JPH01309686A - 多機能プロテアーゼ - Google Patents
多機能プロテアーゼInfo
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- JPH01309686A JPH01309686A JP63142526A JP14252688A JPH01309686A JP H01309686 A JPH01309686 A JP H01309686A JP 63142526 A JP63142526 A JP 63142526A JP 14252688 A JP14252688 A JP 14252688A JP H01309686 A JPH01309686 A JP H01309686A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
産業上の利用分野
本発明は、多機能プロテア−Ｕ、詳しくは新規な細胞内
プロテアーゼとしての多機能プロデア−ぜに関する。 従来の技術 細胞質局在の不活性型プロテアーゼとしての多機能プロ
テアーゼは、本発明者によりラット肝臓から既に単離さ
れており、その機能、分子量’ｙｔｘの解析、分布と局
在性等を詳細に報告されている［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、 ２６１（３２）、１５１９７〜１５２０３及び同１
５２０４〜１５２０７ （１９８６）：化学と生１勿、
ンこＪΣ （８）、 ４８９〜４９０ （１９８
７） ：蛋白・核酸・酵素、３２ （７）、９５５〜
９６１（１９８７＞等］。 上記酵素の分子量は約７５万と推定され、プロテア−Ｕ
としては例外的に大きく、また該酵素はへテロ多量体＠
造の巨大蛋白質複合体であり、同一分子内に基質特異性
の異なった複数の、かつ互いに独立した触媒活性部位を
有しており、この点から多機能プロテアーゼと名付けら
れている。更に該酵素は電子顕微鏡観察により、その分
子が環状型粒子＠造を何しているとル？められ、この点
からプロテアソームとも言われている〔ＮａｔｌＪｒｅ
。 旦４．１９２−１９４ （１９８８））。 かかる多機能プロテア−ぜは、非リソシーム系蛋白質分
解経路に関与する酵素と推定されてあり、細胞質全蛋白
質の約１％を占めるほど多量に存在すること等、その生
物学的重要性か強く指摘されてはいるが、未だ上記ラッ
ト以外にはかがる酵素を単離した例はない。 発明が解決しようとする課題 本発明は、新規な多機能プロテア−ぜ、即ち１＝１〜、
鶏、アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ １ａｅｖｉ
ｓ）並びに酵母（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の多Ｉｔ
ｊＭ能プロテアーゼ（以下、「プロテアソーム」と略記
する）を提供することをその目的とする。 また本発明は、上記プロテアソームの精製及び測定に有
用な抗プロテアンーム抗体及び該抗体の作成のための抗
原を提供することをもその目的としてあり、更に上記抗
体を用いたプロテアソームの免疫学的精製法及び免疫学
的測定法、並びに体液中のプロテアソームの測定による
癌のスクリーニング及び／又は診断技術を提供すること
をもその目的としている。 課題を解決するための手段 本発明によれば、下記の酵素学的及び物理化学的性質を
有することを特徴とするヒトプロテアソームが提供され
る。 イ０合成基貿Ｃｂｚ −Ｌｅｕ −Ｌ ｅｕ−Ｇｌｕ−
ＮＡ （（口しＱｂｚはＮ−ベンジルオキシカルボニル
基を、またＮＡは２−ナフチルアミド基を示す、以下同
じ）を切断できる酵素活性を有し、その至適Ｄ ｌ−１
は８．２〜８．６である： ロ９合成基質Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＮＡ
（但しＭＮＡは４−メトキシ−２−ナフチルアミド基を
示す、以下同じ）を切断できる酵素活性を有し、その至
適ＤＨは９．５〜１０．０である； ハ０合成基貿ＳＵＣ−Ｌｅｕ −ＬｅＬＩ−Ｖａｌ−Ｔ
ｙｒ −ＭＣＡ（但しＳｕｃはスクシニル基を、またＭ
ＣＡは４−メチル−７−クマリルアミド基を示ず、以下
同じ）を切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは８
．２〜８．６である：二、紫外線吸収スペクトルは極大
吸収（λｍａｘ ）が２７８１ｍにあり、２８０ｎｍに
おける吸収はＥ１％＝１１．２である： Ｃｍ ホ、沈降速度法による沈降係数（Ｓ２０１ｗ）は２１．
８３である； へ、要件性光散乱法による拡散係数（Ｄ２ｏ１ｗ）は２
．２８Ｘ１０−７ｃｍ２− ｓ−’である；ト９分子量
は８７００００±５００００である；チ６等電点分画に
よる等電点（ＰＩ）は５．０±０．２である； す、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；ＡＳＸ
８．４ Ｐｈｅ ３．４ＧＩＸ １２
． ４ Ｔｙｒ ４． ６ＡｒＣ１５，５
ＴｒｐＯ，３ ＬＶＳ ６．２ Ｓｅｒ ５．８Ｈｉ
ｓ １．９ Ｔｈｒ ５．４Ａ１８
９． ５ １／２ ＣＶＳ ＮＤＧＩＶ
８．１ Ｍｅｔ ３．ＩＬｅＵ ８．
８ Ｐｒｏ ３．６１ｉｅ ５．７
Ｖａｌ ７．２（但しＮＤは検出されない
ことを意味し、以下同様である）。 尚、上記及び他の本明細書中のアミノ酸組成を示す構成
アミノ酸の略号による表示はＩＵＰＡＣ−Ｉｔ、１Ｂの
規定或いは当該分野における通称又は潰用に従うもので
あり、以下の通りでおる。 ＡＳＸ・・・アスパラギン酸及びアスパラギンＧＩＸ・
・・グルタミン酸及びグルタミンＰｈｅ・・・フェニル
アラニン、Ｔｙｒ・・・チロシンＡｒ（］・・・アルギ
ニン、Ｔｒｌ）・・・トリプトファンＬ’／Ｓ・・・リ
ジン、Ｓｅｐ・・・セリン１−Ｈｉｓ・・・ヒスチジン
、Ｔｈｒ・・・スレオニンＡ１ａ・・・アラニン、１／
２ Ｑｙｓ・・・システィンＧ１ｙ・・・グリシン、Ｍ
ｅｔ・・・メチオニンｌｅｕ・・・ロイシン、１）ｒｏ
・・・プロリン１１０・・・イソロイシン、Ｖａｌ・・
・バリンまた、本明細書における紫外線吸収スペクトル
、沈降速度法による沈降係数、要件性光散乱法による拡
散係数及びアミノ酸組成モル％の多値、その他の物理学
的測定値は、おくまで実験値でおり、５％以内の標準偏
差値を示すものでおる。 本発明によれば、また下記の酵素学的及び物理化学的性
質を有することを特徴とする知多機能プロテアーゼが提
供される。 イ６合成基貿Ｃｂｚ −Ｌ ｅｕ −Ｌ ｅｕ −（３
１ｕ −Ｎ Ａを切断できる酵素活性を有し、その至適
ｐ＋は８．４〜８．７である： ｏ、 合成’３質ＣｂＺ−Ａｌａ−Ａｒ（１−Ａｒ（１
−ＭＮＡを切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは
９．６〜１０．１である； ハ０合成基質Ｓｕｃ −１−ｅｕ −Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ｔｙｒ −ＭＣＡを切断できる酵素活性を有し、その至
適Ｉ） Ｈは８．０〜８．５である； 二、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ ）が
２７８ｎｍに必り、２８０ｎｍにおける吸収はは１１％
−１０，８で揚る： Ｃｍ ホ、沈降速度法による沈降係数（３２ｏ、）は２０、Ｏ
３である： へ、事件性光散乱法による拡散像ｖｌ（Ｄ２ｏ、）は２
．０２ｘ１０−７ｃｍ２− ｓ−’でｉるニド、分子量
は９１００００±５００００である；チ１等電点分画に
よる等電点（ＰＩ）は４．９±±０．２である； ワ、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；ＡＳＸ
８．２ Ｐｈｅ ３．３Ｇｌｘ １３．
１ Ｔｙｒ ４． ５Ａｒ（］ ５．
４ ’ＴｒｐＯ，４Ｌ、ＶＳ ６． ＯＳｏ
ｒ ６． １Ｈｉｓ １．９ Ｔｈｒ
５．５Ａｌａ ９． ４ １／２ ＣＶＳ
ＮＤＧＩＶ ８．５ Ｍｅｔ
２．８Ｌｅｕ ８．３ Ｐｒｏ ３．
６Ｉｌｅ ５．７ Ｖａｌ ７．０更
に本発明によれば、下記の酵素学的及び物理化学的性質
を有することを特徴とするアフリカッメガエル多機能プ
ロテアーゼか提供される。 イ１合成基質Ｃｂｚ −Ｌ ｅｕ −Ｌｅｕ −Ｇ ｌ
ｕ −Ｎ Ａを切断できる酵素活性を有し、その至適ｐ
Ｈは８．９〜９．２である： 口１合成基質Ｃｂｚ−Ａ １ａ−ＡＩ’（］ −Ａｒｇ
−ＭＮＡ！切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは
９．６〜１０．５である； ハ１合成基貿Ｓｕｃ −Ｌｅｕ −Ｌ ｅｕ −Ｖａｌ
−Ｔｙｒ −ＭＣＡを切断できる酵素活性を有し、そ
の至適ｐＩ−１は８．４〜８．８である； 二、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ ）が
２７８ｎｍに必り、２８０ｎｍｋ：おける吸収は１１％
−１２，３である： ｃｍ ホ、沈降速度法による沈降係数（Ｓ ２（３カ）は１９
．６３である： へ、Ｑ−弾性光散乱法による拡散係数（Ｄ２ｏ１ｗ）は
２．１５Ｘ１０−７ｃｍ２−ｓ−’である；ト０分子量
は８４００００±５００００である；チ９等電点分画に
よる等電点（ＰＩ）は５．０±０．２である； ワ、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；ＡＳＸ
８．７ Ｐｈｅ ３．４ＧＩＸ １２．
５ Ｔｙｒ ４．９Ａｒｇ５．２ Ｔ
ｒｉ） ０．３１ｙｓ ６．７ Ｓｅｒ
５．７ト１ｉｓ １．８
Ｔｈｒ ５．５Ａｌａ ９． ５
１／２ Ｃｙｓ ＮＤＧｌｙ ７． ９
Ｍｅｔ ３． ０Ｌｅｕ ８．７
Ｐｒｏ ３．３１１ｅ ５．８
Ｖａｌ ７．１更にまた本発明によれば、下記
の酵素学的及び物理化学的性質を有することを特徴とす
る酵Ｒ１多機能プロテアーゼが提供される。 イ１重合基貿Ｃｂｚ −Ｌ ｅｕ −Ｌ ｅｕ −Ｇ
Ｉｕ −Ｎ Ａを切断できる酵素活性を有し、その至適
ｐ Ｈは８．４〜８．８である： 口８合成１ＩＣｂｚ−Ａｌａ−△ｒ（１−ＡｒＣｌ−Ｍ
ＮＡを切断できる酵素活性をイ１し、その至適ｐ 目は
９．６〜１０．０である； ハ０合成基貿Ｓｕｃ −Ｌ ｅｕ −Ｌｅｕ −Ｖａｌ
−Ｔｙｒ −ＭＣＡを切断できる酵素活性を有し、ぞ
の至適ｐＨは８．４〜８．７でめる： 二、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ ）が
２７８ｎｍにあり、２８００ｍにあけろ吸収は１ ％ Ｅｌ ｏＩＩ、＝７．４である； ホ、沈降速度法による沈降係数（Ｓ２ｏ、Ｗ〉は２０、
Ｏ３である； へ、要件性光散乱法による拡散係数（Ｄ２ｏ、）は２．
６０Ｘ１０−７ｃｍ２− ｓ−’でｉる；ト９分子量は
７１００００±５００００である；チ１等電点分画によ
る等電点（ＰＩ）は４．６±０．２である： ワ、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；Ａｓｘ
１１． ＯＰｈｅ ２．８Ｇｌｘ １２．９
Ｔｙｒ ３．５Ａｒｇ ３．６ Ｔｒ
ｐ Ｏ，４Ｌｙｓ ６．２ Ｓｅｒ
６．２Ｈｉｓ １．３ Ｔｈｒ ５．５
Ａｌａ ８．９ １／２ Ｃｙｓ ＮＤＧｌ
ｙ ９．４ Ｍｅｔ １．８Ｌｅｕ
８．３ Ｐｒｏ ４．５１ｉｅ ６．
５ Ｖａｌ ７．１本発明は、また上記各
プロテアソームのそれぞれにのみ特異反応性を有するこ
とを特徴とする抗体、即ら抗ヒトプロテアソーム抗体、
抗鶏プロテアソーム抗体、抗アフリカッメガエルプロテ
アソーム抗体及び抗酵母プロテアソーム抗体のそれぞれ
を提供するものである。 以下、本発明プロテアソームの′ｉＡ造法につき詳述す
る。 本発明プロテアソームは、当該由来する動物もしくは微
生物の細胞質分画より、通常の精製、単離手段に基づき
収１ｑすることができる。プロテアソームは種々の組繊
細胞に広く分布しており、その起源とする細胞は特に限
定されるものではないが、その含量は代謝活性の高い臓
器、殊に肝臓に多く、従ってかかる細胞を起源細胞とす
るのが好ましい。また、かかる細胞は種々の樹立株細胞
であってもよい。 上記の如き起源細胞の細胞質分画の調製は公知であり、
通常の細胞分画法によることができる。 例えば上記細胞質分画としては、起源細胞のホモジネー
トを遠心分離に供して、細胞膜、核、ミトコンドリア（
ｍｉｔＯｃｈＯｎｄｒｉＯｎ ） 、リソシーム（ｌ
ｙｓｏｓｏｍｃ ）及びミクロソーム（ｍｉｃｒｏｓｏ
ｍｅ ＞の■１胞下方画を除いた後の上清を好適に使用
し得る。 かかる細胞質分画からの本発明プロテアソームの精製、
単離は、当該プロテアソームの物理化学的、免疫化学的
性質等を利用した各種の処理操作に従い実施することが
できる［例えば、「生化学データブック■」第１１７５
〜１２５９頁、第１版第１刷、１９８０年６月２３日、
株式会社東京化学同人発行参照］。該方法としては、具
体的には例えば、通常の蛋白沈澱剤による処理、限外濾
過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、イオ
ン交換を含む吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグ
ラフィー等の各種液体クロマトグラフィー、遠心分離、
電気泳動、透析及びこれらの組合わせ等を広く採用する
ことができる。 本発明プロテアソームは、細胞内及び抽出画分中では不
活性型として存在するが、精製操作中に不可逆的に活性
化され、この活性型酵素は極めて不安定で、単離精製す
ることが困難であるので、常に不活性型として維持する
必要がある。この不活性型としての維持は、例えば分離
溶媒中に２０％グリセリンと１０ｍＭの２−メルカプト
エタノール又は１ｍＭのジチオスレイトールを添加して
おくことにより実施できる。 上記単離、精製操作により均質な物質として得られる本
発明プロテアソームは、前記した酵素学的及び物理化学
的性質により特定される。 また、かくして得られる本発明プロテアソームは、之等
各プロテアソームと特異的に反応する抗体（抗プロテア
ソーム抗体）の製造のための免疫原として利用し得る。 上記抗プロテアソーム抗体は、各種起源のプロテアソー
ムのいずれか一種を特異的に認識する抗体として特定さ
れ、他種由来のプロテアソームとは交叉反応しない点に
おいて特徴付（プられる。かかる抗体は、例えば本発明
プロテアソームを免疫原として用いることにより製造で
きる。尚、上記抗体かポリクローナル抗体である場合、
免疫原としてのプロテアソームは本発明プロテアソーム
の如き均質性が必要であるが、上記抗体が七ツクローナ
ル抗体で必ろ場合は、必ずしもＦ配向質性を有する本発
明プロテアソームを用いる必要はなく、プロテアソーム
を含む各種のものを用いることができる。 上記プロテアソームを免疫原として利用（・た抗体の製
造は、常法に従うことができる。該方法はより具体的に
は、上記免疫原を哺乳動物に投与（免疫）し、生体内に
所望の抗体（ポリクローナル抗体）を産生させてこれを
採取するか、或いは」−記免疫された哺乳動物の形質細
胞（免疫細胞）を、こりと適合性のある形質細胞腫細胞
と融合してハイブリドーマを作成し、これより所望の抗
体（モノクローナル抗体）を産生するクローン８選択、
培養する等により実施される。 上記において免疫される哺乳動物としては、特に制限は
ないが、本発明ブ
プロテアーゼとしての多機能プロデア−ぜに関する。 従来の技術 細胞質局在の不活性型プロテアーゼとしての多機能プロ
テアーゼは、本発明者によりラット肝臓から既に単離さ
れており、その機能、分子量’ｙｔｘの解析、分布と局
在性等を詳細に報告されている［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、 ２６１（３２）、１５１９７〜１５２０３及び同１
５２０４〜１５２０７ （１９８６）：化学と生１勿、
ンこＪΣ （８）、 ４８９〜４９０ （１９８
７） ：蛋白・核酸・酵素、３２ （７）、９５５〜
９６１（１９８７＞等］。 上記酵素の分子量は約７５万と推定され、プロテア−Ｕ
としては例外的に大きく、また該酵素はへテロ多量体＠
造の巨大蛋白質複合体であり、同一分子内に基質特異性
の異なった複数の、かつ互いに独立した触媒活性部位を
有しており、この点から多機能プロテアーゼと名付けら
れている。更に該酵素は電子顕微鏡観察により、その分
子が環状型粒子＠造を何しているとル？められ、この点
からプロテアソームとも言われている〔ＮａｔｌＪｒｅ
。 旦４．１９２−１９４ （１９８８））。 かかる多機能プロテア−ぜは、非リソシーム系蛋白質分
解経路に関与する酵素と推定されてあり、細胞質全蛋白
質の約１％を占めるほど多量に存在すること等、その生
物学的重要性か強く指摘されてはいるが、未だ上記ラッ
ト以外にはかがる酵素を単離した例はない。 発明が解決しようとする課題 本発明は、新規な多機能プロテア−ぜ、即ち１＝１〜、
鶏、アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ １ａｅｖｉ
ｓ）並びに酵母（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の多Ｉｔ
ｊＭ能プロテアーゼ（以下、「プロテアソーム」と略記
する）を提供することをその目的とする。 また本発明は、上記プロテアソームの精製及び測定に有
用な抗プロテアンーム抗体及び該抗体の作成のための抗
原を提供することをもその目的としてあり、更に上記抗
体を用いたプロテアソームの免疫学的精製法及び免疫学
的測定法、並びに体液中のプロテアソームの測定による
癌のスクリーニング及び／又は診断技術を提供すること
をもその目的としている。 課題を解決するための手段 本発明によれば、下記の酵素学的及び物理化学的性質を
有することを特徴とするヒトプロテアソームが提供され
る。 イ０合成基貿Ｃｂｚ −Ｌｅｕ −Ｌ ｅｕ−Ｇｌｕ−
ＮＡ （（口しＱｂｚはＮ−ベンジルオキシカルボニル
基を、またＮＡは２−ナフチルアミド基を示す、以下同
じ）を切断できる酵素活性を有し、その至適Ｄ ｌ−１
は８．２〜８．６である： ロ９合成基質Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＮＡ
（但しＭＮＡは４−メトキシ−２−ナフチルアミド基を
示す、以下同じ）を切断できる酵素活性を有し、その至
適ＤＨは９．５〜１０．０である； ハ０合成基貿ＳＵＣ−Ｌｅｕ −ＬｅＬＩ−Ｖａｌ−Ｔ
ｙｒ −ＭＣＡ（但しＳｕｃはスクシニル基を、またＭ
ＣＡは４−メチル−７−クマリルアミド基を示ず、以下
同じ）を切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは８
．２〜８．６である：二、紫外線吸収スペクトルは極大
吸収（λｍａｘ ）が２７８１ｍにあり、２８０ｎｍに
おける吸収はＥ１％＝１１．２である： Ｃｍ ホ、沈降速度法による沈降係数（Ｓ２０１ｗ）は２１．
８３である； へ、要件性光散乱法による拡散係数（Ｄ２ｏ１ｗ）は２
．２８Ｘ１０−７ｃｍ２− ｓ−’である；ト９分子量
は８７００００±５００００である；チ６等電点分画に
よる等電点（ＰＩ）は５．０±０．２である； す、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；ＡＳＸ
８．４ Ｐｈｅ ３．４ＧＩＸ １２
． ４ Ｔｙｒ ４． ６ＡｒＣ１５，５
ＴｒｐＯ，３ ＬＶＳ ６．２ Ｓｅｒ ５．８Ｈｉ
ｓ １．９ Ｔｈｒ ５．４Ａ１８
９． ５ １／２ ＣＶＳ ＮＤＧＩＶ
８．１ Ｍｅｔ ３．ＩＬｅＵ ８．
８ Ｐｒｏ ３．６１ｉｅ ５．７
Ｖａｌ ７．２（但しＮＤは検出されない
ことを意味し、以下同様である）。 尚、上記及び他の本明細書中のアミノ酸組成を示す構成
アミノ酸の略号による表示はＩＵＰＡＣ−Ｉｔ、１Ｂの
規定或いは当該分野における通称又は潰用に従うもので
あり、以下の通りでおる。 ＡＳＸ・・・アスパラギン酸及びアスパラギンＧＩＸ・
・・グルタミン酸及びグルタミンＰｈｅ・・・フェニル
アラニン、Ｔｙｒ・・・チロシンＡｒ（］・・・アルギ
ニン、Ｔｒｌ）・・・トリプトファンＬ’／Ｓ・・・リ
ジン、Ｓｅｐ・・・セリン１−Ｈｉｓ・・・ヒスチジン
、Ｔｈｒ・・・スレオニンＡ１ａ・・・アラニン、１／
２ Ｑｙｓ・・・システィンＧ１ｙ・・・グリシン、Ｍ
ｅｔ・・・メチオニンｌｅｕ・・・ロイシン、１）ｒｏ
・・・プロリン１１０・・・イソロイシン、Ｖａｌ・・
・バリンまた、本明細書における紫外線吸収スペクトル
、沈降速度法による沈降係数、要件性光散乱法による拡
散係数及びアミノ酸組成モル％の多値、その他の物理学
的測定値は、おくまで実験値でおり、５％以内の標準偏
差値を示すものでおる。 本発明によれば、また下記の酵素学的及び物理化学的性
質を有することを特徴とする知多機能プロテアーゼが提
供される。 イ６合成基貿Ｃｂｚ −Ｌ ｅｕ −Ｌ ｅｕ −（３
１ｕ −Ｎ Ａを切断できる酵素活性を有し、その至適
ｐ＋は８．４〜８．７である： ｏ、 合成’３質ＣｂＺ−Ａｌａ−Ａｒ（１−Ａｒ（１
−ＭＮＡを切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは
９．６〜１０．１である； ハ０合成基質Ｓｕｃ −１−ｅｕ −Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ｔｙｒ −ＭＣＡを切断できる酵素活性を有し、その至
適Ｉ） Ｈは８．０〜８．５である； 二、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ ）が
２７８ｎｍに必り、２８０ｎｍにおける吸収はは１１％
−１０，８で揚る： Ｃｍ ホ、沈降速度法による沈降係数（３２ｏ、）は２０、Ｏ
３である： へ、事件性光散乱法による拡散像ｖｌ（Ｄ２ｏ、）は２
．０２ｘ１０−７ｃｍ２− ｓ−’でｉるニド、分子量
は９１００００±５００００である；チ１等電点分画に
よる等電点（ＰＩ）は４．９±±０．２である； ワ、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；ＡＳＸ
８．２ Ｐｈｅ ３．３Ｇｌｘ １３．
１ Ｔｙｒ ４． ５Ａｒ（］ ５．
４ ’ＴｒｐＯ，４Ｌ、ＶＳ ６． ＯＳｏ
ｒ ６． １Ｈｉｓ １．９ Ｔｈｒ
５．５Ａｌａ ９． ４ １／２ ＣＶＳ
ＮＤＧＩＶ ８．５ Ｍｅｔ
２．８Ｌｅｕ ８．３ Ｐｒｏ ３．
６Ｉｌｅ ５．７ Ｖａｌ ７．０更
に本発明によれば、下記の酵素学的及び物理化学的性質
を有することを特徴とするアフリカッメガエル多機能プ
ロテアーゼか提供される。 イ１合成基質Ｃｂｚ −Ｌ ｅｕ −Ｌｅｕ −Ｇ ｌ
ｕ −Ｎ Ａを切断できる酵素活性を有し、その至適ｐ
Ｈは８．９〜９．２である： 口１合成基質Ｃｂｚ−Ａ １ａ−ＡＩ’（］ −Ａｒｇ
−ＭＮＡ！切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは
９．６〜１０．５である； ハ１合成基貿Ｓｕｃ −Ｌｅｕ −Ｌ ｅｕ −Ｖａｌ
−Ｔｙｒ −ＭＣＡを切断できる酵素活性を有し、そ
の至適ｐＩ−１は８．４〜８．８である； 二、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ ）が
２７８ｎｍに必り、２８０ｎｍｋ：おける吸収は１１％
−１２，３である： ｃｍ ホ、沈降速度法による沈降係数（Ｓ ２（３カ）は１９
．６３である： へ、Ｑ−弾性光散乱法による拡散係数（Ｄ２ｏ１ｗ）は
２．１５Ｘ１０−７ｃｍ２−ｓ−’である；ト０分子量
は８４００００±５００００である；チ９等電点分画に
よる等電点（ＰＩ）は５．０±０．２である； ワ、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；ＡＳＸ
８．７ Ｐｈｅ ３．４ＧＩＸ １２．
５ Ｔｙｒ ４．９Ａｒｇ５．２ Ｔ
ｒｉ） ０．３１ｙｓ ６．７ Ｓｅｒ
５．７ト１ｉｓ １．８
Ｔｈｒ ５．５Ａｌａ ９． ５
１／２ Ｃｙｓ ＮＤＧｌｙ ７． ９
Ｍｅｔ ３． ０Ｌｅｕ ８．７
Ｐｒｏ ３．３１１ｅ ５．８
Ｖａｌ ７．１更にまた本発明によれば、下記
の酵素学的及び物理化学的性質を有することを特徴とす
る酵Ｒ１多機能プロテアーゼが提供される。 イ１重合基貿Ｃｂｚ −Ｌ ｅｕ −Ｌ ｅｕ −Ｇ
Ｉｕ −Ｎ Ａを切断できる酵素活性を有し、その至適
ｐ Ｈは８．４〜８．８である： 口８合成１ＩＣｂｚ−Ａｌａ−△ｒ（１−ＡｒＣｌ−Ｍ
ＮＡを切断できる酵素活性をイ１し、その至適ｐ 目は
９．６〜１０．０である； ハ０合成基貿Ｓｕｃ −Ｌ ｅｕ −Ｌｅｕ −Ｖａｌ
−Ｔｙｒ −ＭＣＡを切断できる酵素活性を有し、ぞ
の至適ｐＨは８．４〜８．７でめる： 二、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ ）が
２７８ｎｍにあり、２８００ｍにあけろ吸収は１ ％ Ｅｌ ｏＩＩ、＝７．４である； ホ、沈降速度法による沈降係数（Ｓ２ｏ、Ｗ〉は２０、
Ｏ３である； へ、要件性光散乱法による拡散係数（Ｄ２ｏ、）は２．
６０Ｘ１０−７ｃｍ２− ｓ−’でｉる；ト９分子量は
７１００００±５００００である；チ１等電点分画によ
る等電点（ＰＩ）は４．６±０．２である： ワ、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；Ａｓｘ
１１． ＯＰｈｅ ２．８Ｇｌｘ １２．９
Ｔｙｒ ３．５Ａｒｇ ３．６ Ｔｒ
ｐ Ｏ，４Ｌｙｓ ６．２ Ｓｅｒ
６．２Ｈｉｓ １．３ Ｔｈｒ ５．５
Ａｌａ ８．９ １／２ Ｃｙｓ ＮＤＧｌ
ｙ ９．４ Ｍｅｔ １．８Ｌｅｕ
８．３ Ｐｒｏ ４．５１ｉｅ ６．
５ Ｖａｌ ７．１本発明は、また上記各
プロテアソームのそれぞれにのみ特異反応性を有するこ
とを特徴とする抗体、即ら抗ヒトプロテアソーム抗体、
抗鶏プロテアソーム抗体、抗アフリカッメガエルプロテ
アソーム抗体及び抗酵母プロテアソーム抗体のそれぞれ
を提供するものである。 以下、本発明プロテアソームの′ｉＡ造法につき詳述す
る。 本発明プロテアソームは、当該由来する動物もしくは微
生物の細胞質分画より、通常の精製、単離手段に基づき
収１ｑすることができる。プロテアソームは種々の組繊
細胞に広く分布しており、その起源とする細胞は特に限
定されるものではないが、その含量は代謝活性の高い臓
器、殊に肝臓に多く、従ってかかる細胞を起源細胞とす
るのが好ましい。また、かかる細胞は種々の樹立株細胞
であってもよい。 上記の如き起源細胞の細胞質分画の調製は公知であり、
通常の細胞分画法によることができる。 例えば上記細胞質分画としては、起源細胞のホモジネー
トを遠心分離に供して、細胞膜、核、ミトコンドリア（
ｍｉｔＯｃｈＯｎｄｒｉＯｎ ） 、リソシーム（ｌ
ｙｓｏｓｏｍｃ ）及びミクロソーム（ｍｉｃｒｏｓｏ
ｍｅ ＞の■１胞下方画を除いた後の上清を好適に使用
し得る。 かかる細胞質分画からの本発明プロテアソームの精製、
単離は、当該プロテアソームの物理化学的、免疫化学的
性質等を利用した各種の処理操作に従い実施することが
できる［例えば、「生化学データブック■」第１１７５
〜１２５９頁、第１版第１刷、１９８０年６月２３日、
株式会社東京化学同人発行参照］。該方法としては、具
体的には例えば、通常の蛋白沈澱剤による処理、限外濾
過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、イオ
ン交換を含む吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグ
ラフィー等の各種液体クロマトグラフィー、遠心分離、
電気泳動、透析及びこれらの組合わせ等を広く採用する
ことができる。 本発明プロテアソームは、細胞内及び抽出画分中では不
活性型として存在するが、精製操作中に不可逆的に活性
化され、この活性型酵素は極めて不安定で、単離精製す
ることが困難であるので、常に不活性型として維持する
必要がある。この不活性型としての維持は、例えば分離
溶媒中に２０％グリセリンと１０ｍＭの２−メルカプト
エタノール又は１ｍＭのジチオスレイトールを添加して
おくことにより実施できる。 上記単離、精製操作により均質な物質として得られる本
発明プロテアソームは、前記した酵素学的及び物理化学
的性質により特定される。 また、かくして得られる本発明プロテアソームは、之等
各プロテアソームと特異的に反応する抗体（抗プロテア
ソーム抗体）の製造のための免疫原として利用し得る。 上記抗プロテアソーム抗体は、各種起源のプロテアソー
ムのいずれか一種を特異的に認識する抗体として特定さ
れ、他種由来のプロテアソームとは交叉反応しない点に
おいて特徴付（プられる。かかる抗体は、例えば本発明
プロテアソームを免疫原として用いることにより製造で
きる。尚、上記抗体かポリクローナル抗体である場合、
免疫原としてのプロテアソームは本発明プロテアソーム
の如き均質性が必要であるが、上記抗体が七ツクローナ
ル抗体で必ろ場合は、必ずしもＦ配向質性を有する本発
明プロテアソームを用いる必要はなく、プロテアソーム
を含む各種のものを用いることができる。 上記プロテアソームを免疫原として利用（・た抗体の製
造は、常法に従うことができる。該方法はより具体的に
は、上記免疫原を哺乳動物に投与（免疫）し、生体内に
所望の抗体（ポリクローナル抗体）を産生させてこれを
採取するか、或いは」−記免疫された哺乳動物の形質細
胞（免疫細胞）を、こりと適合性のある形質細胞腫細胞
と融合してハイブリドーマを作成し、これより所望の抗
体（モノクローナル抗体）を産生するクローン８選択、
培養する等により実施される。 上記において免疫される哺乳動物としては、特に制限は
ないが、本発明ブ
【］ブアソームと特異的に反応する抗
体をハイブリドーマを利用して製造する場合には、細胞
融合に使用する形質■［胞肝細胞との適合性を考慮して
選択するのが望よ（〕く、一般にはマウス、ラット等が
有利に用いられる。 上記免疫は常法により、例えば上記免疫原を哺乳動物に
静脈内、皮内、皮下、腹腔内注則等により投与すること
により実施できる。より具体的には、免疫原を所望によ
り通常のアジュバン１〜と併用して、数回（追加免疫ニ
ブ−スター）投与し、総投与吊が、例えばマウスでは約
２００〜２５０μｇ／個体程度とすることにより行なわ
れる。 ポリクロナル抗体の採取は、例えば上記最終投与の１〜
２週間経過後、免疫された哺乳動物の血清を分離するこ
とにより行ない得る。 またモノクロナル抗体の製造に用いられる免疫細胞とし
ノでは、上記最終投与の約３日後に摘出した牌臓細胞を
好適に使用できる。該免疫細胞と融合される他方の親細
胞としての形質細胞腫細胞としては、既に公知の確立さ
れた種々の細胞株、例えばＰ３ （ｐ３／Ｘ６３−Ａｑ
８） ［Ｎｃｔｕｒｅ、 ２５６ 、４９５−４９７
（１９７５）］ 、Ｐ３−Ｕ １ ［Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 ８１．１−７（１９７８
）］ 、ＮＳ −１［Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、
６ 、５１１−５１９（１９７６）］、ＭＰＣ−１１
［Ｃｅ１ｌ 、 ８ 、４０５−４１５（１９７６）］
、Ｓ Ｐ ２１０ ［Ｎｅｔｕｒｅ 、 ２７６ 、
２６９−２７０（１９７８）］ 、ＦＯ［Ｊ、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、 Ｍｅｔｈ、、３５．１−２１（１９８０）］
、Ｘ６３．６．５．３［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２
３ 。 １５４Ｂ−１５５０（１９７９月、Ｓ １９４ ［Ｊ、
Ｅｘｐ、 ｌｅｄ、 、 １４８ 。 ３１３−３２３（１９７８）］、Ｒ２１０［Ｎａｔｕｒ
ｅ、２７７ 、１３１−１３３［１９７９）］等の母髄
腫細胞等を例示できる。 ハイブリドーマ法によるモノクロナル抗体の製造手法は
公知であり、例えばマイルスタイン（Ｍｉ １ｓｔｅｉ
ｎ）等の方法［）ｉｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ！
ｏｇｙ。 Ｖｏｌ、７３． ｌ）り３．（１９８１）１等に準じて
行なうことカテきる。尚、融合反応はポリエチレングリ
ニ】−ル（ＰＥＧ） 、センダイウィルス（ＨＶＪ）等
を用いる方法や電気処理（電気融合〉による方法等を適
宜採用することができる。また、ハイブリドーマ法に限
らず、例えば上記免疫細胞をエプスタイン バー ライ
スル（ＥＢウィルス）等によって、不滅化（Ｉｍｍｏｒ
ｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）する等の方法を採用することも
できる。 かくして得られるハイブリドーマ又は不滅化細胞は、通
常の限界希釈法に従い単一クローン化に供され、目的と
する抗体産生株を選択し、収得することができる。 該目的抗体産生株の検索は、例えばエライザ（ＥＬＩＳ
Ａ）法［Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、、 ７０゜４１
９−４３９ （１９８０）］、プラーク法、スポット法
、凝集反応法、オフタロニー法、放射免疫測定法（ＲＩ
Ａ）等の一般に抗体の検出に採用される種々の方法［ハ
イブリドーマ法とモノクローナル抗体、株式会社Ｒ＆Ｄ
プラニング発行、３０〜５３頁、昭和５７年３月５日］
に従い実施することができ、この検索には前記した免疫
原が利用できる。 かくして得られる一Ｌツクローナル抗体を産生する細胞
は、通常の培地で継代培養でき、また液体窒素中で長期
保存できる。 上記クローンからの抗体の採取には、該クローンを常法
に従って培養してその培養上清として得る方法や、上記
クローンをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖
させ、その腹水として得る方法等が採用され得る。前者
の方法は高純度の抗体を得るのに適しており、後者の方
法は大量生産に適している。 かくして得られる抗体は、更に塩析、グル濾過法、アフ
ィニティクロマトグラフィー等の通常の手段により精製
することができる。 該抗体の利用によれば、例えばアフィニティクロマトグ
ラフィー等の免疫学的手法による、前記した各種プロテ
アソームの精製が可能である。 更に該抗体の利用によれば、当該プロテアソームの各種
免疫学的手法による測定が可能である。 殊に本発明者の研究によれば、癌患者の体液中にはプロ
テアソームが多Ｉｎに存在し、その子は健常人等の非癌
患者に比し、診断上有意な顕若性を有することが見出さ
れている。従って、上記プロテアソームの測定技術の提
供は、癌のスクリーニング及び／又は診断に極めて有用
である。 尚、かかる癌のスクリーニング及び／又は診断のための
、体液中のプロテアソームの測定は、基本的には通常の
免疫検定法、例えばＲＩＡ、酵素免疫検定法（Ｅ ＩＡ
）等に従うことができ、２等各種免疫検定法にａ３ける
操作、手順等としても一般に採用されている各種方法、
例えば競合法、サンドイツチ法、凝集法等をいずれも準
用することができる。 上記検定法において検体として用いられる体液としては
、例えば血液、細胞組ｆＪＩｉ液、リンパ液、胸水、腹
水、羊水、胃液、尿、膵液、髄液、唾液等を例示でき、
之等の内では血液、特に血清又は血漿が好ましい。 かくして測定された被検者のプロテアソームレベルを健
常人の当該レベルと比較することにより、癌のスクリー
ニング及び／又は診断を良好に行ない１ｑる。 上記癌のスクリーニング及び／又は診断を実施するのに
特に便利な方法としては、上記体液中のプロテアソーム
測定用キットを使用する方法であり、該キットは抗プロ
テアソーム抗体を必須成分として調製された抗体試薬を
含有する。該抗体試薬には、グリセロールや牛等の血清
蛋白のような安定化剤及び／又は保存剤を添加配合する
ことができ、Ｍｈ液はキラ１〜の必須成分とは考えられ
ないが、上記測定を実施する際に、ＤＨを４〜８程度と
する各種のものを添加使用することもできる。 発明の効果 （１）本発明によれば、新規なプロテアソームが提供さ
れる。本発明プロテアソームは基質特異性の異なるプロ
テアーゼ群の復合体であって、蛋白質中の酸性、中性及
び塩基性のいずれの部位をも切断できる活性を有してお
り、この点からプロテアーゼ研究史上堰も強力なプロテ
アーゼといえる。しかもその活性発現の調節は分子内部
で行なわれ、血液中のプラスミン等で活性化されるため
、これは例えば血栓融解剤として有用である。また本発
明プロテアソームは、洗剤や化粧料の添加剤としても利
用できる。 （２）本発明によれば、かかるプロテアソームの精製及
び測定に有用な抗プロテアソ〜ム抗体が提供される。 （３）本発明によれば、かかる抗体を用いるプロテアソ
ームの免疫学的精製法及び免疫学的測定法が提供される
。 （４）本発明によれば、体液中のプロテ）ｌソームを測
定することからなる癌のスクリーニング及び／又１は診
断技術が提供される。 実 施 例 以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明ブーるか
、本発明は之等に限定されるものではない。 尚、以下において活性（プロテアーゼ活性）は、田中等
の文献ｆＪ、Ｂ、Ｃ，，２６１（３２）。 １５１９７−１５２０３ （１９８６）］に記載の方法
に従い、［３トｌ］メヂルーカゼインを用いて測定した
。但し、より簡便且つ高感度な活性測定法としては蛍光
ペプチド基質、例えばＳｕｃ−Ｌｅｕ−１−ｅｕ−Ｖａ
ｌ−Ｔ’ｙｒ−ＭＣＡの分解活性を測定する方法もある
。また、プロテアソームの製造行程は、いずれも４°Ｃ
下に行ない、緩衝液としては特記（７，ない限り、１ｍ
Ｍジチオスレイ［ヘール及び２０％グリセロ−・ルを含
む５０ｍＭトリス・）−Ｉ ＣＱ緩衝液（ｐＨ７，５＞
を用いた。 実施例 １ じ１へプロテアソームの製ｊ；５ ヒト肝臓組織２００Ｃｌを３倍容呆の緩衝液［０，１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジヂオスレイトール及び０
６２５Ｍ シュークロースを含む５０ｍＭ １〜リ
ス−ＨＣＱ緩Ｔｈ液、［）８７．５１でホモジナイズ（
Ｐｏｔｔｅｒ Ｅｌｖｅｈｊｅｍ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚ
ｅｒ ）し、遠心分離（１０５０００ＸＣ）、６０分）
して細胞Ｍフラクション（上清）を１９だ。 上記で得た肝臓上清画分を緩衝液で平衡化したファスト
フローＱ−セファ０−ス（Ｆａｓｔ Ｆ！ｏｖ Ｑ−３
ｅｐｈａｒｏｓｅ、 Ｐｈａｒｍａｅｉａ Ｆｉｎｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、 ８００ｍＱ）と混合した後、４
°Ｃで１時間マグネチツクスターラーで撹拌した。樹脂
をブフナー漏斗に移してから洗浄し、カラム（５ｘ５０
ｃｍ＞に注入し、洗浄液の吸光度が０．２以下になるま
で緩衝液で洗浄した。カラムに吸容した試料をＯ−０，
８ＭＮａＣＱの直線勾配で溶出Ｃ２Ｑ、１０ｍＧフラク
フラクション、約０．４ＭのＮａＣＱ濃度にプロテアソ
ーム活性を得た。 上記で得られた活性フラクションを、ポリエチレングリ
コール６０００（１５％終濃度）により沈澱させ、少量
（２０ｍＱ＞の緩衝液に溶解した後、バイオゲルＡ−１
，５ｍのカラム［バイオゲルへ一’１．５ｍ：バイオ・
ラット社製、４Ｘ８０Ｃｍ］に付し、緩衝液で溶出（２
６ｎ＋Ｑ／分、１０ｍ１２フラクシヨン）して、単一の
ピークからなる活性フラクションを集めた。 次いで、上記で冑たフラクションを緩衝液［１ｒｎＭジ
チオスレイトール及び２０％グリセロールを含む１０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐｌ−１６，８１に対して透
析後、同緩杼ｉ液で平衡化したヒトｏキシアバタイＩ”
（Ｉｌｙｄｒｏｘｙ ＡＤａｔ日ｅ、バイオ・ラッド
社製）の４０ｍＱカラムに付した。カラムを同上緩衝液
で洗浄後、゛１０〜３００ｍＭリン酸塩の直ｆ！濃度勾
配にて溶出（４００ｍＱ、４ｍＱフラクション）した。 活性はリン酸塩濶度約２２０ｍＭの位置に溶出された。 更に、上記で１７だ活性フラクションを、緩衝液で平衡
化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（ｌｌｅｐａ
ｒｉｎ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ、ファルマシ
ア ファイン ケミカルズ社製）の２０ｍＱカラムに付
し、吸光度（２８０ｎｍ）が、ベースラインに戻るまで
緩衝液で洗浄した。Ｏ−０，４Ｍ ＫＣＱの濃度勾配
にて溶出（４００ｍＱ、４ ｍＱフラクション）して、
約１００ｍＭのＫ ＣＱ Ｗ度の位置に活性を溶出させ
た。 上記で１ｑた活性フラクションを、緩衝液Ｌ１ｍＭジチ
オスレイトール及び２０％グリセロールを会む２５ｍＭ
トリス・ＨＣＱ緩衝液、ｐＨ７，５］で平衡化したモノ
＝Ｑカラム［ＨＯｎＯ−Ｑ。 ファルマシア ファイン ケミカルズ社製、１Ｘ１０Ｃ
ｍ］に付し、高速液体クロア１〜グラフイーシステム［
ＦＰＬＣ−システム、ファルマシア ファイン ケミカ
ルズ社製］により溶出（１ｍＱ／分、０−０．８Ｍ
ＫＣＱ）Ｌ、た。 かくして目的の均質なヒトプロテアソームを、ＫＣＱ溌
度が約３４０ｍＭ付近に溶出させた。 実施例 ２ 鶏プロテアソーム、アフリカッメガエルプロテアソーム
及び酵母プロテアソームの製造 上記実施例１に準じて、鶏の肝臓組織から所望の鶏プロ
テアソームを得た。 また、前記山中等の文献に記載の連続クロマトグラフィ
ーに準じて、アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ １
ａｅｖｉｓ）卵巣及び酵母菌（Ｓ。 ｃｅｒｅｖ ｉ ｓ ｉ ａｅ ）から、それぞれアフ
リカッメガエルプロテアソーム及びｌプロテアソームを
得た。 実施例 ３ （１）抗プロテアソーム抗体の製造 ウインベリイら（Ｗｉｎｂｅｒｒｙ ａｎｄ Ｈｏｔｔ
ｅｒ）の方法［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２５２
．７７９６−７８０１（１９’７７）］に準じて、前記
実施例１及び２で（ｑだ各プロテアソームに対する抗体
（ポリクローナル抗体）を次の通り製造した。 即ち、上記プロテアソームの各５ｍ（］を等量のアジュ
バント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊ
ｌＪＶａｎｔ：デイフコ社製）に乳化し、これをそれぞ
れ白兎（２，５ｋｑ、ＩＩｆｌｔ）のフットパッド（ｆ
ｏｏｔ−ｐａｄ ）及び背部に注射した。４週間後、こ
の半開をブースター投与し、更に１週間後に同様にブー
スター投与して、供試動物を免疫した。 上記で免疫した各動物より採血して血清を得、該血清よ
りＩＣＩＧ分画を精Ｍ［プロティンＡ−セファ０−ス
アイフイニテイ クロマトグラフィー ： ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ、、 ２旦、７３−７６ （１９７２＞コして
、各プロテアソームに対する抗体を得た。 （２）モノクローナル抗体の製造 実施例１及び２で得た本発明プロテアソームのそれぞれ
に対するモノクローナル抗体を以下の通り製造した。 即ら、プロテアソームの１００μｑを含有するリン酸緩
衝液食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７，４＞溶液５００μＱを、
等ωのフロイント・アジュバントと混和し、懸濁させた
。得られた懸濁液をプロテアソーム２０μｑ含有分だレ
プ取り、ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下投与した。以後、２
週間目に同波の２０μｑ含有分を皮下に投与した。更に
２週間後、生理食塩水に溶解させた精製プロテアソーム
の２００μｑ含有分を皮下投与し、この最終投与の３８
接に、供試動物から稗臓を摘出し、稗細胞をＲＰＭＩ−
１６４０培地で３回洗浄した。 一方、マウス骨髄腫細胞株Ｐ ３ Ｕ １ Ｉ Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ丁ｏｐｉｃｓ ｉｎ ）ｌｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏａｙ ａｎｄ ｒｍｍＵｎｏｌｏａｙ、８ １
。 １−７ （１９７８）］を、上記と同様に洗浄後、その
４Ｘ１０７個と上記牌細胞２Ｘ１０Ｂ個とを、５００ｍ
Ｑ遠心管に入れて混合した。２００Ｇ、５分間遠心分離
後、上清をパスツールピペツ１−で除去した。３７°Ｃ
に保温したポリエチレングリコール１５００（ベーリン
ガーマンハイム山之内社製）５０ｗ／ｖ％を含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地２ｍ１２を１分間を要して滴下し、次
いで３７°Ｃに保温した牛胎児血清（Ｆｅ２）を含まな
いＲＰＭＩ−１６４０培地１戒を加えて１分間放置後、
更に２ｍＱを加えて２分間放置し、その後３７℃に保温
した１５％ＦＣ３，０，０５力価／Ｑのストレプトマイ
シン、６００００Ｕ／ＱのペニシリンＧカリウム、５４
ｍＭＱのゲンタマイシン及び１ｍＭピルベーｌへを含有
するＲＰＭＩ−１６４０（以下これを［完全ＲＰＭＩＪ
という）８＋ｎＱを加え、２００Ｇで５分間遠心分離し
た。上清を除去し、３７℃に保温した完全ＲＰＭＩに、
牌細胞２×１０’個／ｍＱとなるように懸濁させ、２４
穴マイクロプレート（コースタ−社製）に１．ＯｍＱず
つ分注し、３７°Ｃで５％炭酸ガスインキュベーター内
で培養した。２４時間後、１．０Ｘ１０’Ｍヒポキサン
チン、４．ＯＸｌｏ−７Ｍ７ミノプテリン及び１ 、６
Ｘ １０’Ｍチミジンを会む完全ＲＰＭＩ培地（以下こ
れをｒＨＡ下培地」という）１、ＯｍＱを各ウェルに添
加し、以後、上清の半分を第３、第５及び第７日日にそ
れぞれ新しいトＩＡＴ培地に代え、第９日日に同様に上
清の半分を１ 、 ＯＸ １０’Ｍヒボキサンチン及び
１．６×１０−５〜１チミジンを含む完全ＲＰＭＩ培地
（以下これをｒＨＴ培地」という）に代えた。同様に第
１２．１５．１８及び２１日８に上清の半分をＨＴ培地
に代え、第２４日日に上清の半分を完全ＲＰＭＩ培地に
代えた。以後、この完全ＲＰＭＩ培地で増殖維持した。 かくして得られるハイブリドーマを、限界希釈法により
クローニングした。即ち、ハイブリドーマ２．５×１０
個／ｍＱ、ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞４Ｘ１０’個／
ｍＱとなるように完全ＲＰＭＩ培地に調整し、これをハ
イブリビーフ５個／ウェルになるように９６ウエルのプ
レートに撒き培養した。増殖してくるハイブリドーマを
更に同様の操作によりハイブリドーマ０．５ｆ［Ｎ／つ
１ルとしてクローニングした。 目的の抗体を産生ずるクローンの検索は次の通り行なっ
た。即ち、精製プロテアソーム及び生血清アルブミン（
ＢＳＡ）をそれぞれプレートに不溶化した９６穴プレー
トの各ウェルに、り［１−ユング中の培養上清５０μＱ
を入れて、室温、振盪下に１時間反応させた。反応後、
蒸留水で未反応物を洗浄し、パーオキシダーゼ標識抗マ
ウスＩＱＧ（カッベル社製）の６０００倍希釈液１００
μＱづつを各ウェルに入れ、室温、振盪下に３０分間反
応させた。更に未反応物を蒸留水で洗浄除去し、０．０
１５％Ｈ２０２水溶液中に２．５ｍ（Ｊ／ｍＱの濃度で
溶解さぜたＯ−フェニレンジアミン溶液１００ｕＱづつ
を入れ、室温で１５分間静首反応させた。その後、２
Ｎ Ｈ２Ｓ ０４１００μＱ８加え、反応を・停山さ
せ、発色したマイクロプレートをマイクロリーダー［タ
イターデックマルチスキャン（Ｔｉｔｅｒｔｃｋ Ｍｕ
ｌｔｉｓｋａｎ聞Ｃ）、フローラボラ１へリーズ（Ｆｌ
ｏｗ Ｌａｂｓ、 ＵＳＡ）社製］を用いｒ４９２ｎｍ
で測定したつ 上記方法により、ヒトプロデアソ〜ムにのみ特異反応性
を示す目的の抗体産生クローンを得た。 上記で選別された抗体産生クローンの内のひとつは、工
業技術院微生物工業技術研究所に、ｒＯＡＬ Ｉ−基
質ＷＰ−１Ｊなる微生物の表示にて、微工研菌奇第９８
３８号（ＦＥＲ）Ｉ Ｐ−９８３８）として奇託されて
いる。 上記クローンＮｏ、ＯΔＬ ｌ−１へ４ＷＰ−１を、
完全ＲＰＭＩ培地にて、５％炭酸ガスインキュベーター
中で、３７°Ｃにて４８時間培養し、培谷液勺遠心分離
（３０００ｐｐｍ 、１０分間）シテ、目的のモノクロ
ーナル抗体を倉む培養上清を（７だ。 （３）モノクロ−太ル抗体クラスの特定上記（２）で１
７だモノクローナル抗１ホｔ、１；ＩＱＧ＋クラスに屈
していた。これはラットＬツクローナルタイピングキッ
ト［゛ンイルズ（ＭｉｌｅｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社
製］を利用して確認された。 （４）モノクローナル抗体の精製 前記（２）τ′得たクローンＮＯ，ＯＡＬ ｌ−基質
ＷＰ−１の１ Ｘ １０７個をＲＰＭＩ−１６４０培地
に懸濁させ、ヌードマウス又はヌードラッ１〜に腹腔内
投句した。２−３週間後、蓄積された腹水８採取して、
ヒ１ヘプロテアソーム抗体を含む腹水を（Ｕだ。その抗
体濃度は約０．２へ一５ｍＭｍＱであった。 上記及び前記（２）で１５？た各培養上清をＰＢＳで２
倍に希釈したものを、プロティンΔカラムに付すことに
より精製抗ヒトプロテアソーム抗体を得た。 （５）不溶化抗体の調製 上記（４）で得た精製抗ヒトプロテアソーム抗体を０．
１５Ｍ ＮａＣＱ及び０．０５％ＮａＮ３を含む５０
ｍＭ ＰＢＳ （ＤＩ−１７，４＞にて５μｇ蛋白貿
、／ ｍＱに調製した。 一方、ポリエチレンビーズ（セキスイ化学工業社製、直
径４ｍｍ）１万個を、３０％エタノールを含む１／１０
０ＯＮ ＮａＯＨ水溶液でよく洗浄し、更に１．／１
００ＯＮ ＨＣＱ水溶液で洗浄後、蒸留水で充分に洗
浄した。 上記抗体溶液１００ｍ１２に、上記ビーズ８００個を加
え、２時間撹拌し、次いで４°Ｃ下で一晩放置した。ビ
ーズを濾過し、生理食塩水で洗浄後、０．５％結晶ＢＳ
Ａ （生化学工業社製）を含む５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐ
Ｈ７，４＞中で２時間撹拌し、更に４°Ｃ下で一晩放置
した。ビーズを枦取し、充分に洗浄した不溶化抗体を得
た。 （６）標識抗体の調製 前記（４）で得た精製抗体１００μｑを０．１Ｍホウ酸
緩衝液（ｌＩ８．’２）、０．１’ｍ２に溶かした溶液
に、Ｎａ １２５Ｉ （ＮＥＮ社製）の１ｍＣ１を加え
た。ヨードゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ； Ｐｉｅｃｅ社’Ｉ
）２ｍ（？／ｍＱのジクロルメタン溶液２０μＱをガラ
ス試験管に入れ、窒素ガス気流下に溶媒をとばして乾燥
し、この試験管に上記抗体溶液を加え、水冷下に５分間
静置して反応させた。得られた反応物を別の試験管に移
し、反応を停止させた後、グル濾過［セファロースＣＬ
−６８、溶出液＝０．１５ＭＮａＣＱ、０．１％ＢＳＡ
及び０．０２％ＮａＮ３を含む５０ｍＭリン酸緩衝液］
し、放削活性のピークに一致するＩＣＪＧ分画を採取し
て、１２５Ｉ−標識抗体を得た。該ヒトプ１」テアソー
ム抗体の反応性は、精製ヒトプロテアソームを用いて試
験された。 また、上記の仙に、クロラミンＴ法（ＮａｔＬｌｒｅ。 １９４．４９６ （１９６２））及びポルトンハンター
法ＣＢｉｏｃｈｅｍ、 、Ｊ、 、旦９，１１４ （１
９６３））に従っても、それぞれ良好な１２５Ｉ−標識
抗体を１７だ。 （７）パーオキシダーＬ標識抗体の調製前記（４）で得
た精製抗ヒトプロテアソーム抗体の１０ｍｇを０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐｌ−１６，８＞１−に溶解し、１０ｎ
＋ｒ＋、／ｍＱパーオキシグーゼの同緩衝液を加えて緩
かに撹拌した。１％ゲルタールアルデヒド溶液５０μＱ
を滴下し、室温で２時間反応させ、反応混合物を生理食
塩水に対して、４°Ｃ下に一昼夜透析して、パーオキシ
ダーゼ標識抗体を得た。 また、上記以外にも過ヨウ素酸架橋法（Ｊ。 旧ｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、 ２２．１０
８４−１０９１（１９７４））、マレイミド架橋法（Ｊ
。 Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、 ７３ 、
２３５−２３７（１９７５））、イソシアネ−１へ架橋
法（Ｊ。 旧ＳｔＯＣｈｅｍ、 ｃｙｔｏｃｈｅｍ、 、 ２ユ、
２３３−２４０（１９７３））及びベンゾキノン架橋法
（Ａｎｎ。 Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 １２７ｃ、 １９７−２０８（
１９７６））に従っても、それぞれ良好なパーオキシダ
ーゼ標識抗体を得た。 更に、パーオキシダーゼの代りに、β・Ｇ−ガラクトシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ、マレートデヒドロ
ゲナーし、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコ
ース酸化酵素、アセチルコリンエステラーゼ、グルコア
ミラーゼ、リゾチーム等の酵素を用いても標識抗体が得
られた。 （８）蛍光標識抗体の調製 前記（４）で得た精製抗ヒトプロテアソーム抗体の１０
ｍｇを０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５＞１ ｍＱに
溶解し、１００μｑ／ｍＱＦ ＩＴＣの同緩衝液を滴下
し、室温で１時間撹拌した。その後、０．００５Ｍのリ
ン酸緩衝液で一昼夜透析後、ＤＥＡＥ−セファロースを
用いてイオン交換により’ＩＲ’Ａして、ＦＩＴＣ標識
と１〜プロテアソ一ム抗体を得た。 また、上記の他にＲＩＩＣＱテトラメチルローダミン
イソチオシアネ−１〜）を用いても、同様の方法により
良好’、；ＲＩＴ−Ｃ標識ヒトプロテアソーム抗体が得
られた。 〈プロテアソームの’４：ｊ性試験〉 ■ 活性試験 プロテアソームは、細胞内に不活性型で存在しており、
熱処理及びトリプシン連理を含む種々の処理によって活
性化される。 本発明プロテアソームにつき、以下の通りポリーＬ−リ
ジンによる活性化を試験した。 尚、プロテアーゼ活性は前記した方法に従い、プロテア
ソームの各５μｑを用いで測定した。即ち、プロテアソ
ーム５μｑ、５０ｍＭトリス・ＨＯ２（ｐＨ８，０）
、１ｍＭジヂ７ＪスＬ／イ１〜−ル、１０μｑの阜貿及
び［３日］−カセイン（２５０００ｃｐｍ ）からなる
試験液２００ｔＩＱ’：調製し、これにポリーＬ−リジ
ン［分子量＝３４０００、シグマ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ
ｍ、Ｃｏ、）礼’ｌ］を終濃度か０．５ｍＭ＋ｎＱとな
るように加えて、３７°Ｃ下に１時間反応させ、次いで
２ｍＭｍＱのＢＳＡを含む１０％トリクロロ酢酸０．８
ｍ（２を加えて反応を停止させた後、醗可溶性分画の放
射能を測定した。 活性は、分解率（％／ｈ）で表わし、３回の試験結果の
平均士Ｓ、Ｄ’ｒ示した。 各プロテアソームを用いて１！７られた［３１−（］−
カカイ２９解活性（％／ｈ）の結果を、下記第１表に示
す。 第１表 ■ 合成基質に対する酵素活性とその至適ｐＨ合成基買
としてＳｕｃ −Ｌ ｅｕ −Ｌｅｕ−Ｖａｌ −Ｔｙ
ｒ−ＭＣＡ、Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｃ＋−ＭＮ
Ａ及びＣｂｚ−Ｌｅｕ −Ｌ ｅｕ −Ｇｌｕ−１ＮＡ
をそれぞれ用いて、上記■に記載の方法に準じて本発明
プロテアソームの酵素活性及びその至適ＤＨを測定した
。 尚、緩衝液としては０．１Ｍ＋−リス・ＨＣＱ緩衝液を
用い、試験液のｐＨは直接ｐ［＝１メーターを用いて測
定した。各１））−１値にあけるプロテアソーム活性（
但し、最大分解率）は、上記■に４Ｉじて測定した。但
し、合成基質濃度は０．２ｍＭとし、反応は１０分間を
要して行ない、反応停止は１０％ＳＤＳを１００ｕ９添
加し、更に０．１１Ｖ１トリス−１−ＩＣＱ （ＤＨ９
，０＞の２ｍ□を加えてから、遊離してきたＭＣＡ、Ｍ
ＮＡ又はＮＡＰそれぞれ蛍光光度ｈ１にて測定した。 １ｑられた結果を第１図に示す。 図において、縦軸は活性（最大％）を、横軸は１）Ｈを
それぞれ示し、図中の各結果を示すラインはそれぞれ以
下のものである。 〇−〇：ヒトプ口テアソーム ローロ：ラッｌ〜プ［１テアソーム △−△：鶏プ自テアソーム 一：アフリカツメガエルプロデアソーム×−×：酵母プ
［１テアソーム 第１図より、プロ７アソームは、Ｃ−末端に酸斗、塩基
性及び中性の疎水性アミノ酸をイ１づる３タイプの上記
合成基質のいずれをも分解できる酵素活性を右すること
が認められ、その至適ｐＨは、各合成基質につき、次の
通りと確認された。 Ｊ３ＵＣ−Ｌｅｕ−１−ｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ
］ヒトプロテアソーム ：ｐＨ８，４〜８．６鶏プロ
テアソーム ：ｐＨ８，０〜８．５アフリカッメガ
エルプロ：Ｄｔ−（８，４〜８．８テアソーム 酵母プロテアソーム ：ｐＨ８，４〜・８．７［Ｃｂ
ｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＮＡ］ヒトプロテアソ
ーム ：ｐＨ９，８〜１０．１鶏プロテアソーム
：ｐＨ９，６〜１０．１アフリカッメガエルプロ：Ｉ
）Ｈ９，６〜１０．５テアソーム 酵母プロテアソーム ：１）８９．６〜１０．０［Ｃ
ｂＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＮＡ］ヒトプロテアソ
ーム ：１）Ｈ８，４〜８．６鶏プロテアソーム
：ｐｔ−（８，４〜８．７アフリカツメガエルブロ：
ｐＨ８，９〜９．２テアソーム 酵母プロテアソーム ：ｌ１８．４〜８．８■ 阻害
剤による活性阻害 ２μ９のプロテアソームを種々のプロテアーゼ阻害剤と
室温で１時間反応させた後、上記■と同様にして、至適
ＩＩ下に、合成基質に対する分解率を測定して、阻害剤
による活性の阻害率（％）を求めた。尚、試験したプロ
テアーゼ阻害剤及びその使用濃度は、下記の通りでおる
。 Ａ：ロイペプチン ５０ ｕ ＣＪ ／ ｍ
ＱＢ ： キモスタチン ５０ｕｇ／ｍＱＣ
：Ｎ−エチルマレイミド １０ｍＭＤ：フェニルメ
タンスルフォニル フルオリド（ＰＭＳＦ＞ １０ｍＭＥニジイソプ
ロピル フルオロ フォスフェート（Ｄ［：Ｐ） １ｍＭＦ：ヘミン
５０μＭヒトプロテアソームを用い
てｊｑられた結果を下記第２表に示す。 第２表 上記第２表よりプロテアソームは互いに独立した触媒活
性部位を有していることが明らかでおる。 尚、ヒトプロテアソーム以外の他種プロテアソームにつ
き同一試験を行なった結果、上記第２表と略同様にいず
れも同様の挙動を示した。 〈プロテアソームの物理学的性質〉 プロテアソームの各種物理学的性質を以下の通り調べた
。 即ち、本発明プロテアソームのそれぞれにつき、沈降係
数（Ｓ２ｏ１ｗ）、拡散係数（Ｄ２ｏ１ｗ）、等電点（
ＰＩ）及び分子楕円率（［θ］２２ｏｏＩＩｌ）を、山
中等の文献［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２６１
。 ７１５２０４−１５２０７ （１９８６）］に記載の沈
降速度法（Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｖｏｌｅｃｉ
ｔｙ） 、要件性光散乱法（Ｑｕａｓｉ−ｅｌａｓｔｉ
ｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）、等電点分画
（ｌ５ｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ： Ｉ
Ｆ Ｆ ）及び円偏向二色性（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄ
ｉｃｈｒｏｉｓｍ） ｋ：従ッテ測定した。 １ｎられた結果を第３表に示す。 第３表 また、上記第３表に示した沈降係数及び拡散係数からス
ヘエドベリの式（ＳＶｅｄｂｅｒｇ’Ｓ ｅＱｕａｔｉ
ｏｎ）に基づき分子！（Ｍ、Ｗ、）を算出し、拡散係数
から同様にしてス１−−クス半径（Ｒｈ）を算出した。 之等の結果と共に、各プロテアソームの吸収スペクトル
値［極大吸収（λｍａＸ ） 、２８０ｎｍにＪ３ける
吸光係数（Ｅ １％）］を第４表に示す。 Ｃｍ 第４表 尚、上記第４表の吸収スペクトルにおいて、２６０ｎｌ
ｌｌには吸収のピーク及び眉が認められず、本発明のプ
ロテアソームには、核酸成分が含まれていないと推定さ
れた。 〈プロテアソームのアミノ酸分析〉 山中等の文献［Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２６１
゜１５２０４〜１５２０７ （１９８６）］に記載の方
法と同−条１４［により、本発明プロテアソームのアミ
ノ酸組成比（−Ｅル％）を求めた。 結果を第５表に示す。 第５表 但し、表中ＮＤは検出されないことを示す。 〈プロテアソームの形状〉 ヒトプロテアソームを５０μＣＪ／ｍＱ緩衝液に調製し
、１〜３％ウラニル酢１（ｐＨ４，５）で支持膜上に逆
染色して、電子顕微鏡（日立社製、Ｈ７０００、Ｘ５０
０００）で観察した。 複数個のプロテアソーム分子の上記顕微鏡観察結果を第
２図に示す。 第２図より、ヒトプロテアソームは分子の中央に凹を持
つ対称形の円盤状に観察されることが明らかであり、こ
れは前記物理学的性質によく対応していた。 他種プロテアソーム、即ち鶏プロテアソーム、アフリカ
ッメガエルプロテアソーム及び酵母プロテアソームにつ
いて同様の観察を行なった結果、これらもまた略同様の
形状を有することが確認された。 〈プロテアソームの免疫学的性質〉 ■ ポリクローナル抗体の反応性 前記実施例３− （１）で得た各抗体（ポリクローナル
抗体）を用いて、２等抗体と本発明の各プロテアソーム
との反応性を、オフタロニー法［０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎ
ｙ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓ
ｉｓ ：Ｔｉｔｌｅ ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（
Ｗｅｉｒ、Ｃ，、ｅｄ、”）、ｐり６５５−６８８ 、
ＢｅｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ、０ｘｆｏｒｄ］に従って、以下の通り
試験した。 即ち、１０μｑのプロテアソームをセンターウェルに、
７μＱの抗体をサイドウェルに、それぞれ置き、給湿機
中、至温で２日間反応させた。リン酸塩緩衝食塩水（Ｐ
ＢＳ）で、緩やかに撹拌しながら４日間洗浄俊、蛋白染
色（クーマシー ブリリアント ブルー（Ｃｏｏｍａｓ
ｓｉｅ ｂｒｉｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ）、ＣＢＢ＞を行
なった。 各プロテアソームを用いて得られた結果を第３図（Ａ−
Ｅ ）に示す。 第３図Ａ−Ｅにおいて、センターウェル（各図中央部Ｅ
〉に置かれたプロテアソームはそれぞれ以下の通りであ
る。 Ａ−・・ヒトプロテアソーム（ｔｌｕｍａｎ Ｌｉｖｅ
ｒ）Ｂ・・・ラットプロテアソーム（Ｒａｔ Ｌｉｖｅ
ｒ）［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２６１． １５１
９７−１５２０３（１９８６）］ Ｃ・・・鶏プロテアソーム（Ｃｔ＋１ｃｋｃｎ Ｌｉｖ
ｅｒ）Ｄ・・・アフリカッメカエルプロテアソーム（Ｘ
ｅｎｏｐｕｓ Ｌｃａｖｉｓ ０ｖａｒｙ）Ｅ −ｕ
ｆＥプロテアソーム（Ｙｅａｓｔ）また各図のサイドウ
ェルに置かれた各抗体はそれぞれ以下のものでおる。 １・・・抗ヒトプロテアソーム抗体 ２・・・抗ラットプロテアソーム抗体［同上文献］３・
・・杭用プロテアソーム抗体 ４・・・抗アフリカッメガエルプロテアソーム抗体５・
・・抗酵母プロテアソーム抗体 ６・・・正常ウサギ血清 第３図より、前記実施例３− （１）で得た抗体は、対
応する種のプロテアソームにのみ反応性を有し、他の種
のプロテアソームとは交叉反応性を示さず、更に、各プ
ロテアソームは明らかに相互に免疫学的に相違している
ことが判る。 ■ プロテアソームザブユニットの反応性各プロテアソ
ームのサブユニツｉ〜成分の免疫学的反応性を、以下の
通りイムノプロット分析を用いて試験した。 即ち、各プロテアソーム３５μＱを、５ＤＳ−ＰＡＧＥ
で電気泳動（後記電気泳動法の項参照）さじだ後、セミ
ドラッグエラクトロプロツタ−［（Ｓｅｍｉ Ｄｒｕｇ
Ｅｌａｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｒ）、５ａｒｔＯｒ’ｉ
ＵＳ社製］を用いて、デュラポア−（ＤＩＪｒａｐＯｒ
ｅ）膜［ミリポアー（Ｈｉ ｌ ｌ １ｐｏｒｅ）社製
］へ電気的に移し、その膜を３％牛血清で処理した後、
−次抗体として各抗プロテアソーム抗体１０μｇ／ｍＱ
を作用させ、次いて二次抗体として０．２５μＱｉ／ｍ
Ｑの１２５１−プロティンＡを反応させ、反応物をオー
トラジオグラフィーにより分析した。 各抗体による交叉反応性を求めた結果を第４図（Ａ−Ｆ
）に示す。 第４図へは蛋白質染色（ＣＢＢ）を示し、同Ｂは抗ヒト
プロテアソーム抗体を用いた結果を、同Ｃは抗ラットプ
ロテアソーム抗体を用いた結果を、同りは杭用プロテア
ソーム抗体を用いた結果を、同Ｅは抗アフリカッメガエ
ルプロテアソーム抗体を用いた結果を、同Ｆは抗酵母プ
ロテアソームを用いた結果を、ぞれぞれ示している。 また、図における各レーンは次の試別を示す。 レーント・・ヒトプロテアソーム レーン２・・・ラットプロテアソーム レーン３・・・鶏プロテアソーム レーン４・・・アフリカッメガエルプロテアソームレー
ン５・・・酵母プロテアソーム 第４図より、各プロテアソームのサブユニツ１へ成分は
、主として同種酵素に対するポリクローナル抗体に対し
てはいずれもよく反応するが、他種酵素に対してはぞの
反応性が限定されていることが判る。また種間で互いに
交叉する成分も認められ、ザブユニット成分の部分的な
構造は進化的に保存されていることが判る。 ■ モノクローナル抗体の反応性 （１）前記実施例３− （２）に従って調製された４種
類のヒトプロテアソームに対するモノクローナル抗体（
Ｎｏ、２−１７．２−２１．２−２４及び４−３と１−
る〉を用い、ＥＩＩＳＡ法に従い、之等各抗体と本発明
の各プロテアソームとの反応性を次の通り試験した。 即ち、精製ヒトプロテアソーム２００μΩを固定したイ
ムノプレー１へに、各モノクローナル抗体５０ｔｌＱと
、５０ｍＭリン酸緩衝液［０，４％ＢＳＡ、０．０２％
ツイーン２０ （Ｔｗｅｅｎ２０）及び０．０５％チメ
ロザール含有、ｐＨ７，４］５０μＱとを加えて室温で
２時間（辰盪した後、脱イオン水２５０μ２で３回洗浄
した。次いで、酵素標識抗マウス免疫グロブリン希釈液
［Ｚｙｍｅｄ ｔｌｒｐｏ標識ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍ
ｏｕｓｅ ＩｇＡ、 ＩｇＧ、 ＩｇＭ（Ｈ，Ｌ）
の３０００倍希釈液］の１００μＱを加えて、室温で２
時間娠盛した後、脱イオン水２５０μＱで３回洗浄した
。 更に、クエン酸−リン酸緩衝液（１）Ｈ５，０＞の０．
０２５％０−フェニレンジアミン溶解液に使用直前にそ
の５０１１１１２に対して１０ｔｌＱの割合で３０％Ｈ
２０２を添加して調製した基質溶液１００μＱを加えて
、室温で１０分間静置後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ，１１００
μＱで反応を停止させ、４９２１ｍで吸光度を測定した
。 結果を第５図に示す。図において縦軸は吸光度（４９２
１１ｍ＞を、横軸は希釈倍率（ｌｏｇ表示）ヲ示す。 該図より、各モノクローナル抗体の反応性は、抗体Ｎｏ
、２１７＞４−３＞：２−２１ ＞２！−２４の順でお
ることが判る。 （２）上記（１）と同一の４種のヒトモノクローナル抗
体について、前記■に示したポリクローナル抗体の−ｒ
ムノブロツ１へ分析と同様にして、之等各抗体と本発明
の各プロテアソームとの反応性を試験した。但し、−次
抗体としては、前記実施例３− （２）に従い作成され
たモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞の
培地を使用した。 ｊｑられた各抗体による交叉反応性結果を、第４図と同
様にして第６図に示す。 第６図Ａは蛋白質染色（ＣＢＢ）を示し、同Ｂはヒトモ
ノクローナル抗体Ｎｏ、２−１７を用いた結果を、同Ｃ
はヒトモノクローナル抗体Ｎ０．２−２１を用いた結果
を、同りはヒトモノクローナル抗体Ｎ０．２−２４を用
いた結果を、同Ｅはヒトモノクローナル抗体ＮＯ６４−
３を用いた結果をそれぞれ示している。 また、図における各レーンは次の試料を示す。 レーン］・・・ヒトプロテアソーム レーン２・・・ラットプロテアソーム レーン３・・・鶏プロテアソーム レーン４・・・アフリカッメガエルプロテアソームレー
ン５・・・酵母プロテアソーム 上記第６図より、試験した４種のモノクローナル抗体は
、いずれもヒトプロテアソームの分子量３万のサブユニ
ット成分と強く反応することが判る。尚、モノクローナ
ル抗体Ｎ０．２−１７とＮｏ。 ４−３は同じ分子量のラットプロテアソーム成分とも、
またモノクローナル抗体ＮＯ，２−１７とＮｏ、２−２
４は鶏プロテアソームとも各々交叉反応性を示す。この
ことは之等のモノクローナル抗体は類似のサブユニット
成分との反応性を示すものの、それらのエピトープは互
いに箕なっていることを示している。エビ１−一プの異
なるモノクローナル抗体は、免疫学的定量化におけるキ
ット化のだめに有用である。 〈プロテアソームの電気泳動〉 ポリアクリルアミド スラブ ゲル 電気泳動（ＰＡＧ
Ｅ）をラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ ） （７）方法［Ｎａ
ｔｕｒｅ、２２７，６８０−６８５ （１９７０）］に
従って、ＳＤＳの非存在及び存在下に行なった。 ＳＤＳ非存在下（５％ポリアクリルアミド ゲル、プロ
テアソーム３５μｑ）での蛋白染色（ＣＢＢ）の結果を
第７図に示す。第７図中、各レーンは次の通りである。 レーン１：ヒトプロテアソーム レーン２：ラットプロテアソーム レーン３：鶏プロテアンーム レーン４ニアフリカツメガエルプロテアソームレーン５
：酵母プロテアソーム 第７図より、各プロテアソームは単一のバンドとして泳
動され、その均質性が確認された。尚、同時に測定した
プロテア−Ｕ活性は、上記各バンドに一致して検出され
た。 また、プロテアソームを１％ＳＤＳで変性俊、０．１％
ＳＤＳ存在下で泳動（１５％ポリアクリルアミド ゲル
）した結果を第８図に示す。第８図中、各レーンは次の
通りでおる。 レーン１：ヒトプロテアソーム レーン２：ラットプロテアソーム レーン３：鶏プロテアソーム レーン４ニアフリカツメガエルプロテアソームレーン５
：酵母プロテアソーム 両端のレーン：分子量マーカー蛋白質（ファルマシア
ファイン ケミカフ１１社製）第８図より、各プロテア
ソームは分子量的２２０００〜３３０００に渡る複数の
バンドとして泳動され、このことから各プロテアソーム
は、２等成分からなる複合体（ヘテロ多量体）と認めら
れた。 また、上記泳動パターンはスルフィドリル還元剤（２−
メルカプトエタノール）の存在、非存在にかかわらず、
同様であったことから、プロテアソームにはジスルフィ
ド結合が存在しないものと推定された。 くプロテアソームのクロマトグラフィー分析〉０．５ｍ
ｃ＋のプロテアソームを０．５％トリフルオ０ＦＩ（Ｔ
ＦＡ＞で平衡化したカラム［コスモジル（Ｃｏｓｍｏｓ
ｉ Ｉ）５ Ｃ４−３００：牛丼化学社製、１０ｘ ２
５０ｃｍ］に対し、下記条件にて、逆相高速液体クロマ
トグラフィーを行なった。 システム：ウォーターズ モデル １４１トＩＰＬｃシ
ステム［ウォーターズ社製］溶出：０．５％ＴＦＡを含
むアセ１へニトリルの濃度勾配 流速１ｍＱ／分 フラクション：１ｍＧ検出：吸光
度（Ａ）：Ａ２８００ｍ（第９図中、実線）及びＡ２１
５ ｎｍ （第９図中、破線）各プロテアソームについ
て、得られた溶出パタ−ンの結果を第９図に示す。該図
において、（１）はヒトプロデアソームを、（２）はク
ツ１〜プロテアソームを、（３）は鶏プロテアソームを
、（４）はアフリカッメガエルプロテアソームを、（５
）は酵母プロテアソームを、（６）はブランク ランの
結果をそれぞれ示す。 該図より、本発明の各プロテアソームの構成成分の溶出
パターンは、明確に区別されるものであることが明らか
である。
体をハイブリドーマを利用して製造する場合には、細胞
融合に使用する形質■［胞肝細胞との適合性を考慮して
選択するのが望よ（〕く、一般にはマウス、ラット等が
有利に用いられる。 上記免疫は常法により、例えば上記免疫原を哺乳動物に
静脈内、皮内、皮下、腹腔内注則等により投与すること
により実施できる。より具体的には、免疫原を所望によ
り通常のアジュバン１〜と併用して、数回（追加免疫ニ
ブ−スター）投与し、総投与吊が、例えばマウスでは約
２００〜２５０μｇ／個体程度とすることにより行なわ
れる。 ポリクロナル抗体の採取は、例えば上記最終投与の１〜
２週間経過後、免疫された哺乳動物の血清を分離するこ
とにより行ない得る。 またモノクロナル抗体の製造に用いられる免疫細胞とし
ノでは、上記最終投与の約３日後に摘出した牌臓細胞を
好適に使用できる。該免疫細胞と融合される他方の親細
胞としての形質細胞腫細胞としては、既に公知の確立さ
れた種々の細胞株、例えばＰ３ （ｐ３／Ｘ６３−Ａｑ
８） ［Ｎｃｔｕｒｅ、 ２５６ 、４９５−４９７
（１９７５）］ 、Ｐ３−Ｕ １ ［Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 ８１．１−７（１９７８
）］ 、ＮＳ −１［Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、
６ 、５１１−５１９（１９７６）］、ＭＰＣ−１１
［Ｃｅ１ｌ 、 ８ 、４０５−４１５（１９７６）］
、Ｓ Ｐ ２１０ ［Ｎｅｔｕｒｅ 、 ２７６ 、
２６９−２７０（１９７８）］ 、ＦＯ［Ｊ、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、 Ｍｅｔｈ、、３５．１−２１（１９８０）］
、Ｘ６３．６．５．３［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２
３ 。 １５４Ｂ−１５５０（１９７９月、Ｓ １９４ ［Ｊ、
Ｅｘｐ、 ｌｅｄ、 、 １４８ 。 ３１３−３２３（１９７８）］、Ｒ２１０［Ｎａｔｕｒ
ｅ、２７７ 、１３１−１３３［１９７９）］等の母髄
腫細胞等を例示できる。 ハイブリドーマ法によるモノクロナル抗体の製造手法は
公知であり、例えばマイルスタイン（Ｍｉ １ｓｔｅｉ
ｎ）等の方法［）ｉｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ！
ｏｇｙ。 Ｖｏｌ、７３． ｌ）り３．（１９８１）１等に準じて
行なうことカテきる。尚、融合反応はポリエチレングリ
ニ】−ル（ＰＥＧ） 、センダイウィルス（ＨＶＪ）等
を用いる方法や電気処理（電気融合〉による方法等を適
宜採用することができる。また、ハイブリドーマ法に限
らず、例えば上記免疫細胞をエプスタイン バー ライ
スル（ＥＢウィルス）等によって、不滅化（Ｉｍｍｏｒ
ｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）する等の方法を採用することも
できる。 かくして得られるハイブリドーマ又は不滅化細胞は、通
常の限界希釈法に従い単一クローン化に供され、目的と
する抗体産生株を選択し、収得することができる。 該目的抗体産生株の検索は、例えばエライザ（ＥＬＩＳ
Ａ）法［Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、、 ７０゜４１
９−４３９ （１９８０）］、プラーク法、スポット法
、凝集反応法、オフタロニー法、放射免疫測定法（ＲＩ
Ａ）等の一般に抗体の検出に採用される種々の方法［ハ
イブリドーマ法とモノクローナル抗体、株式会社Ｒ＆Ｄ
プラニング発行、３０〜５３頁、昭和５７年３月５日］
に従い実施することができ、この検索には前記した免疫
原が利用できる。 かくして得られる一Ｌツクローナル抗体を産生する細胞
は、通常の培地で継代培養でき、また液体窒素中で長期
保存できる。 上記クローンからの抗体の採取には、該クローンを常法
に従って培養してその培養上清として得る方法や、上記
クローンをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖
させ、その腹水として得る方法等が採用され得る。前者
の方法は高純度の抗体を得るのに適しており、後者の方
法は大量生産に適している。 かくして得られる抗体は、更に塩析、グル濾過法、アフ
ィニティクロマトグラフィー等の通常の手段により精製
することができる。 該抗体の利用によれば、例えばアフィニティクロマトグ
ラフィー等の免疫学的手法による、前記した各種プロテ
アソームの精製が可能である。 更に該抗体の利用によれば、当該プロテアソームの各種
免疫学的手法による測定が可能である。 殊に本発明者の研究によれば、癌患者の体液中にはプロ
テアソームが多Ｉｎに存在し、その子は健常人等の非癌
患者に比し、診断上有意な顕若性を有することが見出さ
れている。従って、上記プロテアソームの測定技術の提
供は、癌のスクリーニング及び／又は診断に極めて有用
である。 尚、かかる癌のスクリーニング及び／又は診断のための
、体液中のプロテアソームの測定は、基本的には通常の
免疫検定法、例えばＲＩＡ、酵素免疫検定法（Ｅ ＩＡ
）等に従うことができ、２等各種免疫検定法にａ３ける
操作、手順等としても一般に採用されている各種方法、
例えば競合法、サンドイツチ法、凝集法等をいずれも準
用することができる。 上記検定法において検体として用いられる体液としては
、例えば血液、細胞組ｆＪＩｉ液、リンパ液、胸水、腹
水、羊水、胃液、尿、膵液、髄液、唾液等を例示でき、
之等の内では血液、特に血清又は血漿が好ましい。 かくして測定された被検者のプロテアソームレベルを健
常人の当該レベルと比較することにより、癌のスクリー
ニング及び／又は診断を良好に行ない１ｑる。 上記癌のスクリーニング及び／又は診断を実施するのに
特に便利な方法としては、上記体液中のプロテアソーム
測定用キットを使用する方法であり、該キットは抗プロ
テアソーム抗体を必須成分として調製された抗体試薬を
含有する。該抗体試薬には、グリセロールや牛等の血清
蛋白のような安定化剤及び／又は保存剤を添加配合する
ことができ、Ｍｈ液はキラ１〜の必須成分とは考えられ
ないが、上記測定を実施する際に、ＤＨを４〜８程度と
する各種のものを添加使用することもできる。 発明の効果 （１）本発明によれば、新規なプロテアソームが提供さ
れる。本発明プロテアソームは基質特異性の異なるプロ
テアーゼ群の復合体であって、蛋白質中の酸性、中性及
び塩基性のいずれの部位をも切断できる活性を有してお
り、この点からプロテアーゼ研究史上堰も強力なプロテ
アーゼといえる。しかもその活性発現の調節は分子内部
で行なわれ、血液中のプラスミン等で活性化されるため
、これは例えば血栓融解剤として有用である。また本発
明プロテアソームは、洗剤や化粧料の添加剤としても利
用できる。 （２）本発明によれば、かかるプロテアソームの精製及
び測定に有用な抗プロテアソ〜ム抗体が提供される。 （３）本発明によれば、かかる抗体を用いるプロテアソ
ームの免疫学的精製法及び免疫学的測定法が提供される
。 （４）本発明によれば、体液中のプロテ）ｌソームを測
定することからなる癌のスクリーニング及び／又１は診
断技術が提供される。 実 施 例 以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明ブーるか
、本発明は之等に限定されるものではない。 尚、以下において活性（プロテアーゼ活性）は、田中等
の文献ｆＪ、Ｂ、Ｃ，，２６１（３２）。 １５１９７−１５２０３ （１９８６）］に記載の方法
に従い、［３トｌ］メヂルーカゼインを用いて測定した
。但し、より簡便且つ高感度な活性測定法としては蛍光
ペプチド基質、例えばＳｕｃ−Ｌｅｕ−１−ｅｕ−Ｖａ
ｌ−Ｔ’ｙｒ−ＭＣＡの分解活性を測定する方法もある
。また、プロテアソームの製造行程は、いずれも４°Ｃ
下に行ない、緩衝液としては特記（７，ない限り、１ｍ
Ｍジチオスレイ［ヘール及び２０％グリセロ−・ルを含
む５０ｍＭトリス・）−Ｉ ＣＱ緩衝液（ｐＨ７，５＞
を用いた。 実施例 １ じ１へプロテアソームの製ｊ；５ ヒト肝臓組織２００Ｃｌを３倍容呆の緩衝液［０，１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジヂオスレイトール及び０
６２５Ｍ シュークロースを含む５０ｍＭ １〜リ
ス−ＨＣＱ緩Ｔｈ液、［）８７．５１でホモジナイズ（
Ｐｏｔｔｅｒ Ｅｌｖｅｈｊｅｍ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚ
ｅｒ ）し、遠心分離（１０５０００ＸＣ）、６０分）
して細胞Ｍフラクション（上清）を１９だ。 上記で得た肝臓上清画分を緩衝液で平衡化したファスト
フローＱ−セファ０−ス（Ｆａｓｔ Ｆ！ｏｖ Ｑ−３
ｅｐｈａｒｏｓｅ、 Ｐｈａｒｍａｅｉａ Ｆｉｎｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、 ８００ｍＱ）と混合した後、４
°Ｃで１時間マグネチツクスターラーで撹拌した。樹脂
をブフナー漏斗に移してから洗浄し、カラム（５ｘ５０
ｃｍ＞に注入し、洗浄液の吸光度が０．２以下になるま
で緩衝液で洗浄した。カラムに吸容した試料をＯ−０，
８ＭＮａＣＱの直線勾配で溶出Ｃ２Ｑ、１０ｍＧフラク
フラクション、約０．４ＭのＮａＣＱ濃度にプロテアソ
ーム活性を得た。 上記で得られた活性フラクションを、ポリエチレングリ
コール６０００（１５％終濃度）により沈澱させ、少量
（２０ｍＱ＞の緩衝液に溶解した後、バイオゲルＡ−１
，５ｍのカラム［バイオゲルへ一’１．５ｍ：バイオ・
ラット社製、４Ｘ８０Ｃｍ］に付し、緩衝液で溶出（２
６ｎ＋Ｑ／分、１０ｍ１２フラクシヨン）して、単一の
ピークからなる活性フラクションを集めた。 次いで、上記で冑たフラクションを緩衝液［１ｒｎＭジ
チオスレイトール及び２０％グリセロールを含む１０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐｌ−１６，８１に対して透
析後、同緩杼ｉ液で平衡化したヒトｏキシアバタイＩ”
（Ｉｌｙｄｒｏｘｙ ＡＤａｔ日ｅ、バイオ・ラッド
社製）の４０ｍＱカラムに付した。カラムを同上緩衝液
で洗浄後、゛１０〜３００ｍＭリン酸塩の直ｆ！濃度勾
配にて溶出（４００ｍＱ、４ｍＱフラクション）した。 活性はリン酸塩濶度約２２０ｍＭの位置に溶出された。 更に、上記で１７だ活性フラクションを、緩衝液で平衡
化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（ｌｌｅｐａ
ｒｉｎ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ、ファルマシ
ア ファイン ケミカルズ社製）の２０ｍＱカラムに付
し、吸光度（２８０ｎｍ）が、ベースラインに戻るまで
緩衝液で洗浄した。Ｏ−０，４Ｍ ＫＣＱの濃度勾配
にて溶出（４００ｍＱ、４ ｍＱフラクション）して、
約１００ｍＭのＫ ＣＱ Ｗ度の位置に活性を溶出させ
た。 上記で１ｑた活性フラクションを、緩衝液Ｌ１ｍＭジチ
オスレイトール及び２０％グリセロールを会む２５ｍＭ
トリス・ＨＣＱ緩衝液、ｐＨ７，５］で平衡化したモノ
＝Ｑカラム［ＨＯｎＯ−Ｑ。 ファルマシア ファイン ケミカルズ社製、１Ｘ１０Ｃ
ｍ］に付し、高速液体クロア１〜グラフイーシステム［
ＦＰＬＣ−システム、ファルマシア ファイン ケミカ
ルズ社製］により溶出（１ｍＱ／分、０−０．８Ｍ
ＫＣＱ）Ｌ、た。 かくして目的の均質なヒトプロテアソームを、ＫＣＱ溌
度が約３４０ｍＭ付近に溶出させた。 実施例 ２ 鶏プロテアソーム、アフリカッメガエルプロテアソーム
及び酵母プロテアソームの製造 上記実施例１に準じて、鶏の肝臓組織から所望の鶏プロ
テアソームを得た。 また、前記山中等の文献に記載の連続クロマトグラフィ
ーに準じて、アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ １
ａｅｖｉｓ）卵巣及び酵母菌（Ｓ。 ｃｅｒｅｖ ｉ ｓ ｉ ａｅ ）から、それぞれアフ
リカッメガエルプロテアソーム及びｌプロテアソームを
得た。 実施例 ３ （１）抗プロテアソーム抗体の製造 ウインベリイら（Ｗｉｎｂｅｒｒｙ ａｎｄ Ｈｏｔｔ
ｅｒ）の方法［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２５２
．７７９６−７８０１（１９’７７）］に準じて、前記
実施例１及び２で（ｑだ各プロテアソームに対する抗体
（ポリクローナル抗体）を次の通り製造した。 即ち、上記プロテアソームの各５ｍ（］を等量のアジュ
バント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊ
ｌＪＶａｎｔ：デイフコ社製）に乳化し、これをそれぞ
れ白兎（２，５ｋｑ、ＩＩｆｌｔ）のフットパッド（ｆ
ｏｏｔ−ｐａｄ ）及び背部に注射した。４週間後、こ
の半開をブースター投与し、更に１週間後に同様にブー
スター投与して、供試動物を免疫した。 上記で免疫した各動物より採血して血清を得、該血清よ
りＩＣＩＧ分画を精Ｍ［プロティンＡ−セファ０−ス
アイフイニテイ クロマトグラフィー ： ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ、、 ２旦、７３−７６ （１９７２＞コして
、各プロテアソームに対する抗体を得た。 （２）モノクローナル抗体の製造 実施例１及び２で得た本発明プロテアソームのそれぞれ
に対するモノクローナル抗体を以下の通り製造した。 即ら、プロテアソームの１００μｑを含有するリン酸緩
衝液食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７，４＞溶液５００μＱを、
等ωのフロイント・アジュバントと混和し、懸濁させた
。得られた懸濁液をプロテアソーム２０μｑ含有分だレ
プ取り、ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下投与した。以後、２
週間目に同波の２０μｑ含有分を皮下に投与した。更に
２週間後、生理食塩水に溶解させた精製プロテアソーム
の２００μｑ含有分を皮下投与し、この最終投与の３８
接に、供試動物から稗臓を摘出し、稗細胞をＲＰＭＩ−
１６４０培地で３回洗浄した。 一方、マウス骨髄腫細胞株Ｐ ３ Ｕ １ Ｉ Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ丁ｏｐｉｃｓ ｉｎ ）ｌｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏａｙ ａｎｄ ｒｍｍＵｎｏｌｏａｙ、８ １
。 １−７ （１９７８）］を、上記と同様に洗浄後、その
４Ｘ１０７個と上記牌細胞２Ｘ１０Ｂ個とを、５００ｍ
Ｑ遠心管に入れて混合した。２００Ｇ、５分間遠心分離
後、上清をパスツールピペツ１−で除去した。３７°Ｃ
に保温したポリエチレングリコール１５００（ベーリン
ガーマンハイム山之内社製）５０ｗ／ｖ％を含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地２ｍ１２を１分間を要して滴下し、次
いで３７°Ｃに保温した牛胎児血清（Ｆｅ２）を含まな
いＲＰＭＩ−１６４０培地１戒を加えて１分間放置後、
更に２ｍＱを加えて２分間放置し、その後３７℃に保温
した１５％ＦＣ３，０，０５力価／Ｑのストレプトマイ
シン、６００００Ｕ／ＱのペニシリンＧカリウム、５４
ｍＭＱのゲンタマイシン及び１ｍＭピルベーｌへを含有
するＲＰＭＩ−１６４０（以下これを［完全ＲＰＭＩＪ
という）８＋ｎＱを加え、２００Ｇで５分間遠心分離し
た。上清を除去し、３７℃に保温した完全ＲＰＭＩに、
牌細胞２×１０’個／ｍＱとなるように懸濁させ、２４
穴マイクロプレート（コースタ−社製）に１．ＯｍＱず
つ分注し、３７°Ｃで５％炭酸ガスインキュベーター内
で培養した。２４時間後、１．０Ｘ１０’Ｍヒポキサン
チン、４．ＯＸｌｏ−７Ｍ７ミノプテリン及び１ 、６
Ｘ １０’Ｍチミジンを会む完全ＲＰＭＩ培地（以下こ
れをｒＨＡ下培地」という）１、ＯｍＱを各ウェルに添
加し、以後、上清の半分を第３、第５及び第７日日にそ
れぞれ新しいトＩＡＴ培地に代え、第９日日に同様に上
清の半分を１ 、 ＯＸ １０’Ｍヒボキサンチン及び
１．６×１０−５〜１チミジンを含む完全ＲＰＭＩ培地
（以下これをｒＨＴ培地」という）に代えた。同様に第
１２．１５．１８及び２１日８に上清の半分をＨＴ培地
に代え、第２４日日に上清の半分を完全ＲＰＭＩ培地に
代えた。以後、この完全ＲＰＭＩ培地で増殖維持した。 かくして得られるハイブリドーマを、限界希釈法により
クローニングした。即ち、ハイブリドーマ２．５×１０
個／ｍＱ、ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞４Ｘ１０’個／
ｍＱとなるように完全ＲＰＭＩ培地に調整し、これをハ
イブリビーフ５個／ウェルになるように９６ウエルのプ
レートに撒き培養した。増殖してくるハイブリドーマを
更に同様の操作によりハイブリドーマ０．５ｆ［Ｎ／つ
１ルとしてクローニングした。 目的の抗体を産生ずるクローンの検索は次の通り行なっ
た。即ち、精製プロテアソーム及び生血清アルブミン（
ＢＳＡ）をそれぞれプレートに不溶化した９６穴プレー
トの各ウェルに、り［１−ユング中の培養上清５０μＱ
を入れて、室温、振盪下に１時間反応させた。反応後、
蒸留水で未反応物を洗浄し、パーオキシダーゼ標識抗マ
ウスＩＱＧ（カッベル社製）の６０００倍希釈液１００
μＱづつを各ウェルに入れ、室温、振盪下に３０分間反
応させた。更に未反応物を蒸留水で洗浄除去し、０．０
１５％Ｈ２０２水溶液中に２．５ｍ（Ｊ／ｍＱの濃度で
溶解さぜたＯ−フェニレンジアミン溶液１００ｕＱづつ
を入れ、室温で１５分間静首反応させた。その後、２
Ｎ Ｈ２Ｓ ０４１００μＱ８加え、反応を・停山さ
せ、発色したマイクロプレートをマイクロリーダー［タ
イターデックマルチスキャン（Ｔｉｔｅｒｔｃｋ Ｍｕ
ｌｔｉｓｋａｎ聞Ｃ）、フローラボラ１へリーズ（Ｆｌ
ｏｗ Ｌａｂｓ、 ＵＳＡ）社製］を用いｒ４９２ｎｍ
で測定したつ 上記方法により、ヒトプロデアソ〜ムにのみ特異反応性
を示す目的の抗体産生クローンを得た。 上記で選別された抗体産生クローンの内のひとつは、工
業技術院微生物工業技術研究所に、ｒＯＡＬ Ｉ−基
質ＷＰ−１Ｊなる微生物の表示にて、微工研菌奇第９８
３８号（ＦＥＲ）Ｉ Ｐ−９８３８）として奇託されて
いる。 上記クローンＮｏ、ＯΔＬ ｌ−１へ４ＷＰ−１を、
完全ＲＰＭＩ培地にて、５％炭酸ガスインキュベーター
中で、３７°Ｃにて４８時間培養し、培谷液勺遠心分離
（３０００ｐｐｍ 、１０分間）シテ、目的のモノクロ
ーナル抗体を倉む培養上清を（７だ。 （３）モノクロ−太ル抗体クラスの特定上記（２）で１
７だモノクローナル抗１ホｔ、１；ＩＱＧ＋クラスに屈
していた。これはラットＬツクローナルタイピングキッ
ト［゛ンイルズ（ＭｉｌｅｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社
製］を利用して確認された。 （４）モノクローナル抗体の精製 前記（２）τ′得たクローンＮＯ，ＯＡＬ ｌ−基質
ＷＰ−１の１ Ｘ １０７個をＲＰＭＩ−１６４０培地
に懸濁させ、ヌードマウス又はヌードラッ１〜に腹腔内
投句した。２−３週間後、蓄積された腹水８採取して、
ヒ１ヘプロテアソーム抗体を含む腹水を（Ｕだ。その抗
体濃度は約０．２へ一５ｍＭｍＱであった。 上記及び前記（２）で１５？た各培養上清をＰＢＳで２
倍に希釈したものを、プロティンΔカラムに付すことに
より精製抗ヒトプロテアソーム抗体を得た。 （５）不溶化抗体の調製 上記（４）で得た精製抗ヒトプロテアソーム抗体を０．
１５Ｍ ＮａＣＱ及び０．０５％ＮａＮ３を含む５０
ｍＭ ＰＢＳ （ＤＩ−１７，４＞にて５μｇ蛋白貿
、／ ｍＱに調製した。 一方、ポリエチレンビーズ（セキスイ化学工業社製、直
径４ｍｍ）１万個を、３０％エタノールを含む１／１０
０ＯＮ ＮａＯＨ水溶液でよく洗浄し、更に１．／１
００ＯＮ ＨＣＱ水溶液で洗浄後、蒸留水で充分に洗
浄した。 上記抗体溶液１００ｍ１２に、上記ビーズ８００個を加
え、２時間撹拌し、次いで４°Ｃ下で一晩放置した。ビ
ーズを濾過し、生理食塩水で洗浄後、０．５％結晶ＢＳ
Ａ （生化学工業社製）を含む５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐ
Ｈ７，４＞中で２時間撹拌し、更に４°Ｃ下で一晩放置
した。ビーズを枦取し、充分に洗浄した不溶化抗体を得
た。 （６）標識抗体の調製 前記（４）で得た精製抗体１００μｑを０．１Ｍホウ酸
緩衝液（ｌＩ８．’２）、０．１’ｍ２に溶かした溶液
に、Ｎａ １２５Ｉ （ＮＥＮ社製）の１ｍＣ１を加え
た。ヨードゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ； Ｐｉｅｃｅ社’Ｉ
）２ｍ（？／ｍＱのジクロルメタン溶液２０μＱをガラ
ス試験管に入れ、窒素ガス気流下に溶媒をとばして乾燥
し、この試験管に上記抗体溶液を加え、水冷下に５分間
静置して反応させた。得られた反応物を別の試験管に移
し、反応を停止させた後、グル濾過［セファロースＣＬ
−６８、溶出液＝０．１５ＭＮａＣＱ、０．１％ＢＳＡ
及び０．０２％ＮａＮ３を含む５０ｍＭリン酸緩衝液］
し、放削活性のピークに一致するＩＣＪＧ分画を採取し
て、１２５Ｉ−標識抗体を得た。該ヒトプ１」テアソー
ム抗体の反応性は、精製ヒトプロテアソームを用いて試
験された。 また、上記の仙に、クロラミンＴ法（ＮａｔＬｌｒｅ。 １９４．４９６ （１９６２））及びポルトンハンター
法ＣＢｉｏｃｈｅｍ、 、Ｊ、 、旦９，１１４ （１
９６３））に従っても、それぞれ良好な１２５Ｉ−標識
抗体を１７だ。 （７）パーオキシダーＬ標識抗体の調製前記（４）で得
た精製抗ヒトプロテアソーム抗体の１０ｍｇを０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐｌ−１６，８＞１−に溶解し、１０ｎ
＋ｒ＋、／ｍＱパーオキシグーゼの同緩衝液を加えて緩
かに撹拌した。１％ゲルタールアルデヒド溶液５０μＱ
を滴下し、室温で２時間反応させ、反応混合物を生理食
塩水に対して、４°Ｃ下に一昼夜透析して、パーオキシ
ダーゼ標識抗体を得た。 また、上記以外にも過ヨウ素酸架橋法（Ｊ。 旧ｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、 ２２．１０
８４−１０９１（１９７４））、マレイミド架橋法（Ｊ
。 Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、 ７３ 、
２３５−２３７（１９７５））、イソシアネ−１へ架橋
法（Ｊ。 旧ＳｔＯＣｈｅｍ、 ｃｙｔｏｃｈｅｍ、 、 ２ユ、
２３３−２４０（１９７３））及びベンゾキノン架橋法
（Ａｎｎ。 Ｉｍｍｕｎｏｌ、、 １２７ｃ、 １９７−２０８（
１９７６））に従っても、それぞれ良好なパーオキシダ
ーゼ標識抗体を得た。 更に、パーオキシダーゼの代りに、β・Ｇ−ガラクトシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ、マレートデヒドロ
ゲナーし、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコ
ース酸化酵素、アセチルコリンエステラーゼ、グルコア
ミラーゼ、リゾチーム等の酵素を用いても標識抗体が得
られた。 （８）蛍光標識抗体の調製 前記（４）で得た精製抗ヒトプロテアソーム抗体の１０
ｍｇを０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５＞１ ｍＱに
溶解し、１００μｑ／ｍＱＦ ＩＴＣの同緩衝液を滴下
し、室温で１時間撹拌した。その後、０．００５Ｍのリ
ン酸緩衝液で一昼夜透析後、ＤＥＡＥ−セファロースを
用いてイオン交換により’ＩＲ’Ａして、ＦＩＴＣ標識
と１〜プロテアソ一ム抗体を得た。 また、上記の他にＲＩＩＣＱテトラメチルローダミン
イソチオシアネ−１〜）を用いても、同様の方法により
良好’、；ＲＩＴ−Ｃ標識ヒトプロテアソーム抗体が得
られた。 〈プロテアソームの’４：ｊ性試験〉 ■ 活性試験 プロテアソームは、細胞内に不活性型で存在しており、
熱処理及びトリプシン連理を含む種々の処理によって活
性化される。 本発明プロテアソームにつき、以下の通りポリーＬ−リ
ジンによる活性化を試験した。 尚、プロテアーゼ活性は前記した方法に従い、プロテア
ソームの各５μｑを用いで測定した。即ち、プロテアソ
ーム５μｑ、５０ｍＭトリス・ＨＯ２（ｐＨ８，０）
、１ｍＭジヂ７ＪスＬ／イ１〜−ル、１０μｑの阜貿及
び［３日］−カセイン（２５０００ｃｐｍ ）からなる
試験液２００ｔＩＱ’：調製し、これにポリーＬ−リジ
ン［分子量＝３４０００、シグマ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ
ｍ、Ｃｏ、）礼’ｌ］を終濃度か０．５ｍＭ＋ｎＱとな
るように加えて、３７°Ｃ下に１時間反応させ、次いで
２ｍＭｍＱのＢＳＡを含む１０％トリクロロ酢酸０．８
ｍ（２を加えて反応を停止させた後、醗可溶性分画の放
射能を測定した。 活性は、分解率（％／ｈ）で表わし、３回の試験結果の
平均士Ｓ、Ｄ’ｒ示した。 各プロテアソームを用いて１！７られた［３１−（］−
カカイ２９解活性（％／ｈ）の結果を、下記第１表に示
す。 第１表 ■ 合成基質に対する酵素活性とその至適ｐＨ合成基買
としてＳｕｃ −Ｌ ｅｕ −Ｌｅｕ−Ｖａｌ −Ｔｙ
ｒ−ＭＣＡ、Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｃ＋−ＭＮ
Ａ及びＣｂｚ−Ｌｅｕ −Ｌ ｅｕ −Ｇｌｕ−１ＮＡ
をそれぞれ用いて、上記■に記載の方法に準じて本発明
プロテアソームの酵素活性及びその至適ＤＨを測定した
。 尚、緩衝液としては０．１Ｍ＋−リス・ＨＣＱ緩衝液を
用い、試験液のｐＨは直接ｐ［＝１メーターを用いて測
定した。各１））−１値にあけるプロテアソーム活性（
但し、最大分解率）は、上記■に４Ｉじて測定した。但
し、合成基質濃度は０．２ｍＭとし、反応は１０分間を
要して行ない、反応停止は１０％ＳＤＳを１００ｕ９添
加し、更に０．１１Ｖ１トリス−１−ＩＣＱ （ＤＨ９
，０＞の２ｍ□を加えてから、遊離してきたＭＣＡ、Ｍ
ＮＡ又はＮＡＰそれぞれ蛍光光度ｈ１にて測定した。 １ｑられた結果を第１図に示す。 図において、縦軸は活性（最大％）を、横軸は１）Ｈを
それぞれ示し、図中の各結果を示すラインはそれぞれ以
下のものである。 〇−〇：ヒトプ口テアソーム ローロ：ラッｌ〜プ［１テアソーム △−△：鶏プ自テアソーム 一：アフリカツメガエルプロデアソーム×−×：酵母プ
［１テアソーム 第１図より、プロ７アソームは、Ｃ−末端に酸斗、塩基
性及び中性の疎水性アミノ酸をイ１づる３タイプの上記
合成基質のいずれをも分解できる酵素活性を右すること
が認められ、その至適ｐＨは、各合成基質につき、次の
通りと確認された。 Ｊ３ＵＣ−Ｌｅｕ−１−ｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ
］ヒトプロテアソーム ：ｐＨ８，４〜８．６鶏プロ
テアソーム ：ｐＨ８，０〜８．５アフリカッメガ
エルプロ：Ｄｔ−（８，４〜８．８テアソーム 酵母プロテアソーム ：ｐＨ８，４〜・８．７［Ｃｂ
ｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＮＡ］ヒトプロテアソ
ーム ：ｐＨ９，８〜１０．１鶏プロテアソーム
：ｐＨ９，６〜１０．１アフリカッメガエルプロ：Ｉ
）Ｈ９，６〜１０．５テアソーム 酵母プロテアソーム ：１）８９．６〜１０．０［Ｃ
ｂＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＮＡ］ヒトプロテアソ
ーム ：１）Ｈ８，４〜８．６鶏プロテアソーム
：ｐｔ−（８，４〜８．７アフリカツメガエルブロ：
ｐＨ８，９〜９．２テアソーム 酵母プロテアソーム ：ｌ１８．４〜８．８■ 阻害
剤による活性阻害 ２μ９のプロテアソームを種々のプロテアーゼ阻害剤と
室温で１時間反応させた後、上記■と同様にして、至適
ＩＩ下に、合成基質に対する分解率を測定して、阻害剤
による活性の阻害率（％）を求めた。尚、試験したプロ
テアーゼ阻害剤及びその使用濃度は、下記の通りでおる
。 Ａ：ロイペプチン ５０ ｕ ＣＪ ／ ｍ
ＱＢ ： キモスタチン ５０ｕｇ／ｍＱＣ
：Ｎ−エチルマレイミド １０ｍＭＤ：フェニルメ
タンスルフォニル フルオリド（ＰＭＳＦ＞ １０ｍＭＥニジイソプ
ロピル フルオロ フォスフェート（Ｄ［：Ｐ） １ｍＭＦ：ヘミン
５０μＭヒトプロテアソームを用い
てｊｑられた結果を下記第２表に示す。 第２表 上記第２表よりプロテアソームは互いに独立した触媒活
性部位を有していることが明らかでおる。 尚、ヒトプロテアソーム以外の他種プロテアソームにつ
き同一試験を行なった結果、上記第２表と略同様にいず
れも同様の挙動を示した。 〈プロテアソームの物理学的性質〉 プロテアソームの各種物理学的性質を以下の通り調べた
。 即ち、本発明プロテアソームのそれぞれにつき、沈降係
数（Ｓ２ｏ１ｗ）、拡散係数（Ｄ２ｏ１ｗ）、等電点（
ＰＩ）及び分子楕円率（［θ］２２ｏｏＩＩｌ）を、山
中等の文献［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２６１
。 ７１５２０４−１５２０７ （１９８６）］に記載の沈
降速度法（Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｖｏｌｅｃｉ
ｔｙ） 、要件性光散乱法（Ｑｕａｓｉ−ｅｌａｓｔｉ
ｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）、等電点分画
（ｌ５ｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ： Ｉ
Ｆ Ｆ ）及び円偏向二色性（Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄ
ｉｃｈｒｏｉｓｍ） ｋ：従ッテ測定した。 １ｎられた結果を第３表に示す。 第３表 また、上記第３表に示した沈降係数及び拡散係数からス
ヘエドベリの式（ＳＶｅｄｂｅｒｇ’Ｓ ｅＱｕａｔｉ
ｏｎ）に基づき分子！（Ｍ、Ｗ、）を算出し、拡散係数
から同様にしてス１−−クス半径（Ｒｈ）を算出した。 之等の結果と共に、各プロテアソームの吸収スペクトル
値［極大吸収（λｍａＸ ） 、２８０ｎｍにＪ３ける
吸光係数（Ｅ １％）］を第４表に示す。 Ｃｍ 第４表 尚、上記第４表の吸収スペクトルにおいて、２６０ｎｌ
ｌｌには吸収のピーク及び眉が認められず、本発明のプ
ロテアソームには、核酸成分が含まれていないと推定さ
れた。 〈プロテアソームのアミノ酸分析〉 山中等の文献［Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２６１
゜１５２０４〜１５２０７ （１９８６）］に記載の方
法と同−条１４［により、本発明プロテアソームのアミ
ノ酸組成比（−Ｅル％）を求めた。 結果を第５表に示す。 第５表 但し、表中ＮＤは検出されないことを示す。 〈プロテアソームの形状〉 ヒトプロテアソームを５０μＣＪ／ｍＱ緩衝液に調製し
、１〜３％ウラニル酢１（ｐＨ４，５）で支持膜上に逆
染色して、電子顕微鏡（日立社製、Ｈ７０００、Ｘ５０
０００）で観察した。 複数個のプロテアソーム分子の上記顕微鏡観察結果を第
２図に示す。 第２図より、ヒトプロテアソームは分子の中央に凹を持
つ対称形の円盤状に観察されることが明らかであり、こ
れは前記物理学的性質によく対応していた。 他種プロテアソーム、即ち鶏プロテアソーム、アフリカ
ッメガエルプロテアソーム及び酵母プロテアソームにつ
いて同様の観察を行なった結果、これらもまた略同様の
形状を有することが確認された。 〈プロテアソームの免疫学的性質〉 ■ ポリクローナル抗体の反応性 前記実施例３− （１）で得た各抗体（ポリクローナル
抗体）を用いて、２等抗体と本発明の各プロテアソーム
との反応性を、オフタロニー法［０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎ
ｙ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓ
ｉｓ ：Ｔｉｔｌｅ ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（
Ｗｅｉｒ、Ｃ，、ｅｄ、”）、ｐり６５５−６８８ 、
ＢｅｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ、０ｘｆｏｒｄ］に従って、以下の通り
試験した。 即ち、１０μｑのプロテアソームをセンターウェルに、
７μＱの抗体をサイドウェルに、それぞれ置き、給湿機
中、至温で２日間反応させた。リン酸塩緩衝食塩水（Ｐ
ＢＳ）で、緩やかに撹拌しながら４日間洗浄俊、蛋白染
色（クーマシー ブリリアント ブルー（Ｃｏｏｍａｓ
ｓｉｅ ｂｒｉｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ）、ＣＢＢ＞を行
なった。 各プロテアソームを用いて得られた結果を第３図（Ａ−
Ｅ ）に示す。 第３図Ａ−Ｅにおいて、センターウェル（各図中央部Ｅ
〉に置かれたプロテアソームはそれぞれ以下の通りであ
る。 Ａ−・・ヒトプロテアソーム（ｔｌｕｍａｎ Ｌｉｖｅ
ｒ）Ｂ・・・ラットプロテアソーム（Ｒａｔ Ｌｉｖｅ
ｒ）［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２６１． １５１
９７−１５２０３（１９８６）］ Ｃ・・・鶏プロテアソーム（Ｃｔ＋１ｃｋｃｎ Ｌｉｖ
ｅｒ）Ｄ・・・アフリカッメカエルプロテアソーム（Ｘ
ｅｎｏｐｕｓ Ｌｃａｖｉｓ ０ｖａｒｙ）Ｅ −ｕ
ｆＥプロテアソーム（Ｙｅａｓｔ）また各図のサイドウ
ェルに置かれた各抗体はそれぞれ以下のものでおる。 １・・・抗ヒトプロテアソーム抗体 ２・・・抗ラットプロテアソーム抗体［同上文献］３・
・・杭用プロテアソーム抗体 ４・・・抗アフリカッメガエルプロテアソーム抗体５・
・・抗酵母プロテアソーム抗体 ６・・・正常ウサギ血清 第３図より、前記実施例３− （１）で得た抗体は、対
応する種のプロテアソームにのみ反応性を有し、他の種
のプロテアソームとは交叉反応性を示さず、更に、各プ
ロテアソームは明らかに相互に免疫学的に相違している
ことが判る。 ■ プロテアソームザブユニットの反応性各プロテアソ
ームのサブユニツｉ〜成分の免疫学的反応性を、以下の
通りイムノプロット分析を用いて試験した。 即ち、各プロテアソーム３５μＱを、５ＤＳ−ＰＡＧＥ
で電気泳動（後記電気泳動法の項参照）さじだ後、セミ
ドラッグエラクトロプロツタ−［（Ｓｅｍｉ Ｄｒｕｇ
Ｅｌａｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｒ）、５ａｒｔＯｒ’ｉ
ＵＳ社製］を用いて、デュラポア−（ＤＩＪｒａｐＯｒ
ｅ）膜［ミリポアー（Ｈｉ ｌ ｌ １ｐｏｒｅ）社製
］へ電気的に移し、その膜を３％牛血清で処理した後、
−次抗体として各抗プロテアソーム抗体１０μｇ／ｍＱ
を作用させ、次いて二次抗体として０．２５μＱｉ／ｍ
Ｑの１２５１−プロティンＡを反応させ、反応物をオー
トラジオグラフィーにより分析した。 各抗体による交叉反応性を求めた結果を第４図（Ａ−Ｆ
）に示す。 第４図へは蛋白質染色（ＣＢＢ）を示し、同Ｂは抗ヒト
プロテアソーム抗体を用いた結果を、同Ｃは抗ラットプ
ロテアソーム抗体を用いた結果を、同りは杭用プロテア
ソーム抗体を用いた結果を、同Ｅは抗アフリカッメガエ
ルプロテアソーム抗体を用いた結果を、同Ｆは抗酵母プ
ロテアソームを用いた結果を、ぞれぞれ示している。 また、図における各レーンは次の試別を示す。 レーント・・ヒトプロテアソーム レーン２・・・ラットプロテアソーム レーン３・・・鶏プロテアソーム レーン４・・・アフリカッメガエルプロテアソームレー
ン５・・・酵母プロテアソーム 第４図より、各プロテアソームのサブユニツ１へ成分は
、主として同種酵素に対するポリクローナル抗体に対し
てはいずれもよく反応するが、他種酵素に対してはぞの
反応性が限定されていることが判る。また種間で互いに
交叉する成分も認められ、ザブユニット成分の部分的な
構造は進化的に保存されていることが判る。 ■ モノクローナル抗体の反応性 （１）前記実施例３− （２）に従って調製された４種
類のヒトプロテアソームに対するモノクローナル抗体（
Ｎｏ、２−１７．２−２１．２−２４及び４−３と１−
る〉を用い、ＥＩＩＳＡ法に従い、之等各抗体と本発明
の各プロテアソームとの反応性を次の通り試験した。 即ち、精製ヒトプロテアソーム２００μΩを固定したイ
ムノプレー１へに、各モノクローナル抗体５０ｔｌＱと
、５０ｍＭリン酸緩衝液［０，４％ＢＳＡ、０．０２％
ツイーン２０ （Ｔｗｅｅｎ２０）及び０．０５％チメ
ロザール含有、ｐＨ７，４］５０μＱとを加えて室温で
２時間（辰盪した後、脱イオン水２５０μ２で３回洗浄
した。次いで、酵素標識抗マウス免疫グロブリン希釈液
［Ｚｙｍｅｄ ｔｌｒｐｏ標識ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍ
ｏｕｓｅ ＩｇＡ、 ＩｇＧ、 ＩｇＭ（Ｈ，Ｌ）
の３０００倍希釈液］の１００μＱを加えて、室温で２
時間娠盛した後、脱イオン水２５０μＱで３回洗浄した
。 更に、クエン酸−リン酸緩衝液（１）Ｈ５，０＞の０．
０２５％０−フェニレンジアミン溶解液に使用直前にそ
の５０１１１１２に対して１０ｔｌＱの割合で３０％Ｈ
２０２を添加して調製した基質溶液１００μＱを加えて
、室温で１０分間静置後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ，１１００
μＱで反応を停止させ、４９２１ｍで吸光度を測定した
。 結果を第５図に示す。図において縦軸は吸光度（４９２
１１ｍ＞を、横軸は希釈倍率（ｌｏｇ表示）ヲ示す。 該図より、各モノクローナル抗体の反応性は、抗体Ｎｏ
、２１７＞４−３＞：２−２１ ＞２！−２４の順でお
ることが判る。 （２）上記（１）と同一の４種のヒトモノクローナル抗
体について、前記■に示したポリクローナル抗体の−ｒ
ムノブロツ１へ分析と同様にして、之等各抗体と本発明
の各プロテアソームとの反応性を試験した。但し、−次
抗体としては、前記実施例３− （２）に従い作成され
たモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞の
培地を使用した。 ｊｑられた各抗体による交叉反応性結果を、第４図と同
様にして第６図に示す。 第６図Ａは蛋白質染色（ＣＢＢ）を示し、同Ｂはヒトモ
ノクローナル抗体Ｎｏ、２−１７を用いた結果を、同Ｃ
はヒトモノクローナル抗体Ｎ０．２−２１を用いた結果
を、同りはヒトモノクローナル抗体Ｎ０．２−２４を用
いた結果を、同Ｅはヒトモノクローナル抗体ＮＯ６４−
３を用いた結果をそれぞれ示している。 また、図における各レーンは次の試料を示す。 レーン］・・・ヒトプロテアソーム レーン２・・・ラットプロテアソーム レーン３・・・鶏プロテアソーム レーン４・・・アフリカッメガエルプロテアソームレー
ン５・・・酵母プロテアソーム 上記第６図より、試験した４種のモノクローナル抗体は
、いずれもヒトプロテアソームの分子量３万のサブユニ
ット成分と強く反応することが判る。尚、モノクローナ
ル抗体Ｎ０．２−１７とＮｏ。 ４−３は同じ分子量のラットプロテアソーム成分とも、
またモノクローナル抗体ＮＯ，２−１７とＮｏ、２−２
４は鶏プロテアソームとも各々交叉反応性を示す。この
ことは之等のモノクローナル抗体は類似のサブユニット
成分との反応性を示すものの、それらのエピトープは互
いに箕なっていることを示している。エビ１−一プの異
なるモノクローナル抗体は、免疫学的定量化におけるキ
ット化のだめに有用である。 〈プロテアソームの電気泳動〉 ポリアクリルアミド スラブ ゲル 電気泳動（ＰＡＧ
Ｅ）をラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ ） （７）方法［Ｎａ
ｔｕｒｅ、２２７，６８０−６８５ （１９７０）］に
従って、ＳＤＳの非存在及び存在下に行なった。 ＳＤＳ非存在下（５％ポリアクリルアミド ゲル、プロ
テアソーム３５μｑ）での蛋白染色（ＣＢＢ）の結果を
第７図に示す。第７図中、各レーンは次の通りである。 レーン１：ヒトプロテアソーム レーン２：ラットプロテアソーム レーン３：鶏プロテアンーム レーン４ニアフリカツメガエルプロテアソームレーン５
：酵母プロテアソーム 第７図より、各プロテアソームは単一のバンドとして泳
動され、その均質性が確認された。尚、同時に測定した
プロテア−Ｕ活性は、上記各バンドに一致して検出され
た。 また、プロテアソームを１％ＳＤＳで変性俊、０．１％
ＳＤＳ存在下で泳動（１５％ポリアクリルアミド ゲル
）した結果を第８図に示す。第８図中、各レーンは次の
通りでおる。 レーン１：ヒトプロテアソーム レーン２：ラットプロテアソーム レーン３：鶏プロテアソーム レーン４ニアフリカツメガエルプロテアソームレーン５
：酵母プロテアソーム 両端のレーン：分子量マーカー蛋白質（ファルマシア
ファイン ケミカフ１１社製）第８図より、各プロテア
ソームは分子量的２２０００〜３３０００に渡る複数の
バンドとして泳動され、このことから各プロテアソーム
は、２等成分からなる複合体（ヘテロ多量体）と認めら
れた。 また、上記泳動パターンはスルフィドリル還元剤（２−
メルカプトエタノール）の存在、非存在にかかわらず、
同様であったことから、プロテアソームにはジスルフィ
ド結合が存在しないものと推定された。 くプロテアソームのクロマトグラフィー分析〉０．５ｍ
ｃ＋のプロテアソームを０．５％トリフルオ０ＦＩ（Ｔ
ＦＡ＞で平衡化したカラム［コスモジル（Ｃｏｓｍｏｓ
ｉ Ｉ）５ Ｃ４−３００：牛丼化学社製、１０ｘ ２
５０ｃｍ］に対し、下記条件にて、逆相高速液体クロマ
トグラフィーを行なった。 システム：ウォーターズ モデル １４１トＩＰＬｃシ
ステム［ウォーターズ社製］溶出：０．５％ＴＦＡを含
むアセ１へニトリルの濃度勾配 流速１ｍＱ／分 フラクション：１ｍＧ検出：吸光
度（Ａ）：Ａ２８００ｍ（第９図中、実線）及びＡ２１
５ ｎｍ （第９図中、破線）各プロテアソームについ
て、得られた溶出パタ−ンの結果を第９図に示す。該図
において、（１）はヒトプロデアソームを、（２）はク
ツ１〜プロテアソームを、（３）は鶏プロテアソームを
、（４）はアフリカッメガエルプロテアソームを、（５
）は酵母プロテアソームを、（６）はブランク ランの
結果をそれぞれ示す。 該図より、本発明の各プロテアソームの構成成分の溶出
パターンは、明確に区別されるものであることが明らか
である。
第１図は本発明プロテアソームの酵素活性を示す図面で
ある。 第２図は本発明ヒトプロテアソーム分子のウラニル酢酸
による負染色後の電子顕微鏡写真である。 第３図及び第４図は本発明プロテアソームと該プロテア
ソームを用いて作成したポリクローナル抗体との反応性
を示す図面に代る写真である。 第５図及び第６図は本発明プロテアソームと該プロテア
ソームを用いて作成したモノクローナル抗体との反応性
を示づ図面に代る写真である。 第７図及び第８図は本発明プロテアソームの電気泳動パ
ターンを示す図面に代わる写真である。 第９図は本発明プロテアソームの高速液体クロマトグラ
フィーの溶出パターンを示す図面である。 （以 上） 第 ２ ；ゾ ０ 、’：ｌｔ 蕾 〆 −、漆 ＋、（Ｉ） ｆ、 −八 第４図 第（Ｅ、 ｔＶ・ 嘲−一一− ｌ！バ ７ 図 ｏｐ−一 ＢＯ１ｔＯｍ＋＋ 、−、−９４へｍ− 〒１ １４−＠１１１１１１？ ８図 □ 一 種−一林 手続補正書（方式） 昭和６３年９月２０日 特許庁長官 吉 １）文 毅 殿 ＪＬｌｌ 事件
の表示 昭和６３年特許願第１４２５２６号 ２ 発明の名称 多機能プロテアーゼ ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 大塚製薬株式会社 ４代理人 大阪市東区平野町２の１０ 沢の鶴ビル昭和６３年８月
３日 （発送臼：昭和６３年８月３０日） ６ 補正の対象 明細書中「図面の簡単な説明」の欄 補正の内容 １ 明細書第７１頁最下行〜第７２頁第２行に「第５図
・・・である。」とあるを次の通り訂正する。 ［第５図は本発明プロテアソームと該プロテアソームを
用いて作成したモノクローナル抗体との反応性を示す図
面でおる。 第６図は本発明プロテアソームと該プロテアソームを用
いて作成したモノクローナル抗体との反応性を示す図面
に代る写真でおる。」（以 上） 手続ネｌｊ正書（自発） 平成１年６月７日 昭和６３年特許願第１４２５２６号 ２ 発明の名称 多機能プロテアーゼ ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 大塚製薬株式会社 ４代理人 ５ 補正命令の日付 自 発 ６ 補正の対象 明細書中「特許請求の範囲」の項、「発明の詳細な説明
」の項及び「図面の簡単な説明」の項 補正の内容 １ 明細書中「特許請求の範囲」の項の記載を別紙の通
り訂正する。 ２ 明細書第１１頁第１５行にｒ８．２Ｊとあるをｒ８
．４Ｊと訂正する。 ３ 明細書第１２頁第１行に［９，５〜１０．ＯＪとあ
るを［９，８〜１０．ＩＪと訂正する。 ４ 明細書第１２頁第７行にｒ８．２Ｊとあるをｒ８．
４Ｊと訂正する。 ５ 明細書第４１頁第１２行に「ヒトプロテアソームに
のみ」とあるを「各プロテアソームに」と訂正する。 ６ 明細書第７１頁第９行に「明らかである。」とある
を以下の通り訂正する。 「明らかである。 〈プロテアソーム・モノクローナル抗体による癌診断〉 （１）抗ヒトプロテアソームモノクローナル抗体固相化
プレートの作製 前記実施例３−（２）に従って調製されたモノクローナ
ル抗体を５０ｍＭ ＰＢＳ−０，０５％ＮａＮ３で５
μｇ／ｍＱに調整した後、これを９６穴ＥＬＩＳＡ用プ
レート（Ｉｎｔｅｒ Ｍａｄ Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ
ｐｌａｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に−穴当り１００μ
Ｑ添加し、４℃で一晩静置して固相化した。 次いで、プレートをダルベツコＰＢＳで洗浄除去し、非
特異吸着を除去するために５０ｍＭＰＢＳ−０，０５％
ＮａＮ３−１％ＢＳＡを一穴当り３００μＱ添加し、さ
らに４℃で一晩静置反応させて抗体固相化プレートを調
製した。 （２）ヒト血清による各種疾患の診断 抗体固相化プレートの一穴につき、アッセイバッファー
として５０ｍＭ ＰＢＳ−０，０５％ＮａＮ３−０．
１％ＢＳＡ−１，０％グリセロール−０，０２％ツイー
ン（Ｔｗｅｅｎ ） ２０を１００μ９を添加した。次
いで１０μＱの血清サンプルを加えて室温で２時間振盪
反応させた。 反応後、ダルベツコＰＢＳ−０，０２％ツイーン２０で
洗浄除去し、抗ヒトプロテアソームポリクローナル抗体
（アッセイバッファーで１００００倍希釈）を各人に１
００μＱ加え、室温で２時間振盪反応させた。 次いで、ダルベツコＰＢＳ−０，０２％ツイーン２０で
反応液を洗浄し、各人に１００μＱのパーオキシダーゼ
標識抗ウサギ免疫グロブリン抗血清希釈液（Ｚｙｍｅｄ
ＩＩＲＰＯ標識ヤギ抗ウサギＩつＧ、 ＩｇＭ）を加
え、室温で２時間振盪反応させた。次にダルベツコＰＢ
Ｓ−０，０２％ツイーン２０で反応液を洗浄し、０．０
１５％Ｈ２Ｏ２クエン酸緩衝液（ｐ Ｈ５，０）に２．
５ｍｇ／ｍＱの濃度で溶解させた０−フ二二レンジアミ
ン溶液を各人に１００μＱ加え、室温で１０分間静置反
応させた。その後、２ＮＨ２ＳＯａ １００μＱで反応
を停止し、マイクロブレートリーダー（タイターチック
マルチスキャン社製）を用い、４９２ｎｍで測定した。 健常人の平均値に標準偏差の二倍を加えた値をカットオ
フ値とした際の陽性率を下記第１表に示す。 第１表 疾患 陽性数／症例数 （陽性率 ％） 非悪性疾患 肝炎 ３／８ （３７，５％）肝硬変
４／１６ （２５，０％）膵炎 ０／６（０
％） 腎炎 １／３ （３３，３％）腎不全
０／７（０％） 悪性疾患 食道癌 １０／１４ （７１，４％）肝臓癌
２５／４０ （６２，５％）肺癌 ５／６
（８３，３％）卵巣癌 ４１５ （８０，０％
）白血病 １７／３７ （４５，９％）健常人 Ｍ
ｅａｎ＝７９．５ｎｇ／ｍＱ。 標準偏差＝３５．４１ 第１表から、悪性疾患患者では健常人に比較してプロテ
アソームが高く検出されて、血液中にプロテアソームが
流出することが推察される。 従って、血清中のプロテアソームの測定が、各種悪性疾
患の診断に有用であることが判る。」７ 明細書第７１
頁最下行に「第５図及び第６図」とあるを以下の通り訂
正する。 「 第５図は本−発明モノクロナール抗体の反応性を示
す図面である。 第６図は」 （以 上） 特許請求の範囲 ■ 下記の酵素学的及び物理化学的性質を有することを
特徴とするヒト多機能プロテアーゼ。 イ０合成基質Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌｃｕ−Ｇｌｕ−ＮＡ（
但しＣｂｚはＮ−ベンジルオキシカルボニル基を、また
ＮＡは２−ナフチルアミド基を示す、以下同じ）を切断
できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは８．４〜８．６
である； 口９合成基質Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＮＡ
（但しＭＮＡは４−メトキシ−２−ナフチルアミド基を
示す、以下同じ）を切断できる酵素活性を有し、その至
適ｐＨは９．８〜１０．１である； ハ０合成基質５ｕｅ−Ｌｃｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−ＭＣＡ （但しＳｕｃはスクシニル基を、またＭＣ
Ａは４−メチル−７−クマリルアミド基を示す、以下同
じ）を切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは８．
４〜８，６である； 二、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ ）が
２７８ｎｍにあり、２８０ｎｍにおける吸収ホロ沈降速
度法による沈降係数（Ｓ ２０．ｗ）は２１．８３であ
る； へ、要件性光散乱法による拡散係数（Ｄ２ｏ、ｖ）は２
．２８×１Ｏ−７ＣＩＩ！２・ｓ−１である；ト０分子
量は８７００００±５００００である；チ１等重点分画
による等重点（ＰＩ）は５． ０±０．２である； ワ、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；Ａｓｙ、
８．４ Ｐｈｅ ３．４Ｇｌｘ １２
．４ Ｔｙｒ ４． ６Ａｒｇ ５．５
Ｔｒｐ Ｏ，３Ｌｙｓ ６．２
Ｓｅｒ ５．８Ｈｆｓ １゜９ Ｔｈ
ｒ ５．４Ａｌａ ９． ５ １／２ Ｃｙ
ｓ ＮＤＧｕｙ ８．１− Ｍｅｔ
３．１Ｌｅｕ ８．８ Ｐｒｏ
３．６１１ｅ ５．７ Ｖａｌ ７
．２（ＮＤは検出されないことを意味する）。 ■ 下記の酵素学的及び物理化学的性質を有することを
特徴とする部子機能プロテアーゼ。 １０合成基質Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＮＡを
切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは８．４〜８
．７である； 口０合成基質Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＮＡ
を切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは９．６〜
１０．１である； ハ１合成基質５ｕｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−ＭＣＡを切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨ
は８．０〜８．５である； 二、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ ）が
２７８ｎｍにあり、２８０ ｎ１１ｇにおける吸収はＥ
１％＝１０．８である； ＣＩＩＩ ホ、沈降速度法による沈降係数（ｓ２０．ｗ）は２０、
Ｏ８である； へ、要件性先散乱法による拡散係数（Ｄ２ ｇ 、 ｗ
）は２．Ｏ２Ｘ１０−７ｃｍ” ・ｓ−’である；ト
０分子量は９１００００±５００００である；チ０等電
点分画による等重点（Ｐ Ｉ）は４．９±０，２である
； す、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；Ａｓｘ
８．２ Ｐｈｅ ３．３Ｇｌｘ １Ｂ、
Ｉ Ｔｙｒ ４． ５Ａｒｇ ５．
４ Ｔｒｐ Ｏ，４Ｌｙｓ ６．ＯＳｅ
ｒ ６．ｌＨｆ５ １．９ Ｔｈｒ
５．５Ａｌａ ９． ４ １
／２ Ｃｙｓ ＮＤＧｌｙ ８．
５ Ｍｅｔ ２．８Ｌｅｕ ８．３
Ｐｒｏ ３．６１１ｅ ５．７ Ｖ
ａｌ ７．０（ＮＤは検出されないことを意味する
）。 ■ 下記の酵素学的及び物理化学的性質を有することを
特徴とするアフリカッメガエル多機能プロテアーゼ。 ４９合成基質Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＮＡを
切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは８．９〜９
．２である； 口２合成基質Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＮＡ
を切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは９．６〜
１０．５である； ハ９合成基質５ｕｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−ＭＣＡを切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨ
は８．４〜８．８である； 二、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ ）が
２７８ｎｍにあり、２８０ ｎｍにおける吸収はＥ１％
＝１２．３である； Ｃｍ ホ、沈降速度法による沈降係数（Ｓ ２０．ｗ）は１９
．６３である； ヘ、要件性光散乱法による拡散係数（Ｄ２０．ｗ）は２
．１５Ｘ１０−７ｃｍ２ ・ｓ−１である；ト６分子量
は８４００００±５００００である；チ０等電点分画に
よる等電点（ＰＩ）は５．０±０．２である； す、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；Ａｓｘ
８．７ Ｐｈｅ ３．４Ｇｌｘ １２．
５ Ｔｙｒ ４． ９Ａｒｇ ５，２
Ｔｒｐ Ｏ，３Ｌｙｓ ６．７
Ｓｃｒ ５．７Ｈｉｓ １．８ Ｔｈ
ｒ ５．５Ａｌａ ９． ５ １／２ Ｃｙ
ｓ ＮＤＧｌｙ ７．９ Ｍｅｔ
３．０Ｌｅｕ ８．７ Ｐｒｏ ３．３
１１ｅ ５．８ Ｖａｌ ７．１（ＮＤ
は検出されないことを意味する）。 ■ 下記の酵素学的及び物理化学的性質を有することを
特徴とする酵母多機能プロテアーゼ。 イ６合成基質Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＮＡを
切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは８．４〜８
．８である； 口０合成基質Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＮＡ
を切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは９．６〜
１０．０である； ハ９合成基質５ｕｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−ＭＣＡを切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨ
は８．４〜８．７である； 二、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ ）が
２７８止にあり、２８０ ｎｍにおける吸収はＥ１％＝
７．４である； ｃｍ ホ、沈降速度法による沈降係数（Ｓ ２０．ｗ）は２０
、Ｏ８である； へ、要件性先散乱法による拡散係数（Ｄ２０．ｗ）は２
．６０Ｘ１０−７ａｍ２・ｓ−’である；トロ分子量は
７１００００±５００００である；チ１等電点分画によ
る等電点（ＰＩ）は４．６±０．２である； す、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；Ａｓｘ
１１． ＯＰｈｃ ２．８Ｇｌｘ １２． ９
Ｔｙｒ ３． ５Ａｒｇ ３．６
Ｔｒｐ Ｏ，４Ｌｙｓ ６．２ Ｓ
ｅｒ ６．２Ｈ１ｓ １．３ Ｔｈｒ
５．’５Ａｌａ ８． ９ １／２ Ｃｙｓ
ＮＤＧｌｙ ９．４ Ｍｅｔ １
．８Ｌｅｕ ８．３ Ｐｒｏ ４．５１
１ａ ６．５ Ｖａｌ ７．１（ＮＤは
検出されないことを意味する）。
ある。 第２図は本発明ヒトプロテアソーム分子のウラニル酢酸
による負染色後の電子顕微鏡写真である。 第３図及び第４図は本発明プロテアソームと該プロテア
ソームを用いて作成したポリクローナル抗体との反応性
を示す図面に代る写真である。 第５図及び第６図は本発明プロテアソームと該プロテア
ソームを用いて作成したモノクローナル抗体との反応性
を示づ図面に代る写真である。 第７図及び第８図は本発明プロテアソームの電気泳動パ
ターンを示す図面に代わる写真である。 第９図は本発明プロテアソームの高速液体クロマトグラ
フィーの溶出パターンを示す図面である。 （以 上） 第 ２ ；ゾ ０ 、’：ｌｔ 蕾 〆 −、漆 ＋、（Ｉ） ｆ、 −八 第４図 第（Ｅ、 ｔＶ・ 嘲−一一− ｌ！バ ７ 図 ｏｐ−一 ＢＯ１ｔＯｍ＋＋ 、−、−９４へｍ− 〒１ １４−＠１１１１１１？ ８図 □ 一 種−一林 手続補正書（方式） 昭和６３年９月２０日 特許庁長官 吉 １）文 毅 殿 ＪＬｌｌ 事件
の表示 昭和６３年特許願第１４２５２６号 ２ 発明の名称 多機能プロテアーゼ ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 大塚製薬株式会社 ４代理人 大阪市東区平野町２の１０ 沢の鶴ビル昭和６３年８月
３日 （発送臼：昭和６３年８月３０日） ６ 補正の対象 明細書中「図面の簡単な説明」の欄 補正の内容 １ 明細書第７１頁最下行〜第７２頁第２行に「第５図
・・・である。」とあるを次の通り訂正する。 ［第５図は本発明プロテアソームと該プロテアソームを
用いて作成したモノクローナル抗体との反応性を示す図
面でおる。 第６図は本発明プロテアソームと該プロテアソームを用
いて作成したモノクローナル抗体との反応性を示す図面
に代る写真でおる。」（以 上） 手続ネｌｊ正書（自発） 平成１年６月７日 昭和６３年特許願第１４２５２６号 ２ 発明の名称 多機能プロテアーゼ ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 大塚製薬株式会社 ４代理人 ５ 補正命令の日付 自 発 ６ 補正の対象 明細書中「特許請求の範囲」の項、「発明の詳細な説明
」の項及び「図面の簡単な説明」の項 補正の内容 １ 明細書中「特許請求の範囲」の項の記載を別紙の通
り訂正する。 ２ 明細書第１１頁第１５行にｒ８．２Ｊとあるをｒ８
．４Ｊと訂正する。 ３ 明細書第１２頁第１行に［９，５〜１０．ＯＪとあ
るを［９，８〜１０．ＩＪと訂正する。 ４ 明細書第１２頁第７行にｒ８．２Ｊとあるをｒ８．
４Ｊと訂正する。 ５ 明細書第４１頁第１２行に「ヒトプロテアソームに
のみ」とあるを「各プロテアソームに」と訂正する。 ６ 明細書第７１頁第９行に「明らかである。」とある
を以下の通り訂正する。 「明らかである。 〈プロテアソーム・モノクローナル抗体による癌診断〉 （１）抗ヒトプロテアソームモノクローナル抗体固相化
プレートの作製 前記実施例３−（２）に従って調製されたモノクローナ
ル抗体を５０ｍＭ ＰＢＳ−０，０５％ＮａＮ３で５
μｇ／ｍＱに調整した後、これを９６穴ＥＬＩＳＡ用プ
レート（Ｉｎｔｅｒ Ｍａｄ Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ
ｐｌａｔｅ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に−穴当り１００μ
Ｑ添加し、４℃で一晩静置して固相化した。 次いで、プレートをダルベツコＰＢＳで洗浄除去し、非
特異吸着を除去するために５０ｍＭＰＢＳ−０，０５％
ＮａＮ３−１％ＢＳＡを一穴当り３００μＱ添加し、さ
らに４℃で一晩静置反応させて抗体固相化プレートを調
製した。 （２）ヒト血清による各種疾患の診断 抗体固相化プレートの一穴につき、アッセイバッファー
として５０ｍＭ ＰＢＳ−０，０５％ＮａＮ３−０．
１％ＢＳＡ−１，０％グリセロール−０，０２％ツイー
ン（Ｔｗｅｅｎ ） ２０を１００μ９を添加した。次
いで１０μＱの血清サンプルを加えて室温で２時間振盪
反応させた。 反応後、ダルベツコＰＢＳ−０，０２％ツイーン２０で
洗浄除去し、抗ヒトプロテアソームポリクローナル抗体
（アッセイバッファーで１００００倍希釈）を各人に１
００μＱ加え、室温で２時間振盪反応させた。 次いで、ダルベツコＰＢＳ−０，０２％ツイーン２０で
反応液を洗浄し、各人に１００μＱのパーオキシダーゼ
標識抗ウサギ免疫グロブリン抗血清希釈液（Ｚｙｍｅｄ
ＩＩＲＰＯ標識ヤギ抗ウサギＩつＧ、 ＩｇＭ）を加
え、室温で２時間振盪反応させた。次にダルベツコＰＢ
Ｓ−０，０２％ツイーン２０で反応液を洗浄し、０．０
１５％Ｈ２Ｏ２クエン酸緩衝液（ｐ Ｈ５，０）に２．
５ｍｇ／ｍＱの濃度で溶解させた０−フ二二レンジアミ
ン溶液を各人に１００μＱ加え、室温で１０分間静置反
応させた。その後、２ＮＨ２ＳＯａ １００μＱで反応
を停止し、マイクロブレートリーダー（タイターチック
マルチスキャン社製）を用い、４９２ｎｍで測定した。 健常人の平均値に標準偏差の二倍を加えた値をカットオ
フ値とした際の陽性率を下記第１表に示す。 第１表 疾患 陽性数／症例数 （陽性率 ％） 非悪性疾患 肝炎 ３／８ （３７，５％）肝硬変
４／１６ （２５，０％）膵炎 ０／６（０
％） 腎炎 １／３ （３３，３％）腎不全
０／７（０％） 悪性疾患 食道癌 １０／１４ （７１，４％）肝臓癌
２５／４０ （６２，５％）肺癌 ５／６
（８３，３％）卵巣癌 ４１５ （８０，０％
）白血病 １７／３７ （４５，９％）健常人 Ｍ
ｅａｎ＝７９．５ｎｇ／ｍＱ。 標準偏差＝３５．４１ 第１表から、悪性疾患患者では健常人に比較してプロテ
アソームが高く検出されて、血液中にプロテアソームが
流出することが推察される。 従って、血清中のプロテアソームの測定が、各種悪性疾
患の診断に有用であることが判る。」７ 明細書第７１
頁最下行に「第５図及び第６図」とあるを以下の通り訂
正する。 「 第５図は本−発明モノクロナール抗体の反応性を示
す図面である。 第６図は」 （以 上） 特許請求の範囲 ■ 下記の酵素学的及び物理化学的性質を有することを
特徴とするヒト多機能プロテアーゼ。 イ０合成基質Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌｃｕ−Ｇｌｕ−ＮＡ（
但しＣｂｚはＮ−ベンジルオキシカルボニル基を、また
ＮＡは２−ナフチルアミド基を示す、以下同じ）を切断
できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは８．４〜８．６
である； 口９合成基質Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＮＡ
（但しＭＮＡは４−メトキシ−２−ナフチルアミド基を
示す、以下同じ）を切断できる酵素活性を有し、その至
適ｐＨは９．８〜１０．１である； ハ０合成基質５ｕｅ−Ｌｃｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−ＭＣＡ （但しＳｕｃはスクシニル基を、またＭＣ
Ａは４−メチル−７−クマリルアミド基を示す、以下同
じ）を切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは８．
４〜８，６である； 二、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ ）が
２７８ｎｍにあり、２８０ｎｍにおける吸収ホロ沈降速
度法による沈降係数（Ｓ ２０．ｗ）は２１．８３であ
る； へ、要件性光散乱法による拡散係数（Ｄ２ｏ、ｖ）は２
．２８×１Ｏ−７ＣＩＩ！２・ｓ−１である；ト０分子
量は８７００００±５００００である；チ１等重点分画
による等重点（ＰＩ）は５． ０±０．２である； ワ、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；Ａｓｙ、
８．４ Ｐｈｅ ３．４Ｇｌｘ １２
．４ Ｔｙｒ ４． ６Ａｒｇ ５．５
Ｔｒｐ Ｏ，３Ｌｙｓ ６．２
Ｓｅｒ ５．８Ｈｆｓ １゜９ Ｔｈ
ｒ ５．４Ａｌａ ９． ５ １／２ Ｃｙ
ｓ ＮＤＧｕｙ ８．１− Ｍｅｔ
３．１Ｌｅｕ ８．８ Ｐｒｏ
３．６１１ｅ ５．７ Ｖａｌ ７
．２（ＮＤは検出されないことを意味する）。 ■ 下記の酵素学的及び物理化学的性質を有することを
特徴とする部子機能プロテアーゼ。 １０合成基質Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＮＡを
切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは８．４〜８
．７である； 口０合成基質Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＮＡ
を切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは９．６〜
１０．１である； ハ１合成基質５ｕｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−ＭＣＡを切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨ
は８．０〜８．５である； 二、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ ）が
２７８ｎｍにあり、２８０ ｎ１１ｇにおける吸収はＥ
１％＝１０．８である； ＣＩＩＩ ホ、沈降速度法による沈降係数（ｓ２０．ｗ）は２０、
Ｏ８である； へ、要件性先散乱法による拡散係数（Ｄ２ ｇ 、 ｗ
）は２．Ｏ２Ｘ１０−７ｃｍ” ・ｓ−’である；ト
０分子量は９１００００±５００００である；チ０等電
点分画による等重点（Ｐ Ｉ）は４．９±０，２である
； す、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；Ａｓｘ
８．２ Ｐｈｅ ３．３Ｇｌｘ １Ｂ、
Ｉ Ｔｙｒ ４． ５Ａｒｇ ５．
４ Ｔｒｐ Ｏ，４Ｌｙｓ ６．ＯＳｅ
ｒ ６．ｌＨｆ５ １．９ Ｔｈｒ
５．５Ａｌａ ９． ４ １
／２ Ｃｙｓ ＮＤＧｌｙ ８．
５ Ｍｅｔ ２．８Ｌｅｕ ８．３
Ｐｒｏ ３．６１１ｅ ５．７ Ｖ
ａｌ ７．０（ＮＤは検出されないことを意味する
）。 ■ 下記の酵素学的及び物理化学的性質を有することを
特徴とするアフリカッメガエル多機能プロテアーゼ。 ４９合成基質Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＮＡを
切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは８．９〜９
．２である； 口２合成基質Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＮＡ
を切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは９．６〜
１０．５である； ハ９合成基質５ｕｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−ＭＣＡを切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨ
は８．４〜８．８である； 二、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ ）が
２７８ｎｍにあり、２８０ ｎｍにおける吸収はＥ１％
＝１２．３である； Ｃｍ ホ、沈降速度法による沈降係数（Ｓ ２０．ｗ）は１９
．６３である； ヘ、要件性光散乱法による拡散係数（Ｄ２０．ｗ）は２
．１５Ｘ１０−７ｃｍ２ ・ｓ−１である；ト６分子量
は８４００００±５００００である；チ０等電点分画に
よる等電点（ＰＩ）は５．０±０．２である； す、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；Ａｓｘ
８．７ Ｐｈｅ ３．４Ｇｌｘ １２．
５ Ｔｙｒ ４． ９Ａｒｇ ５，２
Ｔｒｐ Ｏ，３Ｌｙｓ ６．７
Ｓｃｒ ５．７Ｈｉｓ １．８ Ｔｈ
ｒ ５．５Ａｌａ ９． ５ １／２ Ｃｙ
ｓ ＮＤＧｌｙ ７．９ Ｍｅｔ
３．０Ｌｅｕ ８．７ Ｐｒｏ ３．３
１１ｅ ５．８ Ｖａｌ ７．１（ＮＤ
は検出されないことを意味する）。 ■ 下記の酵素学的及び物理化学的性質を有することを
特徴とする酵母多機能プロテアーゼ。 イ６合成基質Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＮＡを
切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは８．４〜８
．８である； 口０合成基質Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＮＡ
を切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨは９．６〜
１０．０である； ハ９合成基質５ｕｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−ＭＣＡを切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨ
は８．４〜８．７である； 二、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ ）が
２７８止にあり、２８０ ｎｍにおける吸収はＥ１％＝
７．４である； ｃｍ ホ、沈降速度法による沈降係数（Ｓ ２０．ｗ）は２０
、Ｏ８である； へ、要件性先散乱法による拡散係数（Ｄ２０．ｗ）は２
．６０Ｘ１０−７ａｍ２・ｓ−’である；トロ分子量は
７１００００±５００００である；チ１等電点分画によ
る等電点（ＰＩ）は４．６±０．２である； す、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；Ａｓｘ
１１． ＯＰｈｃ ２．８Ｇｌｘ １２． ９
Ｔｙｒ ３． ５Ａｒｇ ３．６
Ｔｒｐ Ｏ，４Ｌｙｓ ６．２ Ｓ
ｅｒ ６．２Ｈ１ｓ １．３ Ｔｈｒ
５．’５Ａｌａ ８． ９ １／２ Ｃｙｓ
ＮＤＧｌｙ ９．４ Ｍｅｔ １
．８Ｌｅｕ ８．３ Ｐｒｏ ４．５１
１ａ ６．５ Ｖａｌ ７．１（ＮＤは
検出されないことを意味する）。
Claims (4)
- （１）下記の酵素学的及び物理化学的性質を有すること
を特徴とするヒト多機能プロテアーゼ。 イ、合成基質Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＮＡ（
但しＣｂｚはＮ−ベンジルオキシカルボニル基を、また
ＮＡは２−ナフチルアミド基 を示す、以下同じ）を切断できる酵素活性 を有し、その至適ｐＨは８．２〜８．６で ある； ロ、合成基質Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＮＡ
（但しＭＮＡは４−メトキシ−２−ナフチ ルアミド基を示す、以下同じ）を切断でき る酵素活性を有し、その至適ｐＨは９．５ 〜１０．０である； ハ、合成基質Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−ＭＣＡ（但しＳｕｃはスクシニル基を、またＭＣＡは
４−メチル−７−クマリルアミド 基を示す、以下同じ）を切断できる酵素活 性を有し、その至適ｐＨは８．２〜８．６ である； ニ、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ）が２
７８ｎｍにあり、２８０ｎｍにおける吸収は▲数式、化
学式、表等があります▼＝１１．２である； ホ、沈降速度法による沈降係数（Ｓ＿２＿０＿，＿Ｗ）
は２１．８Ｓである； ヘ、準弾性光散乱法による拡散係数（Ｄ＿２＿０＿，＿
Ｗ）は２．２８×１０＾−＾７ｃｍ＾２・Ｓ＾−＾１で
ある；ト、分子量は８７００００±５００００である；
チ、等電点分画による等電点（ＰＩ）は５．０±０．２
である； リ、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；Ａｓｘ８．
４ Ｐｈｅ３．４ Ｇｌｘ１２．４ Ｔｙｒ４．６ Ａｒｇ５．５ Ｔｒｐ０．３ Ｌｙｓ６．２ Ｓｅｒ５．８ Ｈｉｓ１．９ Ｔｈｒ５．４ Ａｌａ９．５ １／２ＣｙｓＮＤ Ｇｌｙ８．１ Ｍｅｔ３．１ Ｌｅｕ８．８ Ｐｒｏ３．６ Ｉｌｅ５．７ Ｖａｌ７．２ （ＮＤは検出されないことを意味する）。 - （２）下記の酵素学的及び物理化学的性質を有すること
を特徴とする鶏多機能プロテアーゼ。 イ、合成基質Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＮＡを
切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨ は８．４〜８．７である； ロ、合成基質Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＮＡ
を切断できる酵素活性を有し、その至適 ｐＨは９．６〜１０．１である； ハ、合成基質Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−ＭＣＡを切断できる酵素活性を有し、その 至適ｐＨは８．０〜８．５である； ニ、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ）が２
７８ｎｍにあり、２８０ｎｍにおける吸収は▲数式、化
学式、表等があります▼＝１０．８である； ホ、沈降速度法による沈降係数（Ｓ＿２＿０＿，＿Ｗ）
は２０．０Ｓである； ヘ、準弾性光散乱法による拡散係数（Ｄ＿２＿０＿，＿
Ｗ）は２．０２×１０−＾７＾ｃｍ＾２・Ｓ＾−＾１で
ある；ト、分子量は９１００００±５００００である；
チ、等電点分画による等電点（ＰＩ）は４．９±０．２
である； リ、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；Ａｓｘ８．
２ Ｐｈｅ３．３ Ｇｌｘ１３．１ Ｔｙｒ４．５ Ａｒｇ５．４ Ｔｒｐ０．４ Ｌｙｓ６．０ Ｓｅｒ６．１ Ｈｉｓ１．９ Ｔｈｒ５．５ Ａｌａ９．４ １／２ＣｙｓＮＤ Ｇｌｙ８．５ Ｍｅｔ２．８ Ｌｅｕ８．３ Ｐｒｏ３．６ Ｉｌｅ５．７ Ｖａｌ７．０ （ＮＤは検出されないことを意味する）。 - （３）下記の酵素学的及び物理化学的性質を有すること
を特徴とするアフリカツメガエル多機能プロテアーゼ。 イ、合成基質Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＮＡを
切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨ は８．９〜９．２である； ロ、合成基質Ｃｂ２ｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＮ
Ａを切断できる酵素活性を有し、その至適 ｐＨは９．６〜１０．５である； ハ、合成基質Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−ＭＣＡを切断できる酵素活性を有し、その 至適ｐＨは８．４〜８．８である； ニ、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ）が２
７８ｎｍにあり、２８０ｎｍにおける吸収は▲数式、化
学式、表等があります▼＝１２．３である； ホ、沈降速度法による沈降係数（Ｓ＿２＿０＿，＿Ｗ）
は１９．６Ｓである； ヘ、準弾性光散乱法による拡散係数（Ｄ＿２＿０＿，＿
Ｗ）は２．１５×１０＾−＾７ｃｍ＾２・Ｓ＾−＾１で
ある；ト、分子量は８４００００±５００００である；
チ、等電点分画による等電点（ＰＩ）は５．０±０．２
である； リ、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；Ａｓｘ８．
７ Ｐｈｅ３．４ Ｇｌｘ１２．５ Ｔｙｒ４．９ Ａｒｇ５．２ Ｔｒｐ０．３ Ｌｙｓ６．７ Ｓｅｒ５．７ Ｈｉｓ１．８ Ｔｈｒ５．５ Ａｌａ９．５ １／２ＣｙｓＮＤ Ｇｌｙ７．９ Ｍｅｔ３．０ Ｌｅｕ８．７ Ｐｒｏ３．３ Ｉｌｅ５．８ Ｖａｌ７．１ （ＮＤは検出されないことを意味する）。 - （４）下記の酵素学的及び物理化学的性質を有すること
を特徴とする酵母多機能プロテアーゼ。 ィ、合成基質Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＮＡを
切断できる酵素活性を有し、その至適ｐＨ は８．４〜８．８である； ロ、合成基質Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＮＡ
を切断できる酵素活性を有し、その至適 ｐＨは９．６〜１０．０である； ハ、合成基質Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−ＭＣＡを切断できる酵素活性を有し、その 至適ｐＨは８．４〜８．７である； ニ、紫外線吸収スペクトルは極大吸収（λｍａｘ）が２
７８ｎｍにあり、２８０ｎｍにおける吸収▲数式、化学
式、表等があります▼＝７．４である； ホ、沈降速度法による沈降係数（Ｓ＿２＿０＿，＿Ｗ）
は２０．０Ｓである； ヘ、準弾性光散乱法による拡散係数（Ｄ＿２＿０＿，＿
Ｗ）は２．６０×１０＾−＾７ｃｍ＾２・Ｓ＾−＾１で
ある；ト、分子量は７１００００±５００００である；
チ、等電点分画による等電点（ＰＩ）は４．６±０．２
である； リ、下記アミノ酸組成（モル％）を有する；Ａｓｘ１１
．０ Ｐｈｅ２．８ Ｇｌｘ１２．９ Ｔｙｒ ３．５ Ａｒｇ３．６ Ｔｒｐ０．４ Ｌｙｓ６．２ Ｓｅｒ６．２ Ｈｉｓ１．３ Ｔｈｒ５．５ Ａｌａ８．９ １／２ＣｙｓＮＤ Ｇｌｙ９．４ Ｍｅｔ１．８ Ｌｅｕ８．３ Ｐｒｏ４．５ Ｉｌｅ６．５ Ｖａｌ７．１ （ＮＤは検出されないことを意味する）。
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