JPH01304880A - ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■　産業上の利用分野 この発明は、たんばく賀のカルボキシ末端よりジペプチ
ド単位でペプチド結合を加水分解する酵素のうち微生物
が生ｌＬ″ｒｊるものに間覆るものである。

■　従来の技術及び本発明が解決しようとしている課題 ジペプチドあるいはトリペプチドは、これまで化学的方
法によりイヒ学薬品を使用して調製されていたため、価
格も高くかつ食品としての安全性も劣り、天吊に合成さ
れ食品や医桑に使用された例心ない。また、その生理活
性や効果もほとんど知られていない。しかし、ジ、トリ
ペプチドのＲ管吸収については、ある程度の研究があり
、これらジペプチドは、アミノ酸の混合液よりも、より
早い速度で吸収されるとされ栄養学的に注目されている
。また、医療に使われる補液への利用の場合でも浸透圧
を高めず高濃度に注入できるなど将来の発展が期待でき
る。

ジペプチドを製造するためには有機化学的に合成するか
、もしくはジペプチジルペプチダーゼで任意のタンパク
質原料を酵素分解することによっ。

得られる。本発明は有力な酵素を開発して、これを使用
する点で後者に属するものである。タンパク賀のアミノ
又はカルボキシ末端からジペプチド単位で切断する酵素
はジペプチジルペプチダーゼと呼ばれ、主として哺乳動
物由来のものが知られている。そのほか、微生物由来の
ものとしてはＣｏ−ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ＊ｕｎおよび
Ｅ、ＣＯ！ｉに属する微生物が本酵素を生産することが
報告されている。これらのいずれの菌の１％もカル４；
キシ末端から作用するＤＰＣＰａｓｅに属するが、菌自
体の病原性の点で安全性に疑問があるのが欠点である。

■　課題を解決する手段及び作用 本発明者は、ジペプチドを食品として利用することを目
的として、病原性のない微生物より酵素を得たいと種々
検討したところ、安全性の高いバチルス属に属する菌株
にも、かような酵素の存在することを知った。すなわち
ｆｉ製した酵素をＡｌａ−６（アラニン６個よりなるペ
プチドを＾１ａ−６と略記し、同様に例えばアラニン２
又は３個よりなるものをＡｌａ−２，Ａｌａ−３の如く
略記する。以下同じ）に作用させるとカルボキシ末端よ
り＾１ａ−２づつに切断するほか、アンジオ′テンシン
！（＾５ｐ−Ａｒ（１−Ｖａ−１−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｈ
ｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−旧５−Ｌｅｕ　）のカルボキシ
末端から旧５−ｔｅｕを遊離する。また、ブラジキニン
（ＡｒｌＪ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｌ／−Ｐｈｅ−８ｅ
ｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒ（１）をＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏ、　Ｇ　１ｙ−Ｐｈｅ、　５ｅｒ−Ｐｒｏ、　Ｐｈ
ｅ−Ａｒ（ｌに分解した。以上の結果より本酵素はカル
ボキシ末端よりジペプチド単位で加水分解するＤＰＣＰ
ａｓｅであることを賄認した。また本酵素の作用ｐＨ７
゜５付近、作用温度５０℃付近である点から、十分産業
的に利用できる酵素であることを！を認して本発明を完
成することができた。以下本発明に使用する菌株の蘭学
゛的性質を示寸。

バチルス　プミルスＨＬ７２１株 一１形態学的性質（肉汁寒天培地中） １）Ｉｌｌｆ胞の形及び大きさ・・・・・・（０，４〜
０．６）　ｘ　（０，８〜１．２）μの桿菌。

連鎖性はない。

２）運動性・・・・・・有り。

３）胞子・・・・・・有り。

４）ダラム染色性・・・・・・陽性 二、生育状態 １）肉汁寒天平板培地・・・・・・生育良好。表面はや
や湿り白色に近い。

２）肉汁寒天平板培地・・・・・・拡布状となり表面に
光沢あり。

３）肉汁液体培地・・・・・・生育良好。液は混濁する
。

４）ゼラチン穿刺培地・・・・・・ゼラチンを液化する
。

５）食塩肉汁液体培養・・・・・・７％の食塩水濃度で
は生育できるが、８％では生育できない。

三、生理学的性質 １）Ｖ＃酸塩の還元・・・・・・陰性 ２）デン粉の加水分解・・・・・・陰性３）クエン酸の
醗酵性・・・・・・陰性４）カタラーゼの生成・・・・
・・陽性５）生育の範囲・・・・・・５０℃まで生育で
きる。

６）糖のｍ解性・・・・・・グルコース、グリセロール
、しよ糖から酸を形成。ただしガス発生を伴わない。

７）アセチルメチルカルビノールの生成・・・・・・陽
性 ８）ゼラチンの分解・・・・・・陽性 以上の結果をバージ−のマニュアル・オブφシステマテ
ィック・バクテリオロジー第２巻（ＢｅｒｌＪ−ｅｌ／
’Ｓ　　ｌ’１ａｎｔｌａｌ　　Ｏｆ　　５ｙｓｔｅｎ
＋ａｔｉｃ　　ＢａＣ１ｅｒｉＯＩＯＱＶ　　ｖｏｌ、
２（１９８６）　）と照合して、本国はバチルス　プミ
ルス＜Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕａｎｉｌｉｕｓ　）と同
定した。

バチルス　ズブチリスＨＬ５２１株 −１形態学的性質（肉汁寒天培地中） １）ｌ胞の形及び大きさ・・・・・・ （０，７〜０．８）　ｘ　（２，０〜３．０）μの桿菌
。

２）運ｖＪ性・・・・・・有り。

３）胞子・・・・・・有り。

４）ダラム染色性・・・・・・毘性。

二、生育状態 １）肉汁寒天平板培地・・・・・・生育良好。表面はや
や乾き白色に近い。

２）肉汁寒天平板培地・・・・・・拡布状となり表面の
光沢はない。

３）肉汁液体培地・・・・・・生育良好。液は混濁覆る
。

４）ゼラチン穿刺培地・・・・・・ゼラチンを液化する
。

５）食塩肉汁液体培養・・・・・・６％の食塩水濃度で
生育できる。

三、住理学的性質 １）６ｒＩ酸塩の還元・・・・・・陽性２）デン粉の加
水分解・・・・・・陽性３）クエン酸の醗酵性・・・・
・・陰性４）カタラーゼの生成・・・・・・陽性５）生
育の範囲・・・・・・５０″Ｃまで生育できる。

６〉糖の醗酵性・・・・・・グルコース、グリセロール
、しよ糖から酸を形成。ただしガス発生を伴わない。

７）アセチルメチルカルビノールの生成・・・・・・陽
性 ８）ゼラチンの分解・・・・・・陽性 以上の結果をバージ−のマニュアル・オブ・システマテ
ィック・バクテリオロジー第２＠と照合して、本国はバ
チルス　ズブチリス（Ｂａｃ　ｉ　ｌ　ｌｕｓ　５ｕｂ
−ｔｉｌｉｓ　）と同定した。

次にバチルス　プミルスＨＬ　７２１菌株の生産する酵
素を訂細に説明づる。

一１作用及び早賀特胃性 本ＩＮ？素は、タンパク買のカルボキシ末端より、アミ
ノ酸の種類の如何を問わずジペプチド単位でペプチドを
遊離覆る。しかしながら、カルボキシ末端より２番目に
プロリンがあった場合は切断しない。

二、作用Ｄ　Ｈ ｐＨ５，５〜９．０　（０，０５ＭｉＬＭＩナトＩＪウ
ムー酊Ｍ緩衝液（ｐＨ５〜６）またはリン酸２ナトリウ
ム−リン酸１力リウムＭ白液（ｐＨ６〜９））で反応す
る。

三、作用最適１）　Ｈ ｐＨ７，５ 四、ｆ［用温度 ０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞で各種温度下１
５分間反応さゼたところ、５５°Ｃまで反応した。

五、作用最適温度 ５０℃ 六、熱安定性 ０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中で各種温度で
６０分間処理し、残存活性を測定したところ、４５℃ま
で安定であった。

七、ｐＨ安定性 ｐＨ５〜８で安定である。

ハ、精製方法 菌体を破砕したのち、Ｑ−セファロース、ハイトロキシ
ルアパタイト、ゲル濾過により、５ＤＳ−ＰＡＧＥで単
一バンドを示す！？素を得た。

九、分子量 １５５．０００　＜ゲル濾過による） 士、生産物 Ａｌａ−６に作用させたところ、すべてＡｌａ−２にな
った。

十−１力価測定沫 ベンゾイル−グリシル−アラニル−プロリンを基質と覆
る下記の方法・条件により測定した。

１０ｍＭベンゾイル−グリシル−アラニル−プロリン０
．１ｄに２０ｍＭリンＭＳ！衝液０．０５献と酵素液０
．０５ｄを加え、４０℃で１５分間反応させ、生ずるア
ラニル−プロリンをニンヒドリン法で定量した。

上記反応で１分間当り１μｍｏｌのアラニル−プロリン
を生成する酵素量を１単位とした。

次にバチルス　ズブチリス１−ＩＬ５２１菌株の生産す
る酵素を詳細に説明する。

一１作用及び基質特異性 本酵素は、タンパク質のカルボキシ末端より、ジペプチ
ド中位でペプチドを遊離する。しかしながら、カルボキ
シ末端より２番目にプロリンがあった場合は切断しない
。

二、作用Ｅ）Ｈ ＤＨ６，０〜１１．０　（０，０５Ｍ耐酸ナトリウム−
酢ｉ！１！緩衝液（ｐＨ５〜６）またはリン酸２ナトリ
ウム−リンＭ１カリウムＭ衝液（ｐＨ６〜１１））で反
応する。

三、作用最適ｐＨ ｐＨ７，５ 四、作用温度 ０．０１Ｍリン酸！ｌ衝液（ｐＨ７，０）で各種温度下
１５分間反応させたところ、５５℃まで反応した。

五、作用最適温度　　、 ５０℃ 六、熱安定性 ０．０１ＭＩＪン１ｌｔｌｉＩｉ液（１）Ｈ７，０＞中
で各種温度で６０分間処理し、残存活性を測定したとこ
ろ、４５℃まで安定であった。

七、ｐＨ安定性 ｐＨ６〜９で安定である。

ハ、精製方法 菌体を破砕したのち、Ｑ−セファロース、ハイトロキシ
ルアパタイト、ゲル濾過により、５ＤＳ−ＰＡＧＥで単
一バンドを示す酵素を讐だ。

九、分子か １１０．０００（ゲル濾過による） 土、生産物 Ａｌａ−６に作用させたところ、すべてＡｌａ−２にな
った。

十−１力価測定法 ペンゾイルーグリシルーアラニループＯリンを基質とす
る下記の方法・条件により測定した。

１０ｍＭ０ｍＭベンゾイル−グリシル−アラニル−プロ
リンａｆｆに２０ｍＭリンＭＭ衝液０．０５−と酵素液
０．０５−を加え、４０℃で１５分間反応させ、生ずる
アラニルーブＯリンをニンヒドリン法で定量した。

上記反応で１分間当り１μｍｏｆのアラニル−プロリン
を生成する酵素量を１単位とした。

本発明では、バチルス　プミルスとかバチルスズブチリ
スの如きＩＮ！’菌をｉ８養し、［）ＰＣＰａｓｅを採
取するものである。゛ 培養法としては、例えば、１％ペプトン、０゜５％醇母
エキス、０．５％食塩を基本培地としたらよい。培ｉ瀉
度は、３０〜４５℃、培養時間は１６〜２４時間前後で
あり、その他については常法に従う。以下に具体的な実
施例を示す。

■　実施例 ＊例１ １％ペプトン、０．５％Ｎｆｆ１エキス、０．５％食塩
を含む培地をｐＨ７，３に調整し、殺菌後、バチルス　
プミルス８１フ２１株を接種し、３７’ＣＩ６時間振ど
う培養した。培養後、遠心分離により菌体を得、１０ｍ
ＭリンＲＨ衝液で懸濁し超音波で菌体を破砕した。さら
に遠心分離により菌体破砕物を除去した。

上澄液にはＤＰＣＰａｓｅｏ、０３Ｕ／ｄを含んでいた
。この上澄液をＱ−セファロース、ハイトロキシルアパ
タイト、ＴＳＫ−Ｑｅ　ＩＧ−３０００８ＷＸＬによる
ゲル濾過によりｆｉｉ製酵素を得た。その酵素活性から
群山された酵素回収率は１゜３％であり、５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより単一のバンドを与えるものであった。

＊例２ １％ペプトン、０．５％Ｈｆｆｉエキス、０．５％食塩
を含む培地をｐ）−１７，３に調整し、殺菌後、バチル
ス　ズブチリスＨＬ５２１株を接種し、３７℃１６時間
振どう培養した。培養後、遠心分離により菌体を得、１
０ｍＭリン酸緩衝液で懸濁し超音波で菌体を破砕した。

さらに遠心分離により菌体破砕物を除去した。

上澄液にはＤＰＣＰａｓｅｏ、０５Ｕ／ｄを含んでいた
。この上ｍＨをＱ−セフ１０−ス、ハイトロキシルアパ
タイト、ＴＳＫ−Ｑｅ　ＩＧ−３０００ＳＷＸＬによる
ゲル濾過により精製酵素を臂た。モの酵素活性からｐ出
されたｉｌ？素回収率は１゜５％であり、５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより単一のバンドを向えるものであった。

■　光明の効果 本光明の酵素は、哺乳類の酵素に比べ大量に調製づるこ
とが可能であるため、任意のタンパク賀原利より効率よ
くジペプチドを生産づることができる。

特許出願人　　江崎グリコ株式会社

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）バチルス属に属するジペプチジルカルボキシペプ
   チダーゼ（以下、ＤＰＣＰａｓｅと表記する。 ）生産菌を培養し、これから採取したことを特徴とする
   ＤＰＣＰａｓｅ。
2. （２）バチルス属に属するＤＰＣＰａｓｅ生産菌を培養
   し、これからＤＰＣＰａｓｅを採取したことを特徴とす
   るＤＰＣＰａｓｅの製造法。
3. （３）ＤＰＣＰａｓｅ生産菌がバチルス　プミルス（Ｂ
   ａｃｉｌｌｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ）又はバチルス　ズブ
   チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属す
   る菌であることを特徴とする特許請求の範囲の（１）又
   は（２）記載のＤＰＣＰａｓｅ又はその製造法。
4. （４）ＤＰＣＰａｓｅ生産菌がバチルス　プミルスＨＬ
   ７２１株（微工研菌寄託第１０００６号）又はバチルス
   　ズブチリス　ＨＬ５２１株（微工研菌寄託第１０００
   ５号）であることを特徴とする特許請求の範囲の（３）
   に記載のＤＰＣＰａｓｅ又はその製造法。