JPH02180833A - 蛋白質含有組成物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野） 本発明は、ウィルス夾雑の可能性のある蛋白質含有組成
物から実質的にウィルスが除去された高活性の蛋白質含
有組成物を製造する方法に関する。

〔従来技術〕

人血液由来の蛋白質含有組成物は、ウィルス、たとえば
肝炎ウィルスやＡＩＤＳウィルスなどが混入してくる可
能性がある。

これらのウィルス伝播を防ぐために液状の蛋白含有組成
物を加熱する方法が知られている（特開昭５５−１４５
６１５号公報、特開昭５（ｉ−１３９４２２号公報、特
開昭５ｆ３−１０６５９４号公報）。

また、蛋白質含有組成物をトリアルキルホスフェートと
接触せしめてウィルスを除去する方法が知られている（
特開昭６０−５１１１６号公報）。

しかし、加熱処理では熱に強いウィルスが残存する可能
性があり、トリアルキルホスフェート処理では非エンベ
ロープウィルスが残存する可能性がある。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は蛋白質の活性を殆ど失うことなく効率よ
く、通常のウィルスはもとよりのこと熱に強いウィルス
、非エンベロープウィルス等の夾雑ウィルスをも不活化
し、医薬品としてより安全な蛋白質含有組成物を提供し
ようとするものである。

（課題を解決するための手段〕 当該目的ないしは課題は本発明、即ちウイルス夾雑の可
能性のある蛋白賞金を液状組成物を５０℃以上の温度条
件下でトリアルキルホスフェートと接触せしめてウィル
スを不活化せしめた後、アフィニティークロマトグラフ
ィーで処理することによる蛋白質含有組成物の製造方法
によって解決され、かくして蛋白質の活性を失うことな
く効率的にウィルスの不活化された蛋白質含有組成物が
提供される。

本発明の方法が適用できる蛋白質は特に限定されるもの
ではなく、血漿由来蛋白質、他の組織由来蛋白質、遺伝
子組み換えや＆ＩＩｔａ培養によって得られた蛋白質な
どが挙げられる。蛋白質としては、たとえばプラスミノ
ーゲン、血液凝固第■囚子、血液凝固第■因子、血液凝
固第Ｘ■因子、アンチトロンビン■、ハプトグロビン、
トロンビン、免疫グロブリンなどが挙げられる。蛋白質
含有組成物は、上記の如き蛋白質を含有するものであれ
ば特に制限はない。

本発明の方法が適用される蛋白賞金存液状組成物には特
に制限はなく、たとえば血漿または組織抽出液、血漿ま
たは＆［ｌ織抽出液を各種分画法により処理して得た百
分からなる溶液、遺伝子組換え宿主または組織の墳養に
より得られる培養液、市販の蛋白質製剤（液状のもの）
または溶液としたものなどが挙げられる。

また、本発明のトリアルキルホスフェートとの接触時の
蛋白賞金を液状組成物の精製度は特に限定されるもので
はなく、任意の精製度のものに適用可能であり、従ワて
トリアルキルホスフェートとの接触は蛋白質の分離、間
型のいずれの段階に適用してもよい。

本発明で使用されるトリアルキルホスフェートは特に限
定されないが、好適にはトリー（ｎ−ブチル）ホスフェ
ート、トリー（ｔｅｒｔ−ブチル）ホスフェ−Ｆ、Ｆ’
Ｊ　　　（ｎ−ヘキシル）ホスフェ−）、）＋Ｊ−（２
−エチルヘキシル）ホスフェート、トリー（ｎ−デシル
）ホスフェートなどが挙げられる。特に好ましいトリア
ルキルホスフェートはトリー（ｎ−ブチル）ホスフェー
ト（以下ＴＮＢＰと言う）である、なお、２１１以上の
異なるトリアルキルホスフェートの混合物も使用するこ
とができる。

本発明に使用されるトリアルキルホスフェートは、０．
０１〜１０　（Ｗ／Ｖ）％の範囲の量、好ましくは約０
．１〜３（ｗ／ｖ）％の範囲の量において使用される。

トリアルキルホスフェートは界面活性剤を伴ってまたは
伴わないで使用することができる。好ましくは、トリア
ルキルホスフェートを界面活性剤と組み合わせて使用す
る。この界面活性剤は、トリアルキルホスフェートが蛋
白賞金を液状組成物と接触する前、同時、または後の任
意の段階に添加することができる。界面活性剤の作用は
、蛋白質含有組成物中のウィルスとトリアルキルホスフ
ェートとの接触を強化することである。

界面活性剤としては、脂肪酸のポリオキシエチレン誘導
体、ソルビトール無水物の部分エステル、たとえばトウ
ィーン８０、トウィーン２０およびポリソルベート８０
、および非イオン性油溶水洗剤、たとえばトリトンＸ１
００　（オキシエチル化アルキルフェノール）が挙げら
れる。さらに、デオキシコール酸ナトリウム、およびス
ルホベクインとして周知の合成ツブイッテルイオン洗剤
であるＺｗｌｔｔｅｒ（ｅｎｔｓ、たとえばＮ−ドデシ
ル−Ｎ、　Ｎ−ジメチル−２−アンモニオ−１−エタン
スルホネート、およびその同族体、または非イオン性洗
浄、たとえばオクチル−β、Ｄ−グルコピラノシドなど
が挙げられる。

界面活性剤を使用する場合、その螢は臨界的ではなく、
たとえば約０．ＱＯ１％〜約１０％、好ましくは約０．
０１％〜１．５％の範囲で使用することができる。

トリアルキルホスフェート処理は、エンベロープコート
ウィルス、たとえばＢ型肝炎ウィルス、ｎｏｎＡｎｏｎ
Ｂ型肝炎ウィルスの不活化に特に有用である。また、さ
らに５０°Ｃ以上で充分な時間加熱処理することにより
、熱に強いウィルスも同時に不活化し得る。

よって、本発明のトリプルキルホスフェートによる蛋白
質含有組成物の処理は、５０”Ｃ以上、好ましくは６０
〜７５℃の温度条件下で３０分以上、好ましくは３〜３
０時間行う、最適には、６０°Ｃ程度で１０〜２０時間
程度の処理である。

また、加熱処理は蛋白質を熱から保護するために安定化
剤の存在下で行ってもよい、安定化剤としては、糖、糖
アルコール、アミノ酸などが挙げられる。

処理後、該蛋白質含有組成物をアフィニティークロマト
グラフィーで処理する。アフィニティークロマトグラフ
ィーで処理することにより、トリアルキルホスフェート
、界面活性剤、加熱処理時の安定化剤を除去することが
できる。さらに、非エンベロープコートウィルスであり
、特別熱に強いウィルスが残存していたとしても、本ア
フィニティークロマトグラフィー処理で除去可能である
。

アフィニティークロマトグラフィーは、蛋白質の種類に
よって適当に選択され得る。たとえば、プラスミノーゲ
ンの場合、固定化リジンによるクロマトグラフィーで処
理することができる。

固定化リジンとは、不溶性担体にリジンを固定化したも
のである。不溶性坦体としては、アガロース、架橋デキ
ストラン、セルロース、ボＩ７７クリルアミド、親水性
とニルポリマーなどが挙げられる。

固定化方法は特に限定されるものではなく、自体公知の
方法にて行えばよい。

処理方法はバッチ法、カラム法のいずれを用いてもよい
、平６１溶媒および吸着溶媒としては、ｐＨ６〜８（好
ましくはｐＨ７〜７．５）の緩衝液（たとえば、リン酸
緩衝液、グリシン１１衝液など）が用いられる。また、
塩化ナトリウムなどを添加しておくことも可能である。

上記条件下、蛋白質は不溶性担体に吸着する。溶出溶媒
としては、たとえば５０〜５００ｍＭ（好ましくはＩ　
Ｑ　Ｏ〜、３００ｍＭ）のＥＡＣＡ　（イプシロンアミ
ノカプロン酸）あるいはリジンを含む溶媒（ｐＨ６〜８
）が用いられる。カラム法の場合、常識的には、プラス
ミノゲン吸着後、ゲル量の約２．５倍の上記緩衝液によ
る洗浄で未吸着物は洗浄除去されるが、本発明における
トリアルキルホスフェートなどの洗浄、除去には４倍以
上（好ましくは４〜１０倍）の上記緩衝液による洗浄を
行うのが望ましい。

血液凝固第Ｘ因子は抗第■囚子抗体よりなる吸着剤、具
体的には固定化抗第■因子抗体を用いたアフィニティー
クロマトグラフィーで処理することができる。担体とし
ては、ポリクローナル抗体カラム、モノクローナル抗体
カラムのどちらを用いてもよい。

ポリクローナル抗体に関して、抗第■因子抗体は、高度
に精製した第Ｘ因子を動物に免疫し、得られた血清から
回収・精製することによって得られる。

当該抗血清の製造は公知の方法にて行なえばよく、たと
えば高度精製第■因子とフロイントの完全アジュバント
の混合乳液を作り、動物の皮肉に２〜３回注射し、最終
免疫の数日後採血を行ない室温で凝固せしめた後、４℃
で一夜放置し、３．００Ｏｒｐｍ　、２０分間の遠心分
離により当該抗血清が得られる。

免疫に用いる動物としては、特に動物種を這ぶ必要はな
く、たとえば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマな
どが挙げられる。当該抗血清の精製は、たとえば、ｊ、
八ｍ、　Ｃｈｅｓ、　Ｓｏｃ、、　６４．３３８６　（
１９４０）、　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、、　ｕ、　１１６
１　（１９５８）に記載の方法にて行なわれる。

モノクローナル抗体に関して、抗第■因子抗体は細胞融
合法によって得られる。細胞融合法は自体既知の手段に
て行なわれ、その−例は増殖性を持った細胞と目的とす
る抗体を産生しているリンパ球とをポリエチレングリコ
ールの存在下で反応せしめることにより、増殖性と抗体
産生能とを同時に兼ね備えた細胞を製し、この細胞に抗
体を産生せしめるものであり、当該抗体は一個の抗原決
定基に対してのみ反応する単一の抗体である。

より具体的には増殖性を持つ細胞としてマウスミエロー
マ細胞を、抗体産生リンパ球として第Ｘ因子で免疫され
たマウスＩ１１臓細胞（ＢｗＪ胞）を用いて融合させ、
さらに目的とする抗体を産生じている細胞をスクリーニ
ングして、当Ｘ亥細胞から第Ｘ因子のモノクローナル抗
体を得る。

また、このようにして得られた抗第■囚子抗体をその活
性を失うことなく固定化する方法としては、以下の不溶
性マトリックスを応用する方法をあげることができ石、
かかる方法としては、たとえばアミノ酸のコポリマーを
使用する方法（Ｊ。

［１ｉｏ１．　Ｃｈｅｐｘ、、皿１９７０　（１９６１
））　、セルロースを使用する方法（Ｎａｔｕｒｅ、　
１８９　５７６　（１９６１））、アガロースあるいは
セファデックスを使用する方法（Ｎａｔｕｒｅ、　１Ｊ
５１．１４９１　（１９６７）、　Ｎａｔｕｒｅ、　２
４５　３０５９（１９７０））　、ポリアクリルアミド
を使用する方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　ｆＪ、　４０７
４　（１９６６））などがあげられる。

これらの方法により抗第■囚子抗体を効率良く固定化し
うる。また、このようにして得られた吸着剤を用いるこ
とにより、収率良く、しかも高純度の第Ｘ因子を得るこ
とができる。

本発明に関して、固定化抗血液凝固第■因子坑体による
処理は、たとえば以下の通りにして行われる。まず、適
度に情調した第■因子含有水溶液を適当な溶媒〔例えば
、０．０１〜０．１　Ｍ　）リス緩衝液（ｐＨ６〜８）
〕で平衡化した固定化抗第■因子抗体にアプライする。

同じ溶媒で洗浄後、溶出液で溶出させた第Ｘ因子画分を
回収する。

血液凝固第■因子も、たとえば固定化抗第■囚子抗体を
用いたアフィニティークロマトグラフィーで処理するこ
とができる。

アンチトロンビン■は、たとえば固定化ヘパリンを用い
たアフィニティークロマトグラフィーで処理することが
できる（特開昭４８−３５０１７号公報）。

ハプトグロビンは、たとえば固定化グロビンを用いたア
フィニティークロマトグラフィーで処理することができ
る（特開昭５５−１１１４９６号公報）。

その他、蛋白によってアフィニティークロマトグラフィ
ーを適当に選択することができる。

〔発明の作用および効果〕

本発明の製造方法によれば、蛋白質の活性の極めて少な
い損失の下に、効率的にウィルスを不活化することがで
きるので、ウィルス感染性が極めて少なく、かつ活性の
高い蛋白質含有組成物を提供することができる。

より具体的には、本発明は以下の作用効果を有するもの
である。

熱に強いウィルスはトリアルキルホスフェート処理によ
って不活化することができるが、トリアルキルホスフェ
ート処理は非エンベロープコートウィルスには不活化効
果が弱く、５０”Ｃ以上の温度条件下でウィルスを不活
化処理を行うことによりそれを補う効果がある。そして
、たとえなお残存しているウィルスがあったとしても、
その後のアフィニティークロマトグラフィー処理でその
ウィルスを除去することができる。

また、２５℃〜３０℃でのトリアルキルホスフェート処
理ではその温度で長くおくことより溶液中に混在するプ
ラスミンなどのプロテアーゼによる蛋白質の分解が促進
される可能性がある。しかし、５０℃以上で処理をする
ときには、混在プロテアーゼによる蛋白質の分解は考え
られない。

よって、本発明の製造方法は医薬品としてより安全な蛋
白質含有組成物の工業的製法としてきゎめて好ましい方
法を提供するものである。

〔実施例〕

実施例１ コーンの冷エタノール分画法で得られた両分■＋■ペー
スト抽出残査（１００ｇ）を、１０単位／麺１のアプロ
チニンと０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むトリス塩Ｍ１Ｓ
街液（ｐＨ８，３）に懸濁し、少時撹拌した後、５％硫
酸アンモニウムを添加・撹拌し遠心分離により上清を分
離した。更に、この上清に３０％硫酸アンモニウムを添
加・撹拌し遠心分離により沈Ｒ１ｇを分離した。′この
沈澱を、アプロチニン４０　Ｋ　Ｔ　Ｅ／ｍｌ、０．９
％塩化ナトリウムを含む０．９％グリシン溶液（ｐＨ１
７，２）に懸濁した。

このプラスミノゲン含有溶液１ｍｌ当たり、シュクロー
スｆ、７５ｇ、０．３％ＴＮＢＰ（トリー（ｎ−ブチル
）ホスフェート）および１％〒ｗｅｅｎ　８０を加えた
溶液を調製し、６０°ｃ１０時間加熱した。

加熱後、プラスミノゲン溶液をＤｅｕｔｓｃｈ、　Ｄ、
　Ｇ。

ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｈム１０９５．　（１９７０）
　）の方法に準じて０．９％塩化ナトリウムを含む０．
９％グリシン溶液（ｐ）１７．２）で平衡化したりジン
−セファロースカラム（１００＋ｓｌ）に注入し、プラ
スミノゲンを吸着させ、次いで０．９％塩化ナトリウム
を含む０．９％グリシン溶液（ｐＨ７，２）で洗浄、更
に１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．９％グリシン溶液（ｐ
Ｈ７，２）５００鵬ｌで洗浄後、０．２５　Ｍリジンを
含む０．９％グリシン溶液（ｐＨ７，２）を用いて吸着
したプラスミノゲンを溶出せしめた。

実験例１ 実施例１で得られたプラスミノゲン含有溶液をシュクロ
ース存在下あるいはシュクロース、ＴＮＢ　Ｐ　／Ｔｗ
ｅｅｎ　８０共存下で６０℃、１０時間液状加熱した時
のプラスミノゲンの安定性を検討した。

（実験方法） プラスミノゲン含を溶液にアプロチニン４０ＫＩＥ／鋤
ｌを添加後、！＋＋１当たり、シュクロースを１．５　
ｇ、　１．７５　ｇあるいは２．０ｇ加え、６０℃、１
０時間加熱し、ＰＬＯ（プラスミノゲン）の安定性を検
討した。シュクロース１．５ｇ、１．７５ｇ添加の系で
はさらに０．３％ＴＮＢＰ／１％Ｔｗｅｅｎ８０を加え
た溶液も調製し、界面活性剤のＴ’ＬＧ安定性への影響
を検討した。ＰＬＯ活性はＭＣＡ　（メチルクマリルア
ミド合成基質を用いて測定し、プラスミノゲン標準品の
検狙線に基づいて活性を換算した。

（結果） プラスミノゲンの安定性は、プラスミノゲンの活性回収
率として表１に示した。

表１に示すように１１の溶液に対し、１．５ｇ以上のシ
ュクロースを添加した溶液で６０″Ｃ１１０時間加熱後
、７０％以上の活性を口取した。また、シュクロース添
加液にさらに界面活性剤を添加しても活性回収率の低下
は認められなかった。この結果は、６０°Ｃ，１０時間
加熱でもＰＬＯは界面活性剤によって失活されないこと
を示唆した。

〔以下余白〕

表１　プラスミノゲン含存溶液の液状加熱におけるプラ
スミノゲンの活性回収率 シュクロース濃度”（ｇ） 活性回収率（％） プラスミノゲン含有溶液　　　　　１００１．５　　　
　　　　　　　　　７２ １．７５　　　　　　　　　　　　Ｂ１２．０　　　　
　　　　　　　　８２ １．５＋Ｄ”　　　　　　　　　　　８４１．７５＋０
　　　　　　　　　　９２０１＝溶液１１に対するシュ
クロース添加量。

ｓｌ、　Ｄは０．３％ＴＮＢＰ／１％Ｔｗｅｅｎ８０添
加。

実験例２ ・ウィルス不活化効果 実施例！で得られたプラスミノゲン含存溶液を用いて界
面活性剤のウィルス不活化効果を３０°Ｃ１６０°Ｃで
検討した。

（実験方法） プラスミノゲン含有溶液１ｍｌ当たりシュクロース１．
５ｇを加えた溶液、およびその溶液にさらに０、３％Ｔ
ＮＢＰ、１％Ｔｗｅｅｎ　８０を加えた溶液を調製し、
一定量のウィルスを添加後、６０″Ｃで加温した。一方
、３０℃加温によるウィルス不活化検討用として、プラ
スミノゲン含有コーンのフラクシッンにＴ　Ｎ　Ｂ　Ｐ
　／　Ｔｗｅｅｎ　８０を加えた溶液、および上記のシ
ュクロース溶液を４倍希釈後、’ｒＮＢＰ　／Ｔｗｅｅ
ｎ　８０を加えた溶液を調製し、一定量のウィルスを添
加後、３０′Ｃで加温した。その後、５分後、１０分後
、３０分後、６０分後および１２０分後にサンプリング
し、下記に示す方法でウィルス感染価を測定した。

〔ウィルス感染価の測定方法〕

（ウィルスおよび細胞） 供試ウィルスとその宿主細胞ならびにウィルス感染価の
測定は、表２に示した系で行った。

〔以下余白〕

表２　供試ウィルスとその宿主細胞およびウィルス感染
価測定法 供試ウィルス 宿主細胞 ウィルス感染価測定法 Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａＬｉｔｌｓ　　　ＦＬ
　　　　プラーク形成法ｖｉｒｕｓ　・（Ｉｎｄｉａｎ
ａ） 各細胞は、イーグルＭＥＭ培地（日永製薬）に非働化牛
脂児血清（Ｆｌｏｗ）を１０％の割合に添加した培地で
培養し、ウィルス感染時には血清添加量を２％に減じた
維持培地を用いた。

（結果） プラスミノジン含有溶液にＴ　Ｎ　Ｂ　Ｐ　／Ｔｗｅｅ
ｎ　８０を加え、３０℃で加温した時、ウィルス感染価
は３０分で検出限界以下になった（表３参照）。

一方、ＴＮＢＰ／界面活性剤のウィルス不活化効果への
シュクロースの影響を検討するために、シュクロースを
添加したプラスミノジン含有コーンのフラクション溶液
を４倍希釈（３０℃では原液では粘稠すぎるため）後、
ＴＮＢＰ／丁ｗｅｅｎ　８０を加えた溶液についてウィ
ルス不活化効果を検討した。その結果、３０”Ｃ加温後
、５分以内にウィルス感染価は駆出限界以下になった。

この結果はプラスミノゲン含存溶液の希釈が、ＴＮＢＰ
界面活性剤によるウィルス不活化効果を高めることを示
唆すると同時に、少なくともシュクロースの共存がＴＮ
ＢＰ／界面活性剤のウィルス不活化効果に影響しないこ
とを示すと考えられた。

一方、プラスミノジン含有溶液にシュクロースを添加し
た溶液を６０℃で加温′したところ、３０分後でも、ウ
ィルス感染価が認められたが、その溶液にさらにＴ　Ｎ
　Ｂ　Ｐ　／Ｔｗｅｅｎ　８０を加え、６０°Ｃで加温
したところ、５分以内でウィルス感染価は駆出限界以下
になり、６０℃での界面活性剤の強いウィルス不活化効
果が確認された。

〔以下余白） 実験例３ ・ＴＮＢＰ／↑ｗｅｅｎ　８０の除去効果１％Ｔｗｓｅ
ｎ　８０およびＱ、３　ＴＮＢＰを含む精製プラスミノ
ジン（２５０ＣＵ／ｓｌ）　５００ｐｇをＤｅｕ　ｔｓ
ｃｈ、　Ｄ、Ｇ、ら（Ｓｃｉｅｒ＋ｃｅ、　皿１０９５
．　（１９７０）　）の方法に準じ、０．９％塩化ナト
リウムを含む０．９％グリシンｍＷ　（ｐ＋ｔ７．２　
）で平衡化したりジン−セファロースカラム１１に注入
し、プラスミノジンを吸着させ、次いで０．９％塩化ナ
トリウムを含む０゜９％グリシン溶液（ｐＨ７，２）で
洗浄後、０．２５　Ｍリジンを含む０．９％グリシンイ
液（ｐｌ！７．２　＞を用いて吸着したプラスミノジン
を溶出せしめた。そして、出発原料、洗浄液および溶出
液について、それぞれ↑ｗｅａｎ　８０ｆｉおよびＴＮ
ＢＰＩを測定した。

↑ｗｅａｎ　８０定量は、バリウムとヨードの複合体形
成（ＳｋＯＯｇらの方法、Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ　３７．３
４５〜３４９　（１９７９年））により測定した。

ＴＮＢＰの定量は、ガスクロマトグラフィーで行った。

〔余白〕

（実験結果） ウィルス不活化の目的で添加したｔｗｅｅｎ　８０およ
びＴＮＢＰは、リジン−セファロースの溶出画分には検
出されなかった（表４．５参照）。

表４　リジン−セファロースによるＴｗｅｏｎ　８０の
除去効果Ｔｗｅｅｎ　８０濃度（ｓｇ／ｓ＋１）　　容
ｆｉ（ｍｌ）　　収率（χ）表５ リジン−セファロースによるＴＮＢＰの除去効果ＴＮｎ
ｒ’ｆｉ度（ｍｇ／ｓ＋１） 容量（１） 収率（χ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ウィルス夾雑の可能性のある蛋白質含有液状組成物を５
   ０℃以上の温度条件下でトリアルキルホスフェートと接
   触せしめてウィルスを不活化せしめた後、アフィニティ
   ークロマトグラフィーで処理することを特徴とする蛋白
   質含有組成物の製造方法。