JPH0324199B2

JPH0324199B2 -

Info

Publication number: JPH0324199B2
Application number: JP110786A
Authority: JP
Inventors: Yasuto Watanabe; Shigeyuki Takenishi; Hirobumi Nakano; Shogo Katsushiro; Toshihiro Kuno; Shiro Abe
Original assignee: Gunze Ltd
Current assignee: Gunze Ltd
Priority date: 1986-01-06
Filing date: 1986-01-06
Publication date: 1991-04-02
Also published as: JPS62158483A

Description

【発明の詳細な説明】

発明の分野本発明は新規アルカリプロテアーゼAPG501お
よびその製造法に関する。さらに詳しくは、本発
明はバチルス（Bacillus）属の微生物により生産
される新規アルカリプロテアーゼAPG501および
バチルス属に属するアルカリプロテアーゼ
APG501生産菌を培養し、得られた培養物から該
アルカリプロテアーゼを採取することからなる該
アルカリプロテアーゼの製造法に関する。発明の背景従来から種々のアルカリプロテアーゼが知られ
ており、繊維、洗剤、皮革加工、食品等の広範な
分野で利用されている。近年、繊維の分野において、絹織物の精練にこ
のアルカリプロテアーゼを用いる酵素精練法が提
案され、本発明者らは用いるアルカリプロテアー
ゼについて種々研究を重ねた。その間に、バチル
ス属に属するある種の新菌株が該酵素精練に適す
る新規なアルカリプロテアーゼAPG501を生産す
ることを見出し、本発明を完成するにいたつた。発明の開示本発明の新規アルカリプロテアーゼAPG501は
以下の理化学的性質を有する。 (a) アルカリ領域でプロテアーゼ作用を有する、 (b) セリシンに対して特に高い特異的なプロテア
ーゼ作用を有し、その至適PHは8.5〜９、至適
温度は60〜65℃、 (c) ４℃において、PH5.5〜11の範囲で安定、 (d) PH7.0において、50℃まで安定、60℃から失
活開始、70℃で完全に失活、 (e) 活性発現ならびに安定化に金属イオンを必要
とせず、ジイソプロピルフルオロリン酸塩
（DFP）で著しく活性が阻害される、 (f) 超遠心法による分子量16300、ゲル過法に
よる分子量19000、 (g) 7.5％ポリアクリルアミドゲルによるデイス
ク電気泳動（PH9.4）において、0.01％ブロモ
フエノールブルー（BPB）の移動を１とした
場合、酵素蛋白の泳動は0.14、 (h) 焦点電気泳動による等電点は6.96、 (i) リジン５、ヒスチジン３、アルギニン２、ア
スパラギン酸14、スレオニン13、セリン20、グ
ルタミン酸６、プロリン１、グリシン17、アラ
ニン20、バリン15、メチオニン２、イソロイシ
ン４、ロイシン８、チロシン７、フエニルアラ
ニン２、トリプトフアン０、およびシステイン
０のアミノ酸組成を有する。本発明のアルカリプロテアーゼAPG501は、こ
とに、セリシンに対して高い特異性を有し、分子
量が比較的小さく、等電点が低い点で公知のアル
カリプロテアーゼと区別される。アルカリプロテアーゼAPG501の活性はつぎの
ようにして測定する。製糸工程での絹糸屑を浴比１：18にて、110℃
で60分間熱水溶出を行ない、この溶出液を275n
ｍにおける吸光度が4.0になるように水で調整し
てセリシン溶出液を調製する。このセリシン溶出
液2.5ml、検体酵素液0.1mlおよび0.3M炭酸ナトリ
ウム−0.3M炭酸水素ナトリウム緩衝液（PH10.0）
0.5mlを混合し、60℃で10分間反応させる。つい
で、反応液に10％トリクロロ酢酸（TCA）溶液
3.0mlを加えて反応を停止させ、氷水中に30分間
放置後、遠心分離（17000G）し、上澄液の275n
ｍにおける吸光度を測定する。275nｍにおける
吸光度１はチロシン4.5マイクロモルに相当する。
この条件下、１分間に１マイクロモルのチロシン
に相当する可溶性窒素化合物を生成する酵素活性
を１単位とする。本発明の新規アルカリプロテアーゼAPG501
は、バチルス属に属する新規な微生物により生産
される酵素である。該微生物は本発明者らによ
り、京都府綾部市で採取した土壌から分離され、
その代表的な菌株であるバチルス・エス・ピイ
（Bacillus sp.）9111−5B株は、微工研菌寄第
8520号の下、通産省工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている。バチルス・エス・ピイ9111−5B株（微工研菌
寄第8520号）の菌学的性質を以下に示す。形態学的特徴 (1) 細胞の大きさ、形栄養細胞0.3〜0.5μｍ×0.7〜1.5μｍ、短桿菌。 (2) 多形性細胞が0.5μｍ×3.0μｍに伸長することがあ
る。 (3) 運動性運動性あり。 (4) 鞭毛周毛を有する。 (5) 胞子 0.4〜0.5μｍ×0.7〜1.2μｍの卵形の耐熱性胞
子を細胞のほぼ中央に形成する。 (6) グラム染色グラム陽性である。 (7) 抗酸性抗酸性なし。種々の培地上での生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養円形コロニーを形成、仮根状、縁および中心
に隆起あり（半レンズ状）。コロニーは平滑、
白クリーム色で、つやがある。 (2) 肉汁寒天斜面培養生育良好、仮根状、表面荒く、白褐色、部分
的にしわを生じる。 (3) 肉汁液体培養菌膜を形成し、菌膜のすぐ下に混濁を生じ
る。 (4) 肉汁寒天高層培養表面の生育良好、穿刺部位に生育、白褐色、
しわ、水滴有り。 (5) 肉汁ゼラチン穿刺培養約１週間で層状に液化、10日で約１cmに及
ぶ。菌体は表面に生育する。 (6) リトマスミルク約30日後にミルク凝固、リトマス変化なし。生理的性質第１表に示すとおりである。

【表】

【表】糖分解テスト第２表に示すとおりである。表中の記号はつぎ
の意味を有する。＋：酸生成、±：部分的酸生成、−：酸生成せずなお、いずれもガス発生は認められなかつた。

【表】 9111−5B株の以上の諸性質をバージエーズ・
マニユアル・オブ・デターミネイテイブ・バクテ
リオロジー第８版（Bergey′s Manual of
Determinative Bacteriology、8th edition）に
記載されるバチルス属の既知菌種のうちの近似す
るバチルス・フアーマス（Bacillus firmus）の
諸性質と比較した。その結果(1)バチルス9111−
5B株は嫌気性条件下でも寒天培地上で生育でき
るが、バチルス・フアーマスは嫌気性条件下では
生育できない。(2)バチルス9111−5B株は52℃で
生育できるが、バチルス・フアーマスは45℃より
高温では生育できない。(3)バチルス9111−5B株
はPH５〜12の広いPH範囲で生育できるが、バチル
ス・フアーマスはPH6.0以上でないと生育できな
い、という点で9111−5B株はバチルス・フアー
マスと明確に区別できる別異の菌種を構成するも
のであり、したがつて、バチルス属に属する新菌
種と判断した。かくして、本発明の新規アルカリ
プロテアーゼAPG501はバチルス・エス・ピイ
9111−5B株を栄養培地にて培養し、培養物中に
APG501を蓄積させ、該培養物からAPG501を採
取することにより得られる。他の細菌と同様、
9111−5B株は、例えば、紫外線、Co⁶⁰、Ｘ線な
どの照射、種々の変異誘発剤の使用などによる人
工的変異手段によつて変異できるものであり、そ
のような変異株も、APG501生産能を有する限り
本発明において使用できる。さらに、9111−5B
株およびその変異株以外の菌株でも、APG501生
産能を有する菌株であれば、いずれも本発明にお
いて使用できる。以下、代表的な例として、9111−5B株を用い
るAPG501の生産について説明する。 9111−5B株の培養本菌株の培養には液体培地を用いる通常の好気
的培養法が採用できる。培地の炭素源としては澱
粉、デキストリン、グルコース等の各種の糖類が
単独または組み合わせて用いられる。窒素源とし
ては、大豆粕、大豆粉、酵母エキス、ミルクカゼ
イン、コーステイープリカー等を単独または組み
合わせて用いることができる。その他、適宜、無
機塩類等を添加することができる。培養は、一般
に、好気的条件下、20〜40℃、PH7.0〜10.0にて、
24〜144時間程度行なわれる。この培養により、
培養物中にアルカリプロテアーゼAPG501が蓄積
される。 APG501の採取、精製培養物中からのアルカリプロテアーゼAPG501
の採取、精製には、微生物代謝産物をその培養物
中から単離、精製するために通常採用される方法
が用いられる。例えば、培養終了後、珪藻土などの過助剤を
用いた過または遠心分離により培養物中に存在
する菌体や培地残渣を除去し、分画分子量5000の
限外過で濃縮し、液状の粗酵素を得る。この粗
酵素を、必要により、さらに、イオン交換クロマ
トグラフイーおよびゲル過で精製し、凍結乾燥
して所望の精製アルカリプロテアーゼAPG501が
得られる。得られたアルカリプロテアーゼAPG501は、前
記のごとく、セリシンに対して特に高い基質特異
性を有しており、繊維工業において、絹織物等の
酵素精練に好適に用いられるが、APG501は、ま
た、カゼインやヘモグロビン等の他の各種の蛋白
に対しても同様な条件下でプロテアーゼ作用を示
し、繊維工業に限らず、洗剤、皮革加工、食品
等、公知のアルカリプロテアーゼと同様な分野で
利用することができる。なお、前記の濃縮粗酵素
液および公知の乾燥方法による粗酵素、粉体、粉
粒体の状態でも、充分なアルカリプロテアーゼ作
用が得られるので、該粗酵素も本発明のアルカリ
プロテアーゼに包含されるものである。つぎに実施例および試験例を挙げて本発明をさ
らに詳しく説明する。実施例１大豆カゼイン0.5％、グルコース0.5％、酵母エ
キス0.1％、K₂HPO₄0.1％およびMgSO₄・
7H₂O0.02％を含有し、Na₂CO₃でPH９に調整した
液体培地を500ml容の坂口フラスコに100ml分注
し、滅菌する。この培地に9111−5B株を接種し、
30℃にて５日間、135回／分で振盪培養する。培養液を18000Gで遠心分離し、上澄液を分画
分子量5000の限外過で濃縮して108単位／mlの
粗酵素液15mlを得る。この粗酵素液をカチオン交換イオンクロマトグ
ラフイー、ついで、ポリビニル系のゲルによるゲ
ル過に付し、凍結乾燥を行なうことにより前記
(a)〜(i)の理化学的性質を有する粉末状の所望の精
製アルカリプロテアーゼAPG501 1.58mgを得る。添付の第１図および第２図に、得られたアルカ
リプロテアーゼAPG501の活性に対するPHおよび
温度の影響を示す。これらは、前記の活性測定法
に従つて、各々、PHおよび温度を変化させて活性
を測定し、最大活性を100％とした場合の相対活
性を示すグラフである。第１図および第２図に示
すごとく、アルカリプロテアーゼAPG501はセリ
シンに対する作用至適PHが8.5〜９、至適温度が
60〜65℃である。また、添付の第３図および第４図に得られたア
ルカリプロテアーゼAPG501の酵素活性のPH安定
性および温度安定性を示す。PH安定性はPH４〜11
の範囲で５℃：16時間処理した後の残存活性を、
また、温度安定性は30〜80℃の範囲でPH７にて10
分間処理した後の残存活性を前記の活性測定法に
従つて測定した。第３図および第４図に示すごと
く、アルカリプロテアーゼAPG501は４℃におい
てPH5.5〜11の範囲で安定であり、PH7.0において
50℃まで安定で、60℃から失活を開始し、70℃で
完全に失活する。実施例２脱脂大豆粕0.5％、デキストリン1.0％、コーン
ステイープリカー0.5％、K₂HPO₄0.1％および
MgSO₄・7H₂O0.02％を含有し、Na₂CO₃でPH９
に調整した液体培地1.3を滅菌後、ミニジヤー
に入れ、9111−5B株を接種する。これを、300r.
p.m.で撹拌下、0.3／分で通気しながら、30℃
にて３日間培養する。培養液を、セライトでコートしたフイルター・
プレスで過し、分画分子量5000の限外過で
18.1倍に濃縮し930単位／mlの粗酵素液72ml（酵
素収率約70％）を得る。得られた酵素の絹織物精練効果を試験した。試験１ 3.0φ×19.5cmの大型試験管を用い、未精練の絹
織物２ｇを、各々、液比１：30で、つぎのとおり
処理して酵素精練試験を行なつた。 (1) 前処理ケイ酸ナトリウム（18゜Be）４ｇ／および
ポリオキシエチレンラウリルエーテル0.5ｇ／
を含有する処理液（PH10）60mlを用いて、98
℃で40分間処理。 (2) 酵素処理無水炭酸ナトリウム0.5ｇ／、炭酸水素ナ
トリウム３ｇ／およびアルカリプロテアーゼ
APG501 20000単位／を含有する処理液（PH
9.0）60mlを用い、60℃で120分間処理。 (3) 後処理炭酸水素ナトリウム１ｇ／およびポリオキ
シエチレンラウリルエーテル0.5ｇ／を含有
する処理液（PH8.0）60mlを用い、98℃で40分
間処理。つぎの式に示すごとく、当初の未精練生地重量
に対する各処理後の生地重量の減量率を脱セリシ
ン率として、各処理後の脱セリシン率を算出した
ところ、前処理後は12.4％、酵素処理後は25.7
％、後処理後は27.1％と、良好な精練効果を示し
た。減量率（％）＝未精練重量−精練重量／未精練重量×
100 試験２ 40角型処理槽を用い、未精練の絹原反860ｇ
を、各々、液比１：35で、つぎのとおり処理して
酵素精練試験を行なつた。 (1) 前処理試験１と同じ処理液30を用い、自然対流撹
拌下に40分間沸騰処理。 (2) 酵素処理無水炭酸ナトリウム0.5ｇ／、炭酸水素ナ
トリウム3.5ｇ／およびアルカリプロテアー
ゼAPG501 22500単位／を含有する処理液
（PH9.0）30を用い、５／分のポンプ循環に
よる撹拌下、60℃で120分間処理。 (3) 後処理試験１と同じ処理液30を用い、自然対流撹
拌下に60分間沸騰処理。試験１と同様に脱セリシン率を算出したとこ
ろ、前処理後は13.1％、酵素処理後は24.3％、後
処理後は26.5％と、良好な精練効果を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、各々、アルカリプロテ
アーゼAPG501の活性に対するPHおよび温度の影
響を示すグラフである。第３図および第４図は、
各々、アルカリプロテアーゼAPG501の安定性に
及ぼすPHおよび温度の影響を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１以下の理化学的性質を有する新規アルカリプ
ロテアーゼAPG501： (a) アルカリ領域でプロテアーゼ作用を有する、 (b) セリシンに対して特異的なプロテアーゼ作用
を有し、その至適PHは8.5〜９、至適温度は60
〜65℃、 (c) ４℃において、PH5.5〜11の範囲で安定、 (d) PH7.0において、50℃まで安定、60℃から失
活開始、70℃で完全に失活、 (e) 活性発現ならびに安定化に金属イオンを必要
とせず、ジイソプロピルフルオロリン酸塩
（DFP）で著しく活性が阻害される、 (f) 超遠心法による分子量16300、ゲル濾過法に
よる分子量19000、 (g) 7.5％ポリアクリルアミドゲルによるデイス
ク電気泳動（PH9.4）において、0.01％ブロモ
フエノールブルー（BPB）の移動を１とした
場合、酵素蛋白の泳動は0.14、 (h) 焦点電気泳動による等電点は6.96、 (i) リジン５、ヒスチジン３、アルギニン２、ア
スパラギン酸14、スレオニン13、セリン20、グ
ルタミン酸６、プロリン１、グリシン17、アラ
ニン20、バリン15、メチオニン２、イソロイシ
ン４、ロイシン８、チロシン７、フエニルアラ
ニン２、トリプトフアン０、およびシステイン
０のアミノ酸組成を有する。２バチルス（Bacillus）属に属し、新規アルカ
リプロテアーゼAPG501を生産する能力を有する
細菌を栄養培地にて培養し、培養物から該アルカ
リプロテアーゼを採取することを特徴とするアル
カリプロテアーゼAPG501の製造法。