JPS6258997A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体Info
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- JPS6258997A JPS6258997A JP60199909A JP19990985A JPS6258997A JP S6258997 A JPS6258997 A JP S6258997A JP 60199909 A JP60199909 A JP 60199909A JP 19990985 A JP19990985 A JP 19990985A JP S6258997 A JPS6258997 A JP S6258997A
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- Japan
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- human
- monoclonal antibody
- apolipoprotein
- monoclonal antibodies
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒトアポリポタンパク’ｊ！ＬＡ−１（３２Ｌ
下アポＡ−Ｉと略記する）に対するモノクローナル抗体
および該モノクローナル抗体の利用法およびその製造法
に関する。
下アポＡ−Ｉと略記する）に対するモノクローナル抗体
および該モノクローナル抗体の利用法およびその製造法
に関する。
アポＡ−Ｉは補乳動物の血清中に含まれるリボタン、ｅ
り質を構成する分子量約２７，０００のタンパク質であ
り、高密度ブイタンパク質（以下ＨＤＬと略記する）の
主要構成成分として存在している。アｙＷＡ−１は血液
中のレシチン：コレステロールアシルトランスフェラー
ゼの活性化因子として知られ末梢コレステロールなエス
テル化しＨＤＬ粒子内にとり込んで代諭することから動
脈硬化防御因子として注目されている。従って臨床検査
上の立場からもア／Ａ−Ｉ含量を測定する意義は大きく
いくつかのキットが市販されている。アポＡ−Ｉの測定
法としては一元放射免疫拡散法（Ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄ
ｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ）やレーザ
ーネフエロメトＩＪ−、ロケット免疫電気泳動法、酵素
免疫法、ラジオイムノアッセイなどがあるが、これらは
いずれも抗原抗体反応に基づいておリアボＡ−Ｉに特異
的な抗血清を採取する必要がある。このためにはヒト血
液から免疫学的に純粋なア４ｈ−１を抗原およびスタン
ダードとして得ることが不可欠である。
り質を構成する分子量約２７，０００のタンパク質であ
り、高密度ブイタンパク質（以下ＨＤＬと略記する）の
主要構成成分として存在している。アｙＷＡ−１は血液
中のレシチン：コレステロールアシルトランスフェラー
ゼの活性化因子として知られ末梢コレステロールなエス
テル化しＨＤＬ粒子内にとり込んで代諭することから動
脈硬化防御因子として注目されている。従って臨床検査
上の立場からもア／Ａ−Ｉ含量を測定する意義は大きく
いくつかのキットが市販されている。アポＡ−Ｉの測定
法としては一元放射免疫拡散法（Ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄ
ｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ）やレーザ
ーネフエロメトＩＪ−、ロケット免疫電気泳動法、酵素
免疫法、ラジオイムノアッセイなどがあるが、これらは
いずれも抗原抗体反応に基づいておリアボＡ−Ｉに特異
的な抗血清を採取する必要がある。このためにはヒト血
液から免疫学的に純粋なア４ｈ−１を抗原およびスタン
ダードとして得ることが不可欠である。
一方、以上のような臨床意義からア、ｆｆＡ−Ｉが動脈
硬化の予防薬、治療薬としての応用も期待される。この
場合においてもヒト血液からアポＡ−Ｉを高度に精製す
る必要が生じる。
硬化の予防薬、治療薬としての応用も期待される。この
場合においてもヒト血液からアポＡ−Ｉを高度に精製す
る必要が生じる。
従来、ヒト血清もしくは血しようからアポＡ−■を精製
する方法としては血清（血しよう）の密度を調整し、超
遠心分離して得たＨＤＬを適当な溶媒（例えばエタノー
ル：エーテル混液）で脱脂し、これを６〜８Ｍ尿素もし
くは塩酸グアニジンもしくはドデシル硫酸ナトリウムを
含む緩衝液（例えばトリス−塩酸緩衝液）に溶解しゲル
濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィな
どによって′Ｎ４ｇ！するのが一般的であった。（例え
ばＢｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２８５
３６（１９７２） 、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｏｈｅｍ、
２４７（８）５８４２（］ ９７２）など）。
する方法としては血清（血しよう）の密度を調整し、超
遠心分離して得たＨＤＬを適当な溶媒（例えばエタノー
ル：エーテル混液）で脱脂し、これを６〜８Ｍ尿素もし
くは塩酸グアニジンもしくはドデシル硫酸ナトリウムを
含む緩衝液（例えばトリス−塩酸緩衝液）に溶解しゲル
濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィな
どによって′Ｎ４ｇ！するのが一般的であった。（例え
ばＢｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２８５
３６（１９７２） 、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｏｈｅｍ、
２４７（８）５８４２（］ ９７２）など）。
また）（ＤＬを高純度で得るために超遠心分離で分離し
たＨＤＬをセファロース６Ｂで精製したのち脱脂しカラ
ムクロマトグラフィを行っている例もある（臨床化学旦
（２）】２６（１９８２））。
たＨＤＬをセファロース６Ｂで精製したのち脱脂しカラ
ムクロマトグラフィを行っている例もある（臨床化学旦
（２）】２６（１９８２））。
しかしこれらの方法は操作が煩雑なうえ、時間がかかる
欠点を有し、必ずしも純粋なアポＡ−Ｉが得られない場
合があった。
欠点を有し、必ずしも純粋なアポＡ−Ｉが得られない場
合があった。
アポＡ−１ｆ：％異的なポリクローナルな抗血清を用い
たアフイニテイクロマトグラフイによってヒト血清から
アポＡ−Ｉを含むリボタンノセク粒子を精製した報告（
Ｊ、 Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、 ２５９（１９）１２２０
１ （１９８４） 、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８１１３５６（１９８４）は
あるが純粋のアポＡ−Ｉの精製法として用いられたもの
ではなかった。
たアフイニテイクロマトグラフイによってヒト血清から
アポＡ−Ｉを含むリボタンノセク粒子を精製した報告（
Ｊ、 Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、 ２５９（１９）１２２０
１ （１９８４） 、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８１１３５６（１９８４）は
あるが純粋のアポＡ−Ｉの精製法として用いられたもの
ではなかった。
本発明者らは、純粋なア、ｆｆＡ−１をヒト血清（もし
くは血しよう）から単離、精製が可能な抗ヒトアポＡ−
Ｉ抗体カラムに使用しうる抗ヒトア、ｆｆＡ−１モノク
ローナル抗体の作製と利用法について鋭意検討した結果
ヒト了ｙｆＡ−ｉに対して特異的で尚かつ互いにアポＡ
−１上の認識部位を異にするモノクローナル抗体を著ｆ
に生産するハイブリドーマ３株を作製することに成功し
本発明を完成するに到った。
くは血しよう）から単離、精製が可能な抗ヒトアポＡ−
Ｉ抗体カラムに使用しうる抗ヒトア、ｆｆＡ−１モノク
ローナル抗体の作製と利用法について鋭意検討した結果
ヒト了ｙｆＡ−ｉに対して特異的で尚かつ互いにアポＡ
−１上の認識部位を異にするモノクローナル抗体を著ｆ
に生産するハイブリドーマ３株を作製することに成功し
本発明を完成するに到った。
本発明によって得られる抗ヒトア、ｔＥ’Ａ−）モノク
ローナル抗体ならび１；これをリガンドとするアフィニ
テイカラムは、ヒト血清（もしくは血しよう）から従来
の精製法に比べ簡便で純粋なアポＡ−１をｎ夷できる利
用価値の高いものであり、ハイブリドーマが産生ずるモ
ノクローナル抗体をリガンドとするため、特異性が高く
ハイシリドーマ株が確立されているので半永久的に同一
のモノクローナル抗体を得ることができる。
ローナル抗体ならび１；これをリガンドとするアフィニ
テイカラムは、ヒト血清（もしくは血しよう）から従来
の精製法に比べ簡便で純粋なアポＡ−１をｎ夷できる利
用価値の高いものであり、ハイブリドーマが産生ずるモ
ノクローナル抗体をリガンドとするため、特異性が高く
ハイシリドーマ株が確立されているので半永久的に同一
のモノクローナル抗体を得ることができる。
以下、本発明の詳細な説明する。
本発明のモノクローナル抗体の製造は次の通りに行なう
。
。
（１）抗Ｗ、感作ｆｌｈ物細胞の偲クツマウスにヒ）
）ＩＤＬを免疫して、脾細胞を調製する。免疫はマウス
の腹腔、皮下などに適当なアジュノセント（例えばＰｒ
ｅｕｎｄｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ５０〜］ＯＯμ２／匹を
ス穐当なアジュノセントとともに数回投与する。適当な
時期にマウス眼底静脈叢から採血し、血清中の抗ヒト）
ＩＤＬ抗体価を０ｕｃｈｔｅｒｌｎｎｙ法（二重免疫拡
散法）（免疫学実験入門、生物化学実験法１５、学会出
版センター刊、ｐ７４．１９８１年）により行なう。こ
の方法により明らかに沈降線が認められたマウスの脾細
胞を融合に供した。
）ＩＤＬを免疫して、脾細胞を調製する。免疫はマウス
の腹腔、皮下などに適当なアジュノセント（例えばＰｒ
ｅｕｎｄｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ５０〜］ＯＯμ２／匹を
ス穐当なアジュノセントとともに数回投与する。適当な
時期にマウス眼底静脈叢から採血し、血清中の抗ヒト）
ＩＤＬ抗体価を０ｕｃｈｔｅｒｌｎｎｙ法（二重免疫拡
散法）（免疫学実験入門、生物化学実験法１５、学会出
版センター刊、ｐ７４．１９８１年）により行なう。こ
の方法により明らかに沈降線が認められたマウスの脾細
胞を融合に供した。
細胞融合３〜４日前１：ヒトＨＩＬＬ ５０／１００μ
２／匹を腹腔もしくは静脈内に投与し膵臓を撮出し脾細
胞を調製する。牌臓をＲＰＭ１１６４０（Ｉｒｖｉｎｅ
５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社與）中で細断し、ピンセット
ではぐし１５００ｒｐｍ５分遠心分離して上清をすてる
。細胞ペレットをさらに２回ＲＰＭ１１６４０で洗浄、
遠心分離し融合に供した。
２／匹を腹腔もしくは静脈内に投与し膵臓を撮出し脾細
胞を調製する。牌臓をＲＰＭ１１６４０（Ｉｒｖｉｎｅ
５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社與）中で細断し、ピンセット
ではぐし１５００ｒｐｍ５分遠心分離して上清をすてる
。細胞ペレットをさらに２回ＲＰＭ１１６４０で洗浄、
遠心分離し融合に供した。
（２） 骨髄種細胞の調製
骨髄種細胞としてはＢＡＬＢ１０マクス由来の８−アザ
グアニン耐性株のＰ３−ＮＳＩ／］ −Ａｇ３−１ （
ＭＳ−１）、 Ｐ３−Ｘｆｉ３−Ａｇ８−Ｕｌ （Ｐ３
Ｕ１ ）、 ５Ｐ２１０−Ａｙｌ ４（Ｓｐ２ ）、
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３．（Ｘ６３−６．５
．３．）などが用いられる。これらの細胞は、８−アザ
グアニン（１５Ｍｇ／ｌ）を含む几ＰＭ１１６４０培地
〔几ＰＭ１１６４０培地にグルタミン（２９５岬／ｌ）
、ピルビン酸ナトリウム（１１０■／ｌ）。
グアニン耐性株のＰ３−ＮＳＩ／］ −Ａｇ３−１ （
ＭＳ−１）、 Ｐ３−Ｘｆｉ３−Ａｇ８−Ｕｌ （Ｐ３
Ｕ１ ）、 ５Ｐ２１０−Ａｙｌ ４（Ｓｐ２ ）、
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３．（Ｘ６３−６．５
．３．）などが用いられる。これらの細胞は、８−アザ
グアニン（１５Ｍｇ／ｌ）を含む几ＰＭ１１６４０培地
〔几ＰＭ１１６４０培地にグルタミン（２９５岬／ｌ）
、ピルビン酸ナトリウム（１１０■／ｌ）。
炭酸水素ナトリウム（２９／ｌ）、ペニシリンＧカリウ
ム（ｘｏｏ、ｏｏｏｕ／ｚ）、硫酸ストレゾトマイシｙ
（５０”ｔ／ｌ ） 、牛胎児血清（ＦｏＳ ） （
ＧＩＢＯＯ社製） （１ｏ％（ｖ／ｖ）を加えた培地〕
で培養し対数増殖期の細胞２Ｘ］Ｏ’以上を確保する。
ム（ｘｏｏ、ｏｏｏｕ／ｚ）、硫酸ストレゾトマイシｙ
（５０”ｔ／ｌ ） 、牛胎児血清（ＦｏＳ ） （
ＧＩＢＯＯ社製） （１ｏ％（ｖ／ｖ）を加えた培地〕
で培養し対数増殖期の細胞２Ｘ］Ｏ’以上を確保する。
（３） 細胞融合
（１）で調製したマウス脾細胞と（２）で得られる骨髄
種細胞をＲＰＭＩ培地（ＦｏＳを含まない）で数回洗浄
し両者の細胞数の比が脾細胞：骨髄陳細胞＝５〜１０：
】になるよう混合後１５００ｒｐｍ ５分遠心分離して
上清を捨てる。細胞ペレットにｓ ｏ ％ （ｖ／ｖ）
／ジエチレングリコール４０００ （ＰＥＧ４０００
） （ＦｏＳを含まないＲＰＭＩ１６４０中）ｌ−を１
分間で撹拌しながら徐々に滴下する。１分間混合後ＲＰ
ＭＩ ］ ６４０ 培地（ＰＯＳを含まない）１−を１
分間で攪拌しながら徐々に滴下する。さらにＲＰＭＩ］
６４０培地８−を徐々に滴下後１５００ｒｐｍｌｏ分間
遠心分離後上清をすてＲＰＭ１１６４０培地３〇−にサ
スペンドしその１００μｔを９６クエルマイクロプレー
トに分注し５４００２インキユベーターで３７℃２４時
間培養する。２４時間後ハ ミノプテリン（０，４μＭ）Ｉチミジン（１６μＭ）を
加えた培地）】ＯＯμｔを加える。以後３日間２４時間
ごとに培養上清］ ００ ｐＬを捨て新たＥＨＡＴ培地
１００ ｐｔを加え約２週間培養する。
種細胞をＲＰＭＩ培地（ＦｏＳを含まない）で数回洗浄
し両者の細胞数の比が脾細胞：骨髄陳細胞＝５〜１０：
】になるよう混合後１５００ｒｐｍ ５分遠心分離して
上清を捨てる。細胞ペレットにｓ ｏ ％ （ｖ／ｖ）
／ジエチレングリコール４０００ （ＰＥＧ４０００
） （ＦｏＳを含まないＲＰＭＩ１６４０中）ｌ−を１
分間で撹拌しながら徐々に滴下する。１分間混合後ＲＰ
ＭＩ ］ ６４０ 培地（ＰＯＳを含まない）１−を１
分間で攪拌しながら徐々に滴下する。さらにＲＰＭＩ］
６４０培地８−を徐々に滴下後１５００ｒｐｍｌｏ分間
遠心分離後上清をすてＲＰＭ１１６４０培地３〇−にサ
スペンドしその１００μｔを９６クエルマイクロプレー
トに分注し５４００２インキユベーターで３７℃２４時
間培養する。２４時間後ハ ミノプテリン（０，４μＭ）Ｉチミジン（１６μＭ）を
加えた培地）】ＯＯμｔを加える。以後３日間２４時間
ごとに培養上清］ ００ ｐＬを捨て新たＥＨＡＴ培地
１００ ｐｔを加え約２週間培養する。
ハイブリドーマの増殖が認められたウェルについて以下
に記載する酵素免疫法（以下ＥＬＩＳＡと略記する）に
よりスクリーニングを行った。
に記載する酵素免疫法（以下ＥＬＩＳＡと略記する）に
よりスクリーニングを行った。
ＥＬＩＳＡ 用９６ ’７エルマイクロタイタープレー
ト（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社製）の各ウェルにタンノセク倚
として２５０μ２鷹に調製したヒトＨＤＬ５０μｔを加
え室温で２時間静置した後ＨＤＬｆｄ液を回収する。各
ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝食
塩水（ＰＢＳ、リン酸２ナトリウム・１２Ｈ叩０２．９
ｆ、リン酸ｌカリクム０．２２、塩化ナトリウム８．０
？、塩化カリウム０．２ Ｆ蒸留水を加えてｌ Ｌ、
ｐＨ７，４）で洗浄後１％（Ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミ
ンを含むＰＢＳで各ウェルを一杯にみたし室温で１時間
静置後０．０５チＴｗｅｅｎ ２０を含むＰｆ３３ （
洗浄液）でウェルなよく洗浄する。このようにして抗原
をコーティングしたウェルに増殖の認められたノ・イブ
リドーマ培養上清５０μｔを加え室温で２時間静置後上
記洗浄液で洗浄する。次にピオチン結合抗マクｘ Ｉｇ
Ｇ （１０ｐｆ／ｍｌ ）（Ｖｅｃｔｏｒ社裂）１００
μｔを加え室温１時間静置する。洗浄液でウェルを洗浄
後アビジン結合アルカリフォスファターゼ（Ｖｅｃｔｏ
ｒ社型）の希釈液５０μｔを加え１５分静置し洗浄液で
充分洗浄後、基質（ｐ−二トロフェニルフオスフエート
、Ｓｉｇｍａ社製）の１雫賃ジエタノールアミン緩衝液
（ｐＨ９，８）１００μｔを加え室温３０分反応後４０
５ ｎｍで測定する。
ト（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社製）の各ウェルにタンノセク倚
として２５０μ２鷹に調製したヒトＨＤＬ５０μｔを加
え室温で２時間静置した後ＨＤＬｆｄ液を回収する。各
ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝食
塩水（ＰＢＳ、リン酸２ナトリウム・１２Ｈ叩０２．９
ｆ、リン酸ｌカリクム０．２２、塩化ナトリウム８．０
？、塩化カリウム０．２ Ｆ蒸留水を加えてｌ Ｌ、
ｐＨ７，４）で洗浄後１％（Ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミ
ンを含むＰＢＳで各ウェルを一杯にみたし室温で１時間
静置後０．０５チＴｗｅｅｎ ２０を含むＰｆ３３ （
洗浄液）でウェルなよく洗浄する。このようにして抗原
をコーティングしたウェルに増殖の認められたノ・イブ
リドーマ培養上清５０μｔを加え室温で２時間静置後上
記洗浄液で洗浄する。次にピオチン結合抗マクｘ Ｉｇ
Ｇ （１０ｐｆ／ｍｌ ）（Ｖｅｃｔｏｒ社裂）１００
μｔを加え室温１時間静置する。洗浄液でウェルを洗浄
後アビジン結合アルカリフォスファターゼ（Ｖｅｃｔｏ
ｒ社型）の希釈液５０μｔを加え１５分静置し洗浄液で
充分洗浄後、基質（ｐ−二トロフェニルフオスフエート
、Ｓｉｇｍａ社製）の１雫賃ジエタノールアミン緩衝液
（ｐＨ９，８）１００μｔを加え室温３０分反応後４０
５ ｎｍで測定する。
この方法で抗体産生陽性と判断した培養上清については
上記のＥＬＩＳＡ中抗原なＨＤＬの代りに精製アポＡ−
１を用いたプレートでもＥＬＩＳＡを実施する。抗原が
ＨＤＬであっても精製アポＡ−１であっても強く反応す
るウェルについて限界希釈法を２回繰返し実施してクロ
ーニングを行った。クローニング後も安定して抗ヒトア
、１！Ａ−１抗体を産生ずるハイブリドーマ株を選択し
た。
上記のＥＬＩＳＡ中抗原なＨＤＬの代りに精製アポＡ−
１を用いたプレートでもＥＬＩＳＡを実施する。抗原が
ＨＤＬであっても精製アポＡ−１であっても強く反応す
るウェルについて限界希釈法を２回繰返し実施してクロ
ーニングを行った。クローニング後も安定して抗ヒトア
、１！Ａ−１抗体を産生ずるハイブリドーマ株を選択し
た。
（４） モノクローナル抗体の調製
１（ＡＬＢ、１０７ り；ｘ、雄８週令の腹腔ニ０．５
ｖｎＶＶ５のプリスタン（２，６，１０，１４−テト
ラメチルペンタデカン）を投与後約２週間後に（３）で
得られた抗ヒトアｒｆＡ−（モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ細胞１〜２Ｘ１０’／匹を腹腔に移植する
。約２週間で腹水が生成するので浅水を採取し３．００
Ｏｒｐｍ １０分間遠心分離して上清を集め飽和硫安
を等量加え（５０俤硫安）塩析する。生じた沈澱を遠心
分離（ｓ、ｏｏ。
ｖｎＶＶ５のプリスタン（２，６，１０，１４−テト
ラメチルペンタデカン）を投与後約２週間後に（３）で
得られた抗ヒトアｒｆＡ−（モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ細胞１〜２Ｘ１０’／匹を腹腔に移植する
。約２週間で腹水が生成するので浅水を採取し３．００
Ｏｒｐｍ １０分間遠心分離して上清を集め飽和硫安
を等量加え（５０俤硫安）塩析する。生じた沈澱を遠心
分離（ｓ、ｏｏ。
ｒｐｍ ５分）して集めＰＢＳＩ：、溶解後ＰＢ８
に−夜透析する。この透析画分を０ＮＢｒ活性化セフ
アロース４Ｂ（ファルマシア社ｆｆ）ｌ二ＷＤＬを結合
させたアフイニライカラムにかけモノクローナル抗体を
吸着させ０，２Ｍグリシン−塚酸緩衝液（ｐ）（２，３
）などで溶出することにより精製モノクローナル抗体を
得る。
に−夜透析する。この透析画分を０ＮＢｒ活性化セフ
アロース４Ｂ（ファルマシア社ｆｆ）ｌ二ＷＤＬを結合
させたアフイニライカラムにかけモノクローナル抗体を
吸着させ０，２Ｍグリシン−塚酸緩衝液（ｐ）（２，３
）などで溶出することにより精製モノクローナル抗体を
得る。
モノクローナル抗体の詩興性は先述の
ＥＬＩＳＡのほかにいわゆるウェスタンブロッティング
法により行なう。抗体のクラスはメルカプトエタノール
存在下ドデシル硫酸す）ＪｌｌラムＳＤＳ） 電気泳動
により抗体のＨ鎖から決定する。
法により行なう。抗体のクラスはメルカプトエタノール
存在下ドデシル硫酸す）ＪｌｌラムＳＤＳ） 電気泳動
により抗体のＨ鎖から決定する。
タンパク量の定量はフォーリン法で行なう。
アポＡ−１上の認識部位が同一か異なるか（二ついては
得られた抗体を各々酵素で標識し競合法によって推定す
る。
得られた抗体を各々酵素で標識し競合法によって推定す
る。
このようにしてＨｌ ５ｇ９． Ｈ３Ｄス０，１（１４
Ａ９と命名したハイブリドーマ株から得られるモノクロ
ーナル抗体はＩｇＧクラスに属し、互い１：アポＡ−１
上の認識部位を異にしている抗体である。
Ａ９と命名したハイブリドーマ株から得られるモノクロ
ーナル抗体はＩｇＧクラスに属し、互い１：アポＡ−１
上の認識部位を異にしている抗体である。
本発明のモノクローナル抗体を用いるヒト血しようから
のアポＡ−１の精製法は次の通りである。
のアポＡ−１の精製法は次の通りである。
前述のようにして精製されたモノクローナル抗体を０Ｎ
Ｂｒ活性化セフアローヌ４Ｂに結合させた免疫吸着体を
炸裂する。この場合、３種のモノクローナル抗体各々を
０ＮＢｒ活性化セフアロース４Ｂに結合させ、そのうち
の１種単独、もしくは２種もしくは３種を混合しても免
疫吸着体として用いることができる。この免疫吸着体に
ヒト血しようをそのまま吸着させＰＢＳなどで充分洗浄
後グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，３）などで溶出する
ことによりアポＡ−ｉを含むリホタン／４り質粒子が得
られる。
Ｂｒ活性化セフアローヌ４Ｂに結合させた免疫吸着体を
炸裂する。この場合、３種のモノクローナル抗体各々を
０ＮＢｒ活性化セフアロース４Ｂに結合させ、そのうち
の１種単独、もしくは２種もしくは３種を混合しても免
疫吸着体として用いることができる。この免疫吸着体に
ヒト血しようをそのまま吸着させＰＢＳなどで充分洗浄
後グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，３）などで溶出する
ことによりアポＡ−ｉを含むリホタン／４り質粒子が得
られる。
さらにこれを溶媒（エタノール：エーテルなど）で脱脂
して得られるアボタンノにり質画分をＰＨ１に溶解し再
度前述のモノクローナル抗体結合免疫吸着体に吸着させ
同様の操作で溶出すると電気泳動的に単一のアポＡ−１
が精製される。この方法によれば血しようをそのまま適
用でき、超遠心分離することなしに精製が可能である。
して得られるアボタンノにり質画分をＰＨ１に溶解し再
度前述のモノクローナル抗体結合免疫吸着体に吸着させ
同様の操作で溶出すると電気泳動的に単一のアポＡ−１
が精製される。この方法によれば血しようをそのまま適
用でき、超遠心分離することなしに精製が可能である。
本カラムは繰返し使用ができる。
以下、本発明の実施例を示す。
実施例１
（１） 抗原の採取
健常人５名の血液をクエン酸ナトリウムを抗凝固剤とし
て用い計】を採取した。ただちに遠心分離（］０．ＯＯ
Ｏｒｐｍ １０分）して血しようを分離した。このう
ち一部はモノクローナル抗体カラムによるアｙＷｈ−１
精製用として一８０℃に凍結保存した。残りの血しよう
にエチレンジアミン４酢酸の２ナトリウム場（ＥＤＴＡ
）とアジ化ナトリクムを各々０．０５％（Ｗ／ｖ’）
になるように加え、塩化ナトリウム（固体）を加えて密
度を１．０６３（り一）に調製した。超遠心分離機（日
立製作所５５Ｐ７３）を用イ］Ｏｔ）、０００ Ｘ ９
１７時間】０℃で分離し浮上するカイロミクロン、超低
密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ ）、低密度リポタンパ
クｆｊｌ（ＬＤＬ）を除去した残りに臭化す）Ｊｌｌエ
ム固体）を加え密度をｔ２１（”ｍ）としたのも１６０
，０００×２４８時間、】０℃で超遠心分離した。浮上
したＨＤＬ画分を集め別途塩化ナトリウムと臭化ナトリ
ウムで調製した密度１．２１ （’／７）の溶液と混合
し数回超遠心分離することによリアルゾミンなどのタン
−ぞり質を除去した。
て用い計】を採取した。ただちに遠心分離（］０．ＯＯ
Ｏｒｐｍ １０分）して血しようを分離した。このう
ち一部はモノクローナル抗体カラムによるアｙＷｈ−１
精製用として一８０℃に凍結保存した。残りの血しよう
にエチレンジアミン４酢酸の２ナトリウム場（ＥＤＴＡ
）とアジ化ナトリクムを各々０．０５％（Ｗ／ｖ’）
になるように加え、塩化ナトリウム（固体）を加えて密
度を１．０６３（り一）に調製した。超遠心分離機（日
立製作所５５Ｐ７３）を用イ］Ｏｔ）、０００ Ｘ ９
１７時間】０℃で分離し浮上するカイロミクロン、超低
密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ ）、低密度リポタンパ
クｆｊｌ（ＬＤＬ）を除去した残りに臭化す）Ｊｌｌエ
ム固体）を加え密度をｔ２１（”ｍ）としたのも１６０
，０００×２４８時間、】０℃で超遠心分離した。浮上
したＨＤＬ画分を集め別途塩化ナトリウムと臭化ナトリ
ウムで調製した密度１．２１ （’／７）の溶液と混合
し数回超遠心分離することによリアルゾミンなどのタン
−ぞり質を除去した。
このようにして得られたＨ Ｄ Ｌを０．０５ ％ Ｅ
ＤＴＡ、。
ＤＴＡ、。
０９％塩化ナトリウム溶液に一夜透析しＨＤＬ画分を得
た。
た。
（２） 抗原感作マウス脾細胞の調製ＢＡＬＢ／Ｃマ
ウス′ｊｉｊ；５週令（日本チャールスリノζ−）５匹
の腹腔に（１）で調製したＨＤＬとＦｒｅｕｎｄ’ｓ
ｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ （Ｄｌｆｃｏ ）
を等量混合しＨＤＬ ］ ００μり７匹となるよう投与
して免疫した。
ウス′ｊｉｊ；５週令（日本チャールスリノζ−）５匹
の腹腔に（１）で調製したＨＤＬとＦｒｅｕｎｄ’ｓ
ｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ （Ｄｌｆｃｏ ）
を等量混合しＨＤＬ ］ ００μり７匹となるよう投与
して免疫した。
約２週間間隔でＨＤＬ １００ ｐｆ／匹を同様の方法
で免疫をくり返し４〜５回の免疫で前述の０ｕｃｈｔｅ
ｒｔｎｎｙ法で明らかな沈降線が認められた。
で免疫をくり返し４〜５回の免疫で前述の０ｕｃｈｔｅ
ｒｔｎｎｙ法で明らかな沈降線が認められた。
融合３日前にＨＤＬ ５０μｔをマウス尾静脈より投与
し融合当日脾細胞を調製して融合に供した。
し融合当日脾細胞を調製して融合に供した。
（３） マクス骨髄種細胞の調製
８−アザグアニン耐性のマウス骨髄種細胞Ｎ５−１を８
−アザグアニンを含むＲＰＭ１１６４０培地で調製し融
合時に２Ｘ１０７以上の細胞を確保し融合に供した。
−アザグアニンを含むＲＰＭ１１６４０培地で調製し融
合時に２Ｘ１０７以上の細胞を確保し融合に供した。
（４） ハイブリドーマの作製
＋２１ ＋３）で得られた脾細胞（ＩＸＩＯ’以上）と
マウス骨髄種細胞を５：１の混合比で前述の方法により
融合した。ＨＡＴ培地でハイブリドーマを選択し、前述
のＥＬＩｓＡを用いて抗体温性のウェルを選びＨＴ＠地
（ＨＡ’ｆ’培地からアミノプテリンのみ除去したもの
）を用い２回の限界希釈を実施した。安定に抗体を産生
ずるハイブリドーマ株を几ＰＭ１１６４０培地で培養す
ることによりｌ−１１５Ｅ９．Ｈ３Ｄ１０．Ｈ１４Ａ９
のハイブリドーマ３株を得た。
マウス骨髄種細胞を５：１の混合比で前述の方法により
融合した。ＨＡＴ培地でハイブリドーマを選択し、前述
のＥＬＩｓＡを用いて抗体温性のウェルを選びＨＴ＠地
（ＨＡ’ｆ’培地からアミノプテリンのみ除去したもの
）を用い２回の限界希釈を実施した。安定に抗体を産生
ずるハイブリドーマ株を几ＰＭ１１６４０培地で培養す
ることによりｌ−１１５Ｅ９．Ｈ３Ｄ１０．Ｈ１４Ａ９
のハイブリドーマ３株を得た。
（５） 腹水中のモノクローナル抗体の精製プリスタ
ン処理したＢＡＬＢ１０雄８週令の腹腔に（４）で得ら
れたハイブリドーマ株３株を各々ｌＸｌ０’／匹移殖し
た。約２週間後に生成した腹水を採取し各々３０００ｒ
ｐｍｌＯ分遠心分離して得た上清を５０％硫安分画しＰ
ＢＳに透析した。
ン処理したＢＡＬＢ１０雄８週令の腹腔に（４）で得ら
れたハイブリドーマ株３株を各々ｌＸｌ０’／匹移殖し
た。約２週間後に生成した腹水を採取し各々３０００ｒ
ｐｍｌＯ分遠心分離して得た上清を５０％硫安分画しＰ
ＢＳに透析した。
別途ＣＮＢｒ 活性化セファロース４ＢにＨＤＬを結合
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のマニュアルに従って調製）さ
せたＨＤＬ−セファロース４Ｂをカラム（Ｉ Ｘ １０
ｃｍ ）を３本調製し、これに先の透析内液を３種の
抗体別個に流した。塩化ナトリウムを０．５ Ｍにした
ＰＢＳで洗浄し２８０ ｎｍの吸光度が０．０２以下に
なったら０．２ Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，３
）で溶出した。溶出後直ちに適量のＩＭ）リスヒドロキ
シアミノメタン溶液を加えて中和した。０．２Ｍグリシ
ン−塩酸緩衝液で溶出される両分を集め０．０５％（′
／Ｖ）アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに透析後精製モノ
クローナル抗体とした。このようにして得られた３種の
精製モノクローナル抗体は５ｎｓ−［気泳動で単一であ
った。またメルカプトエタノール還元下での５ＤＳ−電
気泳動で３塊の精製モノクローナル抗体はマウスγ鎖に
相当するＨ鎖の）々ンドを与えいずれもＩｆＧクラスの
抗体であることが判明した。
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のマニュアルに従って調製）さ
せたＨＤＬ−セファロース４Ｂをカラム（Ｉ Ｘ １０
ｃｍ ）を３本調製し、これに先の透析内液を３種の
抗体別個に流した。塩化ナトリウムを０．５ Ｍにした
ＰＢＳで洗浄し２８０ ｎｍの吸光度が０．０２以下に
なったら０．２ Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，３
）で溶出した。溶出後直ちに適量のＩＭ）リスヒドロキ
シアミノメタン溶液を加えて中和した。０．２Ｍグリシ
ン−塩酸緩衝液で溶出される両分を集め０．０５％（′
／Ｖ）アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに透析後精製モノ
クローナル抗体とした。このようにして得られた３種の
精製モノクローナル抗体は５ｎｓ−［気泳動で単一であ
った。またメルカプトエタノール還元下での５ＤＳ−電
気泳動で３塊の精製モノクローナル抗体はマウスγ鎖に
相当するＨ鎖の）々ンドを与えいずれもＩｆＧクラスの
抗体であることが判明した。
（６） 精製モノクローナル抗体の特異性ウェスタン
ブロッティング法により得られた抗体の特異性を確認し
た。０．１％ＳＤＳを含む５〜２０％グラジエントポリ
アクリルアシビ電気泳動により前述のヒトＨＤＬ及び血
しようを泳動させたのち、ゲルとニトロセルロースペー
ノぞ−（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社Ｉ！りを重ね合せゲルホルダ
ーにはさみ、２５ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン、
１ｇ２ｍＭグリシン、２０％（ｖ／ｖ）メタノールを含
むトランスファー緩衝液（ｐＨ８，３） 中】ｏ（ｖ／
、） テ４℃、４時間トランスファーし、ゲル中で分離
したタン、ｅり質をニトロセルロースベーノぞ−に転写
した。トランスファー後のニトロセルロースペーノソ−
を切りとり一部はコマジーブリリアントブルー几２５０
で染色し残りは１％クシ血清アルブミンを含むＰＢＳに
１時間浸したのち３種の精製モノクローナル抗体各々の
浴液と、４℃で一晩反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅ
ｎ ２０を含むＰＢＳで洗浄後、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）
と室温で２時間反応させたのち０．０５チＴｗｅｅｎ
２０を含むＰＢＳで洗浄した。４−クロロ−１−ナフト
−ルを含む基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ）溶液と３０分反応
後に現われるスポットの位置をすでにコマジ−ブリリア
ントゾル−Ｒ２５０で染色したバンドと比較した。結果
を第１図に示す。
ブロッティング法により得られた抗体の特異性を確認し
た。０．１％ＳＤＳを含む５〜２０％グラジエントポリ
アクリルアシビ電気泳動により前述のヒトＨＤＬ及び血
しようを泳動させたのち、ゲルとニトロセルロースペー
ノぞ−（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社Ｉ！りを重ね合せゲルホルダ
ーにはさみ、２５ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン、
１ｇ２ｍＭグリシン、２０％（ｖ／ｖ）メタノールを含
むトランスファー緩衝液（ｐＨ８，３） 中】ｏ（ｖ／
、） テ４℃、４時間トランスファーし、ゲル中で分離
したタン、ｅり質をニトロセルロースベーノぞ−に転写
した。トランスファー後のニトロセルロースペーノソ−
を切りとり一部はコマジーブリリアントブルー几２５０
で染色し残りは１％クシ血清アルブミンを含むＰＢＳに
１時間浸したのち３種の精製モノクローナル抗体各々の
浴液と、４℃で一晩反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅ
ｎ ２０を含むＰＢＳで洗浄後、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）
と室温で２時間反応させたのち０．０５チＴｗｅｅｎ
２０を含むＰＢＳで洗浄した。４−クロロ−１−ナフト
−ルを含む基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ）溶液と３０分反応
後に現われるスポットの位置をすでにコマジ−ブリリア
ントゾル−Ｒ２５０で染色したバンドと比較した。結果
を第１図に示す。
すなわち第１図は、精製モノクローナル抗体の特異性を
示すものでヒ） ＨＤＬおよび血しようを０．１％ＳＤ
Ｓを含む５〜２０％グラジェントポリアクリルアミド電
気泳動により分離した後、ウェスタンブロッティングに
よってニトロセルロース膜にトランスファージタモので
ある。そして図中、 Ａはウェスタンブロッティングでトランスファーした蛋
白のコマジーブリリアントブルーＲ２５０染色図を示し
、 Ｂ〜Ｄはクエスタンプロッテイングでトランスファーし
た後、精製したモノクローナル抗体Ｈ１ｓＥ９． Ｈ３
Ｄ１０． Ｈｌ ４Ａ９の夫々の溶液と４℃で一夜反応
後、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩＰＧ抗体と反応さ
せ、させ、さらに４−クロロ−１−ナフトールを含む基
質溶液と接触して得られる染色図を示している。
示すものでヒ） ＨＤＬおよび血しようを０．１％ＳＤ
Ｓを含む５〜２０％グラジェントポリアクリルアミド電
気泳動により分離した後、ウェスタンブロッティングに
よってニトロセルロース膜にトランスファージタモので
ある。そして図中、 Ａはウェスタンブロッティングでトランスファーした蛋
白のコマジーブリリアントブルーＲ２５０染色図を示し
、 Ｂ〜Ｄはクエスタンプロッテイングでトランスファーし
た後、精製したモノクローナル抗体Ｈ１ｓＥ９． Ｈ３
Ｄ１０． Ｈｌ ４Ａ９の夫々の溶液と４℃で一夜反応
後、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩＰＧ抗体と反応さ
せ、させ、さらに４−クロロ−１−ナフトールを含む基
質溶液と接触して得られる染色図を示している。
第１図から明白なようにこれらのモノクローナル抗体は
ＩＩＤＬ中の他のアポタンノック質や血しよう中のアｙ
ｔ？ｈ−■以外のいかなるタン／−ｅり質とも反応せず
アポＡ−７にのみ特異性を示す抗体であることが認めら
れた。
ＩＩＤＬ中の他のアポタンノック質や血しよう中のアｙ
ｔ？ｈ−■以外のいかなるタン／−ｅり質とも反応せず
アポＡ−７にのみ特異性を示す抗体であることが認めら
れた。
（カ 七ツクｏ−ｆル抗体３種のアポＡ−Ｉ上の認識部
位の相違３ｆ１のモノクローナル抗体が各々認識するア
ポＡ−Ｉ上の抗原決定基が互いに異なるか否かを調べる
ため酵素標識を行った。酵素標識法は、モノクローナル
抗体分子をブタ胃液ペプシン（Ｓｉｇｗａ社）です解し
得られたＦ（ａｂ’）。
位の相違３ｆ１のモノクローナル抗体が各々認識するア
ポＡ−Ｉ上の抗原決定基が互いに異なるか否かを調べる
ため酵素標識を行った。酵素標識法は、モノクローナル
抗体分子をブタ胃液ペプシン（Ｓｉｇｗａ社）です解し
得られたＦ（ａｂ’）。
をメルカプトエチルアミンで還えして得られるＦａｂ’
とマレイミド基を導入した西洋ワサビペルオキシダーゼ
（Ｂｏａｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ ｈｅ ｉｍ社＆りと
を結合させる方法（免疫実験操作法’ｉＪ 、Ｉ）３４
９７゜日本免疫学会、１９８）で調製した。
とマレイミド基を導入した西洋ワサビペルオキシダーゼ
（Ｂｏａｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ ｈｅ ｉｍ社＆りと
を結合させる方法（免疫実験操作法’ｉＪ 、Ｉ）３４
９７゜日本免疫学会、１９８）で調製した。
これらの酵素標識抗体と酵素非標識抗体とのＨＤＬへの
競合能を測定することにより互いの認識部位の相違を推
定した。
競合能を測定することにより互いの認識部位の相違を推
定した。
前述のようにＨＤＬをコーティングしたＥＬ Ｉ ＳＡ
用マイクロタイタープレートの各ウェルに上記の酵素標
識抗体（０，２ｐり／／Ｉ／）と酵素非標識抗体（０〜
１０００μＰ／ｎｔ）の等景況合液５０μｌを入れ室温
２時間静置した後０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む
ＰＢＳで洗浄し基質として２．２′−アジノジー（３−
エチルにンズチアプリン硫酸）のジアンモニウム塩（Ａ
ＢＴＳ、 Ｓｉｇｍａ社製）とＲ２０，を用い反応（室
温３０分）させ６俤シユク酸で反応を止め４０５ ｎｍ
における吸光度を測定した。
用マイクロタイタープレートの各ウェルに上記の酵素標
識抗体（０，２ｐり／／Ｉ／）と酵素非標識抗体（０〜
１０００μＰ／ｎｔ）の等景況合液５０μｌを入れ室温
２時間静置した後０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む
ＰＢＳで洗浄し基質として２．２′−アジノジー（３−
エチルにンズチアプリン硫酸）のジアンモニウム塩（Ａ
ＢＴＳ、 Ｓｉｇｍａ社製）とＲ２０，を用い反応（室
温３０分）させ６俤シユク酸で反応を止め４０５ ｎｍ
における吸光度を測定した。
結果を第２図に示す。
この第２図は酵素標識及び非標識モノクロ ニーナル抗
体のＨＤＬへの競合能を示すものでＨＤＬヲコーティン
グしたＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレートの各ウェ
ルにペルオキシダーゼ標識抗体〔０，２μ）／ゴ；（再
２図ＡはＨ３Ｄ］ Ｏ）。
体のＨＤＬへの競合能を示すものでＨＤＬヲコーティン
グしたＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレートの各ウェ
ルにペルオキシダーゼ標識抗体〔０，２μ）／ゴ；（再
２図ＡはＨ３Ｄ］ Ｏ）。
（第２図Ｂは１１１４Ａ９）〕と酵素非標識抗体（０〜
１０００μｒ／ｄ：Ｈ３５Ｅ９．ｌ−１１４Ａ９．また
はＨ３Ｄ１０）の等景況合液５０μｔを入れ、室温で２
時間静置した後、洗浄し、さらに基質として２．２’
−アジノジ−（３−エチル堅ンズチアゾリン硫酸）−ジ
アンモニウム塩とＨ２Ｏ２を用い室温で３０分間反応さ
せ、６チシユウ酸で反応停止後４０５ ｎｍにおける吸
光度を測定した値のグラフである。図中、 Ｂｏ＝酵素非標識抗体の非存在下での吸光度、Ｂ＝酵素
非標識抗体存在下での吸光度を表わす。
１０００μｒ／ｄ：Ｈ３５Ｅ９．ｌ−１１４Ａ９．また
はＨ３Ｄ１０）の等景況合液５０μｔを入れ、室温で２
時間静置した後、洗浄し、さらに基質として２．２’
−アジノジ−（３−エチル堅ンズチアゾリン硫酸）−ジ
アンモニウム塩とＨ２Ｏ２を用い室温で３０分間反応さ
せ、６チシユウ酸で反応停止後４０５ ｎｍにおける吸
光度を測定した値のグラフである。図中、 Ｂｏ＝酵素非標識抗体の非存在下での吸光度、Ｂ＝酵素
非標識抗体存在下での吸光度を表わす。
以上の結果から３種のモノクローナル抗体は互いに競合
しないことから互いに認識部位を異にしていることが判
明した。
しないことから互いに認識部位を異にしていることが判
明した。
ｐ施例２
実施例】で得られた３種のモノクローナル抗体のうちＨ
１４Ａ９を０ＮＢｒ ｆ＆性化セファロース４Ｂに０．
５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１ Ｍ炭酸水素六トリク
ム緩衝液、ｐＨ８，３中カツプリングさせゲル１−当り
１．８１ｑのモノクローナル抗体が結合した免疫吸着体
（ゲルとして３ｍＡりを調製した。
１４Ａ９を０ＮＢｒ ｆ＆性化セファロース４Ｂに０．
５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１ Ｍ炭酸水素六トリク
ム緩衝液、ｐＨ８，３中カツプリングさせゲル１−当り
１．８１ｑのモノクローナル抗体が結合した免疫吸着体
（ゲルとして３ｍＡりを調製した。
これを内径１ｃｌｎのガラスカラムに充填し０．５Ｍ塩
化す）Ｊｌｌラム含むＰＢＳで平衡化した。このカラム
に前述のヒト血しょうｌ−をアプライし０．５ Ｍ塩化
ナトリウムを含むＰＢＳで洗浄後流液の２８０ ｎｍに
おける吸光度が００２以下になったら０．２Ｍグリシン
−塩酸緩衝液で溶出した。
化す）Ｊｌｌラム含むＰＢＳで平衡化した。このカラム
に前述のヒト血しょうｌ−をアプライし０．５ Ｍ塩化
ナトリウムを含むＰＢＳで洗浄後流液の２８０ ｎｍに
おける吸光度が００２以下になったら０．２Ｍグリシン
−塩酸緩衝液で溶出した。
溶出液は直ちに中和した。本画分は殆ど大部分がアｙｌ
ｆＡ−１で若干のアポＡ−１１とアポ０群を含むＩＪＪ
タン、ｅり質粒子であった。
ｆＡ−１で若干のアポＡ−１１とアポ０群を含むＩＪＪ
タン、ｅり質粒子であった。
本画分をＰＢＳに透析後エタノール：エーテル＝３：２
次いでエーテルで脱脂し窒素ガスで乾燥させたアポタン
パク質を得た。これをＰＢＳに溶解し再度同一のカラム
にかけ同様の操作で溶出させた画分を０．１ Ｍ炭酸ア
ンモニウムに透析後凍結乾燥させた。この画分は５ＤＳ
−電気泳動でアポＡ−■の単一ノ々ンドのみを示した。
次いでエーテルで脱脂し窒素ガスで乾燥させたアポタン
パク質を得た。これをＰＢＳに溶解し再度同一のカラム
にかけ同様の操作で溶出させた画分を０．１ Ｍ炭酸ア
ンモニウムに透析後凍結乾燥させた。この画分は５ＤＳ
−電気泳動でアポＡ−■の単一ノ々ンドのみを示した。
この方法により血しようを超遠心分離することなしにア
ポＡ−Ｉを単離精製することができる。
ポＡ−Ｉを単離精製することができる。
第１図Ａ、 Ｂ、 Ｏ，Ｄは本発明の精製モノクロー第
ナル抗体の特異性を示しヒトＨＤＬおよび血しようを０
１％ＳＤＳを含む５〜２０％グラジェントポリアクリル
アミド電気泳動により分離した後ウェスタンブロッティ
ングによってニトロセルロース膜にトランスファーした
ものである。第２図ＡおよびＢは酵素標識及び非標識モ
ノクローナル抗体のＨＤＬへの競合能を示し、ＨＤＬを
コーティングしたＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレー
トの各ウェルにペルオキシダーゼ標識抗体〔０，２μｔ
／ｍｔ：Ｃ第２図ＡはＨ３Ｄ１０ ）、（第２図ＢはＨ
１４Ａ９））と酵素非標識抗体（０〜１０００μｆ／ｍ
／ ： Ｈ１５Ｅ９．Ｈ１４Ａ９またはＨ３Ｄ１０
）の等景況合液５０μｔを入れ、室温で２時間静置した
後、洗浄し、さらに基質として２．２′−アジノジー（
３−エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩
とＨ２Ｏ，を用い室温で３０分間反応させ、６％シュウ
酸で反応停止後４０５ｎｍにおける吸光度を測定した値
のグラフである。
１％ＳＤＳを含む５〜２０％グラジェントポリアクリル
アミド電気泳動により分離した後ウェスタンブロッティ
ングによってニトロセルロース膜にトランスファーした
ものである。第２図ＡおよびＢは酵素標識及び非標識モ
ノクローナル抗体のＨＤＬへの競合能を示し、ＨＤＬを
コーティングしたＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレー
トの各ウェルにペルオキシダーゼ標識抗体〔０，２μｔ
／ｍｔ：Ｃ第２図ＡはＨ３Ｄ１０ ）、（第２図ＢはＨ
１４Ａ９））と酵素非標識抗体（０〜１０００μｆ／ｍ
／ ： Ｈ１５Ｅ９．Ｈ１４Ａ９またはＨ３Ｄ１０
）の等景況合液５０μｔを入れ、室温で２時間静置した
後、洗浄し、さらに基質として２．２′−アジノジー（
３−エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩
とＨ２Ｏ，を用い室温で３０分間反応させ、６％シュウ
酸で反応停止後４０５ｎｍにおける吸光度を測定した値
のグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、モノクローナル抗体がＩｇＧクラスに属することを
特徴とするヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉに対するモノ
クローナル抗体。 ２、モノクローナル抗体のアポリポタンパク質上の認識
部位が互いに異なる特許請求の範囲第１項に記載のモノ
クローナル抗体３種。 ３、ヒトアポリポタンパク質上の認識部位が互いに異な
るモノクローナル抗体１種もしくは２種もしくは３種を
リガンドとしたアフイニテイクロマトグラフイーにより
ヒト血清もしくは血しようから高純度のアポリポタンパ
ク質Ａ−Ｉを精製する方法。 ４、マウスをヒト高密度リポタンパク質で免疫して得ら
れる脾細胞とマウス骨髄種細胞を通常の方法で融合して
得られたハイブリドーマでヒトアポリポタンク室Ａ−Ｉ
にのみ特異 的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを培
地中で培養するかまたはマウス腹腔に移植して腹水化す
ることにより培養液もしくは腹水中に該モノクローナル
抗体を蓄積させ、該培養液もしくは腹水からモノクロー
ナル抗体を採取することを特徴とするヒトアポリポタン
パク質Ａ−Ｉに対するモノクローナル抗体の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60199909A JPS6258997A (ja) | 1985-09-09 | 1985-09-09 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60199909A JPS6258997A (ja) | 1985-09-09 | 1985-09-09 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6258997A true JPS6258997A (ja) | 1987-03-14 |
Family
ID=16415618
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60199909A Pending JPS6258997A (ja) | 1985-09-09 | 1985-09-09 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6258997A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63159398A (ja) * | 1986-09-29 | 1988-07-02 | スクリップス クリニック アンド リサーチ ファウンデーション | アポリポタンパクａ―１に対して特異性を有するモノクローナル抗体又はそのパラトープ含有ポリペプチド部分並びにそれを使用する診断装置 |
| JPH03200597A (ja) * | 1989-12-21 | 1991-09-02 | Tokyo Tatsuno Co Ltd | 給油機用ホース取付具 |
| JP2010226764A (ja) * | 2007-02-13 | 2010-10-07 | Cotron Corp | マイクロスピーカ及びマイクロスピーカの組立方法 |
-
1985
- 1985-09-09 JP JP60199909A patent/JPS6258997A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63159398A (ja) * | 1986-09-29 | 1988-07-02 | スクリップス クリニック アンド リサーチ ファウンデーション | アポリポタンパクａ―１に対して特異性を有するモノクローナル抗体又はそのパラトープ含有ポリペプチド部分並びにそれを使用する診断装置 |
| JPH03200597A (ja) * | 1989-12-21 | 1991-09-02 | Tokyo Tatsuno Co Ltd | 給油機用ホース取付具 |
| JP2010226764A (ja) * | 2007-02-13 | 2010-10-07 | Cotron Corp | マイクロスピーカ及びマイクロスピーカの組立方法 |
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