JPH0464429B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はフローサイトメトリーを応用した血液
の光学的測定技術に使用するに適した赤血球特に
成熟赤血球と網状赤血球などの血球計数測定用試
薬に関する。

従来の技術 血液試料中の未成熟の赤血球は網状赤血球（レ
チクロサイトReticulocyto.RETとも略記）と称
せられ、通常全赤血球中0.7〜2.2％がこれにあた
り、網状赤血球数の測定によつて急性内出血、溶
血性貧血、産生不良性貧血その他の各種診断を裏
付けるため近時の臨床検査に重要視されてきた。

上記網状赤血球の計数には当初ニユーメチレン
ブルー、ブリリアントクレゾールブルー等の塩基
性染料により染色された塗沫血液が用いられ、全
赤血球を顕微鏡で観察しながら発色した網状赤血
球の割合を計数することが行われた。

上掲の各種染料による染色には血液試料の前処
理、染色後の目視算定に時間と労力を要し、検査
数の大きい場合に不適当であつた。

そこで開発されたフローサイトメトリーによる
血液検査は高速化、精度の向上を達成しつつある
がなお未だ網状赤血球計数にとつて様々な問題が
残されている。

従来技術のうち、米国特許第4336029号、同第
4325706号、同第4284412号は網状赤血球の染色に
アクリジンオレンジを用いることを提案してい
る。このアクリジンオレンジは網状赤血球中の
RNA成分に吸着されて赤色螢光を発し、緑色螢
光が主体の成熟赤血球と区別して計数可能にす
る。しかし、アクリジンオレンジの場合、(A)染色
溶液それ自体のバツクグランド螢光が強く、血球
由来の螢光強度測定に背景雑音となり誤差を生じ
易い、(B)螢光が赤色領域の630nm以上であるた
め、高感度の螢光測光装置が必要、(C)非特異染色
の度合が強く、成熟赤血球の中に赤色螢光を発生
させるため、検体間誤差の小さい染色液組成の調
製が難しい、(D)血小板を強く染色するため、測定
中に血小板と赤血球が同時通過すると成熟赤血球
の散乱光強度と血小板の赤色螢光強度とが同時測
定され、これが網状赤血球相当の信号レベルを構
成するので誤差の原因となる、(E)アクリジンオレ
ンジ溶液は環境依存性が大きく螢光強度が変化し
易い、などの問題があつた。

また、特開昭59−142465号公報においては染料
としてチオフラビンＴの使用を開示している。こ
れは、血液試料のRNA染色を行つた後希釈や洗
浄によつて背景螢光及び成熟赤血球の非特異螢光
を減少させたうえで網状赤血球のRNA螢光をフ
ローサイトメータで検出測定するものであるが、
(F)上記希釈を通じて非特異螢光の低減に伴ない同
時にRNA結合の染料による特異螢光も低減する
ため、螢光感度の高い測定装置が要求される。ま
た、(G)希釈後は螢光強度の経時的低下が激しくな
るので再現性の高いデータが得られない又（G′）
染色に比較的時間がかかるという問題があつた。

さらに、ピロニンＹを染料として用いることも
行われたが、これは固定した赤血球をRNA染色
してから洗浄して非特異螢光及び背景螢光を完全
に除いた後、RNA結合の染料による特異螢光を
測定するものである。これは(H)血球の事前固定処
理、染色、洗浄の各工程に要する時間が大きく他
の方式の数十倍の所要時間がかかるため多検体処
理には適当でない、(I)ピロニンＹそのものの螢光
量子収率がきわめて低く、このため大出力レーザ
光源による励起によつてはじめて測定可能にな
る、(J)ピロニンＹは低重合度のRNA、DNAとし
か結合しないので特異螢光を得るべきRNA染色
の効率が低い、などの問題があつた。

発明が解決しようとする問題点 従来使用されているフローサイトメトリーによ
る染色網状赤血球計数に避け難い前述のごとき、
アクリジンオレンジの場合の(A)〜(E)、チオフラビ
ンＴの場合の(F)〜(G)′、ピロニンＹの場合の(H)〜
(J)のすべての問題点を及ぶ限り除去し得る染料物
質を選択使用して、染色試料中の網状赤血球の螢
光強度を増強させ、その反面試料溶液については
その背景螢光を低下させて螢光測定におけるＳ／
Ｎ比を高め、網状赤血球の測定精度を格段に向上
せしめることが本発明の解決しようとする課題で
ある。

問題点を解決するための手段 本発明は、上記の問題点の多くを解決し、全血
液試料中の赤血球について成熟赤血球群と未成熟
赤血球であつてRNAの多い網状赤血球群とを
RET比率の多少、赤血球濃度の大小等に影響さ
れることなく鮮烈かつ強固な螢光染色を網状赤血
球群に施こしこれの高精度の識別を可能にするも
のであり、そのために本発明は網状赤血球を螢光
染色するためオーラミンを用いることを特色とす
るフローサイトメトリー用血球測定試薬を実現し
たものである。血球形状を安定化させるために塩
化ナトリウム等のアルカリ金属塩を添加して染色
液試薬を等張にし、また血液細胞の染色効率を高
めるために緩衝剤を添加することが最適である。

螢光染料としてのオーラミンＯは または が用いられ、さらにオーラミンＧ やジエチルアニリン等より製造するbis−（４−
Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノフエニル）イミノメタン も用いられ得る。これらのオーラミンは染色血球
に対して鮮明な色相を与えるとともにそれ自体の
着色力も大である。

なお、オーラミンを螢光染料とした場合、界面
活性剤例えばトリトン−Ｘを少量添加すると、染
色された成熟赤血球及び網状赤血球の均一化が効
率よく達成され各血球からの散乱光強度及び螢光
強度の増強を助けるとともに、この増強作用はグ
ルタルアルデヒドを加えるとより高められ結局溶
液の背景螢光を相対的に抑制し得るので、網状赤
血球分布をまとめ膜粘性を下げてその弁別計数を
さらに一層容易ならしめ測定精度の向上に役立
つ。

オーラミンは試薬１ml当り20〜2500μgの含量
が、又塩化ナトリウムなどのアルカリ金属塩は同
じく５〜20mgでよく、PHは６〜10に適宜調整する
ことが好適である。

上述した組成分を含有する等張緩衝染料溶液は
EDTAなどで抗凝固化した全血液試料と混合す
るための血球測定特に網状赤血球測定用試薬とな
る。

作 用 以上の構成による血球測定用試薬を抗凝固性全
血液試料に混合すると、オーラミン染料が網状赤
血球を含む血球をすべて鮮烈に染色し特に細胞中
のRNAと結合し析出させ１時間以上安定した黄
色螢光を帯びさせる。染色された血球は水銀又は
キセノンア−クランプ、レーザ（He−Cdレーザ
又はArレーザ）の490〜500nm程度までの励起光
源を用い約520〜700nm程度以上の黄色螢光をフ
ローサイトメータで検出する。

本発明による試薬を使用した場合の成熟赤血球
群の弁別域は未成熟の網状赤血球さらに血小板の
各弁別域と明確に区別しやすくなる。

実施例 (1) オーラミンＯ：1gr、塩化ナトリウム：9grに
0.01M／リン酸緩衝液と水を加えて１とし
PH7.20の黄色の試薬を調製した。この試薬５ml
にEDTA抗凝固新鮮血10μを加え、室温で10
分間インキユベートした後螢光フローサイトメ
ータに送入した。光源は約480nmまでの励起光
を発生する水銀アークランプを用い、520nm以
上の螢光を受光検出した。前方散乱光−後方螢
光で検出した網状赤血球の弁別域を四角形で囲
んだ0.1〜26％RETの30検体についての測定結
果が第１図ａ，ｂ及び第２図に示されている。
この場合の測定データＹと目視計数データＸと
の相関は極めて高く、相関係数ｒ＝0.995、回
帰直線はＹ＝1.14×−0.05が得られた。

(2) 細胞容積を反映しにくく赤血球群と血小板と
の区別が比較的困難とされる側方散乱光を後方
螢光とともに測光し成熟赤血球、網状赤血球、
血小板をそれぞれ個別に計数することにした。

染色液組成は、オーラミンＯ：400mgｒ、塩
化ナトリウム：9gr、グルタルアルデヒド：30
mgｒに0.02M／リン酸緩衝液と水を加えて１
としPH8.00の黄色を帯びた試薬を調製した。
この染色液５mlにEDTA抗凝固血液又はこれ
から密度勾配法により網状赤血球を濃縮した試
料10μを加え、室温で10分間インキユベート
した後上記(1)と同様に螢光フローサイトメータ
により580nm以上の螢光と側方散乱光とを受光
検出計数した。目視データとの相関は、網状赤
血球比率の低値域から高値域まで極めてよく、
赤血球の散乱光も比較的均一化されていた。結
果は第３図ａ，ｂに示した。

(3) 次にオーラミンの濃度を１桁以上薄めたほ
か、組成数値を変えて(2)と同じ検体で側方散乱
光／後方螢光で網状赤血球を計数した。

染色液組成は、オーラミンＯ：30mgｒ、塩化
ナトリウム：13gr、グルタルアルデヒド：100
mgｒに0.02M／ホウ酸緩衝液と水を加えて１
としPH9.00の黄色試薬を調製した。この試薬
５mlにEDTA抗凝固血から密度勾配法により
網状赤血球を濃縮した試料10μを加え、室温
で10分間インキユベートした後フローサイトメ
ータに送入し血球測定した。受光した螢光波長
は540nm以上であつた。結果は、第４図ａ，ｂ
に明らかなように、赤血球の散乱の拡がりが見
られたが測定値は殆んど変らなかつた。

(4) オーラミンＯ：400mg、塩化ナトリウム：8gr
に0.01M／のリン酸緩衝液と水を加え１の
PH8.0の試薬を調製した。この試薬２mlに
EDTA抗凝固剤入り新鮮血10μを加え室温で
30秒間インキユベートした後螢光フローサイト
メータに送入した。光源はアルゴンイオンの青
色レーザー光を用い、波長488nm出力10mwの
低出力で前記試料を励起し前方散乱光と520nm
以上の側方螢光を光電変換器で受光するかたち
で螢光フローサイトメータで測定した。

従来にない低出力励起にもかゝわらず、試料
数30検体で従来法の目視法との相関係数ｒ＝
0.97回帰直線Ｙ＝1.145×−0.07（％）が得られ、
網状赤血球数の低値から高位までよく目視と一
致するデータが得られた。

第５図ａ，ｂ，ｃは、横軸に螢光強度率縦軸に
散乱強度率をとり各粒子信号をプロツトしたもの
で横の数値は図の四角で囲んだ部分の網状赤血球
数の測定値と視算値を示している。

第６図は前記の相関を示すグラフで、横軸にオ
ーラミンＯによる測定値と縦軸に視算値を表した
ものである。

効 果 以上に述べた本発明試膜を用いフローサイトメ
ータに血液試料と混合してから流すと、赤血球群
と血小板との弁別はもちろんのこと、赤血球群の
中で成熟した通常の赤血球と未成熟の網状赤血球
との唆別が鮮明な染色状態で明確に行えることに
なる。実際に目視測定データとの優れた相関が確
認された。また、血液試料との混合後の溶液の背
景螢光が極端に低下させ得るのでアクリジンオレ
ンジ等の場合のように螢光の一部をフイルタで選
択してとるのでなく血球の螢光を特異的にすべて
捕捉することができ、低出力の励起光源を用いて
も可測である。この場合、染料としてのオーラミ
ンは成熟赤血球膜に非特異吸着しても微弱な螢光
を発するに留まり、これに対して網状赤血球では
高い強度の螢光を発するので判別が簡単である。
又染色が迅速であり従来のアクリジンオレンジ法
の1/10以下の時間で網状赤血球の多い検体まで充
分染色が完了する。フローサイトメトリーでは血
球を浮懸した試料溶液を計数孔を通過させるが、
この際血小板と成熟赤血球とが同時に孔を通過す
ると網状赤血球として計数される誤差が伴なう。
しかし本発明試薬を用いると、網状赤血球の螢光
強度が極めて高くなるため成熟赤血球数と網状赤
血球数を混同することなくそれぞれ正確に計数し
得る。これに関連して、オーラミン濃度をある程
度高めると非特異吸着した染料同士の反撥により
血球同士の凝集−同時通過が避けられる。さら
に、オーラミンはPH上昇で簡単に分解するのでフ
ローサイトメータ流路系に付着しても洗浄が極め
て容易である。また、オーラミンを用いた場合、
染料自体の特性から赤血球の前方散乱光強度分布
のまとまりがよくこれまでのような散開状態が少
なくなつたため、前方散乱光による血小板と赤血
球との分離が良好になりこれらの計数の精度向上
も期待できる。オーラミンはまた非特異染色の条
件を増大させても網状赤血球の螢光強度だけが増
加する特異染色の増強につながる一方成熟赤血球
の螢光強度は増加しない。この結果、染色の度合
を高めてフローサイトメータの螢光強度をより一
層上昇させたり、低い比率域の網状赤血球試料に
対する計数精度を維持した適応性が高まるなど多
くの利点を実現し得るものである。

【図面の簡単な説明】

第１ａ，１ｂ図は本発明試薬を使用してフロー
サイトメータにより測定した散乱光強度−螢光強
度分布図、第２図は第１ａ，１ｂ図に基づく網状
赤血球計数の測定データと目視データの相関を示
すグラフ、第３ａ，３ｂ図及び第４ａ，４ｂ図は
異なる実施例についての第１ａ，１ｂ図と同様の
分布図を示すものである。さらに、第５ａ，５
ｂ，５ｃ図は他の実施例による第１図又は第３
図、第４図と同様の分布図、第６図は第５図に対
する、第２図と同様の相関グラフを示すものであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 網状赤血球の螢光染料としてオーラミンＯを
   含有することを特徴とするフローサイトメトリー
   用血球測定試薬。 ２ 特許請求の範囲１記載の試薬において、オー
   ラミンＯ：20〜2500μg／ml、アルカリ金属塩５
   〜20mg／ml、適量の緩衝剤を添加しPH６〜9.5に
   調整してなることを特徴とするフローサイトメト
   リー用血球測定試薬。