JPH01296979A - 新規微生物並びに９−ケト型１６員環マクロライド抗生物質の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規微生物並びに該微生物によって生産する
医薬、動物飼料添加剤、動物用治療薬、水産用抗生物質
として有用である９−ケト型１６員環マクロライド抗生
物質の製法に関するものである。

〔従来の技術〕

一般式（１） で表される９−ケト型１６貫通マクロライド抗生物質の
Ｒ１がアセチル基、Ｒ３がイソバレリル基であるカルボ
マイシンＢはタンナー（Ｔａｎｎｅｔ）　　ラ［Ｆ、　
Ｗ、　Ｔａｎｎｅｒ、　Ａ、　Ｒ，Ｅｎｇｌｉｓｈ：Ａ
ｎｔｉｂｉｏｔ、ａｎｄ　Ｃｈｅａ＋ｏｔｈｅｒ、、　
　２．４４１（１９５２）　　）によって見出されたカ
ルボマイシン八を生産する菌株スト１／ブトミセスハル
ステシイ　（ＳｔｒｅｐｔｏｌＴｌｙｃｅｓ　ｈａｌｓ
ｔｅｄｉｉ）　　の培養液からホッホシュタイ：／　（
Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ）　　ら〔Ｆ、　Ａ。

Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ、　Ｐ、　Ｐ、　Ｒｅｇｎａ：Ｊ、
　、Ａ、　Ｃ，Ｓ、　、二、　３３５３　（１９５５）
　〕によって見出された。また、上記式（１）のＲ１が
水素原子、Ｒ２がインバレリル基であるニタマイシ７　
（Ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）　　はナカザワ（Ｋ、　Ｎａ
ｋａｚａｗａ。

Ｊ、Ａｇｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｊａｐａｎ、　２９．
６４７　、　　（１９５５））によりストレプトミセス
　ジャカルタエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｄ
ｊａｋａｒｔａｅｎｓｉｓ）の生産物から見出されてい
る。

しかし、これらの菌株による培養液中の生産量は僅かで
あり、生物活性の評価をするための場合でも、充分な量
を確保することは困難であった。

従って、これらの抗生物質は、その誘導体とすることに
よってより高い効果を期待できる原料として有望視され
ているが、その生産に多大の労力を必要としこの種の抗
生物質の開発、研究の障害になっていた。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は９−ケト型１６員環マクロライド抗生物質の生
産量の高い新規微生物並びにその微生物を使用して高収
量で９−ケト型１６員環マクロライド抗生物質を製造す
る方法を堤供することを目的とするものである。

〔課題を解決するための手段〕

１６員環マクロライド抗生物質の生合成経路はフルマイ
ら（Ｔ、　Ｆｕｒｕｍａ　ＩＩＫ、　Ｔａｋｅｄａ、　
ＩＪ、　５ｕｚｕｋ　ｉ　：Ｊ、　Ａｎｔ　１ｂｉｏｔ
ｉｃｓ、　２８．７８９（１９７５）　］によって提唱
されている如＜、１６員環マクロライド抗生物質のアグ
リコン部は９位ケト体を出発物質として還元が起こり９
位ヒドロキシ体となる。かくして、生物学的活性な最終
生産物は９位ヒドロキシ体の１６員環マクロライド系抗
生物質である。

本発明者らは、１６員環マクロライド抗主物質の９位が
ケト型の物質を生産する生産菌で、この抗生物質の生産
量の高い微生物を得べく鋭意研究し、９位がヒドロキシ
体の物質を高収量で生産する菌株を選択し、次に人工変
異処理により９位還元酵素欠失株を創成することにより
９位ケト型の１６員環マクロライド抗生物質を高収量で
生産する微生物を得ることに成功し、この微生物を栄養
培地に培養し９−ケト型１６員環マクロライド抗生物質
を高収量で得る方法を見出し本発明を完成した。

本発明はストレプトミセス属に属する１６員環マクロラ
イド抗生物質生産菌であって、９位還元酵素を欠失した
新規微生物並びに、同微生物を栄養培地に培養して培養
物から式（１） （式中ＲＩ　　は水素原子又はアセチル基、Ｒ２は水素
原子又は炭素数２〜６個を有するアルカノイル基を示す
）で表される９−ケト型１６員環マクロライド抗生物質
を高収量で得る方法である。

本発明のスト１／ブトミセス属に属する１６員環マクロ
ライド抗生物質生産菌であって、９位還元酵素の欠失し
た微生物は次のようにして検索することができる。

天然界より採取した土壌を生理食塩水を加え、攪拌後濾
過し、濾液をｌ５Ｐ−２培地で培養生育させ、生育した
放線菌を栄養培地に接種培養し、培養液中の活性成分を
分離し９位ヒドロキシ型１６員環マクロライド抗生物質
を生産した菌株を検索し、この菌株を培養し、生育した
菌体にＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロングアニ
ジン処理等の変異処理を施し、この変異処理を施した菌
体を集め培養し、培養液中の活性成分を分離しクロマト
スキャナーにより２８０ｎｍ　に吸収を持つ物質を検出
した菌株を選び出したものが本発明の微生物である。

この方法により検索された代表的な微生物はストレプト
ミセスＮｏ、７６５９株（本菌株は微生物工業技術研究
所にＦＥＲＭ　Ｐ−９９８５として寄託されている）で
ある。この菌株はカルボマイシンＢの生産株として極め
て優れたものである。

以下ストレプトミセスＮα７６５９株について、本発明
の微生物を検索する具体的方法を示す。

検索法 （マクロライド生産菌の検索） 自然界より採取した土壌１ｇに生理食塩水ＬＯｍｌ（界
面活性剤ツイーン８００．０１％添加）を加え、激しく
攪拌した後、東洋濾紙Ｎｏ、　２で濾過し：ａ液を１０
倍完投階的に滅菌生理食塩水で希釈する。この液ＯＡｍ
ｌをｌ５Ｐ−２培地（酵母エキス０．４％、麦芽エキス
１．０％、グルコース０．４％、寒天１．５％、ｐＨ７
，３）　　上に塗り拡げ２８℃で７日間培養する。生育
した放線菌をＰ　２２　Ｍ培地（脱脂大豆粉２％、グル
コース２％、肉エキス０．２％、に２１１ＰＯ，０１１
％、ＭｇＳＯ４−７Ｌｏ　０．０５％）３０ｍｌを入れ
た２５〇−容三角フラスコに接種し、２日間２８℃で振
盪培養する。この培養液０．２−を１れ一１９培地（グ
リセリン４．０％、ペプトン０．５％、グルコース０．
２％、可溶性澱粉０．２％、脱脂大豆粉０．５％。

ドライイースト０．５％、ＮａＣ１０，５％、　ＣａＣ
０＊　０．２％、ｐＨ６、４）　３０−を入れた２５０
ｍ１容三角フラスコに接種し、２８℃、４日間振盪培養
する。培養液を遠心分離（１，５００Ｘ　ｇ、１５　ａ
ｋｉｎ）　Ｌ、上澄液１−を小遠心管にとり、ＫＪｐＯ
ｎ　１００ｍｇ、　−酢酸エチル　ｌ　ｍｌを加え、ゴ
ム栓をして激しく攪拌後、１０（１０Ｘ　ｇ、　ＩＱｍ
ｉｎ　で遠心分離した。２層に別れた上層の液をシリカ
ゲル薄層プレート　（メルク社製　ｋ５７１５）　　に
１０ｄ宛スポツトし展開溶媒（酢酸エチル：アセトン＝
９＝１）にて６０分間展開する。

このプレートをドラフト内で乾燥後１０％（Ｗ／１ｍ）
Ｈ２ＳＯ，を噴霧し１０５℃オーブン内で５分間加熱す
る。マクロライド抗生物質は茶褐色に発色し、標準品の
ロイコマイシンと比較した。かくしてロイコマイシン生
産菌株を検索しその一株としてＰ４２５９株が得られた
。

（変異処理） ＩＳＰ−２培地上で２８℃、１４日間培養したＰ４２５
９株の表面から菌糸をかきとり、ジオクチルスルホサク
シネー）Ｏ，（１０５％を含むＤＨ８，５の０．ＩＭ　
　リン酸ナトリウム緩衝液１０ｍ１に懸濁し、ミリポア
フィルタ−（孔径１０　μｍ、　ＬＣＷＰ）で濾過し、
濾液０．５ｍｌ’をＰ２２Ｍ培地（３０ｍｌ！／２５０
ｍ１三角フラスコ）に接種し３０℃、４８時間振盪培養
する。この培養液０．２ｒｄをＳ培地〔グルコース１％
、ペプトン０．４％、酵母エキス０．４％、　ＭｇＳＯ
４・７ＨｚＤ　Ｏ，０５％、Ｋ）１２ＰＩ］、　（１，
２％、に２）ＩＰ［１，０，４％（２５ｒｎＩｌ／２５
０　ｔａｌｌ容三角フラスコ）〕に接種し２４時間振盪
培養する。これを３．０００ｒ、ｐ、ｍ　１０分間遠心
分離して菌体を集め、２０−の０．０５！Ｊ　　）　Ｉ
Ｊスス−レイン酸バッファー（ｐＨ８，５）　　に！！
濁し、ワーリングブレンダーにて菌糸を切断する。これ
に１■／ｍｌのＮ−メチル＝Ｎ′−二トローＮ−ニトロ
ソグアニジンを０．２−添加し３０℃で６０分間緩やか
に振盪する。

後３．００Ｏｒ、Ｉ）、ｍ、１０分間遠心分離し菌体を
集めＳ培地（２５−）２５０−容三角フラスコ）に懸濁
し３０℃、４８時間振盪培養する。この菌体を３．００
Ｏｒ、　ｐ、　ｉｎで１゜分間遠心分離して菌体を集め
、岡西らの方法〔：Ａ。

０ｋａｎｉｓｈｉ、に、５ｕｚｕｋｉ　ａｎｄ　ＨｏＬ
ｌｍｅｚａｗａ：Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ！、、
　−亜、　３８９　（１９７４）　）によってプロトプ
ラスト化し、再生を行った。再生したコロニーをＰ２２
Ｍ培地に接種し３０℃、４８時間培養後、その０．２−
をＮＺ培地（グリセリン２％、ＮＺアミンＡ１％、酵母
エキス０．１％、　Ｍｇ５Ｏ＜づＨ２Ｏ０，０５％、に
、ＨＰＯ４０，０５％、ｐＨ７，Ｑ。

２５ｍｊ！／２５０ｍｊ！容三角フラスコ）に接種し３
０℃、７２　時間振盪培養する。培養液１　＋ｎｆを小
遠心管にとり、ＫＪＰＯ＋　５０　ｍｇ、酢酸エチル１
ｍｅを加え攪拌抽出する。遠心分離（３，００Ｏｒ、　
ｐ、　ｍ、　１０＋ｎ１ｎ）後上層の酢酸エチル層１０
ｄを薄層クロマトプレートにスポットし、酢酸エチル：
アセトン＝９：１の溶媒で展開する。

展開後プレートをクロマトスキャナー（島原製作所Ｃ３
９３０型）により２８０　ｎｍに吸収を持つ物質を生産
するＮα７６５９株をを選び出した。

次にこのＮα７６５９株の菌学的性状を述べる。

（菌学的性状） ｌ）形態 気菌糸は貧弱で直鎖乃至分岐が認められ、らせんは認め
られない。輪生技も認められない。

胞子鎖は普通３〜１０個の胞子を着生するが胞子着生は
貧弱である。

胞子表面は平滑である。

１１）各種培地における生育状態を第１表に示す。

第　　１　　表 ｉｉｉ　）生理学的性質 （１）生育温度：１５〜３５℃で生育する。３７℃以上
では生育できない。

（２）ゼラチンの液化；陽性 （３）スターチの加水分解；陽性 （４）ミルクの凝固：陰性 （５）メラニン様色素の生成：チロシン寒天培地で陽性 ｉｖ）炭素源の利用性（ブリーダム・ゴ）　ＩＪ−ブ寒
天培地で試験） グルコース、フラクトース、イノシトール：陽性 アラビノース、キシロース、シュークロース。

ラムノース、ラフィノース、マンノース、セルロース：
陰性 次に本発明のストレプトミセス属に属し１６員環マクロ
ライド抗生物質生産菌であって、９位還元酵素の欠失し
た微生物を培養し、９−ケト型１６員環マクロライド抗
生物質を得る方法について説明する。

本製造法は、上記の菌株を通常の微生物が利用し得る公
知の栄養源を含有する培地で公知の方法で培養する。例
えば炭素源としては、例えばグルコース、グリセリン、
澱粉、マルトース。

油脂類などが使用できる。窒素源としては、例えば大豆
粉、肉エキス、酵母エキス。ペプトン。

コーンステイープリカー、綿実粕などの有機物並びに硫
簑アンモニウム、硝酸アンモニウム。

塩化アンモニウム、硝酸す）ＩＪウムなどのｆ＠機物を
使用できる。また必要に応じて食塩、塩化カリウム、リ
ン酸塩その他重金属塩などの無機塩類を添加する他、醗
酵中の発泡を抑制するために例えばシリコン等の消泡剤
を適宜添加することができる。

培養法：ま一般に行われている抗生物質の生産の方法と
同じく、好気的深部培養法が適しており、２０〜３５℃
で培養を行い、生産は２〜６日位が好適である。

培養後、培養液より９−ケト型１６員環マクロライド抗
生物質例えばカルボマイシンＢ、ニダマイシンなど採取
するには、微生物の生産する代謝産物を採取するに通常
に用いられている手段を適宜に利用すればまい。例えば
、不純物との溶解度の差を利用する手段、イオン交換樹
脂や各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する手段
、水と混ざらない溶媒による抽出などの単独或いは組合
せで利用できる。例えば、培養液をｐＨ４前後にし、こ
れから菌体を分離して′ａ液を得、この濾液のｐＨを８
．０以上にしてからトルエン等の有機溶媒で抽出する手
段等で９−ケト型１６員環マクロライド抗生物質を抽出
することができる。

この抗生物質を更に精製するためには、シリカゲル、セ
ファデックス、カーボキシメチルセルロース、アルミナ
、活性炭などの吸着剤、ゲル濾過剤を用いたカラムクロ
マトグラフ法等により行うことができる。

次に本発明の９−ケト型１６員環マクロライド抗生物質
を製造する方法の実施例を挙げる。

〔実施例〕

例　　１ ストレプトミセスＮｏ、７６５９株のスラント培養より
Ｐ２２Ｍ培地に接種し、３０℃、４８時間振盪培養する
。この培養液０．２ｍｌをＣ５−３培地（脱脂大豆粉３
％、綿実粕３％、コーンスターチ５％、大豆油５％。

３０ｍｆ１５００ｍｊ’容三角フラスコ）１００本に接
種し、３０ｔ、　　４日間培養した。培養液を集め、Ｈ
ＣＩ　　でｐＨ３，５に調整し、濾過助剤セライト　（
和光純薬）を培養液重量の５％宛加えて吸引濾過を行っ
た。

濾液を５ＮＮａＯ）１にてｐＨ８，，５に調整し、トル
エン５１を加えて攪拌抽出を行いトルエン層をとり０．
０ＩＮ　ＨＣＩ　水を加えて攪拌抽出を行った。水層を
分取し、ｐＨを６Ｎ　ＮａＯＨにて８．５　に調整し、
トルエン２１を加え攪拌抽出を行った。トルエン層をロ
ータリーエバポレーターでａ縮乾固し、カルボマイシン
Ｂとニダマイシンの混合粉末１０ｇが得られた。

例　　２ 例１で得たカルボマイシンＢとニダマイシンの混合粉末
を少量のベンゼンに溶解し、シリカゲルカラムクロマト
グラフィー（ワコーゲルＣ−２００、３ｃｍ　Ｘ　８０
　ｃｍカラム）を行った。

展開はベンゼン：アセトン＝４：１で行い、各分画を薄
層クロマトグラフィー（メルクシリカゲルプレー）　Ｆ
２％４．展開はベンゼン二アセトン＝４＝１で分析しク
ロマトスキアナ−（島原Ｃ５−９３０）によりスポット
を検出した。Ｒｆ＝０．６を示す物質ｆｌ（カルボマイ
シンＢ）とＲｆ＝０．４５を示す物質ｆｔ　にダマイシ
ン）をそれぞれ最も純度の高い分画を集め濃縮乾固した
。カルボマイシンＢの収量は２．０ｇ、ニダマイシンの
収量は０．４ｇであった。

Ｒｆ＝０．６を示す物質ｆ、とＲｆ＝０゜４５を示す物
質ｆ２　の理化学的性質は次の通りである。

１）紫外部吸収 両物質とも２７８ｎｍ　に極大吸収を示した。

ｆ、　　：Ｅｉ＞、（２７８）＝２８８．３ｆ　２：　
Ｅ　１Ｔｈ−（２７８）　＝３０２．５ｆ、の紫外部吸
収スペクトルを第１図に示す。

２　）　’）ｌ−ＮＭＲ ｆ、の４００　ＭＨｚ　’ＩＩ−ＮＭＲを第２図に示す
。

ｆ２　の４００　Ｍ　Ｈｚ　’Ｈ−ＮＭＲを第３図に示
す。

３　）　”Ｃ−ＮＭＲ ｆ　ｌ＋　ｆ　２　（Ｄ”Ｃ−ＮＭＲＬ：よる各炭素原
子の化学シフト値を第２１表に示す。

４）質量分析 ケミカルインパクト法によるｆ、、ｆ２　の質量分析の
結果 ｆ、：Ｍ＝÷１＝、８２６ ｒ、　　：　Ｍ−−！−ｔ　＝７８４ これらの結果を文献値（Ａ、　Ｋｉｎｕｍａｋｉら：Ｊ
。

Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、　２７．１１７（１９７４）
　、Ｓ、Ｏｍｕｒａ　　ら：Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、、９７：１４．４００１（１９７１
）　、　Ｍ、５ｕｚｕｋｉ：Ｊ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
ｓ、２４．９０４（１９７１）、Ｆ、Ａ、ｆｌｏｃｈｓ
ｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｋ。

Ｍｕｒａｉ：Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、、　７６、
５０８０（１９５４））と比較してｆ、物質はカルボマ
イシンＢ、ｆ２物質はニダマイシンであると同定された
。

（以下、この頁余白） 第２表 ｆｌおよびｆ２物質の”Ｃ−Ｎ！ＪＲ ”Ｃ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　５ｈｉｆｔｓ　　ｐｐｍＪ
、Ａ、Ｃ，Ｓ、９７．４００１（１９７５）〔発明の効
果〕 本発明は９−ケト型１６員環マクロライド抗生物質を高
収量で得る新規微生物並びにこの微生物を用いて９−ケ
ト型１６員環マクロライド抗生物質を製造する方法を提
供するもので極めて有用な発明である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で得られたｆｌ　物質の紫外部吸収スペ
クトルである。 第２図は本発明で得られたｆ、物質の４００ＭＨｚ’Ｈ
−ＮＭＲ（ＣＤの、）を示す。 第３図は本発明で得られたｆ２物質の４００Ｍ　Ｉ（ｚ
’ｌ（−ＮＭＲ（ＣＤＣｆ３）を示す。 特許出願人　　工　楽　株式会社 代　理　人　　新　井　　　力　（ほか２名）第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ストレプトミセス属に属する１６員環マクロライド
   抗生物質生産菌であって、９位還元酵素の欠失した新規
   微生物。 ２、ストレプトミセス属に属する１６員環マクロライド
   抗生物質生産菌であって、９位還元酵素の欠失した微生
   物を栄養培地に培養し、培養物から採取することを特徴
   とする式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ＿１は水素原子又はアセチル基、Ｒ＿２は水素
   原子又は炭素数２〜６個を有するアルカノイル基を示す
   ）で表される９−ケト型１６員環マクロライド抗生物質
   の製法。 ３、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）Ｎ
   ｏ．７６５９株（ＦＥＲＭＰ−９９８５）を栄養培地に
   培養し、培養物から採取することを特徴とする式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ＿１は水素原子又はアセチル基、Ｒ＿２は水素
   原子又は炭素数２〜６個を有するアルカノイル基を示す
   ）で表される９−ケト型１６員環マクロライド抗生物質
   の製法。