JPH10114777A

JPH10114777A - 抗生物質スピロキシマイシンとその製造法

Info

Publication number: JPH10114777A
Application number: JP26876696A
Authority: JP
Inventors: Tomio Takeuchi; 富雄竹内; Masa Hamada; 雅濱田; Hiroshi Osanawa; 博長縄; Yoshikazu Takahashi; 良和高橋; Ryuichi Sawa; 竜一澤
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1996-10-09
Filing date: 1996-10-09
Publication date: 1998-05-06

Abstract

(57)【要約】【課題】新規な抗菌性抗生物質を提供することを目的
とする。【解決手段】多剤耐性菌（メチシリン耐性菌等）に優
れた抗菌活性を示す新しい分子骨格を有する抗生物質を
探索し、新しい抗生物質としてスピロキシマイシンを得
た。スピロキシマイシンは下記の式（Ｉ）で表わされる
化合物である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は抗菌活性を有する新
規な抗生物質であるスピロキシマイシン（Spiroximici
n）に関し、またスピロキシマイシンの製造法に関す
る。さらに本発明はスピロキシマイシンまたはその塩を
有効成分とする抗菌剤に関する。さらに本発明はスピロ
キシマイシンを生産できる特性を持つ新規な微生物アミ
コラトプシス・エスピーＭＪ６６−５９Ｆ３株に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】細菌感染症の化学療法において、多剤耐
性菌の出現は重大な問題である。従来知られるまたは使
用されている既知の抗菌性化合物とは、異なる化学構造
の骨格を有し且つ優れた抗菌活性と性質を示す新しい化
合物の発見または創製をすることは常に望まれており、
そのための研究が行なわれている。

【０００３】

【発明が解決すべき課題】本発明は、上記の要望に応え
ることができる抗菌活性を持つ新規な抗生物質を提供す
ることを目的にするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは有用
な抗生物質を発見すべく研究を行い、その結果、新規な
微生物として、アミコラトプシス属に属する菌株を分離
することに成功し、またこの菌株が新しい構造骨格を有
する抗生物質を産生していることを見い出だした。そし
て、この物質を単離することに成功してスピロキシマイ
シン(Spiroximicin)と命名した。このスピロキシマイシ
ンがグラム陽性の細菌並びにその薬剤耐性菌（メチシリ
ン耐性菌等）に抗菌活性を示すことを見い出だした。さ
らに研究を続けてスピロキシマイシンを分析することに
より、スピロキシマイシンの化学構造を決定した。そし
てスピロキシマイシンが新規化合物であることを確認
し、後記の式（Ｉ）により表わせることを知見した。

【０００５】しかして、本発明は、アミコラトプシス属
に属する微生物を培養して得られて本発明者らによりス
ピロキシマイシンと命名された抗生物質およびその製造
法について提供するものである。さらに、本発明はスピ
ロキシマイシンまたはその塩を有効成分とする抗菌剤を
提供するものである。

【０００６】すなわち、第１の本発明によると次式
（Ｉ）で表わされる抗生物質スピロキシマイシンあるいはその
塩が提供される。本発明による式（Ｉ）のスピロキシマ
イシンの理化学的性状は、次の通りである。（１）外観黄色粉末（２）分子式Ｃ₂₂Ｈ₂₀Ｏ₉ （３）高分解能質量分析（ＨＲＦＡＢＭＳ：負イオンモ
ード）実験値：m/z 428.1097 （Ｍ^-）計算値：m/z 428.1107 （４）融点 110−117 ℃ （５）比旋光度〔α〕_D ²⁸＝−69°（ｃ0.3,アセトン）

【０００７】（６）紫外線吸収スペクトル添付図面の図１に示す通りである。（７）赤外線吸収スペクトル添付図面の図２に示す通りである。（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル 500 MHzにおいて重クロロホルム中で室温にて測定した
プロトンＮＭＲスペクトルは、添付図面の図３に示す通
りである。（９）炭素13核磁気共鳴スペクトル 125 MHzにおいて重クロロホルム中で室温にて測定した
炭素13ＮＭＲスペクトルは、添付図面の図４に示す通り
である。（１０）薄層クロマトグラフィーシリカゲル60Ｆ₂₅₄（メルク社製）の薄層クロマトグラ
フィーで展開溶媒としてクロロホルム−メタノール
（９：１）で展開したときのＲｆ値は0.37である。

【０００８】なお、図３および図４のスペクトル中で×
印を付したシグナルは混在するヘプタンに由来するもの
である。

【０００９】本発明による新規抗生物質スピロキシマイ
シンが前記の式（Ｉ）で示される化学構造を有すること
は、プロトンＮＭＲ、炭素13ＮＭＲ等の分析を詳細に検
討することにより前記の通り決定された。

【００１０】本発明による式（Ｉ）のスピロキシマイシ
ンは後記の生物学的性質を有する。すなわち、スピロキ
シマイシン（Ｉ）は、薬剤耐性菌（メチシリン耐性菌
等）を含むグラム陽性の細菌に対して抗菌活性を示す。
またスピロキシマイシンは、ほ乳動物に対する急性毒性
が低い。

【００１１】試験例１各種の微生物に対するスピロキシマイシン(I）の最小発
育阻止濃度（μg/ml）は日本化学療法学会標準法に基づ
き、ミュラー・ヒントン寒天培地（ディフコ）上で倍数
希釈法によって測定した。その結果得られたスピロキシ
マイシンの抗菌スペクトルを表１に示す。

【００１２】

【００１３】

【００１４】試験例２マウスを使用して式（Ｉ）のスピロキシマイシンの急性
毒性を試験するにあたって、10％ジメチルスルホキシド
およびツイーン80含有の生理食塩水にスピロキシマイシ
ンを溶解し、その溶液を腹腔内に注射し、マウスを14日
間観察した。その結果、スピロキシマイシンは、31mg／
kgで毒性は認められなかった。

【００１５】さらに、第２の本発明によると、アミコラ
トプシス属に属する前記の式（Ｉ）のスピロキシマイシ
ンの生産菌を培養し、培養物からスピロキシマイシンを
採取することを特徴とする式（Ｉ）の抗生物質スピロキ
シマイシンの製造法が提供される。

【００１６】第２の本発明の方法で使用するスピロキシ
マイシンの生産菌は、前述した理化学的性質および生物
学的性質を有する抗生物質スピロキシマイシンを生産す
る能力を有するものであれば、その種を問わず使用で
き、広範な微生物から選ぶことができる。かかる微生物
のうち、スピロキシマイシン生産菌の具体的かつ好適な
一例は、本発明者らにより平成元年６月、微生物化学研
究所において、静岡市横内町の土壌より分離された放線
菌で、ＭＪ６６−５９Ｆ３の菌株番号が付された菌株が
ある。

【００１７】以下にＭＪ６６−５９Ｆ３株の菌学的諸性
質について記載する。ＭＪ６６−５９Ｆ３株の菌学的性状１．形態よく分岐した基生菌糸は、ジクザグ状を呈し、分断が認
められる。気菌糸は、直状あるいは不規則な曲状を呈
し、円筒形〜長円形の胞子の連鎖を認める。胞子の大き
さは約0.4× 0.9〜1.2ミクロンで、その表面は平滑であ
る。輪生枝、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子は認めら
れない。

【００１８】２．各種培地における生育状態色の記載について［］内に示す標準は、コンティナー
・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモ
ニー・マニュアル(Container Corporation ofAmerica
のcolor harmony manual)を用いた。

【００１９】（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（27
℃培養）無色の発育上に白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性
色素は認められない。（２）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP-培地
５、27℃培養）うす黄茶［2ic,Honey Gold］の盛り上がった発育上に、
白の気菌糸を着生し、溶解性色素はかすかに茶色味を帯
びる。（３）スターチ・無機塩寒天培地（ISP-培地４、27℃培
養）無色の発育上に白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性
色素は認められない。（４）イースト・麦芽寒天培地（ISP-培地２、27℃培
養）うす黄だいだい［2 ga,Colonial Yellow〜2ic,Honey Go
ld］の盛り上がった発育上に、白の気菌糸を着生し、溶
解性色素は認められない。（５）オートミール寒天培地（ISP-培地３、27℃培養）無色〜うす黄［1 ba,Yellow Tint］の発育上に、白の気
菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。（６）チロシン寒天培地（ISP-培地７、27℃培養）うす黄茶［2ic,Honey Gold］〜にぶ黄だいだい［3 ne,T
opaz］の発育上に、白の気菌糸を着生し、溶解性色素
は、かすかに茶色味を帯びる。

【００２０】３．生理的性質（１）生育温度範囲グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース 1.0
％、L-アスパラギン0.05％、リン酸水素二カリウム 0.0
5％、ひも寒天 3.5％、pH7.0)を用い、10℃、20℃、24
℃、27℃、30℃、37℃および50℃の各温度で試験した結
果、10℃を除きそのいずれの温度でも生育したが生育至
適温度は30℃付近と思われる。（２）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培
地、ISP-培地４；27℃培養） 21日間の培養で陰性である。

【００２１】（３）メラニン様色素の生成（トリプトン
・イースト・ブロス、ISP-培地１；ペプトン・イースト
・鉄寒天培地、ISP-培地６；チロシン寒天培地、ISP-培
地７；いずれも27℃培養）いずれの培地においても陰性である。（４）炭素源の利用性（プリドハム・ゴドリーブ寒天培
地、ISP-培地９；27℃培養） D-グルコース、D-キシロース、D-フルクトース、ラムノ
ース、D-マントニールを利用して発育し、L-アラビノー
スをおそらく利用する。シュクロース、イノシトール、
ラフィノースは利用しない。（５）硝酸塩の還元反応（0.1％硝酸カリウム含有ペプ
トン水、ISP-培地８；27℃培養）陰性である。

【００２２】以上の性状を要約すると、MJ66-59F3株は
その形態上、よく分岐した基生菌糸は、ジクザク状を呈
し、分断が認められる。気菌糸は直状あるいは不規則な
曲状を呈し、円筒形〜長円形の胞子の連鎖を認める。輪
生枝、菌束糸、胞子のう及び運動性胞子は認められな
い。種々の培地で、無色〜うす黄茶〜にぶ黄だいだいの
発育上に白の気菌糸を着生する。溶解性色素はグリセリ
ン・アスパラギン寒天培地（ISP-培地５）及びチロシン
寒天培地（ISP-培地７）でかすかに茶色味を帯びる程度
である。なお、他の培地では溶解性色素は認められな
い。この菌株の生育至適温度は30℃付近である。スター
チの水解性、メラニン様色素の生成及び硝酸塩の還元反
応はいずれも陰性である。

【００２３】ところで、MJ66-59F3株は、菌体成分とし
て、細胞壁タイプはIV型（メソ型の2,6-ジアミノピメリ
ン酸、アラビノース、ガラクトースを含有）、全菌体中
の糖パターンはＡ型（アラビノース、ガラクトースを含
有）である。

【００２４】リン脂質はＰII型（ホスファチジルエタノ
ールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファ
チジルグリセロールを含有し、ホスファチジルコリン、
未知のグルコサミン含有リン脂質を含まない）である。
ミコール酸は含有せず、主要なメナキノンはMK-9(H₄)
であった。脂肪酸は、iso-16:0, 16:0, cis-17:1が主成
分であった。

【００２５】以上の結果を総合すると、MJ66-59F3株は
アミコラトプシス(Amycolatopsis、文献、Internationa
l Journal of Systematic Bacteriology, 36巻、29〜37
頁、1986年）属に属すると考えられる。そこでアミコラ
トプシス属の既知菌種を検索した結果、近縁の種とし
て、胞子の表面が平滑を呈する３種、アミコラトプシス
・ファスチジオサ(Amycolatopsis fastidiosa,文献１、
同上、文献２、International Journal of Systematic
Bacteriology, 37巻、292 〜295 頁、1987年)、アミコ
ラトプシス・オリエンタリス(Amycolatopsis orientali
s, 文献１、２、同上)及びアミコラトプシス・メタノリ
カ(Amycolatopsis methanolica、文献、International
Journal of Systematic Bacteriology, 40巻、194〜204
頁、1990年）があげられた。これら菌株を入手次第、実
地に比較検討する予定であるが、現時点ではMJ66-59F3
株はアミコラトプシス・エスピー(Amycolatopsissp.）M
J66-59F3株とする。

【００２６】なお、MJ66-59F3株を工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託申請し、平成８年８月23日、ＦＥ
ＲＭＰ−１５８０１として受託された。

【００２７】第２の本発明の方法においては、スピロキ
シマイシンの製造は次の通り行なわれる。すなわち、ス
ピロキシマイシンの製造は、スピロキシマイシン生産菌
を栄養培地中に接種して、25〜30℃の温度、好ましくは
27℃の温度で好気的に振とうしながら培養することによ
って行なわれ、スピロキシマイシンを含む培養物が得ら
れる。このような目的に用いる栄養培地としては、放線
菌の培養に使用しうるものが使用される。栄養源とし
て、例えば市販されているペプトン、酵母エキス、コー
ン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウム等の窒素源
が使用でき、またグリセリン、でん粉、グルコース、ガ
ラクトース、デキストリン等の炭水化物あるいは脂肪な
どの炭素源が使用できる。さらに食塩、炭酸カルシウム
等の無機塩を添加して使用できる。その他必要に応じて
微量の金属塩を添加することができる。これらのもの
は、スピロキシマイシン生産菌が利用し、スピロキシマ
イシンの生産に役に立つものであればよく、公知の放線
菌の培養材料はすべて用いることができる。

【００２８】スピロキシマイシンの生産には、アミコラ
トプシス属に属するスピロキシマイシンの生産能を有す
る微生物が使用される。具体的には、本発明者らの分離
したアミコラトプシス・エスピーMJ66-59F3株がスピロ
キシマイシンを生産することを本発明者らによって明ら
かにされているが、その他の菌株については、抗生物質
生産菌の単離の常法によって自然界より分離することが
可能である。また、アミコラトプシス・エスピーMJ66-5
9F3株を含めて、スピロキシマイシンの生産菌を放射線
照射その他変異処理に付して、スピロキシマイシンの生
産能を高める余地も残っている。さらに遺伝子工学的手
法によってスピロキシマイシンの生産も可能である。

【００２９】スピロキシマイシンの製造のため、アミコ
ラトプシス属に属するスピロキシマイシン生産菌を適当
な培地で好気的に培養するに当っては、培養温度は、ス
ピロキシマイシン生産菌の発育が実質的に阻害されずに
この物質を生産しうる範囲であれば、特に制約されるも
のではなく、使用する生産菌に応じて選択できるが、好
ましくは25−30℃の範囲内の温度、特に27℃を挙げるこ
とができる。スピロキシマイシン生産のための種母培地
としては、寒天培地上、MJ66-59F3株の斜面培養から得
た生育物を使用する。

【００３０】このMJ66-59F3株の生育は通常３ないし４
日で最高に達するが、一般に充分な抗菌活性が培地に付
与されるまで続ける。この培養液中のスピロキシマイシ
ンの力価の経時変化は、ミクロコッカス・ルテウス IFO
3333あるいはバチルス・ステアロサーモフィルスを被
験菌とする円筒平板法により測定できる。

【００３１】第２の本発明の方法においては、上記のよ
うにして得られたスピロキシマイシン生産菌の培養物か
らスピロキシマイシンを採取するが、採取法としては微
生物の生産する代謝物を採取するのに用いられる手段を
適宜利用することからなる。例えば、水と混ざらない溶
媒による抽出の手段、各種吸着剤に対する吸着親和性の
差を利用する手段、ゲル濾過、向流分配を利用したクロ
マトグラフィー等を単独または組み合わせて利用しスピ
ロキシマイシンを採取できる。また、分離した菌体から
は、適当な有機溶媒を用いた溶媒抽出法や菌体破砕によ
る溶出法により菌体から抽出し上記と同様に単離精製し
て採取することができる。かくして、前記した抗生物質
スピロキシマイシンが得られる。

【００３２】さらに、第３の本発明では、式（Ｉ）のス
ピロキシマイシンまたはそれの製薬学的に許容できる塩
を有効成分とする抗菌剤が提供される。

【００３３】スピロキシマイシンの製薬学的に許容でき
る塩の例には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム
塩またはマグネシウム塩がある。

【００３４】この抗菌剤においては、有効成分化合物は
製薬学的に許容できる常用の固体または液状担体、例え
ばエタノール、水、でん粉等と混和して抗菌剤組成物に
調製できる。

【００３５】また、第４の本発明では、前記の式（Ｉ）
のスピロキシマイシンを生産する特性を持つアミコラト
プシス・エスピーMJ66-59F3株が提供される。

【００３６】以下に実施例により本発明をさらに詳細に
説明する。

【００３７】実施例１抗生物質スピロキシマイシンの製造寒天斜面培地に培養したアミコラトプシス・エスピーMJ
66-59F3 株(FERM P-15801)をガラクトース２％、デキ
ストリン２％、バクトソイトン(ディフコ社製）１
％、コーン・スティープ・リカー（イワキ社製） 0.5
％、硫酸アンモニウム 0.2％、炭酸カルシウム 0.1％を
含む液体培地（pH 7.4に調整）を三角フラスコ(500ml
容）に110mlずつ分注し、常法により120℃で20分滅菌し
たものに接種し、その後27℃で３日間回転振とう培養し
た。これにより酵母培養液を得た。

【００３８】この種母培養液を、ガラクトース１％、
グリセロール 0.5％、デキストリン１％、バクトソイト
ン（ディフコ社製） 0.5％、コーン・スティープ・リカ
ー（イワキ社製） 0.25％、硫酸アンモニウム 0.1％、
炭酸カルシウム 0.2％を含む液体培地1000ml（pH 7.4に
調整）を坂口フラスコ（500ml容）に125mlずつ分注し、
常法により120℃で20分滅菌したものに２％量で接種
し、その後27℃で５日間回転振とう培養した。

【００３９】このようにして得られた培養液を遠心分離
して菌体を分離した。この培養ろ液（800ml）をダイヤ
イオンHP-20（60ml）に吸着させ、水（100ml）で水洗後
に、水（150ml）と60％アセトン水（200ml）のグラジエ
ント法によって溶出した。活性画分を濃縮乾固して残留
物（350mg）を得、これを遠心液液分配クロマトグラフ
ィーにより１-ブタノール−水の溶媒系を用いて精製
し、目的物質を含む画分を濃縮乾固し、98.7mgのオイル
状物質を得た。さらにこの物質をセファデックスＬＨ−
20（340ml）によって、メタノールを展開溶媒として精
製した後(65mg）、遠心液液分配クロマトグラフィーに
よりクロロホルム−メタノール−水（５：６：４）の溶
媒系を用いて精製し、最終的にアセトン−ヘプタンで再
沈殿させて目的物質であるスピロキシマイシンの黄色粉
末52mgを得た。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はスピロキシマイシンの90％メタノール水
溶液及び0.1M HC1-90％メタノール水溶液中の紫外線吸
収スペクトルである。

【図２】図２はスピロキシマイシンのＫBr錠剤法で測定
した赤外線吸収スペクトルである。

【図３】図３はスピロキシマイシンの重クロロホルム溶
液中にて室温で測定した500MHzにおけるプロトン核磁気
共鳴スペクトルである。

【図４】図４はスピロキシマイシンの重クロロホルム溶
液中にて室温で測定した125MHzにおける炭素13核磁気共
鳴スペクトルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者高橋良和東京都多摩市桜ケ丘３丁目２番地の３ (72)発明者澤竜一東京都府中市八幡町２丁目１番地の１府中八幡町ダイヤモンドマンション402

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次式（Ｉ）で表わされる化合物である抗生物質スピロキシマイシン
（Spiroximicin）またはその塩。
【請求項２】アミコラトプシス属に属する請求項１に
記載の式（Ｉ）のスピロキシマイシン（Spiroximicin）
の生産菌を培養し、培養物からスピロキシマイシンを採
取することを特徴とする抗生物質スピロキシマイシンの
製造方法。
【請求項３】請求項１に記載の式（Ｉ）で表わされる
スピロキシマイシンまたはその製薬学的に許容できる塩
を有効成分とする抗菌剤。
【請求項４】請求項１に記載の式（Ｉ）のスピロキシ
マイシンを生産する特性を持つアミコラトプシス・エス
ピーＭＪ６６−５９Ｆ３株。