JPH0133450B2 - - Google Patents
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- JPH0133450B2 JPH0133450B2 JP55095167A JP9516780A JPH0133450B2 JP H0133450 B2 JPH0133450 B2 JP H0133450B2 JP 55095167 A JP55095167 A JP 55095167A JP 9516780 A JP9516780 A JP 9516780A JP H0133450 B2 JPH0133450 B2 JP H0133450B2
- Authority
- JP
- Japan
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- pka
- factor xii
- isg
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- activity
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明は、改良された免疫血清グロブリン
（ISG）調製剤、及び特に現存するプレカリクレ
イン（prekallikrein）活性化活性（PKA）及び
特別なPKAプレカーサーから時間と共に発生す
るPKAを実質的に有さないISG調製剤に関する。 ISGの無ガンマグロブリン血症の患者への投与
が複雑な感染症を処置するのに大きな臨床的価値
を有することは十分公知である。悪いことに、現
在の筋肉内注射による投与法は、達成され得る抗
体の有効循環値をしばしば厳しく制限する。更
に、ISGの大投薬量による直接的な静脈内注射
は、時に起こる望ましからぬ血管運動応答のため
にしばしば可能でない。この応答の起源は、補体
を結合し及びアナフイラキシー様の反応を開始さ
せるIgG集合体の存在に帰せられる。キニン
（kinin）系成分の可能な役割は、PKAのISG中に
おける存在が指摘されてきたにも拘らず従来考慮
されなかつた。 今日まで、特別なPKAプレカーサーが市販の
ISG溶液中のPKA活性に関係するという示唆は
なかつた。全く驚くことに、今回現存する及び潜
在的なPKA活性は、イオン交換体と接触させて
現存するPKA活性及びISG溶液中に存在するこ
とが予じめ知られてないPKAへのカリクレイン
活性化プレカーサーの双方を除去することによ
り、ISG溶液から排除することができる。ISG精
製法及びこれによつて生成される生成物の詳細は
下記の通りである。 精製されたISG調製剤は、PKA及びフアクタ
ー（Factor）XIIであることが示されるPKAへの
カリクレイン活性化プレカーサーの双方を実質的
に有さないISG水溶液を含んでなる。この精製法
は、PKA及び／又はフアクターXIIを含有すると
考えられるコーン画分のISG溶液を、実質的に
すべてのPKA及びフアクターXIIをISG溶液から
除去するのを保証するのに十分な条件下にアニオ
ン交換物質と接触させることを含んでなる。好適
な具体例において、精製法は初期フアクターXII活
性を１％以下で含有するISG溶液とするのに十分
な条件下に、ISG溶液をアニオン交換樹脂（例え
ばQAE又はDEAE−セフアデツクス充填物）と
接触することを含んでなる。 図面は、５％ISGの新しく溶解した溶液（画分
、緩衝剤、0.05TRIS、0.05NaCl、PH8.1に溶解
したアセトン乾燥粉末）のDEAE−セフアデツク
スクロマトグラフイーを例示し、図に示した条件
下に分離されるISG、フアクターXII及びPKA活
性の各量を示す。 本発明の発見は、種々のISG溶液をキニン成分
の存在に対して検査した結果に基づいている。こ
の検討は、そのような成分の関係及び血管活性物
質の可能な発生を理解するために行なつた。その
ような成分の同定は、該成分の除去法及び望まし
からぬ血管活性剤を有さないISG溶液の調製法の
発見に対して必要な前提条件であると考えた。 PKA活性の重要な量はしばしばISG溶液にお
いて観察されるということは公知である。この観
察される量の可変性及び貯蔵後に増加する活性の
見かけの傾向は、新しく溶解させたISG溶液中の
PKA活性の出現の時間依存性に関する研究をう
ながした。37℃で保温したとき、ISG溶液は
PKA活性量が漸次増加することを示した。この
活性の出現速度はゆつくりであるけれど、それは
数日間に亘つて継続することが発見された。37℃
で７日後、この活性量は明らかに10倍以上増加し
た。 上述のPKA活性のゆつくりした出現が研究の
期間に亘るキニン系成分の進行的活性化の結果で
あるかどうかを決定するために、外因性酵素の添
加効果を検討した。ISG溶液をPKA又はカリク
レインのいずれかと一緒に保温した結果を第表
に示す。
（ISG）調製剤、及び特に現存するプレカリクレ
イン（prekallikrein）活性化活性（PKA）及び
特別なPKAプレカーサーから時間と共に発生す
るPKAを実質的に有さないISG調製剤に関する。 ISGの無ガンマグロブリン血症の患者への投与
が複雑な感染症を処置するのに大きな臨床的価値
を有することは十分公知である。悪いことに、現
在の筋肉内注射による投与法は、達成され得る抗
体の有効循環値をしばしば厳しく制限する。更
に、ISGの大投薬量による直接的な静脈内注射
は、時に起こる望ましからぬ血管運動応答のため
にしばしば可能でない。この応答の起源は、補体
を結合し及びアナフイラキシー様の反応を開始さ
せるIgG集合体の存在に帰せられる。キニン
（kinin）系成分の可能な役割は、PKAのISG中に
おける存在が指摘されてきたにも拘らず従来考慮
されなかつた。 今日まで、特別なPKAプレカーサーが市販の
ISG溶液中のPKA活性に関係するという示唆は
なかつた。全く驚くことに、今回現存する及び潜
在的なPKA活性は、イオン交換体と接触させて
現存するPKA活性及びISG溶液中に存在するこ
とが予じめ知られてないPKAへのカリクレイン
活性化プレカーサーの双方を除去することによ
り、ISG溶液から排除することができる。ISG精
製法及びこれによつて生成される生成物の詳細は
下記の通りである。 精製されたISG調製剤は、PKA及びフアクタ
ー（Factor）XIIであることが示されるPKAへの
カリクレイン活性化プレカーサーの双方を実質的
に有さないISG水溶液を含んでなる。この精製法
は、PKA及び／又はフアクターXIIを含有すると
考えられるコーン画分のISG溶液を、実質的に
すべてのPKA及びフアクターXIIをISG溶液から
除去するのを保証するのに十分な条件下にアニオ
ン交換物質と接触させることを含んでなる。好適
な具体例において、精製法は初期フアクターXII活
性を１％以下で含有するISG溶液とするのに十分
な条件下に、ISG溶液をアニオン交換樹脂（例え
ばQAE又はDEAE−セフアデツクス充填物）と
接触することを含んでなる。 図面は、５％ISGの新しく溶解した溶液（画分
、緩衝剤、0.05TRIS、0.05NaCl、PH8.1に溶解
したアセトン乾燥粉末）のDEAE−セフアデツク
スクロマトグラフイーを例示し、図に示した条件
下に分離されるISG、フアクターXII及びPKA活
性の各量を示す。 本発明の発見は、種々のISG溶液をキニン成分
の存在に対して検査した結果に基づいている。こ
の検討は、そのような成分の関係及び血管活性物
質の可能な発生を理解するために行なつた。その
ような成分の同定は、該成分の除去法及び望まし
からぬ血管活性剤を有さないISG溶液の調製法の
発見に対して必要な前提条件であると考えた。 PKA活性の重要な量はしばしばISG溶液にお
いて観察されるということは公知である。この観
察される量の可変性及び貯蔵後に増加する活性の
見かけの傾向は、新しく溶解させたISG溶液中の
PKA活性の出現の時間依存性に関する研究をう
ながした。37℃で保温したとき、ISG溶液は
PKA活性量が漸次増加することを示した。この
活性の出現速度はゆつくりであるけれど、それは
数日間に亘つて継続することが発見された。37℃
で７日後、この活性量は明らかに10倍以上増加し
た。 上述のPKA活性のゆつくりした出現が研究の
期間に亘るキニン系成分の進行的活性化の結果で
あるかどうかを決定するために、外因性酵素の添
加効果を検討した。ISG溶液をPKA又はカリク
レインのいずれかと一緒に保温した結果を第表
に示す。
【表】
PKAはPKA活性の更なる発生をもたらすこと
に影響しないが、カリクレインはPKAの出現速
度を劇的に加速する。このPKA発生の迅速な速
度は添加されるカリクレインの量に依存するが、
各々の場合同様の程度の活性化が達成された。更
にカリクレインと一緒に保温した後に到達する
PKA活性の最終量は、ISGを非常に長期間に亘
つて単独で保温したときに得られるものと対比で
きた。これらのデータは、プレーPKA物質のプ
ール（pool）がISG溶液中に存在することを示唆
した。このプレカーサーをPKAへ活性化するカ
リクレインの能力はこの成分をハーゲマン因子と
しても公知であるフアクターXIIとして潜在的に同
定しうることを示唆し、及びこれはカリクレイン
処理へ供する前後のフアクターXII及びPKA量を
測定することによつて仮に確認できた。参照第
表。
に影響しないが、カリクレインはPKAの出現速
度を劇的に加速する。このPKA発生の迅速な速
度は添加されるカリクレインの量に依存するが、
各々の場合同様の程度の活性化が達成された。更
にカリクレインと一緒に保温した後に到達する
PKA活性の最終量は、ISGを非常に長期間に亘
つて単独で保温したときに得られるものと対比で
きた。これらのデータは、プレーPKA物質のプ
ール（pool）がISG溶液中に存在することを示唆
した。このプレカーサーをPKAへ活性化するカ
リクレインの能力はこの成分をハーゲマン因子と
しても公知であるフアクターXIIとして潜在的に同
定しうることを示唆し、及びこれはカリクレイン
処理へ供する前後のフアクターXII及びPKA量を
測定することによつて仮に確認できた。参照第
表。
【表】
画分粉末のDEAE−セフアデツクスのクロマ
グラフイーからの画分を含有するプールした“プ
レーPKA”のXII量（凝集法による）及びPKA量 精製工程及びフアクターXIIの存在の確認に際し
て使用される物質及び評価法は下記の通りであ
る。 物質及び方法 MES、Trizma 塩基（TRIS HClを製造する
ために使用）、ベンゾイルアルギニンエチルエス
テル：シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical
Co.、St.Louis、Missouri）製。 ｐ−アミノベンズアミジン、ε−アミノカプロ
ン酸、ジチオスレイトール、及びヨードアセトア
ミド：アルドリツチ・ケミカル社（Aldrich
Chem.Co.、Milwaukee、Wisconsin）製。 DEAE−セフアデツクス、コンカナバリン −
Ａ−セフアローズ（Concanavalin Ａ−
Sepharose）、セフアローズCL−4B：フアーマシ
ア社（Pharmacia Inc.、Piscataway、New
Jersey）製。 フアクターXII欠陥血漿：ジヨージ・キング研究
所（George King Laboratories、Overland
Park、Kansas）製。 スロンボフアツクス試薬（Thrombofax
Reagent）（牛の脳のセフアリン）：オルト・ダイ
アグノスチツクス社（Ortho Diagnostics、Inc.、
Raritan、New Jersey）製。 プレカリクレイン（PK）物質は、新しく採取
し、クエン酸塩処理した人間の血漿を、室温下に
0.05M Tris HCl、PH8.0に対して大規模にダイア
フイルター（diafilter）し、及び次いでこれを同
一の緩衝剤中で平衡化したDEAE−セフアデツク
スのカラム中を通過させることによつて調製し
た。PK活性の大部分を含有する結合してない画
分をプールし、及び室温で２時間コンカナバリン
Ａ−セフアローズを用いてバツチ式に吸着させ
た。次いでコンカナバリンＡ−セフアローズをブ
フナー斗に集め、Tris緩衝剤で洗浄し、次い
で結合したPKを、0.2M α−メチル−Ｄ−グル
コシドを含有する同一の緩衝剤で流出させた。こ
の工程から得られるPK物質は、室温で24時間後
カリクレインの自然発生が起こらないので、実質
的に活性化を含まなかつた。 プレカリクレイン活性剤 プレカリクレイン活性剤（PKA）は、カツタ
ー研究所（Cutter Laboratories、Inc.、
Berkley、California）から得られるコーン画分
（Cohn Fraction）から調製した。新しい画分
のペーストを0.05M Tris HCl緩衝剤、PH8.0に
溶解し、この溶液を同一の緩衝剤中で平衝化させ
たDEAE−セフアデツクスを用いてバツチ式に吸
着させた。このDEAE−セフアデツクスを焼結し
たガラス斗上で除去し、更なる出発緩衝剤で及
び最後に0.5M NaClを含有する出発緩衝剤で乾
燥した。PKAを含有する0.1M NaCl洗浄物を超
過によつて濃縮し、ダイヤフイルトレーシヨン
（diafiltration）によりPBS緩衝剤（0.05M
NaH2PO4、0.15M NaCl、PH7.5）と交換させた。 ベンズアミジン−EACA−セフアローズ セフアローズCL−4B（フアーマシア社）を、
室温下、PH11.0においてシアノーゲンブロマイド
で活性化させ、及びε−アミノカプロン酸をPH
9.5において夜通し活性化された樹脂に結合させ
た。十分洗浄後、PHを5.6に調節し、物質をｐ−
アミノベンズアミジンの添加に先立つて短期間カ
ルボジイミドで処理した。 カリクレイン この酵素は、精製されたプレカリクレインを室
温下に触媒量の濃PKAと混合し、及びカリクレ
インへの転化を完結させることによつて調製し
た。次いでこの混合物を、0.05M Tris HCl、PH
8.0中で平衡化させたベンズアミジン−EACA−
セフアローズのカラムに適用した。短期間洗浄し
た後、直線的なアルギニンのグラジエントを適用
した。カリクレインを含有する画分をプールし、
PHを6.0に調節し（0.1M MES緩衝剤、PH6.0で交
換）、及び超過により4.5BAEEu／mlまで濃縮
した。超過後の収率は93％であり、比活性は
A280当り16.8BAEE単位であつた。この物質を非
常に純粋であると報告する。調製物のSDS−
PAGEは分子量85000の単一帯を示した。 PKAに対する評価 PKAに対する評価法は、限られた量のPKAに
よつてプレカリクレインから製造されるカリクレ
インを、BAEEでの初期速度評価法によつて決定
するというカツプルド評価法（coupled assay）
であつた。プレカリクレイン物質（50λ）及び
PKA（25λ）に対して試験すべき試料を、一緒に
37℃に保温した。５分間において、25λ部分を取
り出し、PBS緩衝剤、PH8.0中0.05ｍＭ BAEE
の２mlと37゜で混合し、及び熱電対のついた37゜の
キユーベツト・ホルダー（cuvette holder）を用
いる分光器において加水分解速度を253ｍＭで連
続的に記録した。 評価法において、プレカリクレインのカリクレ
インへの転化速度がプレカリクレインに関して擬
一次であるように、プレカリクレイン物質の濃度
を酵素PKAに対するKmよりも十分に高くした。
即ちPKAの量を計算するための方程式 PKA（ｕ／ml）＝３／ｔ loPKo／PKo−Kt は、PK濃度に並びに一定のPKA濃度に比例する
反応速度を仮定している。 この方程式において、“３”は保温混合物中の
試料に対する希釈係数であり；ｔは５分間一定に
保つた保温の時間であり；Ktは特定の保温時間
で生成するカリクレインの量、即ち△A253／分で
あり；及びPKoはプレカリクレインの出発量で
ある。 この評価法は2mu／mlのPKA量に対して敏感
であり、PKのＫへの60％転化以下において殆ん
ど正確であつた。 プレーPKA活性（フアクターXII）に対する評価 活性なPKAのプレカーサーに対する評価法は、
試料0.9ml及び濃度4.5BAEEu／mlのカリクレイ
ン0.1mlを、活性酵素へ完全に転化させるのに十
分な期間37゜に保温することを含む。この結果は、
約400分が最小許容時間であることを示した。こ
の保温後25λ部分を取り出し、普通の方法でPKA
に対し評価した。試料中で持ち込まれた検出しう
るカリクレイン活性は存在するから、PKA含量
の計算に先立つてこのバツクグラウンドを引き算
することにより、測定した△A253を補正しなけれ
ばならない。 フアクターXII凝集試験 フアクターXIIは、通常のプールした血漿を対照
として用いるフイブロメータ（Fibrometer ）
において、先天的に欠陥の血漿が凝固する時間を
補正する能力に対して試験した。 実施例 ISGの免疫グロブリン画分からのプレーPKA
の分離 DEAE−セフアデツクスをPH8.1で用い且つ
0.05M Tris HCl及び0.05M NaClからなる緩衝
剤を用いることにより、コーン画分の５％ISG
溶液（200ml）をクロマトグラフイーで処理した。
これらの条件下において、免疫グロブリンの主な
たん白質ピークは、図に示されるように、カラム
に保留されなかつた。しかしながら、カリクレイ
ン活性化プレーPKAのピークはカラムに捕捉さ
れ及び全濃度0.22M NaClでの塩グラジエントに
より流出させることができた。これらの流出物の
特性は、フアクターXIIに関して先に示したものと
同様であることがわかつた。 更に、PKA活性のピークも塩グラジエントで
流出できた。この活性は塩濃度0.32〜0.34Mにお
いて流出でき、プレーPKA物質のピークから良
く分離されていた。PKA及びプレーPKA画分の
双方のDEAEへの結合は、これらの活性をISGか
ら実質的に完全に除去することを可能にする。こ
れは、新しく溶解したISG調製剤に関し、図面で
及び下表で示されている。DEAE−セフアデツ
クスでのクロマトグラフイーによるISGは、免疫
電気泳動法と抗全人血漿との関係に従えば、電気
泳動での移動の純度における変化が観察されなか
つた。
グラフイーからの画分を含有するプールした“プ
レーPKA”のXII量（凝集法による）及びPKA量 精製工程及びフアクターXIIの存在の確認に際し
て使用される物質及び評価法は下記の通りであ
る。 物質及び方法 MES、Trizma 塩基（TRIS HClを製造する
ために使用）、ベンゾイルアルギニンエチルエス
テル：シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical
Co.、St.Louis、Missouri）製。 ｐ−アミノベンズアミジン、ε−アミノカプロ
ン酸、ジチオスレイトール、及びヨードアセトア
ミド：アルドリツチ・ケミカル社（Aldrich
Chem.Co.、Milwaukee、Wisconsin）製。 DEAE−セフアデツクス、コンカナバリン −
Ａ−セフアローズ（Concanavalin Ａ−
Sepharose）、セフアローズCL−4B：フアーマシ
ア社（Pharmacia Inc.、Piscataway、New
Jersey）製。 フアクターXII欠陥血漿：ジヨージ・キング研究
所（George King Laboratories、Overland
Park、Kansas）製。 スロンボフアツクス試薬（Thrombofax
Reagent）（牛の脳のセフアリン）：オルト・ダイ
アグノスチツクス社（Ortho Diagnostics、Inc.、
Raritan、New Jersey）製。 プレカリクレイン（PK）物質は、新しく採取
し、クエン酸塩処理した人間の血漿を、室温下に
0.05M Tris HCl、PH8.0に対して大規模にダイア
フイルター（diafilter）し、及び次いでこれを同
一の緩衝剤中で平衡化したDEAE−セフアデツク
スのカラム中を通過させることによつて調製し
た。PK活性の大部分を含有する結合してない画
分をプールし、及び室温で２時間コンカナバリン
Ａ−セフアローズを用いてバツチ式に吸着させ
た。次いでコンカナバリンＡ−セフアローズをブ
フナー斗に集め、Tris緩衝剤で洗浄し、次い
で結合したPKを、0.2M α−メチル−Ｄ−グル
コシドを含有する同一の緩衝剤で流出させた。こ
の工程から得られるPK物質は、室温で24時間後
カリクレインの自然発生が起こらないので、実質
的に活性化を含まなかつた。 プレカリクレイン活性剤 プレカリクレイン活性剤（PKA）は、カツタ
ー研究所（Cutter Laboratories、Inc.、
Berkley、California）から得られるコーン画分
（Cohn Fraction）から調製した。新しい画分
のペーストを0.05M Tris HCl緩衝剤、PH8.0に
溶解し、この溶液を同一の緩衝剤中で平衝化させ
たDEAE−セフアデツクスを用いてバツチ式に吸
着させた。このDEAE−セフアデツクスを焼結し
たガラス斗上で除去し、更なる出発緩衝剤で及
び最後に0.5M NaClを含有する出発緩衝剤で乾
燥した。PKAを含有する0.1M NaCl洗浄物を超
過によつて濃縮し、ダイヤフイルトレーシヨン
（diafiltration）によりPBS緩衝剤（0.05M
NaH2PO4、0.15M NaCl、PH7.5）と交換させた。 ベンズアミジン−EACA−セフアローズ セフアローズCL−4B（フアーマシア社）を、
室温下、PH11.0においてシアノーゲンブロマイド
で活性化させ、及びε−アミノカプロン酸をPH
9.5において夜通し活性化された樹脂に結合させ
た。十分洗浄後、PHを5.6に調節し、物質をｐ−
アミノベンズアミジンの添加に先立つて短期間カ
ルボジイミドで処理した。 カリクレイン この酵素は、精製されたプレカリクレインを室
温下に触媒量の濃PKAと混合し、及びカリクレ
インへの転化を完結させることによつて調製し
た。次いでこの混合物を、0.05M Tris HCl、PH
8.0中で平衡化させたベンズアミジン−EACA−
セフアローズのカラムに適用した。短期間洗浄し
た後、直線的なアルギニンのグラジエントを適用
した。カリクレインを含有する画分をプールし、
PHを6.0に調節し（0.1M MES緩衝剤、PH6.0で交
換）、及び超過により4.5BAEEu／mlまで濃縮
した。超過後の収率は93％であり、比活性は
A280当り16.8BAEE単位であつた。この物質を非
常に純粋であると報告する。調製物のSDS−
PAGEは分子量85000の単一帯を示した。 PKAに対する評価 PKAに対する評価法は、限られた量のPKAに
よつてプレカリクレインから製造されるカリクレ
インを、BAEEでの初期速度評価法によつて決定
するというカツプルド評価法（coupled assay）
であつた。プレカリクレイン物質（50λ）及び
PKA（25λ）に対して試験すべき試料を、一緒に
37℃に保温した。５分間において、25λ部分を取
り出し、PBS緩衝剤、PH8.0中0.05ｍＭ BAEE
の２mlと37゜で混合し、及び熱電対のついた37゜の
キユーベツト・ホルダー（cuvette holder）を用
いる分光器において加水分解速度を253ｍＭで連
続的に記録した。 評価法において、プレカリクレインのカリクレ
インへの転化速度がプレカリクレインに関して擬
一次であるように、プレカリクレイン物質の濃度
を酵素PKAに対するKmよりも十分に高くした。
即ちPKAの量を計算するための方程式 PKA（ｕ／ml）＝３／ｔ loPKo／PKo−Kt は、PK濃度に並びに一定のPKA濃度に比例する
反応速度を仮定している。 この方程式において、“３”は保温混合物中の
試料に対する希釈係数であり；ｔは５分間一定に
保つた保温の時間であり；Ktは特定の保温時間
で生成するカリクレインの量、即ち△A253／分で
あり；及びPKoはプレカリクレインの出発量で
ある。 この評価法は2mu／mlのPKA量に対して敏感
であり、PKのＫへの60％転化以下において殆ん
ど正確であつた。 プレーPKA活性（フアクターXII）に対する評価 活性なPKAのプレカーサーに対する評価法は、
試料0.9ml及び濃度4.5BAEEu／mlのカリクレイ
ン0.1mlを、活性酵素へ完全に転化させるのに十
分な期間37゜に保温することを含む。この結果は、
約400分が最小許容時間であることを示した。こ
の保温後25λ部分を取り出し、普通の方法でPKA
に対し評価した。試料中で持ち込まれた検出しう
るカリクレイン活性は存在するから、PKA含量
の計算に先立つてこのバツクグラウンドを引き算
することにより、測定した△A253を補正しなけれ
ばならない。 フアクターXII凝集試験 フアクターXIIは、通常のプールした血漿を対照
として用いるフイブロメータ（Fibrometer ）
において、先天的に欠陥の血漿が凝固する時間を
補正する能力に対して試験した。 実施例 ISGの免疫グロブリン画分からのプレーPKA
の分離 DEAE−セフアデツクスをPH8.1で用い且つ
0.05M Tris HCl及び0.05M NaClからなる緩衝
剤を用いることにより、コーン画分の５％ISG
溶液（200ml）をクロマトグラフイーで処理した。
これらの条件下において、免疫グロブリンの主な
たん白質ピークは、図に示されるように、カラム
に保留されなかつた。しかしながら、カリクレイ
ン活性化プレーPKAのピークはカラムに捕捉さ
れ及び全濃度0.22M NaClでの塩グラジエントに
より流出させることができた。これらの流出物の
特性は、フアクターXIIに関して先に示したものと
同様であることがわかつた。 更に、PKA活性のピークも塩グラジエントで
流出できた。この活性は塩濃度0.32〜0.34Mにお
いて流出でき、プレーPKA物質のピークから良
く分離されていた。PKA及びプレーPKA画分の
双方のDEAEへの結合は、これらの活性をISGか
ら実質的に完全に除去することを可能にする。こ
れは、新しく溶解したISG調製剤に関し、図面で
及び下表で示されている。DEAE−セフアデツ
クスでのクロマトグラフイーによるISGは、免疫
電気泳動法と抗全人血漿との関係に従えば、電気
泳動での移動の純度における変化が観察されなか
つた。
【表】
完全な活性化に十分な期間カリクレインで処
理することによつて決定した。
プレーPKAの特性 DEAE−セフアデツクスでのクロマトグラフイ
ーによつて部分的に精製されたプレーPKA画分
を、フアクターXII欠陥血漿を用いる凝集評価法に
より、フアクターXII活性に関して試験した。図面
から、分離されたプレーPKA画分はかなりのフ
アクターXII活性を示し、一方同時にPKA活性を
殆んど示さないということが明らかである。プレ
ーPKAのフアクターXIIとしての同定は、人間の
フアクターXIIに対する免疫電気泳動法と特異的な
抗血清との関係によつて確められた。 PKAへの完全な活性化を保証するのに十分長
い期間フアクターXIIをカリクレインと共に保温し
た後、本質的に凝集活性は観察されなかつた。即
ち達成されるPKA活性量は、キニン系に対する
活性化順序と一致して、カリクレインによるフア
クターXIIのPKAの直接的な転化に基づいた。 上述のように、PKA及びフアクターXIIの双方
がPH8.0でDEAE−セフアデツクスへ結合すると
いう観察に基づいて、これらの活性の双方をISG
の主IgG画分から分離することを可能になつた。
この結果、PKA活性を本質的に含まないISGの
調製が可能となり、多分更に重要なことにこの
ISGはフアクターXIIからのPKAの後続的発生に
対する潜在性が排除された。なお本発明の方法に
おいて、他の公知のアニオン交換樹脂も使用でき
ることは理解されねばならない（例えばQAE−
セフアデツクスも同様の結果を示した）。 本発明の精製されたISG調製剤は、静脈内投与
に対して有用であり、即ち静脈内用法のために
ISGを化学的に改変する必要性が回避できたと思
われる。
理することによつて決定した。
プレーPKAの特性 DEAE−セフアデツクスでのクロマトグラフイ
ーによつて部分的に精製されたプレーPKA画分
を、フアクターXII欠陥血漿を用いる凝集評価法に
より、フアクターXII活性に関して試験した。図面
から、分離されたプレーPKA画分はかなりのフ
アクターXII活性を示し、一方同時にPKA活性を
殆んど示さないということが明らかである。プレ
ーPKAのフアクターXIIとしての同定は、人間の
フアクターXIIに対する免疫電気泳動法と特異的な
抗血清との関係によつて確められた。 PKAへの完全な活性化を保証するのに十分長
い期間フアクターXIIをカリクレインと共に保温し
た後、本質的に凝集活性は観察されなかつた。即
ち達成されるPKA活性量は、キニン系に対する
活性化順序と一致して、カリクレインによるフア
クターXIIのPKAの直接的な転化に基づいた。 上述のように、PKA及びフアクターXIIの双方
がPH8.0でDEAE−セフアデツクスへ結合すると
いう観察に基づいて、これらの活性の双方をISG
の主IgG画分から分離することを可能になつた。
この結果、PKA活性を本質的に含まないISGの
調製が可能となり、多分更に重要なことにこの
ISGはフアクターXIIからのPKAの後続的発生に
対する潜在性が排除された。なお本発明の方法に
おいて、他の公知のアニオン交換樹脂も使用でき
ることは理解されねばならない（例えばQAE−
セフアデツクスも同様の結果を示した）。 本発明の精製されたISG調製剤は、静脈内投与
に対して有用であり、即ち静脈内用法のために
ISGを化学的に改変する必要性が回避できたと思
われる。
図面は、５％ISGの新しく溶解した溶液のイオ
ン交換クロマトグラフイーを示す。
ン交換クロマトグラフイーを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ コーン画分の免疫血清グロブリン調製剤
を、実質的にすべてのフアクターXIIの除去を保証
するのに十分な条件下に、アニオン交換物質とPH
7.2以上で接触させて精製されたものであつて、
そして フアクターXII及びプレカリクレイン活性化活性
を実質的に有さない、 ことを特徴とする精製された免疫血清グロブリン
調製剤。 ２ 潜在的なプレカリクレイン活性化活性として
測定されるフアクターXIIの量が、存在するなら
ば、約2mu／ml以下である特許請求の範囲第１項
記載の調製剤。 ３ プレカリクレイン活性化活性の量が、存在す
るならば、約2mu／ml以下である特許請求の範囲
第１項記載の調製剤。 ４ コーン画分の免疫血清グロブリン調製剤
を、実質的にすべてのフアクターXIIの除去を保証
するのに十分な条件下に、アニオン交換物質とPH
7.2以上で接触させることを特徴とする該調製剤
からフアクターXIIを除去する方法。 ５ 免疫血清グロブリン調製剤をアニオン交換ク
ロマトグラフイーに供する特許請求の範囲第４項
記載の方法。 ６ 除去法がアニオン交換樹脂からフアクターXII
を溶離させる結果となる濃度よりも低い全イオン
濃度を利用する特許請求の範囲第４項記載の方
法。 ７ イオン性種がPH約8.1において約0.2Mよりも
低い濃度でNaClを含んでなる特許請求の範囲第
６項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/057,880 US4272521A (en) | 1979-07-16 | 1979-07-16 | Purified immune serum globulin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5616416A JPS5616416A (en) | 1981-02-17 |
| JPH0133450B2 true JPH0133450B2 (ja) | 1989-07-13 |
Family
ID=22013311
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9516780A Granted JPS5616416A (en) | 1979-07-16 | 1980-07-14 | Immunizing serum globulin bend and its method |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4272521A (ja) |
| JP (1) | JPS5616416A (ja) |
| DE (1) | DE3025078A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE32011E (en) * | 1981-12-14 | 1985-10-22 | Scripps Clinic And Research Foundation | Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies |
| US4639513A (en) * | 1984-02-02 | 1987-01-27 | Cuno Inc. | Intravenously injectable immunoglobulin G (IGG) and method for producing same |
| US5165938A (en) * | 1984-11-29 | 1992-11-24 | Regents Of The University Of Minnesota | Wound healing agents derived from platelets |
| US4590002A (en) * | 1984-12-10 | 1986-05-20 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Methods for preparation of highly purified, gamma globulins free of hepatitis-B-virus infectivity |
| JPH0662435B2 (ja) * | 1986-02-28 | 1994-08-17 | 株式会社ミドリ十字 | 免疫グロブリンの製造方法 |
| JPH0662436B2 (ja) * | 1986-05-19 | 1994-08-17 | 株式会社ミドリ十字 | 静注用免疫グロブリン製剤の製造方法 |
| US4911910A (en) * | 1986-11-25 | 1990-03-27 | Biotech Research Labs, Inc. | Purified equine immunologlobulins and method of use thereof |
| US5157113A (en) * | 1987-08-10 | 1992-10-20 | Miles Inc. | Removal of nucleic acids from monoclonal antibody preparations |
| AT391810B (de) * | 1988-02-26 | 1990-12-10 | Immuno Ag | Verwendung von chymotrypsin zum unwirksammachen des praekallikrein-aktivators |
| US7745106B2 (en) * | 1997-06-24 | 2010-06-29 | Cascade Medical Enterprises, Llc | Methods and devices for separating liquid components |
| US6979307B2 (en) * | 1997-06-24 | 2005-12-27 | Cascade Medical Enterprises Llc | Systems and methods for preparing autologous fibrin glue |
| US20080199513A1 (en) * | 1997-06-24 | 2008-08-21 | Cascade Medical Enterprises, Llc | Systems and methods for preparing autologous fibrin glue |
| DK2270044T3 (en) * | 1998-06-09 | 2015-01-26 | Csl Behring Ag | Liquid immunoglobulin G (IgG) product |
| AU2763099A (en) | 1998-06-22 | 2000-01-10 | Charles E. Worden | Enriched platelet wound healant |
| FR2824568B1 (fr) * | 2001-05-11 | 2004-04-09 | Lab Francais Du Fractionnement | Procede de preparation de concentres d'immunoglobulines humaines a usage therapeutique |
| WO2006102488A1 (en) * | 2005-03-22 | 2006-09-28 | Cascade Medical Enterprises, Llc | Systems and methods of producing membranes |
| JP2012513425A (ja) | 2008-12-22 | 2012-06-14 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 免疫グロブリンの精製 |
| FR2974301B1 (fr) * | 2011-04-20 | 2013-08-23 | Lab Francais Du Fractionnement | Procede de preparation d'un produit plasmatique deplete en un ou plusieurs facteurs thrombogenes |
| IL212911A0 (en) * | 2011-05-16 | 2011-07-31 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Immunoglobulin reduced in thrombogenic contaminants and preparation thereof |
| CN110339209B (zh) * | 2019-07-18 | 2023-06-06 | 上海泰坦科技股份有限公司 | 一种去甲状腺结合蛋白的小牛血清的制备方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3717708A (en) * | 1968-10-24 | 1973-02-20 | Cutter Lab | Blood coagulation complex |
| US3869436A (en) * | 1971-06-01 | 1975-03-04 | Statens Bakteriologiska Lab | Method for fractionating plasma proteins using peg and ion-exchangers |
| ZA738779B (en) * | 1972-11-27 | 1974-10-30 | Baxter Laboratories Inc | Production of gamma globulin |
| US4137307A (en) * | 1973-11-15 | 1979-01-30 | The Green Cross Corporation | Process for preparing haptoglobin aqueous solution using strong anion exchanger |
| CA1064396A (en) | 1975-02-18 | 1979-10-16 | Myer L. Coval | Fractional precipitation of gamma globulin with polyethylene glycol |
| US4126605A (en) * | 1975-12-29 | 1978-11-21 | Plasmesco Ag | Process of improving the compatibility of gamma globulins |
| US4165370A (en) * | 1976-05-21 | 1979-08-21 | Coval M L | Injectable gamma globulin |
| US4075193A (en) * | 1976-11-26 | 1978-02-21 | Parke, Davis & Company | Process for producing intravenous immune globulin |
| US4124576A (en) * | 1976-12-03 | 1978-11-07 | Coval M L | Method of producing intravenously injectable gamma globulin |
| US4136094A (en) * | 1977-08-31 | 1979-01-23 | The Regents Of The University Of Minnesota | Preparation of intravenous human and animal gamma globulins and isolation of albumin |
-
1979
- 1979-07-16 US US06/057,880 patent/US4272521A/en not_active Expired - Lifetime
-
1980
- 1980-07-02 DE DE19803025078 patent/DE3025078A1/de active Granted
- 1980-07-14 JP JP9516780A patent/JPS5616416A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3025078C2 (ja) | 1993-02-18 |
| US4272521A (en) | 1981-06-09 |
| DE3025078A1 (de) | 1981-02-05 |
| JPS5616416A (en) | 1981-02-17 |
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