JPH0134033B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、銅・亜鉛スーパーオキシドデイスム
ターゼ（以下Cu・Zn−SODと略称する）の新規
な精製方法に関するものである。 SODは、細菌から哺乳動物ならびにヒトなど
の生体組織や血液中に存在し、生体内で酸素毒性
を示す活性酸素分子種の１つであるスーパーオキ
シドイオン（O^- ₂）を分解する酵素で、キレート
している金属の相違によりFe−SOD、Mn−
SOD、Cu・Zn−SODの３種に分類されている。
そして、SODは生体内で酸素分子から発生した
スーパーオキシドイオンによる組織障害から起こ
ると考えられている炎症、たとえば、変形性関節
症、および慢性関節リウマチ、または放射線照射
による障害に対する有効な治療剤として注目され
ている。 SODを生体組織や血液から精製単離する方法
として硫安塩析法、加熱処理法（特開昭57−
12993）、有機塩素化合物処理法（Journal of
Biologial Chemistry（J.B.C.）244 6051（1969））
、
イオン交換樹脂処理法（特公昭53−22137）など、
種々の方法が知られている。しかし、これらの方
法は、精製効率が悪くて高比活性の製品を高収率
で得ることが困難であつたり、脱塩処理や、夾雑
タンパク質除去などの繁雑な前処理を要するなど
工業的精製法として必ずしも優れた方法ではな
い。 そこで、本発明者らはSODの簡便な精製法に
ついて種々検討した結果、生体組織及び血液から
Cu・Zn−SODを抽出した粗抽出液を非極性ハイ
ポーラスポリマー系樹脂に接触させるとSODは
選択的かつ効率よく非極性ハイポーラスポリマー
系樹脂に吸着すること及び該樹脂からCu・Zn−
SODのみが選択的に溶出され、Fe−SODやMn
−SODは溶出されないことを見い出した。 本発明は上記知見に基づき完成されたものであ
る。即し、本発明は非極性ハイポーラスポリマー
系樹脂に不純なCu・Zn−SODを含有する溶液を
接触させた後、該樹脂を洗浄し、次いで該樹脂に
吸着したCu・Zn−SODを溶出することを特徴と
するCu・Zn−SODの精製法に関する。 本発明で使用する非極性ハイポーラスポリマー
系樹脂としてはCu・Zn−SOD吸着能を有するも
のなら特に制限はないが、樹脂基材として、例え
ば、スチレンとジビニルベンゼンを、又、それら
を主成分とし、他に少量の成分、例えば２−ビニ
ルピリジンを添加して共重合したポリスチレン系
の樹脂が望ましく、例えば、アンバーライト
XAD−２、XAD−４、XAD−９（商標、ロー
ム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンHP−
10、HP−20、HP−21、HP−30、HP−40、HP
−50（商標、三菱化成工業株式会社製）、ジユオラ
イトＳ−861、Ｓ−862、ES−863、ES−865、ES
−866（商標、ダイヤモンド・シヤムロツク社製）、
レバチツトOC−1031（商標、バイエル社製）など
が有る。より好ましくは、150Åより高く1500Å
以下の最多頻度細孔径と0.4〜1.1ml／ｇの細孔容
積をもつポリスチレン系の非極性ハイポーラスポ
リマーであり、アンバーライトXAD−２、ダイ
ヤイオンHP−10、HP−20、HP−21、HP−30、
HP−40、ジユオライトＳ−861、ES−863、ES
−865、レバチツトOC−1031が収率及び精製効率
の面ですぐれている。 本発明において原料として使用する不純な
Cu・Zn−SODを含有する溶液はCu・Zn−SOD
含有溶液なら特に制限なく、例えば生体組織から
Cu・Zn−SODを抽出した粗抽出液精製途中の
Cu・Zn−SOD含有溶液などがあげられるが、粗
抽出液が好ましい。 本発明で使用し得る、Cu・Zn−SODを抽出し
た液又は含有する溶液を得るための材料として
は、Cu・Zn−SODを含有するものであれば良く
その範囲には、酵母、植物、動物及びバクテリア
由来のものが含まれる。これらのうちでも特に重
要なものは、酵母および哺乳動物性のものであ
る。哺乳動物の場合には、血液および組織のいづ
れであつても良く、人、牛、馬、豚、羊等その種
は問わない。また組織としては肝臓、腎臓、胎盤
等Cu・Zn−SODを含有するものであれば、いづ
れについても使用し得る。 血液の場合は、血液をそのまま使用しても良い
が、より好ましくは、血しよう部分を洗浄除去し
た赤血球部分を用いるのが良い。赤血球を溶血す
るためには、たとえば、赤血球容積に対して１〜
４倍容の水を添加する等の方法がとられる。 組織の場合は、何倍でも良いが、１〜10倍容、
好ましくは、2.5〜５倍容の水又は0.1〜0.3Mの無
機中性の塩水溶液を添加し、通常の細胞破砕機を
用いて組織細胞を破砕し、Cu・Zn−SODを含む
水可溶性タンパク質を抽出することにより粗抽出
液を得ることができる。 樹脂に吸着したCu・Zn−SOD以外の夾雑物を
除去する洗浄剤としては、水でもよいが、好まし
くは酸性で緩衝作用を有するものであればいづれ
の塩でも良く、イオン強度をもたせる塩の種類は
重要ではない。たとえば、酢酸、クエン酸、コハ
ク酸、フタル酸、カコジル酸、マレイン酸等の塩
類が使用される。 洗浄剤のイオン強度およびPHは、1M以下でPH
４〜６が良く、さらに好ましくは、0.2M以下の
イオン強度でPH4.5〜5.5の酸性バツフアーが良
い。 Cu・Zn−SODを選択的に溶出する溶出剤とし
ては水可溶性有機溶媒及び塩溶液が挙げられる。
水可溶性有機溶媒としては、低級アルコール系の
メタノール、エタノール、プロピルアルコール、
ブタノール等が、またケトン系の水可溶性有機溶
媒としてはアセトン等が利用できるが、これらの
うち、特に好ましくは、メタノールとアセトンで
ある。 塩溶液としては、中性塩そのものでも、又PH６
〜11に緩衝能を保持するバツフアーであつて良
く、イオン強度をもたせる塩の種類は、かならず
しも重要ではない。たとえば、食塩、塩化カリウ
ムなどの中性塩やカコジル酸、マレイン酸、リン
酸、イミダゾール２，４，６−トリメチルピリジ
ン、トリエタノールアミン、ベロナール、Ｎ−エ
チルモルホリン、トリス、グリシン、２−アミノ
−２−メチル−１，３−プロパンジオール、ジエ
タノールアミン、ホウ酸、グリシルグリシン、炭
酸等の塩類が使用される。 塩溶液のイオン強度およびPHは、イオン強度
2M以下でPHは６〜11が良く、さらに好ましくは、
溶出後の処理等を考え、イオン強度0.5M以下、
PH９〜10.5が使用される。 溶出剤の水可溶性有機溶媒とバツフアーの組成
比は、水可溶性有機溶媒の種類により異なるが、
水可溶性有機溶媒の割合は５〜80％の範囲であれ
ばいづれでもよいが、メタノールの場合40〜60
％、アセトンの場合20〜40％が好ましい結果を与
える。 本発明の方法により採取、精製されたCu・Zn
−SOD含有溶出液は、塩酸、硫酸、酢酸等の無
機及び有機酸を用いてPHを中性付近に調整後、通
常の方法により、常温下に減圧脱溶媒され、脱イ
オン水又は緩衡液に対して透析を行い、残存する
塩類を除去し、DEAE−担体クロマト、ゲル過
等の精製操作をへて、高度に純化されたCu・Zn
−SODを得ることができる。 次に本発明方法がすぐれた効果を発揮すること
を実験例により説明する。 実験例 SOD活性の回収率及び比活性 (1) 試料の調整 ヒト赤血球150mlに脱イオン水300ml (C)の場合（50ml）を添加して溶血し次いでこ
の溶血液に次の(A)、(B)又は(C)の処理を施す。そ
の後得られた溶液を0.005Mリン酸バツフアー
（PH7.5）で十分透析し、試料とした。 (A) 本発明方法 溶血液を、ダイヤイオンHP−20カラム
（2.3×25cm．100ml）に通し、溶血液中に含
まれるCu・Zn−SODのほぼ全てを吸着させ
た。カラムは0.05M酢酸ナトリウムバツフア
ー（PH5.0）200mlで洗浄し、さらに水100ml
で洗浄後、メタノール50％（ｖ／ｖ）を含有
する0.1Mグリシン・ナトリウムバツフアー
（PH10.0）の溶出液により溶出した。Cu・Zn
−SODは１つのピークとなつて溶出され、
溶出開始から50〜250mlの溶出液の中にほぼ
全ての活性が見い出された。（この活性画分
に回収されるSODの活性は70084単位で、溶
血液からの回収率は92％であつた。）さらに
このメタノールを含む溶出液をPH7.0とし、
30℃に加熱した浴中でエバポレーターにより
40mlまで濃縮する。 (B) 熱処理法（特開昭57−12993） 溶血液に塩化ナトリウム15g、塩化第二銅
15mgを加え、70℃60分間加熱処理を行つた。
室温まで冷却後、遠心分離により生じた沈殿
物を除去し、さらに塩化第二銅215mgを加え、
PH5.6とし、再度65℃15分間熱処理を行つた。
冷却後、生じた沈殿物を過により除去し、
微青色の液450mlを得た。 (C) 有機塩素化合物処理法（J.B.C.244 6051
（1969）） 溶血液を撹拌しながらその液に75mlのエタ
ノールと45mlのクロロホルムを添加してヘモ
グロビンを沈殿させた。この沈殿含有溶液を
30mlの水で希釈し、遠心分離により沈殿物を
除去後、得られた上澄液にリン酸第二カリウ
ム塩70g（30％（ｗ／ｖ）に相当）を加えて
２相に相分離させた。Cu・Zn−SODを含有
する上層部（エタノール−水相）を採取し、
浮遊物を遠心分離により除去後、0.75倍容の
アセトンを加えてCu・Zn−SODを沈殿さ
せ、次いでその沈殿を脱イオン水10mlに溶解
した。 (2) 実験方法 試料中のCu・Zn−SODのSOD活性の測定
は、Mc CordとFridovichの方法（JBC244
6049（1969））に準じて行つた。即ちキサンチン
オキシターゼのキサンチンを基質とした酵素反
応により生じたスーパーオキシドイオン（O^- ₂）
の酸化型チトクロームＣの還元作用をSODが
阻害することを利用する方法で波長550nmに於
ける時間的変化によりSOD活性を測定した。
この方法では、SOD活性が強いと吸収変化が
弱くなる。 また、試料中のタンパク質の定量には、牛の
血清アルブミンを標準としてLowryらの方法
（JBC193 265（1951））に準じて行つた。即ち、
リンモリブデン酸とリンタングステン酸よりな
るフエノール試薬によるタンパク質中のチロシ
ン、トリプトフアンおよびシステインを還元呈
色させる反応と、アルカリ性でCu²⁺がプロト
ンを失なつたタンパク質鎖中の窒素原子と結合
して錯体を形成して発色するビユレツト反応を
組み合せてタンパク質の含量を定量する方法で
ある。定量に当つては、牛の血清アルブミンを
標準として検量線を作成し、これとの比として
タンパク量を表示する。 (3) 実験結果 結果を第一表に示す。

【表】 この表から明らかなように対照法であるＢ、
Ｃでは回収率70％前後、比活性400単位／mgタ
ンパク程度であるのに対し、本発明方法である
Ａでは回収率87％、比活性800単位／mgタンパ
クと回収率で２割以上、比活性でほぼ２倍もの
改善がみられた。 このように本発明方法は高品位のCu・Zn−
SODを高回収率で得ることができ、又、操作
も簡易という利点を有する。又、使用する非極
性ハイポーラスポリマー系樹脂は通常の方法に
より再生され、しかも再生されたものは新品と
同等のCu・Zn−SOD吸着能を有しているの
で、半永久的に再生使用でき、極めて経済的で
ある。 次に本発明方法を実施例によりさらに具体的
に説明する。 実施例 １ 新鮮なヒト胎盤30個を、血液を除去することな
しに、胎盤の重量の2.5倍容の1.15％塩化カリウ
ム溶液又は0.9％塩化ナトリウム溶液を加えホモ
ゲナイガーを使用し十分に組織を破砕した。この
破砕液を遠心して、固形分を除き、Cu・Zn−
SODを含有する粗抽出液を得た。これを、何ら
前処理することなしに直接ダイヤイオンHP−20
カラム（12×70cm、８）を通過させCu・Zn−
SODを吸着させた。0.05M酢酸ナトリウムバツフ
アー（PH5.0）16でカラムを洗浄後、さらに水
８で洗浄し、樹脂に吸着している赤色夾雑物を
除去した。溶出は、0.1Mグリシン・ナトリウム
バツフアーに50％（ｖ／ｖ）のメタノールを含む
PH10.0の溶出剤により行つた。Cu・Zn−SODの
活性を示す画分は溶出開始後、溶出液の４〜20
の間に現われ、溶出液中に回収されるSODの活
性は、この段階で91％であつた。 さらにこの溶出液をPH7.0に中和し、30℃に加
熱した浴中で、エバポレーターによりメタノール
を除き、さらに２まで濃縮した。濃縮液は
0.005Mリン酸バツフアー（PH7.5）で十分に透析
し平衡化した。透析液中に含まれるCu・Zn−
SODは2796600単位有り、抽出液からの回収率は
88％、この工程による比活性の上昇は約500倍の
608単位／mg（タンパク質）であつた。 透析された濃縮液は、通常用いられる精製手段
によりさらに精製され、高度に純化される。即
ち、0.005Mリン酸バツフアー（PH7.5）で平衡化
されたDE−52（商標、ワツトマン社製DEAE−セ
ルロース）カラム（2.6×45cm、240ml）に吸着
し、0.005Mリン酸バツフアー（PH7.5）で洗浄
後、0.04Mの食塩を含有する0.005Mリン酸バツ
フアー（PH7.5）により溶出した。Cu・Zn−SOD
は大小２つのピークとなつて溶出された。この活
性ピーク部分を集め、限外過膜により濃縮し、
0.9％食塩を含有する0.005Mリン酸バツフアーで
平衡化した。この濃縮液は、さらに同バツフアー
で平衡化されたSephadex Ｇ−75（商標、フアル
マシア社製）カラム（2.9×150cm、１）でゲル
過精製された。このようにして得られるCu・
Zn−SODは極めて純度が高く、その比活性は
3500単位／mg（タンパク質）であつた。また以上
の全工程を通して回収されたCu・Zn−SODは
1620800単位有り、回収率は51％であつた。 実施例 ２ 実施例２の操作に従い、カラム洗浄後、溶出溶
液、非極性ハイポーラスポリマー樹脂等を変えた
実験を行つた。即ち、新鮮なヒト胎盤24個を、血
液の除去をすることなしに、胎盤の重量の2.5倍
容の1.15％塩化カリウム溶液を加え、ホモゲナイ
ザーを使用して十分に組織を破砕した。この破砕
液を遠心して固形分を除き、33.6のCu・Zn−
SODを含有する粗抽出液を得た。この粗抽出液
2.8（胎盤２個分に相当）を用い、種々の非極
性ハイポーラスポリマー樹脂500mlをつめたカラ
ム（4.0cm×40cm）に吸着し、実施例２の手法に
従つてCu・Zn−SODの精製を行つた。カラム洗
浄液および溶出溶液等の条件、得られたCu・Zn
−SODの活性、粗抽出液からの回収率、比活性
は、第２表のとおりである。

【表】 実施例 ３ 新鮮なヒト胎盤２個を1.15％塩化カリウム溶液
で十分に血液を洗浄除去後、胎盤の重量の2.5倍
容の同上溶液を加えてホモゲナイザーにより十分
に組織を破砕し、固形分を遠心除去した。上清液
を何ら処理することなしにそのままダイヤイオン
HP−20カラム（2.7×35cm、200ml）に通導する
ことによりCu・Zn−SODを吸着した。カラム
は、0.05M酢酸ナトリウムバツフアー（PH5.0）
400mlで洗浄し、さらに水200mlで洗浄後、0.1M
グリシン−ナトリウムバツフアーに50％（ｖ／
ｖ）のメタノールを含むPH10.0の溶出剤により溶
出した。Cu・Zn−SODは単１ピークとなつて溶
出され、溶出開始から100ml〜500mlの中にほぼ全
てのSOD活性が含まれていた。回収されるCu・
Zn−SODの活性は、97550単位でありCu・Zn−
SOD粗抽出液からの収率は88％であつた。溶出
液の本工程以降の精製法は、DE−52樹脂の代わ
り、DEAE−Toyopearl（東洋ソーダ社製）を使
用する以外全く実施例２と同様の操作であり、全
工程を通して回収されるCu・Zn−SODは52100
単位、47％、比活性は3450単位／mg（タンパク
質）であつた。なお本実施例で、胎盤を脱血せず
Cu・Zn−SODを抽出した実施例１より収量及び
収率が低下している原因は、脱血することにより
胎盤に含まれる赤血球部分のCu・Zn−SODが失
なわれることによる。 実施例 ４ 牛の肝臓１Kgを1.15％塩化カリウム溶液で洗浄
し、肝臓重量の５倍容の同上溶液を加え、ホモゲ
ナイザーを用いて十分な組織の細胞を破砕した。
遠心により、破砕液中の不溶性の固形分は除去
し、Cu・Zn−SODを含む粗抽出液を得た。この
液は、さらに処理することなしに、ダイヤイオン
HP−20カラム（6.5×60cm、２）に通導され、
0.05酢酸ナトリウムバツフアー４で洗浄後さら
に水１で洗浄した。この吸着・洗浄工程を通じ
て、SOD活性の13％の洩れが見られた。溶出は
0.1Mグリシン−ナトリウムバツフアーの50％
（ｖ／ｖ）メタノール溶液（PH10.0）により行つ
た。SODの活性は溶出開始後0.45〜４の溶出液
中に集まり、回収されるSODの活性は1680000単
位で、抽出液からの収率は80％であつた。Cu・
Zn−SODを含有する溶出液は、実施例２のごと
くさらに精製操作を経て、純粋なCu・Zn−SOD
となる。 実施例 ５ パン酵母１Kgを２倍容の0.02Mリン酸バツフア
ー（PH7.0）に懸濁し、冷却下フレンチプレスに
より、菌体を破砕した。破砕液中の固形分は遠心
して除去し、Cu・Zn−SODを含有する粗抽出を
得た。この抽出液をさらに処理することなくダイ
ヤイオンHP−20カラム（2.8×40cm、250ml）に
通導し、Cu・Zn−SODを吸着した。カラムは
0.05酢酸ナトリウムバツフアー（PH5.0）500mlで
洗浄し、さらに水100mlで洗浄後、0.1Mグリシン
−ナトリウムバツフアーに50％（ｖ／ｖ）のメタ
ノールを含有するPH10.0の溶出剤により溶出し
た。Cu・Zn−SODは単一のピークとなつて溶出
され、溶出開始から100ml〜500mlの中にほぼ全て
のSOD活性が含まれていた。回収されたCu・Zn
−SODの活性は266900単位で、抽出液からの収
率は51％であつた。また、この段階で得られた
Cu・Zn−SODの比活性は980単位／mg（タンパ
ク質）であつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 非極性ハイポーラスポリマー系樹脂に不純な
   銅・亜鉛スーパーオキシドデイスムターゼを含有
   する溶液を接触させた後、該樹脂を洗浄し、次い
   で該樹脂に吸着した銅・亜鉛スーパーオキシドデ
   イスムターゼを溶出することを特徴とする銅・亜
   鉛スーパーオキシドデイスムターゼの精製法。