とを、文献〔エー・シー・
ピーコツクおよびシー・ダブリユー・デイングマ
ン、バイオケミストリー、第６巻、第1818〜1827
頁（1967）〕に記載されているようなアガロース
ゲル電気泳動により単離した。両断片をHinf、
BspおよびMboによりそれぞれ部分開裂し、
生成物を1μg／mlの臭化エチジウムを含有するト
リス−酢酸緩衝液（pH7.8）における１％アガロ
ースゲルにて分離した。染色後、放射能バンドを
放射能写真により可視化させた。BstNおよび
HgiA部位も、1.04kb（3′近位）断片について同
様に決定した。分析の結果を第１９図に示す。 ヌクレオチド配列決定のため、HchrIF−
35HBαを種々の制限酵素で開裂させ生成物をト
リス−硼酸−EDTA緩衝液における５％％ポリ
アクリルアミドゲルによる電気泳動により分離し
（エー・シー・ピーコツクおよびシー・ダブリユ
ー・デイングマン上記）、そしてゲルから抽出し、
ダブリユー・ミユーラー等、ジヤーナル・モレキ
ユラー・バイオロジー、第124巻、第343〜358頁
（1978）に記載されているように精製した。 使用した配列決定方法を第１９図に示し、下記
に説明する。 １および２：BglによるHchrIF−35HBαの
開裂、標識化、EcoRおよびPstによる開裂な
らびにBgl＊−EcoR断片（940bp）（“１”）
およびBgl＊−EcoR断片（360bp）（“２”）
の単離； ３および４：EcoRによるHchrlF−35HBα
の開裂、標識化、Bspによる開裂ならびに
EcoR＊−Bsp断片（680bp）（“３”）および
EcoR＊−Bsp断片（880bp）（“４”）の単
離； ５，６，７および８：PvuによるHchrIF−
35HBαの開裂標識化、BglおよびEORlによる
開裂ならびにPvu＊−EcoR断片（780bp）
（“５”）、Pvu＊−Bgl断片（215bp）（“６”）
、
Pvu＊−Bgl断片（90bp）（“７”）およびPvu
＊−EcoR断片（290bp）（“８”）の単離； ９および10：EcoRによるHchrIF−35HBα
の開裂、1300bp EcoR−EcoR断片のトリス
−硼酸EDTA緩衝液における１％アガロースゲ
ル電気泳動による単離、さらにHinfによる開
裂ならびにHinf−Hinf断片（450bp）および
Hinf−Hinf断片（180bp）の単離。より大き
なHinf−Hinf断片の標識化とMboによる
開裂とはHinf＊−Mbo（190bp）（“９“）の
単離を可能にした。より短いHinf−Hinf断
片の標識化とAvaによる開裂とはHinf＊−
Ava断片（150bp）（“10”）の単離を可能にし
た； 11：MboによるHchrIF−35HBαの開裂、標
識化、Bglによる開裂ならびにMbo＊−Bgl
断片（465bp）（‘11”）の単離； 12、13および14：BspおよびBglによる
HchrIF−35HBαの開裂、上記のように1200bp
Bsp−Bgl断片のアガロース電気泳動による
単離、ならびに(a)HgiAによる開裂、標識化、
Mboによる開裂およびHgiA＊−Mbo断片
（300bp）（“12”）とHgiA＊−Mbo断片
（360bp）（“13”）との単離または(b)BstNによ
る開裂、標識化、EcoRによる開裂およびBstN
＊−EcoR断片（380bp）（“14”）の単離。 マキサム−ギルバート法（上記）により、各種
の断片を配列決定した。全ての断片を両ストラン
ドに関しかつ配列決定用の原点として役立つ制限
部位にわたつて配列決定した。 HchrIF−35HBαにおけるコード域のヌクレオ
チド配列とHif−2hにおけるそれ（コード域）と
の比較（第８〜１０図と第２０〜２３図との比
較）は、それらが同一であることを示す。特に、
驚くことに、HchrIF−35HBα断片のコード配列
内、すなわち5′非コード域におけるHinf部位と
3′非コード域におけるEcoRI部位との間には、イ
ントロンの存在が示されない。したがつて、成熟
IFN−αmRNAに対応する染色体配列にはイント
ロンを検出することができなかつた。 Hif−chr26およびHif−chr3の特性化 chr−３およびchr−26の遺伝子含有断片は、ヘ
テロデユプレツクス分析により同一と思われるが
少なくとも１つのBgl制限部位において異な
り、これらをヌクレオチド配列決定により検査し
た。725ベース対における５つのヌクレオチドの
相違が見出された。これらのうち２つのみがコー
ド配列にあると思われる。遺伝子だけでなくそれ
らに先立つ少なくとも3.5Kbpとそれらに続く
6.0Kbpとは完全なヘテロデユプレツクスを形成
しかつ僅か２つのアミノ酸変化を伴う比較的少な
い配列差しかないので、Hif−chr3とHif−chr26
とは同一遺伝子の対立形態であると思われる。こ
れらはIFN−α4a（Hif−chr3）およびIFN−α4b
（Hif−chr26）と名付けられる。前記した慣用の
配列決定技術により決定されたIFN−α4bのヌク
レオチド配列と対応アミノ酸配列とを第２９〜３
２図に示す。 第２９〜３２図を第８〜１０図、第１２〜１６
図および第２０〜２３図と比較すれば、各配列に
よりコードされる蛋白質はそれらの残基の約15％
において互いに相違することが示される。この相
違は、2000〜9000万年前に分化した非対立遺伝子
の生成物に対して典型的である。 ねずみ細胞におけるHif−chr35の発現 ねずみ細胞において発現させるため、Hif−
chr35断片の供給源としてプラスミドＺ−
pBR322（Pst）／HchrIF−35HBα（上記）を使用
した。プラスミドPstで制限しかつ5′エキソヌ
クレアーゼで処理して5′dG末端を除去した。次
いで、この断片を、pBR322のBamH、BamH
断片とポリオーマDNAとの結合により調製さ
れたプラスミドの5′dG−末端化Kpn断片に挿
入した。得られたベクトルを使用してねずみ3T3
細胞を形質転換させ、この場合燐酸カルシウム技
術を使用した〔エヌ・マンテイ等、ネイチヤー
誌、第281巻、第40〜46頁（1979）〕。これら形質
転換細胞は便宜上ねずみ3T3（ポリオーマーHif−
chr35）と名付けられる。20〜40時間後、分析は
ひと細胞に対し300単位／IFN−α1mlのIFN−α
活性を示し、牛細胞に対しては約3000単位／IFN
−α1mlの活性を示した。 勿論、第８〜１０図、第１２〜１６図、第２０
〜２３図および第２９〜３２図に示したヌクレオ
チド配列は、ヌクレオチド配列に対し、たとえば
既に起こつたまたは続いて用いうる単一もしくは
多重のベース置換、挿入、転位もしくは欠失を含
む突然変異のような如何なる変化をも考慮に入れ
てないことを了解すべきである。さらにこの配列
はこれら図面に示されたコドンと同じアミノ酸を
コードする他のコドンの可能な置換をも考慮に入
れてない。したがつて、IFN−αの免疫学的もし
くは生物学的活性を示すポリペプチドをコードす
るような改変配列も本発明の範囲内にあることを
了解すべきである。 さらに、第８〜１０図、第１２〜１６図、第２
０〜２３図および第２９〜３２図に示されたアミ
ノ酸配列は、生体内もしくは試験管内試剤、たと
えば生体内グリコシル化酵素との相互作用により
惹起されるポリペプチドに対し如何なる変化をも
考慮に入れてないことを了解すべきである。した
がつて、IFN−αの免疫学的もしくは生物学的活
性を示すこれらポリペプチドの断片および誘導体
も本発明の一部であることを了解せねばならな
い。 細菌宿主におけるインターフエロンの免疫学的も
しくは生物学的活性を示すポリペプチドの産生 細胞病理学的効果減少分析〔ダブリユー・イ
ー・スチユアート・およびエス・イー・スルキ
ン、S.E.Proc.Soc.Exp.Biol.Med、第123巻、第
650〜653頁（1966）〕は少量のIFN（細菌細胞１個
当り１個以下の活性分子）を検出しうるので、上
記した10種のヒブリドλフアージで感染させたイ
ー・コリHB101の溶菌物をIFNの存在につき分
析した。11種のフアージのうち７種（chr−10、
chr−12、chr−19およびchr−27を除く全て）は、
３〜５単位／mlの範囲のIFN活性を有する溶菌
物を与えた。chr−10およびchr−12の場合、前記
したようにpBR322のPst部位にサブクローン
化させたヒブリド化（Hif−2hに対する）Hind
−HindもしくはEcoR−EcoR断片は大腸
菌においてIFN−α活性を表わした。大腸菌は
mRNAをスプライスし得ないと思われるので
〔オー・メルセロー−プイジヤロンおよびピー・
クーリルスキー、ネイチヤー誌、第279巻、第647
〜649頁（1979）〕、これらIFN−α染色体遺伝子
は恐らくそれらのコード領域中にイントロンを含
有しないと思われる。 最終結論 本発明によりポリ(A)RNAから調製された
cDNAを含有する一群の組替えDNA分子がセン
ダイウイルス処理（誘発）されたひと白血球から
単離され、その代表的なものは次の性質を有して
いる： (1) 誘発されたひと白血球からのポリ(A)RNAに
はヒブリド化するが、非誘発のものからのポリ
(A)RNAにはヒブリド化しない、 (2) RNAの混合物からIFN−αmRNAを選択す
る能力によりおよびヒブリド抑制翻訳分析にお
いてインターフエロンmRNAの翻訳を抑制
（可逆的に）する能力により示されるように、
IFN−αmRNAにヒブリド化する、 (3) この群の或る種のものを含有する大腸菌は、
次の性質を有する化合物を生産する： (a) トリプシンに対し感受性であり、 (b) ひと細胞系においてIFN−α活性を示す
が、ねずみ細胞系においてはほんの 僅かの活性
しか示さず、 (c) 20000〜30000の分子量を有し（第８〜１０
図のヌクレオチド配列に 基づけば19388であ
る）、 (d) IFN−α活性は、ひと白血球インターフエ
ロンに対する抗体により特異性に 抑制される、 (4) 本発明のヒブリドプラスミドのDNA挿入物
は、IFN−αmRNAをRNA混合物から選択す
る能力に加え、IFN−αDNAをcDNAを包含す
る各種供給源の混合物からおよび洗色体DNA
のヒブリドフアージ遺伝子集団から選択するこ
とができる、 (5) IFN−αに対する多数の異なる洗色体遺伝子
が存在し、しかもこれら遺伝子がイントロンを
欠失すると共に適当な宿主におけるインターフ
エロンおよびインターフエロン様ポリペプチド
の直接的発現を可能にすることは予想外であ
る、 (6) これら組替えDNA分子のDNA挿入物におけ
る少なくとも３種のヌクレオチド配列が異なつ
ており、これはIFN−αに関し少なくとも３種
の非対立遺伝子が存在することを示唆してい
る、 (7) これら３種のヌクレオチド配列によりコード
される蛋白質は標準リンパ芽球細胞インターフ
エロンから決定された35個のアミノ酸とは異な
つている、 (8) IFN−α遺伝子断片の各種組合せ物に対し調
製されたヒブリド蛋白質は、相互にまたはそれ
らの親とは定量的に異なる性質を示し、さらに
IFN−αに融合した付加的アミノ酸を有する蛋
白質またはアミノ末端配列の一部を含まない
IFN−αからなる蛋白質はIFN活性を示す。 これらの性質は、本発明により示された組替え
DNA分子がひと白血球インターフエロンに関す
るコード配列の少なくとも１部を含有しかつこれ
らプラスミドの幾つかがひと白血球インターフエ
ロンの免疫学的もしくは生物学的活性を有するポ
リペプチドの大腸菌における発現をもたらすこと
を示している。また明らかなように、本明細書に
示したポリペプチドは蛋白質技術分野で周知され
ているように本発明の範囲を逸脱することなく断
片化、改変もしくは誘導体化させることもでき
る。 本明細書に記載した方法により調製される微生
物および組替えDNA分子は、西ドイツ連邦共和
国ゲツチンゲン所在のドイツチエ・ザンムルン
ク・フオン・ミクロオルガニスメンに1980年１月
７日に寄託した培養物を例とし、HcIF Ａ〜Ｅと
して次のように同定されている： Ａ：イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）／
HcIF−4c） Ｂ：イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）／
HcIF−2h） Ｃ：イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）／
HcIF−SN35） Ｄ：イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）／
HcIF−SN42） Ｅ：イー・コリHB101（Ｚ−pKT287（Pst）／
HcIF−2h−AH6 ） これらの培養物はそれぞれ寄託番号DSM1699
〜1703が付与されている。 さらに、本明細書に記載した方法により調製さ
れた微生物およびDNA分子は、アメリカ合衆国
メリーランド州、ロツクビル所在のアメリカン・
タイプ・カルチヤー・コレクシヨンに1980年３月
27日に寄託された培養物を例としHcIF−Ｇ〜Ｈ
として同定され、それぞれATCC寄託番号31633
〜31634が付与されている： Ｇ：イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）／
HcIF−−206）Ｈ：イー・コリHB101（Ｚ−
pBR322（Pst）／HcIF−SN35−Ａ HL6） 本明細書中に記載した方法により調製したその
他の微生物は、西ドイツ連邦共和国ゲツチンゲン
所在のドイツチエ・ザンムルンク・フオン・ミク
ロオルガニスメンに1980年10月１日に寄託した培
養物を例とし、HchrIF−Ａ〜Ｊとして同定され
かつ寄託番号DSM1914〜1923が付与されてい
る： A.イー・コリHB101におけるchr3のサブクロー
ン化Hind断片； B.イー・コリHB101におけるchr12のサブクロー
ン化EcoRI断片； C.イー・コリHB101におけるchr12のサブクロー
ン化Hind断片； D.イー・コリHB101におけるchr13のサブクロー
ン化EcoR断片； E.イー・コリHB101におけるchr23のサブクロー
ン化EcoR断片； F.イー・コリHB101におけるchr23のサブクロー
ン化Hind断片； G.イー・コリHB101におけるchr26のサブクロー
ン化EcoR断片； H.イー・コリHB101におけるchr26のサブクロー
ン化Hind断片； I.イー・コリHB101におけるchr35のサブクロー
ン化Hind−BamH断片； Ｊ：イー・コリHB101におけるchr35のサブクロ
ーン化BamH断片。 最後に本明細書中に記載した方法により調製さ
れた微生物は、アメリカ合衆国メリーランド州、
ロツクビル所在のアメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨンに1980年12月15日に寄託され、
HchrIF−Ｋ〜HchrIF−ＱおよびHcIF−Ｉ〜
HcIF−Ｋとして同定されかつそれぞれATCC寄
託番号31760HchrIF−Ｋ、31761HchrIF−Ｌ、
31762HchrIF−Ｍ、31763HchrIF−Ｎ、
31764HchrIF−Ｏ、31765HchrIF−Ｐ、
31766HchrIF−Ｑ、31767HcIF−Ｉ、31768HcIF
−Ｊ、31769HcIF−Ｋが付与されている： K.イー・コリHB101におけるchr23のサブクロー
ン化Tac−Tac断片 ； L.イー・コリHB101におけるchr10のサブクロ
ーン化Bgl−Bgl 断片； M.イー・コリHB101におけるchr10rのサブクロ
ーン化Hind−Hi nd断片； N.イー・コリHB101におけるchr26のサブクロー
ン化Bgl−Bgl 断片； O.イー・コリHB101におけるchr30のサブクロー
ン化Hind−Hin ｄ断片； P.イー・コリHB101におけるchr13のサブクロー
ン化Bgl−Tac断 片； Q.イー・コリHB101におけるchr16のサブクロ
ーン化Bgl−Tac 断片； HcIF−Ｉ：イー・コリDS410（C8−IFN−α2） HcIF−Ｊ：イー・コリDS410（LAC−AUG
（α2）） HcIF−Ｋ：イー・コリDS410（β−Lac−AUG
（α2）） 以上、本発明を多くの具体例につき説明した
が、この基本的構成を変化させて、本発明の方法
および組成物を利用する他の具体例を提供しうる
ことが明白である。したがつて、本発明の範囲は
例をもつて前記した特定具体例でなく、寧ろ特許
請求の範囲により規定されるべきであることが了
解されよう。
【図面の簡単な説明】
第１図はその幾つかが本発明のポリペプチドを
コードする挿入DNA配列を特徴とするような組
替えDNA分子の混合物を製造するための、本発
明の方法の一実施態様を示す概略図、第２図は本
発明の初期クローン選別法の概略図、第３図は本
発明により調製されたDNA配列を使用するクロ
ーン選別法の一実施態様を示す概略図第４図は本
発明のクローンの一つの制限地図であつて、ただ
しこのクローンの各制限部位の絶対的位置は示さ
ず、第８〜１０図においてこれら制限部位のより
絶対的な位置を示し、第５図は本発明の一つの組
替えDNA分子におけるDNA挿入物の方向性を決
定する方法の概略図、第６図は本発明により使用
しうる幾つかのクローン化ベヒクルの部分的ヌク
レオチド配列を示す図、第７図は本発明の細菌培
養から調製された上澄液のセフアデツクスＧ−
100分別化の結果を示す図、第８〜１０図は本発
明の組替えDNA分子に対するDNA挿入物のヌク
レオチド配列を示す図であつて、この配列はポリ
G5′末端に続くヌクレオチドからポリＡ残基およ
びポリC3′末端の前のヌクレオチドまで番号を付
け、ヌクレオチド57〜125は信号配列を示し、か
つヌクレオチド126〜626は「成熟」インターフエ
ロンおよび停止コドンを示し、信号配列のアミノ
酸配列は下部文字においてそのヌクレオチド配列
の上方に示されかつ「成熟」インターフエロンの
アミノ酸配列は上部文字においてそのヌクレオチ
ド配列の上方に示され、この遺伝子における各種
の制限エンドヌクレアーゼ認識部位をも第８〜１
０図に示し、これら部位は第４図に示されるもの
よりも絶対的に位置決定され、第１１図は本発明
の組替えDNA分子の２つのDNA挿入物の制限地
図に関する略比較図、第１２〜１６図は本発明の
組替えDNA分子の２つのDNA挿入物のヌクレオ
チド配列を示す図であつて、この配列はポリ
G5′末端に続くヌクレオチドからポリＡ残基およ
びポリC3′末端の前のヌクレオチドまで番号を付
け、これら挿入物の各々に対する信号配列のアミ
ノ酸配列は下部文字においてその各ヌクレオチド
配列の上方に示されかつ「成熟」インターフエロ
ンのアミノ酸配列は上部文字においてそのヌクレ
オチド配列の上方に示され、第１７図はＺ−
pBR322（Pst）／HcIF−−206の部分制限地図
および第１２〜１６図に示されたHif−−206
断片のヌクレオチド配列を決定するのに使される
配列決定方法を示す図、第１８図はHif−2h断片
にヒブリド化する一連のヒブリドフアージの部分
制限地図を示す図、第１９図はＺ−pBR322
（Pst）／HchrIF−35HBαのヒブリド挿入物の部
分制限地図およびそのヌクレオチド配列を決定す
るのに使用する配列決定方法を示す図、第２０〜
２３図はHchrIF−35HBα断片のヌクレオチド配
列およびそれから生ずるアミノ酸配列を示す図、
第２４図はHuIFN−α関連遺伝子に対する部分
結合地図を示す図であつて、矢印は誘発白血球ポ
リ(A)RNAと共にＲ−ループを形成する領域を示
し、ハツチングした枠（chr−16）はブロツチン
グ実験から推定されたが、Ｒ−ループ地図では示
されなかつた配列を示し、第２５図はプラスミド
C8−IFN−α1の構成の概略図、第２６図はプラ
スミドLAC−AUG（α2）の構成の概略図、第２
７図はLAC−AUG（α2）の構成、特にAUG開始
信号およびCYSN−末端アミノ酸におけるプラス
ミドの構成を示す図、第２８図はプラスミドC8
−IFN−α2の構成およびヒブリド分子，，
およびの概略図、第２９〜３２図はヌクレオ
チド配列とそれによりIFN−α4bに対してコード
されるアミノ酸配列およびそのシグナル配列を示
す図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ (a) Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−4c
    〔DSM1699〕、 Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−2h〔DSM1700〕、 Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−SN35
    〔DSM1701〕、 Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−SN42
    〔DSM1702〕、 およびＺ−Ｚ−PKT287（Pst）／HcIF−2h−
    AH6〔DSM1703〕のDNA挿入物、 (b) Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−−206 〔ATCC31633〕およびＺ−pBR322（Pst）／
    HcIF−SN35−AHL6〔ATCC31634〕のDNA
    挿入物、 (c) 前記DAN挿入物のいずれかにヒブリド化し
    かつIFN−α型のポリペプチドをコードする
    DNA配列、および (d) (a)，(b)および(c)で特定されるDNA挿入物お
    よび配列によりコードされるのと同じアミノ酸
    をコードするシノニムコドンによつて１以上の
    コドンが交換されかつIFN−α型のポリペプチ
    ドをコードするDNA配列であつて、前記DNA
    配列が組替えDNA分子中で発現制御配列に作
    用結合しているDNA配列、 よりなる群から選択されるDNA配列を特徴とす
    る組替えDNA分子。 ２ DNA挿入物(a)のいずれか１つにヒブリド化
    するDNA配列(c)が、 （ｇ） Hif−chr3のHind断片〔DSM1914〕、 Hif−chr12のEcoRI断片〔DSM1915〕、 Hif−chr12のHind断片〔DSM1916〕、 Hif−chr13のEcoRI断片〔DSM1917〕、 Hif−chr23のEcoRI断片〔DSM1918〕、 Hif−chr23のHind断片〔DSM1919〕、 Hif−chr26のEcoRI断片〔DSM1920〕、 Hif−chr26のHind断片〔DSM1921〕、 Hif−chr35のHind−BamHI断片
    〔DSM1922〕、 Hif−chr35のBamHI断片〔DSM1923〕、 Hif−chr23のTac−Tac断片〔ATCC31760〕、 Hif−chr10lのBgl−Bgl断片
    〔ATCC31761〕、 Hif−chr10rのHind−Hind断片
    〔ATCC31762〕、 Hif−chr26のBgl−Bgl断片
    〔ATCC31763〕、 Hif−chr30のHind−Hind断片
    〔ATCC31764〕、 Hif−chr13のBgl−Tac断片〔ATCC31765〕
    および Hif−chr16lのBgl−Tac断片〔ATCC31766〕 のいずれかのヒブリド化部分、 （ｈ） 前記DNA挿入物のいずれかにヒブリド
    化しかつIFN−α型のポリペプチドをコードす
    るDNA配列、および （ｉ） （ｇ）および（ｈ）で特定されるDNA
    配列によりコードされるのと同じアミノ酸をコ
    ードするシノニムコドンによつて１以上のコド
    ンが交換されかつIFN−α型のポリペプチドを
    コードするDNA配列、 から選択される特許請求の範囲第１項記載の組替
    えDNA分子。 ３ 式： 【表】 のDNA配列を特徴とする特許請求の範囲第１項
    記載の組替えDNA分子。 ４ 式： 【表】 【表】 のDNA配列を特徴とする特許請求の範囲第１項
    記載の組替えDNA分子。 ５ 式： 【表】 のDNA配列を特徴とする特許請求の範囲第１項
    記載の組替えDNA分子。 ６ 発現制御配列がlac系、β−lac系、trp系、、
    フアージλの主オペレータおよびプロモータ領
    域、fdコート蛋白の制御領域並びに原核もしくは
    真核細胞およびそのウイルスの遺伝子の発現を制
    御するその他の配列よりなる群から選択される特
    許請求の範囲第１項記載の組替えDNA分子。 ７ C8−IFN−α1、C8−IFN−α2、LAU−
    AUG（α2）およびβ−lac−AUG（α2）から選択
    される特許請求の範囲第１項記載の組替えDNA
    分子。 ８ 次に記載のものから選択されるDNA配列を
    特徴とする少なくとも１種の組替えDNA分子に
    より形質転換された微生物またはねずみ細胞： (a) Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−4c〔DSM1699〕、 Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−2h〔DSM1700〕、 Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−SN35
    〔DSM1701〕、 Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−SN42
    〔DSM1702〕、 およびＺ−pKT287（Pst）／HcIF−2h−AH6
    〔DSM1703〕のDNA挿入物、 (b) 前記DNA挿入物のいずれかにヒブリド化し
    かつIFN−α型のポリペプチドをコードする
    DNA配列、および (c) (a)および(b)で特定されるDNA挿入物および
    配列によりコードされるのと同じアミノ酸をコ
    ードするシノニムコドンによつて１以上のコド
    ンが交換されかつIFN−α型のポリペプチドを
    コードするDNA配列であつて、前記DNA配列
    が組替えDNA分子中で発現制御配列に作用結
    合しているDNA配列、 ９ 微生物またはねずみ細胞がイー・コリである
    特許請求の範囲第８項記載の微生物またはねずみ
    細胞。 １０ イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）／
    HcIF−4c）、 イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−
    2h）、 イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−
    SN35）、 イー・コリHB101（Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−
    SN42） およびイー・コリHB101（Ｚ−pKT287（Pst）／
    HcIF−2h−AH6）から選択される特許請求の範
    囲第８項記載の形質転換微生物またはねずみ細
    胞。１１ イー・コリHB101（Ｚ−pBR322
    （Pst）／HcIF−−206）およびイー・コリ
    HB101（Ｚ−pBR322（Pst）／HcIF−SN35−
    AHL6）から選択される特許請求の範囲第８項記
    載の形質転換微生物またはねずみ細胞。 １２ HchrIF−Ａ、HchrIF−Ｂ、HchrIF−Ｃ、
    HchrIF−Ｄ、HchrIF−Ｅ、HchrIF−Ｆ、
    HchrIF−Ｇ、HchrIF−Ｈ、HchrIF−Ｉおよび
    HctrIF−Ｊから選択される特許請求の範囲第８
    項記載の形質転換微生物またはねずみ細胞。 １３ イー・コリDS410（C8−IFN−α1）、イ
    ー・コリDS410（C8−IFN−α2）、イー・コリ
    DS410（LAC−AUG（α2））、イー・コリ
    DS410HB101（β−lac−AUG（α2））およびねず
    み3T3（polyoma−Hif−chr35）から選択される
    特許請求の範囲第８項記載の形質転換微生物また
    はねずみ細胞。 １４ HchrIF−Ｋ、HchrIF−Ｌ、HchrIF−Ｍ、
    HchrIF−Ｎ、HchrIF−０、HchrIF−Ｐ、
    HchrIF−Ｑ並びにHif−chr19およびHif−chr27
    により形質転換された微生物またはねずみ細胞か
    ら選択される特許請求の範囲第８項記載の形質転
    換微生物またはねずみ細胞。 １５ 式： 【表】 【表】 のDNA配列から選択されるα−インターフエロ
    ンをコードするDNA配列。 １６ 式： 【表】 のDNA配列から選択されるα−インターフエロ
    ンをコードするDNA配列。 １７ 式： 【表】 のDNA配列から選択されるα−インターフエロ
    ンをコードするDNA配列。
JP61182054A 1980-01-08 1986-08-04 組替えＤＮＡ分子、これにより形質転換された宿主、およびＩＦＮ−α型ポリペプチドをコ−ドするＤＮＡ配列 Granted JPS62122590A (ja)

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